CN1256309A - 麻黄细胞(Ephedra)ZHJ－25 CGMCC No.0359及诱导方法 - Google Patents
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Abstract
本发明涉及利用生物技术从麻黄属植物诱导麻黄细胞及其诱导方法。本发明诱导出的麻黄细胞(Ephedra)ZHJ－25,已于1998年9月23日保芷在中国微生物保芷中心,保芷编号为CCMCNO0359。本发明的诱导方法是取麻黄属植物经清洗、灭菌、接种到1.0—10%重量/体积糖培养基中,在23—26℃下保温5—30天,获得的麻黄愈伤组织转移到培养基中进行继代培养。本发明所得麻黄细胞的增殖量为接种时的3—5倍,麻黄碱的含量为干重的0.1—20%。
Description
本发明涉及利用生物技术从麻黄属植物诱导麻黄细胞系，更具体地，本发明涉及通过麻黄植物诱导麻黄细胞(Ephedra)ZHJ-25 CGMCC No.0359及可生产麻黄碱的高产细胞系的方法。
麻黄属植物中主要含有麻黄碱，伪麻黄碱，L-N甲基麻黄碱，d-N甲基伪麻黄碱，L去甲基麻黄碱，d-去甲基伪麻黄碱等。麻黄草是一种常用中草药，具有发汗，平喘，祛风等作用。麻黄碱与肾上腺素一样能够兴奋交感神经，但麻黄碱可以口服，而且作用时间长，此点为肾上腺素所不能。麻黄碱能使支气管扩张，鼻黏膜收缩，并使血压升高临床用于特效治疗咳嗽，气喘，枯草热，百日咳等。另外，它能减低月经痛病的疼痛，亦能作散瞳药。
目前，国内外生产麻黄碱大都是利用天然的麻黄植物进行提取，如我国内蒙的赤峰制药厂及十多家麻黄碱生产厂家都是利用该方法。天然植物生产提取生产麻黄碱需要耗费大量的天然资源，以保证生产的顺利进行。经过多年的采挖，麻黄植物资源已相当缺乏而且生态环境遭到了破坏。在刘国钧的《新疆麻黄植物立地条件的探讨》一文中已述及麻黄植物群落贫乏，在10×5平方米的样地上最多只记载5-10个群落，有的只有2-3个群落。在程争鸣的《人工种植麻黄生物碱含量变化规律》一文中报道，仅新疆就已建成八个生产麻黄碱的厂，年消耗麻黄植物将近60,000吨左右。几年内麻黄植物资源即将枯竭。据报道，新疆麻黄草经过含量测定，具有工业生产价值的可利用量仅为蕴臧量的1/3。不合理的采挖，不但破坏草场，而且使荒漠植被也受到严重危害。
种植麻黄属的植物一般需要3年的时间才可收获，而且种植过麻黄植物的土壤具有毒性，需荒废1--2年方可种植其他植物，故种植麻黄草需要站用大量可耕地。
鉴于以上情况，有必要开发生产麻黄碱的其他方法。
经文献检索得知，目前国内外的报道中的利用麻黄植物诱导麻黄细胞生产麻黄碱的方法有多种，但其麻黄碱的含量一般均在0.17--0.6％左右。在Ramawal，K.G.etc.Effect of Amino Acid on Ephedrine Production in Ephedra geradianaCa//ous Culture Phylochemistry vol.18(3)；p484-485一文中报道麻黄碱的含量为0.5--0.6％。
本发明的目的在于克服上述已有技术的缺陷，从麻黄植物细胞系中分离诱导出麻黄细胞ZHJ-25，目的之二在于提供一条生产麻黄碱原料的新途径。利用生物技术开发大规模工业化生产麻黄碱的方法。即通过组织培养的方法诱导出愈伤组织，可利用这种ZHJ-25麻黄细胞进行工业化生产麻黄碱。目的之三在于提高产率，本发明所诱导的麻黄细胞系，麻黄碱的含量为干重的2.0--5.0％，细胞的增殖量为3--6倍。
本发明的目的是这样实现的：
该微生物的名称：麻黄细胞(Ephedra)ZHJ-25
该麻黄细胞(Ephedra)ZHJ-25，已于1998年9月23同保藏在中国微生物保藏中心(其简称为CGMCC)，保藏编号为CGMCC No.0359。
麻黄细胞(Ephedra)ZHJ-25 CGMCC No.0359的微生物特性：利用麻黄植株诱导出产生麻黄碱的麻黄细胞ZHJ-25，该麻黄细胞有如下的特征：(1)麻黄细胞的形态特征：
在含有2，4-D和吲哚乙酸的琼脂培养基上于23-26℃培养2天后观察，即可看出细胞在增长，在原有的细胞团上增殖出细小的颗粒状的细胞，再培养3-5天后就可观察到0.5-5mm大小的细胞团。麻黄细胞呈椭球体和球体，细胞的直径大约为10-150微米左右。(2)麻黄愈伤组织的特征
麻黄的细胞经增殖形成愈伤组织，麻黄愈伤组织有的呈现出聚集体，有的呈现出分散形的状态。愈伤组织边缘呈现类颗粒的波状，微粘。在悬浮培养时呈现1mm左右的细小的颗粒状，悬浮于培养液中，待到生产的后期，由于愈伤组织产生出麻黄碱，细胞的比重加大，细胞易沉降于液体的底部。颜色为浅黄色到深棕色不等。(3)生理生化特征
可利用多种糖源，最合适的培养温度为25℃，低于10℃或高于40℃细胞生长缓慢甚至死亡。最合适的PH为5.8，在光照及暗培养中细胞均可生产麻黄碱及衍生物，只是麻黄碱及衍生物的含量不同。过氧化物同工酶，是麻黄细胞ZHJ-25生长活性标志，苯丙氨酸转氨酶与麻黄细胞ZHJ-25中的麻黄碱及衍生物的代谢产率成正比关系。
本发明提供了利用麻黄植株诱导出生产麻黄碱的麻黄细胞系ZHJ-25的方法，优化了该细胞系的生长条件，并且经过代谢调控，获得高产的麻黄细胞系，其细胞的增殖量为接种时的3-6倍，麻黄碱的含量为干重的0.1-20％。
本发明方法中所用的麻黄植物植株包括草麻黄Ephdra sinica Stapf，木贼麻黄Ephedra equisetinna Bunge，中麻黄Ephdra intermedia Schrenk，膜果麻黄Ephdra przewalskii Stapf；还包括单子麻黄，蓝枝麻黄，双穗麻黄，细子麻黄等。
本发明利用麻黄植株诱导麻黄细胞(Ephedra)ZHJ-25 CGMCC No.0359的步骤如下：(i)将麻黄属植株用洗涤灵洗净，再用蒸馏水冲洗三遍，放入通常的消毒剂如：次氯酸钠，双氧水，升汞等配制的水溶液中，灭菌10-30分钟：(ii)将上述(i)洗净植物的茎切成0.5cm长短，接到含1.0-10％(重量/体积)糖的
培养基(如表1中所示)中，在23-26℃保温培养5-30天：(iii)将(ii)的生长后所得麻黄愈伤组织从外植体上切下，转移到新配制表1的培
养基中在23-26℃保温培养12-15天。
表1麻黄细胞(Ephedra)ZHJ-25的培养基组成
| 试剂名称 | 浓度mmol/L | 试剂名称 | 浓度mmol/L |
| 硝酸钾 | 2-10.0 | 硫酸铜 | 0.0001-0.001 |
| 磷酸二氢钠 | 0.3-3.0 | 硫酸锌 | 0.01-0.1 |
| 硫酸镁 | 1-3 | 乙二胺四乙酸钠铁 | 0.1-2 |
| 硼酸钠 | 0.001-0.007 | 动力精 | 0.001-0.01 |
| 硫酸氨 | 0.5-3.0 | (IAA)吲哚乙酸 | 0.0005-0.005 |
| 氯化钙 | 0.5-3.0 | 蔗糖 | 1.0-10(％W/V) |
本发明的优点：
本发明提供一种新的麻黄细胞(Ephedra)ZHJ-25 CGMCC No.0359，以及这种麻黄细胞的诱导方法，该方法可以得到高产的麻黄细胞系，其细胞的增殖量为接种时的3-5倍，利用高压液相色谱法及1990年版的《中华人民共和国药典》中酸碱滴定法等方法对本发明的麻黄细胞测定，所得麻黄碱的含量为0.1-20％。该方法可实现工业化，为生产麻黄碱提供了一条新的原料供应途径。
下面结合附图及实施例对本发明进行进一步的说明：
图l是麻黄细胞的增殖曲线
实施例1麻黄细胞(Ephedra)ZHJ-25 CGMCC No.0359诱导
将麻黄植株用洗涤灵洗净，再用蒸馏水冲洗三遍。放入70％(V/V)的酒精水溶液中15分钟，再放入30％(V/V)的次氯酸钠水溶液中l0-30分钟。将灭菌后的植株切成约0.5cm长，接到含1％(重量/体积)糖的培养基(表2配方)中，在23-26℃保温培养5-30天，可见有细小的愈伤组织从外植体上长出。切下愈伤组织，转移到新配制培养基中(成分如表2所示)，在同样的培养条件下培养12--15天，即可得到良好的麻黄愈伤组织。
表2麻黄细胞ZHJ-25的培养基组成
实施例2，3，4，5，6麻黄细胞(Ephedra)ZHJ-25 CGMCC No.0359的诱导
| 试剂名称 | 浓度mmol/L | 试剂名称 | 浓度mmol/L |
| 硝酸钾 | 5.0 | 硫酸铜 | 0.0001 |
| 磷酸二氢钠 | 3.0 | 硫酸锌 | 0.06 |
| 硫酸镁 | 1.5 | 乙二胺四乙酸钠铁 | 0.1 |
| 硼酸钠 | 0.005 | 动力精 | 0.001 |
| 硫酸氨 | 2.0 | IAA | 0.0005 |
| 氯化钙 | 2.0 | 蔗糖 | 1.0(％W/V) |
麻黄细胞由麻黄植株的诱导过程及诱导的条件如实施例1所述，只是麻黄细胞诱导时的培养基不同，现分别示出如下：
表3麻黄细胞ZHJ-25的培养基组成实施例7麻黄细胞(Ephedra)ZHJ-25 CGMCC No.0359增殖率随培养进程的变化
将麻黄细胞在固体生长培养基中进行培养，每8-15天即将麻黄细胞转移到新配制的生长培养基中进行继代培养，保证细胞的生理活性。图1是在麻黄细胞生长过程中，每三天取样，称得细胞的鲜重量，计算细胞相对于接种时重量的变化。从图1中可以看出，在8-15天，细胞增殖率达到最大，延长生长期，细胞的活性降低，增殖率降低。其增殖率计算按下列公式：
实施例8麻黄细胞(Ephedra)ZHJ-25 CGMCC No.0359培养生产麻黄碱(i)麻黄细胞接种在含有2，4-D及吲哚乙酸的植物细胞培养基中，在23-26℃培养10-30天，即得麻黄细胞的培养；(ii)经过10-30天的培养后，麻黄细胞的颜色变为深棕色，取出麻黄细胞在低温下
干燥，然后研成细粉，过100目的不锈钢筛网，作为样品。
Claims (6)
1.一种麻黄细胞(Ephedra)ZH-25 CGMCC No.0359。
2.一种诱导权利要求1所述麻黄细胞(Ephedra)ZH-25 CGMCC No.0359的方法，包括下列步骤顺序进行：
(1)将麻黄属植株用洗涤灵洗净，再用蒸馏水冲洗三遍，放入通常的消毒剂如：次氯酸钠，双氧水，升汞等配制的水溶液中，灭菌10-30分钟；
(2)将上述(1)洗净植物的茎切成0.5cm长短，接到含1.0-10％(重量/体积)糖的培养基中，在23-26℃保温培养5-30天；
(3)将(2)的生长后所得麻黄属愈伤组织从外植体上切下，转移到新配制的培养基中进行继代培养，在23-26℃温度下培养12-15天。
3.按权利要求2所述诱导麻黄细胞(Ephedra)ZH-25 CGMCC No.0359的方法，其特征在于：所述的麻黄细胞的培养基组成配方，试剂名称 浓度mmol/L 试剂名称 浓度mmol/L硝酸钾 2-10.0 硫酸铜 0.0001-0.001磷酸二氢钠 0.3-3.0 硫酸锌 0.01-0.1硫酸镁 1-3 乙二胺四乙酸钠铁 0.1-2硼酸钠 0.001-0.007 动力精 0.001-0.01硫酸氨 0.5-3.0 IAA 0.005-0.005氯化钙 0.5-3.0 蔗糖 1.0-10(％w/v)
4.按权利要求3所述诱导麻黄细胞(Ephedra)ZHJ-25 CGMCC No.0359方法其特征在于：所述的培养基组成配方中，还包括加入浓度为0.1-20mmol/L的苯丙氨酸。
5.按权利要求3所述诱导麻黄细胞(Ephedra)ZHJ-25 CGMCC No.0359方法其特征在于：所述的培养基组成配方中，还包括加入10％-50％重量百分比的真菌发酵液，其真菌发酵液的浓度为10-50w/v。
6.按权利要求3所述诱导麻黄细胞(Ephedra)ZHJ-25 CGMCC No.0359方法其特征在于：所述的培养基组成配方中，还包括加入0.6-0.7％重量百分比的琼脂。
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