CN106636238A - 一种微生物利用酒糟发酵生产γ‑氨基丁酸的方法 - Google Patents

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郑俊贤
杨套伟
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Abstract

一种微生物利用酒糟发酵生产γ‑氨基丁酸的方法。本发明公开了一株重组菌株B.amyloliquefaciens B10‑127/pGAD利用酒糟作为碳氮源，发酵生产γ‑氨基丁酸的方法，属于基因工程和生物工程领域。该发明是通过构建含来源于植物乳杆菌GB01‑21(CCTCCM209102)的谷氨酸脱羧酶的重组菌，在37℃，空气流量为120m3/h·m3培养基，搅拌转速为350r/min条件下，酒糟发酵培养基培养发酵60h，获得48.9g/Lγ‑氨基丁酸的方法。有效开发利用酒糟，生产高附加值物质，减少酒糟对环境的污染，在一定程度上能带来可观的经济效益。

Description

一种微生物利用酒糟发酵生产γ-氨基丁酸的方法
技术领域
本发明涉及基因工程技术改造微生物，使得重组菌能以酒糟为原料生产γ-氨基丁酸的方法，属于基因工程和生物工程领域。
背景技术
γ-氨基丁酸(γ-amino butyric acid，GABA)是天然存在于某些生物体内的非蛋白质氨基酸，其为哺乳动物中枢神经系统重要的抑制性神经递质，具有抗焦虑、降血压、镇定安神、增强记忆、调节激素分泌、促进生殖、利尿，镇痛等生理功能，在食品、饲料、医药等领域都具有广泛的应用。
正如以授权专利(CN201110209999.7)的技术背景所述，目前报道的利用酒糟的技术主要有：烘干去稻壳直接生产饲料；经微生物发酵生产菌体蛋白饲料；进行固态发酵，生产酶类饲料添加剂；厌氧发酵生产沼气；也有利用酒糟的水解液发酵生产丁二酸的报道。但未见利用微生物发酵酒糟生产γ-氨基丁酸的报道。
因此，针对当前酒糟的处理方式是直接用来做饲料的应用附加值极低，且其中大部分的营养成分均未有效开发与利用等问题。发明人利用研究室前期通过菌种选育保藏Bacillus amyloliquefaciens B10-127(CCTCC NO：M2012349，已在已授权专利中公开，授权号：ZL201310342414.8)分泌的复杂胞外酶系，在一定条件下利用酒糟作为碳源进行生长和代谢的特性，通过基因工程技术改造该菌种使其能生物发酵转化酒糟为γ-氨基丁酸。有效开发利用酒糟，生产高附加值物质，减少酒糟对环境的污染，在一定程度上能带来可观的经济效益。
发明内容
本发明要解决的技术问题是提供一种微生物利用酒糟发酵生产γ-氨基丁酸的方法。
本发明提供一株可利用酒糟发酵生产γ-氨基丁酸的基因工程菌种。
所述的酒糟为发酵酒醪经压榨、分离去除酒液后留下的固形物，经预粉碎处理的基质。
本发明的技术方案：通过基因工程技术，构建一株能以廉价酒糟为碳源直接发酵生产γ-氨基丁酸的重组解淀粉芽孢杆菌。
所述的重组菌发明人按分类命名为B.amyloliquefaciens B10-127/pGAD.
所述重组菌的构建方法如下：
(1)以植物乳杆菌GB01-21(CCTCCM209102)的基因组DNA为模板，利用正向引物F(5’-TTCCATATGATGGACCAGAAGCTGTTAAC-3’，酶切位点NdeI)，反向引物R(5’-GGCGGATCCCAGGTGTGTTTAAAGCTGTT-3’，酶切位点BamHI)进行PCR扩增即得到植物乳杆菌谷氨酸脱羧酶基因全长1401bp，所述核苷酸序列是SEQ ID N0.1所示的序列。
(2)将上一步得到的重组基因序列，连接到pMA5表达载体中，得到重组质粒pMA5-GAD，重组质粒化转化B.amyloliquefaciens B10-127，获得重组解淀粉芽孢杆菌，命名为B.amyloliquefaciens B10-127/pGAD。
发酵培养基：酒糟100g/L，葡萄糖30g/L，玉米浆5g/L，尿素3g/L，柠檬酸钠6g/L，K2HPO44g/L，MgSO40.2g/L；将上述发酵培养基用5mol/L的NaOH调节其pH至6.5(接种后添加商品化500U/mL左右糖化酶、300U/mL左右复合纤维素酶和少量氨基酸氧化酶，不用添加淀粉酶)。其中葡萄糖的作用是保证发酵前期菌体快速生长。
本发明的效益：在一定条件下利用酒糟作为碳源进行生长和代谢的特性，通过基因工程技术改造该菌种使其能生物发酵转化酒糟为γ-氨基丁酸。有效开发利用酒糟，生产高附加值物质，减少酒糟对环境的污染，在一定程度上能带来可观的经济效益。
具体实施方式
实施例1含谷氨酸脱羧酶重组载体的构建
(1)谷氨酸脱羧酶基因片段获得：以植物乳杆菌GB01-21(CCTCCM209102)的基因组DNA为模板，利用正向引物F(5’-TTCCATATGATGGACCAGAAGCTGTTAAC-3’，酶切位点NdeI)，反向引物R(5’-GGCGGATCCCAGGTGTGTTTAAAGCTGTT-3’，酶切位点BamHI)进行PCR扩增。
(2)将重组基因与pMA5分别用BamHI、NdeI双酶切，纯化后用T4DNA连接酶16℃过夜连接。连接产物化学法转化JM109感受态细胞。转化液涂布含卡那霉素(50mg/L)LB平板，提取质粒，双酶切验证构建的重组质粒，命名为pMA5-GAD。测序工作由上海生工完成。
实施例2重组解淀粉芽孢杆菌的构建
将实施例1得到的重组质粒pMA5-GAD化学法转化入B.amyloliquefaciensB10-127感受态细胞，具体方法如下：
(1)转化实验所需溶液如下(g/L)：
Sp-A：(NH4)2SO4 4，K2HPO4 28，柠檬酸钠12Sp-B：MgSO4·7H2O 0.4
100×CAYE：Casamino acid 20，酵母粉100 Sp I培养基：Sp-A 49％，Sp-B 49％，50％葡萄糖2％，100×CAYE 2％Sp II培养基：Sp I培养基98％，50mmol/LCaCl2 1％，250mmol/L MgCl2 1％。115℃湿热灭菌。
(2)将B.amyloliquefaciens B10-127的单菌落接种至2mL Sp I培养基中(50mL离心管)，37℃、200r/min培养过夜；
(3)取100μL培养液至5mL Sp I培养基中，37℃、200r/min培养至对数期(OD600值为1左右)，约4～5h；
(4)取200μL培养液至2mL Sp II培养基中，37℃、200r/min培养90min，取出后加入20μL 10mmol/L EGTA，于37℃、200r/min继续培养10min，然后分装成500μL每管，加入5μL重组质粒pMA5-GAD，混匀，37℃、200r/min培养90min，取菌液涂布抗性平板。37℃培养12h，挑取阳性转化子验证。得到重组菌B.amyloliquefaciens B10-127/pGAD。
实施例3：重组菌B.amyloliquefaciens B10-127/pGAD利用酒糟发酵产γ-氨基丁酸。
将实施例2构建的重组菌B.amyloliquefaciens B10-127/pGAD接种于l0mL含卡那霉素的LB培养基中，37℃振荡培养过夜，摇床转速160r/min，培养时间为12h左右，种子培养基组成：淀粉10g/L，酵母提取物5g/L，胰蛋白胨10g/L，NaCl 10g/L。
将上述培养好的种子液按4％接种量接种于发酵培养基中进行发酵培养，发酵温度37℃，空气流量为120m3/h·m3培养基，搅拌转速为350r/min。定时取样测定细胞浓度、底物残留量和γ-氨基丁酸生产量，发酵培养60h，即刻停止发酵。发酵结束后，γ-氨基丁酸产量达到48.9g/L。
虽然本发明已以较佳实施例公开如上，但其并非用以限定本发明，任何熟悉此技术的人，在不脱离本发明的精神和范围内，都可做各种的改动与修饰，因此本发明的保护范围应该以权利要求书所界定的为准。
序列表
<110> 江南大学
<120>一种微生物利用酒糟发酵生产γ-氨基丁酸的方法
<160> 2
<210> 2
<211> 1401
<212> DNA
<213> Lactobacillus plantarum GB01-21
<400> 1
1 ATGGCAATGT TATACGGTAA ACACAATCAT GAAGCTGAAG AATACTTGGA ACCAGTCTTT
61 GGTGCGCCTT CTGAACAACA TGATCTTCCT AAGTATCGGT TACCAAAGCA TTCATTATCC
121 CCTCGAGAAG CCGATCGCTT AGTTCGTGAT GAATTATTAG ATGAAGGCAA TTCACGACTG
181 AACTTGGCAA CTTTTTGTCA GACCTATATG GAACCCGAAG CCGTTGAATT GATGAAGGAT
241 ACGCTGGCTA AGAATGCCAT CGACAAATCT GAGTACCCCC GCACGGCCGA GATTGAAAAT
301 CGGTGTGTGA ACATTATTGC CAATCTGTGG CACGCACCTG ATGACGAACA CTTTACGGGT
361 ACCTCTACGA TTGGCTCCTC TGAAGCTTGT ATGTTAGGCG GTTTAGCAAT GAAATTCGCC
421 TGGCGTAAAC GCGCTCAAGC GGCAGGTTTA GATCTGAATG CCCATCGACC TAACCTCGTT
481 ATTTCGGCTG GCTATCAAGT TTGCTGGGAA AAGTTTTGTG TCTACTGGGA CGTTGACATG
541 CACGTGGTCC CAATGGATGA GCAACACATG GCCCTTGACG TTAACCACGT CTTAGACTAC
601 GTGGACGAAT ACACAATTGG TATCGTCGGT ATCATGGGCA TCACTTATAC CGGTCAATAT
661 GACGACCTAG CCGCACTCGA TAAGGTCGTT ACTCACTACA ATCATCAGCA TCCCAAATTA
721 CCAGTCTACA TTCACGTTGA CGCAGCGTCA GGTGGCTTCT ATACCCCATT TATTGAGCCG
781 CAACTCATCT GGGACTTCCG GTTGGCTAAC GTCGTTTCGA TCAACGCCTC CGGGCACAAG
841 TACGGTTTAG TTTATCCCGG GGTCGGCTGG GTCGTTTGGC GTGATCGTCA GTTTTTACCG
901 CCAGAATTAG TCTTCAAAGT TAGTTATTTA GGTGGGGAGT TGCCGACAAT GGCGATCAAC
961 TTCTCACATA GTGCAGCCCA GCTCATTGGA CAATACTATA ATTTCATTCG CTTTGGTATG
1021 GACGGTTACC GCGAGATTCA AACAAAGACT CACGATGTTG CCCGCTACCT AGCAGCTGCT
1081 CTGGATAAAG TTGGTGAGTT TAAGATGATC AATAACGGAC ACCAACTACC TCTGATTTGT
1141 TACCAACTAG CCCCGCGCGA AGATCGTGAA TGGACCCTTT ATGATTTATC GGACCGCCTA
1201 TTAATGAACG GCTGGCAAGT ACCAACATAT CCTTTACCTG CTAATCTAGA ACAACAAGTC
1261 ATCCAACGAA TCGTCGTTCG AGCTGACTTT GGCATGAATA TGGCACACGA TTTCATGGAT
1321 GACCTGACCA AGGCTGTCCA TGACTTAAAC CAAGCCCACA TTGTCTATCA TCATGACGCG
1381 GCACCTAAGA AATACGGATT CACACACTGA

Claims (5)

1.一种微生物利用酒糟发酵生产γ-氨基丁酸的方法，其特征在于构建重组B.amyloliquefaciens B10-127/pGAD发酵能利用酒糟生产γ-氨基丁酸。
2.权利要求1所述的B.amyloliquefaciens B10-127/pGAD重组菌，为重组质粒pMA5-GAD化学法转化入B.amyloliquefaciens B10-127所获得。
3.一种重组质粒pMA5-GAD的构建，其特征在于，将来源植物乳杆菌GB01-21(CCTCCM209102)的谷氨酸脱羧酶GAD通过基因工程方法连接到pMA5表达载体上。
4.一种重组菌利用酒糟发酵γ-氨基丁酸，其特征在于，以酒糟为碳源和营养物质的发酵培养基，在B.amyloliquefaciens B10-127/pGAD发酵生产γ-氨基丁酸。
5.根据权利要求4所述的发酵培养基为：酒糟100g/L，葡萄糖30g/L，玉米浆5g/L，尿素3g/L，柠檬酸钠6g/L，K2HPO44g/L，MgSO40.2g/L；将上述发酵培养基用5mol/L的NaOH调节其pH至6.5(接种后添加商品化500U/mL左右糖化酶、300U/mL左右复合纤维素酶和少量氨基酸氧化酶，不用添加淀粉酶)。其中葡萄糖的作用是保证发酵前期菌体快速生长。
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