CN102206606A - 一株重组大肠杆菌及其在生产5-氨基乙酰丙酸中的应用 - Google Patents
一株重组大肠杆菌及其在生产5-氨基乙酰丙酸中的应用 Download PDFInfo
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Abstract
本发明公开了一株重组大肠杆菌，其中所述重组大肠杆菌名为重组大肠杆菌DALA，由如下方法制得：构建含hemAM和hemL基因的共表达载体p-hemAM-hemL，再构建含rhtA基因的表达载体p-rhtA，将所构建的重组质粒p-hemAM-hemL和p-rhtA共转化大肠杆菌中，得同时过量表达hemAM、hemL和rhtA基因的重组大肠杆菌DALA。本发明还公开了所述重组大肠杆菌在生产5-氨基乙酰丙酸中的应用，发酵结果表明，本发明的重组大肠杆菌的ALA产量达到了4.13g/L，ALA/葡萄糖转化率为0.168g ALA/g葡萄糖，提示具有很好的工业开发和应用前景。
Description
技术领域
本发明涉及基因工程和微生物发酵领域，具体地说，涉及一株重组大肠杆菌及其构建方法以及该重组菌株在生产5-氨基乙酰丙酸(ALA)中的应用。
背景技术
5-氨基乙酰丙酸(ALA)，其分子式为C5O3NH9，分子量为131.13，熔点为118℃，ALA在农业上具有重要的应用。研究表明它是无公害的天然物质，具有生物降解性。5-氨基乙酰丙酸是一种新型农药，由于其在环境中易降解，无残留，对哺乳动物无毒性，因其作为一种无公害的绿色农药而受到关注。ALA在农业领域应用也非常广泛，主要应用于绿色除草剂、植物生长调节剂、杀虫剂等方面。除了在农业上的应用，在医学领域，ALA作为一种安全、选择、渗透性好的光动力学药物逐渐受到青睐。ALA已经应用于皮肤癌、膀胱癌、消化道癌、肺癌等的诊断与光动力治疗(PDT)中。
目前，ALA的生产方法集中在化学合成。关于δ-ALA化学合成方法的报道最早文献出自上世纪50年代，进入20世纪90年代，有关化学合成的研究最为活跃。相关化学合成主要集中在以马尿酸和琥珀酸为原料的合成工艺研究、以糠醛等杂环物质为原料的合成工艺研究及以乙酰丙酸或其衍生物为原料的合成工艺研究。由于化学合成反应步骤多、副产物多、分离提纯难、ALA的得率低等问题，从而造成生产成本高。除此之外，由于化学合成中涉及很多有毒试剂，从而对环境也会造成污染。所以随着社会和科学技术的发展。以廉价的可再生资源为底物，利用微生物发酵生产ALA已是未来的趋势。目前市场上，葡萄糖价格为4500元/吨，ALA价格为80000000元/吨。即使ALA-HCl，其价格也极为昂贵，达到4,000,0000元/吨。所以利用葡萄糖廉价底物为原料发酵生产ALA，成本上具有极大的优势。
国外一些科研者通过诱变育种法对光合细菌球形红细菌(Rhodobacter sphaeroides)诱变，筛选ALA高产菌株。通过发酵工艺，ALA产量达到了7.2g/L。然而由于光合细菌发酵中采用光照，从而增加了成本，不适合大规模工业发酵生产。大肠杆菌(E.coli)作为生产工业产物的宿主由于其遗传背景清楚、易操作、生长速率快、易培养、可利用无机盐培养基培养及可利用多种碳源，而受到越来越多的重视。随着基因工程技术的成熟，人们已经采用基因重组技术将R.sphaeroides中的ALA合成酶基因(hemA)在野生型大肠杆菌中表达。Mariet和Zeikus获得大肠杆菌(Escherichia coli)重组菌株，ALA发酵产量达到了3.79g/L。L.Xie et al.等利用含有R.sphaeroides的ALA合成酶基因的重组大肠杆菌，经过发酵优化，ALA产量达到5.2g/L。上述ALA生产方法是利用C4-途径，即通过表达ALA合成酶生物转化琥珀酸和甘氨酸生产ALA。
目前由于琥珀酸主要是通过化学合成法制备，所以琥珀酸和甘氨酸为底物生物转化ALA成本较高，同时由于高浓度的甘氨酸(＞1.7g/L)即造成对菌体生长的抑制，所以生物转化工艺相对复杂。同时，生物转化中所用培养基为昂贵的LB培养基，所以这也成为ALA工业化的瓶颈。如何降低发酵成本以及简化发酵工艺，成为ALA大工业生产的关键问题。只有降低生物法生产ALA的成本，同时简化发酵工艺，利用微生物工业化生产ALA才有望代替目前的化学合成方法。
发明内容
针对目前ALA生产中的缺陷，本发明要解决的问题是提供一株重组大肠杆菌及其构建方法以及该重组菌株在生产5-氨基乙酰丙酸(ALA)中的应用。
本发明的技术方案是基于ALA的C5途径，采用在大肠杆菌中过量表达来源于大肠杆菌或沙门氏菌中的中hemA基因突变体和来源于大肠杆菌的大肠杆菌、亚利桑那沙门氏菌或伤寒沙门氏菌中的hemL基因，在改良无机盐培养基内以葡萄糖为唯一碳源发酵生产5-氨基乙酰丙酸(ALA)。
本发明所述重组大肠杆菌，其特征在于，所述重组大肠杆菌名为重组大肠杆菌DALA，由如下方法制得：构建含hemAM和hemL基因的共表达载体p-hemAM-hemL，再构建含rhtA基因的表达载体p-rhtA，将所构建的重组质粒p-hemAM-hemL和p-rhtA共转化大肠杆菌中，得同时过量表达hemAM、hemL和rhtA基因的重组大肠杆菌DALA。
其中，所述hemAM是来源于大肠杆菌或沙门氏菌的hemA基因的突变体；所述hemL基因来源于大肠杆菌或沙门氏菌；所述rthA基因来源于大肠杆菌。
进一步优选的是，所述hemAM是来源于亚利桑那沙门沙门氏菌的hemA基因的突变体；所述hemL基因来源于沙门氏菌。
上述表达hemAM、hemL或rhtA基因的载体为pBluescript SK-、pUC19、pUC18、pCL1920或pTrc99A；其中质粒pBluescript SK-、pCL1920和来源于DSMZ(德国微生物保藏中心)，质粒pUC19、pUC18和pTrc99A来源于famentas公司。
其中，所述表达hemAM和hemL基因的载体优选pUC19；所述表达rhtA基因的载体优选pCL1920。
上述出发菌株大肠杆菌选大肠杆菌MG1655、大肠杆菌DH5α、大肠杆菌JM109、大肠杆菌W3110或大肠杆菌XL1-Blue；其中MG1655、JM109和W3110来源于ATCC(美国典型菌种保藏中心)；大肠杆菌DH5α、大肠杆菌Xl1-blue来源于DSMZ(德国微生物保藏中心)。
其中，所述出大肠杆菌优选大肠杆菌DH5α。
上述重组大肠杆菌DALA优选是DH5α/pUC-hemAM-hemL+pCL1920-rhtA。
本发明所述重组大肠杆菌的构建步骤：
1.hemAM和hemL基因的共表达载体的构建
基本方法是将来源于大肠杆菌或沙门氏菌的hemA基因的突变体hemAM插入到含有来自大肠杆菌hemL基因的质粒载体pBluescript SK-、pUC19、pUC18、pCL1920或pTrc99A中；或者将来源于大肠杆菌的hemL基因插入含有来源于大肠杆菌或沙门氏菌的hemA基因的突变体hemAM的质粒载体pBluescript SK-、pUC19、pUC18、pCL1920或pTrc99A中，从而获得hemAM和hemL基因的共表达载体p-hemAM-hemL。
2.rhtA基因表达载体的构建
基本方法是以大肠杆菌基因组为模板，克隆rhtA基因，将所克隆获得的rhtA插入质粒pBluescript SK-、pUC19、pUC18、pCL1920或pTrc99A中，从而获得rhtA的表达载体p-rhtA。
3.ALA发酵重组菌株的构建
基本方法是将所构建的重组质粒p-hemAM-hemL和p-rhtA共转化大肠杆菌MG1655、JM109、DH5α、W3110、BL21或XL1-blue中，从而获得过量表达hemAM、hemL和rhtA的重组大肠杆菌DALA。
上述过量表达hemAM、hemL和rhtA的重组大肠杆菌DALA优选构建重组大肠杆菌DALA DH5α/pUC-hemAM-hemL+pCL1920-rhtA。
本发明所述重组大肠杆菌在生产5-氨基乙酰丙酸中的应用，其特征在于，所述应用是以所述重组大肠杆菌在改良的无机盐培养基中发酵葡萄糖来生产5-氨基乙酰丙酸；其中，所述改良无机盐培养基配方为：葡萄糖5-50g/L，(NH4)2SO410-30g/L，KH2PO41-8g/L，Na2HPO4·12H2O 10-30g/L，MgSO4·7H2O 0.1-1.5g/L，MnSO4·7H2O0.001-0.1g/L，酵母粉0.5-3g/L，异丙基-β-D-硫代半乳糖苷(IPTG)0.05-1mM；所述发酵中培养基中添加浓度为50-100μg/mL的氨苄青霉素和浓度为30-50μg/mL的壮观霉素。
上述改良无机盐培养基进一步优选的配方为：(NH4)2SO416g/L，KH2PO43g/L，Na2HPO4·12H2O 16g/L，MgSO4·7H2O 1g/L，MnSO4·7H2O 0.01g/L，酵母粉2g/L，异丙基-β-D-硫代半乳糖苷(IPTG)0.1mM，葡萄糖35g/L。
本发明所述重组大肠杆菌在生产5-氨基乙酰丙酸中的应用，具体方法是：
1.摇瓶培养及ALA检测
摇瓶培养：挑取所构建的重组菌株单菌落至装有3-5mL的发酵培养基的25mL的三角瓶中，氨苄青霉素终浓度为100μg/mL，壮观霉素终浓度为50μg/mL，37℃，225转/分，培养12h。
将过夜培养的菌液按照0.5-3％(v/v)的接种量接入装有50mL发酵培养基的300mL的三角瓶中，氨苄青霉素终浓度为100μg/mL，壮观霉素终浓度为50μg/mL，37℃，200-280转/分，发酵时间为8-56h。期间每2-6h取样，然后利用比色法检测ALA的浓度。
ALA检测方法是：将样品稀释至2mL，加入1mL的乙酸盐缓冲液，0.5mL的乙酰丙酮，然后煮沸15min。冷却至室温，取2mL的反应液至新管中，然后加入2mL的改良Ehrlich’s试剂，反应20min，利用分光光度计554nm下检测。
2.发酵罐培养及ALA检测
种子液的制备：挑取所构建的重组大肠杆菌单菌落至装有3-5mL的发酵培养基的25mL的三角瓶中，氨苄青霉素终浓度为100μg/mL，壮观霉素终浓度为50μg/mL，30-39℃，200-250转/分，培养8-16h。
将过夜培养的菌液按照0.5-3％(v/v)的接种量接入装有50mL发酵培养基的300mL的三角瓶中，氨苄青霉素终浓度为100μg/mL，壮观霉素终浓度为50μg/mL，37℃，200-250转/分，培养6-10h，制得种子液。
发酵罐培养：将制备好的种子液以体积百分比计按照2％的接种量转接装有3L发酵培养基的5L发酵罐中进行培养。发酵温度为35℃-38℃，pH为6.0-7.0，溶氧控制在50％以上，发酵时间为36-60h。间隔2-6h取样，然后利用比色法检测ALA的浓度。
ALA检测方法同上。
上述重组大肠杆菌在生产5-氨基乙酰丙酸的应用中，发酵温度优选37℃，pH优选6.2，溶氧控制在50％以上，发酵时间为60h。
本发明所提供的重组大肠杆菌及其生产5-氨基乙酰丙酸(ALA)的方法，具有非常重要的工业应用价值。
通过实验比较发现，本发明所述的重组菌株DALA的ALA的产量最高。
其中，摇瓶培养中，进行实验的重组菌株DEX、DEL、DA、DAL和DXAL的ALA产量分别是0.016g/L、0.024g/L、0.176g/L、2.05g/L和1.32g/L，而本发明所述的重组菌株DALA的ALA产量为2.86g/L，在所有参试菌中最高，为菌株DEX的ALA产量的179倍。发酵罐培养中，进行实验的重组大肠杆菌DALA的ALA产量达到了4.13g/L，葡萄糖的转化率达到了0.168g ALA/g葡萄糖。提示具有很好的工业开发和应用前景。
附图说明
图1.重组大肠杆菌发酵葡萄糖生产ALA的途径。
图2.构建质粒表达载体图谱。
图3.各重组菌株ALA产量的比较。
图4.发酵罐培养重组菌株生产ALA。
具体实施方式
一般性说明：实施例所涉及的酶均购自TaKaRa公司，质粒提取试剂盒购自天根公司，琼脂糖凝胶回收DNA片段试剂盒购自申能博彩公司，操作完全按照相应说明述进行。质粒构建中基因测序由华大基因公司完成。ALA标准样品及其他试剂均购自Sigma公司。DH5α感受态细胞购自全式金生物技术有限公司。
LB液体培养基(1L)：酵母粉5，蛋白胨10，NaCl 10，pH 7.0。
LB-氨苄抗性固体培养基(1L)：酵母粉5，蛋白胨10，NaCl 10，氨苄青霉素100μg/mL。
ALA检测方法：将样品稀释至2mL，加入1mL的乙酸盐缓冲液，0.5mL的乙酰丙酮，然后煮沸15min。冷却至室温，取2mL的反应液至新管中，然后加入2mL的改良Ehrlich’s试剂，反应20min，利用分光光度计554nm下检测。
所述乙酸盐缓冲液组成为(1L)：57mL冰乙酸，82g无水醋酸钠。
所述改良Ehrlich’s试剂：在50mL的量筒中加入30mL的冰乙酸，1g对-二甲氨基苯甲醛，8mL 70％高氯酸，然后定容50mL。
实施例1、gltX基因表达载体的构建
根据NCBI公布的大肠杆菌基因组序列，利用引物gltX-F：5′-TCCCTGCAGAAAGGAGGATATACATATGAAAATCAAAACTCGCTTCGCGC-3′和gltX-R：5′-GGCGTCGACTTACTGCTGATTTTCGCGTTCAGCAATAAAATCC-3′以大肠杆菌基因组或直接采用菌落PCR，克隆gltX基因。将克隆的gltX片段分别利用核酸内切酶PstI和SalI消化处理，同时将质粒载体pUC19也分别利用核酸内切酶PstI和SalI消化处理。将消化处理的gltX片段和pUC19质粒载体利用琼脂糖凝胶试剂盒回收，然后利用T4连接酶连接。连接体系为10μL：
gltX片段：6μL
pUC19载体：2μL
10×Buffer：1μL
T4连接酶：1μL
16℃连接12h后，将10μL的连接液转化大肠杆菌DH5α感受态细胞。转化过程为：将10μL的连接液加入100μL的DH5α感受态细胞细胞中，混匀。冰浴30min，42℃热击90s，冰浴2min，加入900μL的LB培养基，37℃，100转/分，孵化1h，涂布氨苄青霉素抗性平板，培养16h，挑取转化子，提取质粒验证。然后进一步测序验证gltX基因的正确。从而获得重组质粒pUC-gltX。
实施例2、hemL基因表达载体的构建
根据NCBI公布的大肠杆菌基因组序列，利用引物hemL-F：5′-ACAGGATCCAAAGGAGGATATACATATGAGTAAGTCTGAAAATCTTTACAGCG-3′和hemL-R：5′-AATGAGCTCTCACAACTTCGCAAACACCCGACGTGCAGCA-3′以大肠杆菌基因组或直接采用菌落PCR，克隆hemL基因。将克隆的hemL片段分别利用核酸内切酶BamI和SacI消化处理，同时将质粒载体pUC19也分别利用核酸内切酶BamI和SacI消化处理。将消化处理的hemL片段和pUC19质粒载体利用琼脂糖凝胶试剂盒回收，然后利用T4连接酶连接。连接体系为10μL：
hemL片段：6μL
pUC19载体：2μL
10×Buffer：1μL
T4连接酶：1μL
16℃连接12h后，将10μL的连接液转化大肠杆菌DH5α感受态细胞。转化过程为：将10μL的连接液加入100μL的DH5α感受态细胞中，混匀。冰浴30min，42℃热击90s，冰浴2min，加入900μL的LB培养基，37℃，100转/分，孵化1h，涂布氨苄青霉素抗性平板，培养16h，挑取转化子，提取质粒验证。然后进一步测序验证hemL基因的正确。从而获得过重组质粒pUC-hemL。
实施例3、hemA基因的突变及表达载体的构建
根据NCBI公布的沙门氏菌基因组序列，利用引物hemAM-F：5′-CCCGTCGACAAAGGAGGATATACATATGACCAAGAAGCTTTTAGCACTCGGTATCAAC-3′和hemAM-R：5′-AAATCTAGACTACTCCAGCCCGAGGCTGTCGCGCAGA-3′以大肠杆菌基因组或直接采用菌落PCR，克隆hemAM基因。将克隆的hemL片段分别利用核酸内切酶SalI和XbaI消化处理，同时将质粒载体pUC19也分别利用核酸内切酶SalI和XbaI消化处理。将消化处理的hemAM片段和pUC19质粒载体利用琼脂糖凝胶试剂盒回收，然后利用T4连接酶连接。连接体系为10μL：
hemAM片段：6μL
pUC19载体：2μL
10×Buffer：1μL
T4连接酶：1μL
16℃连接12h后，将10μL的连接液转化大肠杆菌DH5α感受态细胞。转化过程为：将10μL的连接液加入100μL的DH5α感受态细胞中，混匀。冰浴30min，42℃热击90s，冰浴2min，加入900μL的LB培养基，37℃，100转/分，孵化1h，涂布氨苄青霉素抗性平板，培养16h，挑取转化子，提取质粒验证。然后进一步测序验证hemAM基因的正确。从而获得重组质粒pUC-hemAM。
实施例4、hemAM和hemL基因共表达载体的构建
利用核酸内切酶BamI和SacI消化处理质粒pUC-hemL，获得BamI-hemL-SacI片段。然后利用核酸内切酶BamI和SacI消化处理质粒pUC-hemAM。利用T4连接酶将片段BamI-hemL-SacI连接至pUC-hemAM，连接体系为10μL：
hemL片段：6μL
pUC-hemAM载体：2μL
10×Buffer：1μL
T4连接酶：1μL
16℃连接12h后，将10μL的连接液转化大肠杆菌DH5α感受态细胞。转化过程为：将10μL的连接液加入100μL的DH5α感受态细胞中，混匀。冰浴30min，42℃热击90s，冰浴2min，加入900μL的LB培养基，37℃，100转/分，孵化1h，涂布氨苄青霉素抗性平板，培养16h，挑取转化子，提取质粒验证。然后进一步测序验证hemAM和hemL基因的正确从而获得重组质粒pUC-hemAM-hemL。
实施例6、gltX、hemAM和hemL基因共表达载体的构建
利用核酸内切酶PstI和SalI消化处理质粒pUC-gltX，获得PstI-gltX-SalI片段。然后利用核酸内切酶PstI和SalI消化处理质粒pUC-hemAM-hemL。利用T4连接酶将片段PstI-gltX-SalI连接至pUC-hemAM-hemL，连接体系为10μL：
gltX片段：6μL
pUC-hemAM-hemL载体：2μL
10×Buffer：1μL
T4连接酶：1μL
16℃连接12h后，将10μL的连接液转化大肠杆菌DH5α感受态细胞。转化过程为：将10μL的连接液加入100μL的DH5α感受态细胞中，混匀。冰浴30min，42℃热击90s，冰浴2min，加入900μL的LB培养基，37℃，100转/分，孵化1h，涂布氨苄青霉素抗性平板，培养16h，挑取转化子，提取质粒验证。从而获得重组质粒pUC-gltX-hemAM-hemL。
实施例7、rhtA表达载体的构建
根据NCBI公布的大肠杆菌基因组序列，利用引物rhtA-F：5′-CCGAAGCTTTTAATAAGGAGGATATACATATGCCTGGTTCATTACGTAAAATGCCGG-3′和rhtA-R：5′-GCCCTGCAGTTAATTAATGTCTAATTCTTTTATTTTGCTCTC-3′以大肠杆菌基因组或直接采用菌落PCR，克隆rhtA基因。将克隆的rhtA片段分别利用核酸内切酶HindIII和PstI消化处理，同时将质粒载体pCL1920也分别利用核酸内切酶HindIII和PstI消化处理。将消化处理的rhtA片段和pCL1920质粒载体利用琼脂糖凝胶试剂盒回收，然后利用T4连接酶连接。
连接体系为10μL：
rhtA片段：6μL
pCL1920载体：2μL
10×Buffer：1μL
T4连接酶：1μL
16℃连接12h后，将10μL的连接液转化大肠杆菌DH5α感受态细胞。转化过程为：将10μL的连接液加入100μL的DH5α感受态细胞中，混匀。冰浴30min，42℃热击90s，冰浴2min，加入900μL的LB培养基，37℃，100转/分，孵化1h，涂布壮观霉素抗性平板(30μg/mL)，培养16h，挑取转化子，提取质粒验证。然后进一步测序验证rhta基因的正确。从而获得过量表达rhtA的重组质粒pCL1920-rhtA。
实施例8、重组菌株的构建及ALA产量的比较
重组菌株的构建：分别将上述所构建的质粒pUC-gltX、pUC-hemL、pUC-hemAM、pUC-hemAM-hemL以及pUC-gltX-hemAM-hemL转化大肠杆菌DH5α感受态细胞，分别获得重组菌株DH5α/pUC-gltX(命名为DEX)、DH5α/pUC-hemL(命名为DEL)、DH5α/pUC-hemAM(命名为DA)、DH5α/pUC-hemAM-hemL(命名为DAL)以及DH5α/pUC-gltX-hemAM-hemL (命名为DXAL)。将重组质粒pUC-hemAM-hemL和重组质粒pCL1920-rhtA共转化大肠杆菌DH5α感受态细胞，获得重组菌株DH5a/pUC-hemAM-hemL+pCL1920-rhtA(命名为DALA)。
各重组菌株的发酵比较：挑取所构建的重组菌株DEX、DEL、DA、DAL、DXAL以及DALA单菌落至装有20mL的发酵培养基的250mL的三角瓶中，37℃，225转/分，培养12h。按照体积比1％的接种量将培养液转接装有50mL发酵培养基的300mL的三角瓶中，37℃，225转/分，4h取样，发酵时间为36h。其中DEX、DEL、DA、DAL、DXAL的发酵培养基组分为：(NH4)2SO416g/L，KH2PO43g/L，Na2HPO4·12H2O 16g/L，MgSO4·7H2O 1g/L，MnSO4·7H2O 0.01g/L，酵母粉2g/L，100μg/mL氨苄青霉素，IPTG0.1mM，葡萄糖35g/L。其中，氨苄青霉素的添加是为了维持质粒的稳定。而重组菌株DALA的发酵培养基组分为：(NH4)2SO416g/L，KH2PO43g/L，Na2HPO4·12H2O 16g/L，MgSO4·7H2O 1g/L，MnSO4·7H2O 0.01g/L，酵母粉2g/L，100μg/mL氨苄青霉素，50μg/mL壮观霉素，IPTG 0.1mM，葡萄糖35g/L。其中，氨苄青霉素和壮观霉素的添加是为了维持双质粒的稳定。
ALA检测方法具体是：将样品稀释至2mL，加入1mL的乙酸盐缓冲液，0.5mL的乙酰丙酮，然后煮沸15min。冷却至室温，取2mL的反应液至新管中，然后加入2mL的改良Ehrlich’s试剂，反应20min，利用分光光度计554nm下检测。
各重组菌株ALA产量统计见图3。其中，重组菌株DEX、DEL、DA、DAL和DXAL的ALA产量分别是0.016g/L、0.024g/L、0.176g/L、2.05g/L和1.32g/L。而重组菌株DALA的ALA产量最大，为2.86g/L，为菌株DEX的ALA产量的179倍。
实施例9、重组菌株E.coli DALA分批发酵生产ALA
种子液的制备：挑取所构建的重组大肠杆菌单菌落至装有4mL的发酵培养基的25mL的三角瓶中，37℃，225转/分，培养12h。将培养的菌液按照1％(v/v)的接种量接入装有50mL发酵培养基的300mL的三角瓶中，37℃，225转/分，培养8h。从而制备好种子液。
发酵罐培养：将制备好的种子液按照2％(v/v)的接种量转接装有3L发酵培养基的5L发酵罐中进行培养。发酵温度为37℃，pH为6.2，溶氧控制在50％以上，发酵时间为56h。间隔4h取样，然后利用比色法检测ALA的浓度。
ALA检测方法为比色法，详见实施例一般性说明。
上述重组菌株DALA的发酵培养基组分为：(NH4)2SO416g/L，KH2PO43g/L，Na2HPO4·12H2O 16g/L，MgSO4·7H2O 1g/L，MnSO4·7H2O 0.01g/L，酵母粉2g/L，100μg/mL氨苄青霉素，50μg/mL壮观霉素，IPTG 0.1mM，葡萄糖35g/L。
发酵结果如图4所示，重组大肠杆菌DALA的ALA的产量达到4.13g/L，葡萄糖的转化率达到了0.168g ALA/g葡萄糖。
Claims (10)
1.一株重组大肠杆菌，其特征在于，所述重组大肠杆菌名为重组大肠杆菌DALA，由如下方法制得：构建含hemAM和hemL基因的共表达载体p-hemAM-hemL，再构建含rhtA基因的表达载体p-rhtA，将所构建的重组质粒p-hemAM-hemL和p-rhtA共转化大肠杆菌中，得同时过量表达hemAM、hemL和rhtA基因的重组大肠杆菌DALA。
2.如权利要求1所述的重组大肠杆菌，其特征在于，所述hemAM是来源于大肠杆菌或沙门氏菌的hemA基因的突变体；所述hemL基因来源于大肠杆菌或沙门氏菌；所述rthA基因来源于大肠杆菌。
3.如权利要求2所述的重组大肠杆菌，其特征在于，所述hemAM是来源于亚利桑那沙门沙门氏菌的hemA基因的突变体；所述hemL基因来源于沙门氏菌。
4.如权利要求1所述的重组大肠杆菌，其特征在于，所述表达hemAM、hemL或rhtA基因的载体为pBluescript SK-、pUC19、pUC18、pCL1920或pTrc99A。
5.如权利要求4所述的重组大肠杆菌，其特征在于，所述表达hemAM和hemL基因的载体选pUC19；所述表达rhtA基因的载体选pCL1920。
6.如权利要求1所述的重组大肠杆菌，其特征在于，所述大肠杆菌选大肠杆菌MG1655、大肠杆菌DH5α、大肠杆菌JM109、大肠杆菌W3110或大肠杆菌XL1-Blue。
7.如权利要求6所述的重组大肠杆菌，其特征在于，所述大肠杆菌选大肠杆菌DH5α。
8.如权利要求1所述的重组大肠杆菌，其特征在于，所述重组大肠杆菌DALA为DH5α/pUC-hemAM-hemL+pCL1920-rhtA。
9.权利要求1所述重组大肠杆菌在生产5-氨基乙酰丙酸中的应用，其特征在于，所述应用是以所述重组大肠杆菌在改良的无机盐培养基中发酵葡萄糖来生产5-氨基乙酰丙酸；其中，所述改良无机盐培养基配方为：葡萄糖5-50g/L，(NH4)2SO410-30g/L，KH2PO41-8g/L，Na2HPO4·12H2O 10-30g/L，MgSO4·7H2O 0.1-1.5g/L，MnSO4·7H2O 0.001-0.1g/L，酵母粉0.5-3g/L，异丙基-β-D-硫代半乳糖苷(IPTG)0.05-1mM；所述发酵中培养基中添加浓度为50-100μg/mL的氨苄青霉素和浓度为30-50μg/mL的壮观霉素。
10.如权利要求9所述重组大肠杆菌在生产5-氨基乙酰丙酸中的应用，其特征在于，所述重组大肠杆菌在改良的无机盐培养基中发酵葡萄糖的发酵条件为：菌种接种量以体积百分比计为2％～5％，发酵温度为35℃～38℃，pH为6.0～7.0，溶氧控制在50％以上，发酵时间为36～60h。
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|---|
| 《Research in Microbiology》 20030331 Vitaliy A.Livshits et al. Identification and characterization of the new gene rhtA involved in threonine and homoserine efflux in Escherichia coli 123-135 1-10 第154卷, 第2期 * |
| 《农药》 20031130 赵春晖等 化学法与生物转化合成5-氨基乙酰丙酸的研究进展 11-15 1-10 第42卷, 第11期 * |
| 《现代化工》 20081031 傅维琦等 生物法合成5-氨基乙酰丙酸的研究进展 190-193 1-10 第28卷, * |
Cited By (20)
| Publication number | Priority date | Publication date | Assignee | Title |
|---|---|---|---|---|
| WO2012129748A1 (zh) * | 2011-03-31 | 2012-10-04 | 山东大学 | 一株重组大肠杆菌及其在生产5-氨基乙酰丙酸中的应用 |
| WO2014121724A1 (zh) * | 2013-02-07 | 2014-08-14 | 中国科学院天津工业生物技术研究所 | 5-氨基乙酰丙酸高产菌株及其制备方法和应用 |
| US10975400B2 (en) | 2013-02-07 | 2021-04-13 | Tianjin Institute Of Industrial Biotechnology, Chinese Academy Of Sciences | 5-aminolevulinic acid high-yield bacterial strain, preparation method and use thereof |
| CN104004701A (zh) * | 2014-06-18 | 2014-08-27 | 江南大学 | 一种构建高产5-氨基乙酰丙酸大肠杆菌工程菌株的方法 |
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