JP6499510B2 - 遺伝子組み換え酵母及びそれを用いた５−アミノレブリン酸の製造法 - Google Patents
遺伝子組み換え酵母及びそれを用いた５−アミノレブリン酸の製造法 Download PDFInfo
- Publication number
- JP6499510B2 JP6499510B2 JP2015094650A JP2015094650A JP6499510B2 JP 6499510 B2 JP6499510 B2 JP 6499510B2 JP 2015094650 A JP2015094650 A JP 2015094650A JP 2015094650 A JP2015094650 A JP 2015094650A JP 6499510 B2 JP6499510 B2 JP 6499510B2
- Authority
- JP
- Japan
- Prior art keywords
- gene
- yeast
- hem1
- promoter
- aminolevulinic acid
- Prior art date
- Legal status (The legal status is an assumption and is not a legal conclusion. Google has not performed a legal analysis and makes no representation as to the accuracy of the status listed.)
- Expired - Fee Related
Links
Landscapes
- Preparation Of Compounds By Using Micro-Organisms (AREA)
- Micro-Organisms Or Cultivation Processes Thereof (AREA)
Description
本発明は、５−アミノレブリン酸の生産性が向上した遺伝子組み換え酵母及び当該酵母を用いた５−アミノレブリン酸の製造法に関する。
５−アミノレブリン酸はヘムやクロロフィルといったポルフィリン誘導体の前駆体となるアミノ酸であり、動物、植物にとって生理的に重要な物質である。これまでに食品や肥料、化粧品において多数の製品が出されており、最近では、癌治療薬、脳腫瘍治療薬、さらには二価鉄との併用による糖尿病予防効果、抗マラリア薬への可能性が報告され、医療分野における開発も注目されている。
５−アミノレブリン酸の製造方法は、化学合成法、微生物を用いる方法が知られているが、化学合成法は収率が悪く、実用化は一部のみ成されている程度である。一方、微生物による製造法についての研究開発は多数なされており、近年では光合成細菌（特許文献１）やコリネバクテリウム（特許文献２）、大腸菌（非特許文献１）などによる製造方法が多数報告され、特に光合成細菌によるＡＬＡ製造方法については実用化が進んでいる。
Ｊ．Ｍｉｃｒｏｂｉｏｌ．Ｂｉｏｔｅｃｈｎｏｌ．１８，１１３６−１１４０
従来の微生物を用いた製造方法は、宿主となる微生物の生育条件に合わせてｐＨ６〜８といった中性条件で実施されている。しかし、５−アミノレブリン酸は酸性条件で安定である一方、中性付近では非常に分解しやすく、不可逆的に二量体（ピラジン）に変換されることが知られている。そのため、酸性条件下において５−アミノレブリン酸が製造可能な方法が求められている。
従って、本発明の課題は、酸性条件下でも生育が可能で、かつ５−アミノレブリン酸の効率のよい生産が可能な微生物、及び当該微生物を用いた５−アミノレブリン酸の製造法を提供することである。
従って、本発明の課題は、酸性条件下でも生育が可能で、かつ５−アミノレブリン酸の効率のよい生産が可能な微生物、及び当該微生物を用いた５−アミノレブリン酸の製造法を提供することである。
本発明者は、酸性条件下における増殖が可能な酵母に着目し検討を行なったが、これまで酵母による５−アミノレブリン酸の製造方法の報告例はなかった。また、酵母が５−アミノレブリン酸合成酵素遺伝子を有することは知られているが、本発明者がその酵母を培養しても５−アミノレブリン酸の産生は確認できなかった。そこで、さらに検討した結果、酵母中の５−アミノレブリン酸合成酵素遺伝子の発現を増強させれば、当該遺伝子組み換え酵母は５−アミノレブリン酸を生産する能力を有するようになることを見出した。さらに検討した結果、５−アミノレブリン酸合成酵素遺伝子に加えて、ミトコンドリア膜上のキャリアタンパク質のうち、特定の６遺伝子から選ばれる１種以上の遺伝子の発現も増強させれば、当該遺伝子組み換え酵母の５−アミノレブリン酸を生産する能力がさらに向上することを見出し、本発明を完成した。
すなわち、本発明は、次の〔１〕〜〔５〕を提供するものである。
〔１〕（ａ）５−アミノレブリン酸合成酵素をコードする遺伝子ＨＥＭ１、並びに（ｂ）ミトコンドリア膜上のキャリアタンパク質をコードする遺伝子であるＭＤＬ１、ＪＥＮ１、ＰＯＲ２、ＤＩＣ１、ＣＴＰ１及びＹＰＲ０１１Ｃから選ばれる１種以上の発現が増強された遺伝子組み換え酵母。
〔２〕酵母中で発現するプロモーターの下流に遺伝子（ａ）を有するベクターと酵母中で発現するプロモーターの下流に遺伝子（ｂ）を有するベクターで形質転換されたもの、あるいは酵母中で発現するプロモーターの下流に遺伝子（ａ）及び遺伝子（ｂ）を有するベクターで形質転換されたものである〔１〕記載の遺伝子組み換え酵母。
〔３〕酵母中で発現するプロモーターが、ＰＧＫプロモーターである〔２〕記載の遺伝子組み換え酵母。
〔４〕酵母が、Saccharomyces cerevisiaeである〔１〕〜〔３〕のいずれかに記載の遺伝子組み換え酵母。
〔５〕〔１〕〜〔４〕のいずれかに記載の遺伝子組み換え酵母を培養することを特徴とする５−アミノレブリン酸又はその塩の製造法。
〔２〕酵母中で発現するプロモーターの下流に遺伝子（ａ）を有するベクターと酵母中で発現するプロモーターの下流に遺伝子（ｂ）を有するベクターで形質転換されたもの、あるいは酵母中で発現するプロモーターの下流に遺伝子（ａ）及び遺伝子（ｂ）を有するベクターで形質転換されたものである〔１〕記載の遺伝子組み換え酵母。
〔３〕酵母中で発現するプロモーターが、ＰＧＫプロモーターである〔２〕記載の遺伝子組み換え酵母。
〔４〕酵母が、Saccharomyces cerevisiaeである〔１〕〜〔３〕のいずれかに記載の遺伝子組み換え酵母。
〔５〕〔１〕〜〔４〕のいずれかに記載の遺伝子組み換え酵母を培養することを特徴とする５−アミノレブリン酸又はその塩の製造法。
本発明の遺伝子組み換え酵母を用いれば、酸性条件下で、５−アミノレブリン酸又はその塩を安定して、かつ効率良く生産することができる。
本発明の遺伝子組み換え酵母の親株としては、サッカロマイセス属、キャンデダ属、ピキア属の酵母などを用いることができるが、サッカロマイセス属の酵母であるSaccharomyces cerevisiaeを用いることが好ましい。また、Saccharomyces cerevisiaeとしては、ＹＰＨ４９９株、ＢＹ４７４１株、ＢＹ４７４２株、Ｓ２８８Ｃ株等の入手可能な株を用いることができる。
本発明の遺伝子組み換え酵母では、
（ａ）５−アミノレブリン酸合成酵素をコードする遺伝子ＨＥＭ１、及び
（ｂ）ミトコンドリア膜上のキャリアタンパク質をコードする遺伝子であるＭＤＬ１、ＪＥＮ１、ＰＯＲ２、ＤＩＣ１、ＣＴＰ１及びＹＰＲ０１１Ｃから選ばれる１種以上の遺伝子の発現を増強することで、５−アミノレブリン酸の生産性を向上させている。
（ａ）５−アミノレブリン酸合成酵素をコードする遺伝子ＨＥＭ１、及び
（ｂ）ミトコンドリア膜上のキャリアタンパク質をコードする遺伝子であるＭＤＬ１、ＪＥＮ１、ＰＯＲ２、ＤＩＣ１、ＣＴＰ１及びＹＰＲ０１１Ｃから選ばれる１種以上の遺伝子の発現を増強することで、５−アミノレブリン酸の生産性を向上させている。
遺伝子（ａ）（ＨＥＭ１）は、アミノレブリン酸合成酵素遺伝子として知られており、酵母中にも存在することが知られている。しかし、ＨＥＭ１を有する酵母を培養しても、５−アミノレブリン酸の産生は確認できなかった。本発明では、後述の（ｂ）の遺伝子群と共に、この（ａ）ＨＥＭ１の発現を増強する必要がある。
（ｂ）の「ミトコンドリア膜上のキャリアタンパク質」とは、ミトコンドリア膜上に存在し、ミトコンドリア内外の物質の輸送にかかわるトランスポーターの役割を担うタンパク質である。具体的には、ＭＤＬ１遺伝子は、ペプチドのトランスポートにかかわるATP-binding cassette super familyに属するキャリアタンパク質Multi Drug resistance-like proteinをコードする遺伝子である。ＪＥＮ１遺伝子は、Monocarboxylate-proton transporterをコードする遺伝子である。ＰＯＲ２遺伝子は、Putative mitochondrial proteinをコードする遺伝子である。ＤＩＣ１遺伝子は、Dicarboxylate carrierをコードする遺伝子である。ＣＴＰ１遺伝子は、Citrate transport proteinをコードする遺伝子である。ＹＰＲ０１１Ｃ遺伝子は、APS/PAPS transporterをコードする遺伝子である。
（ｂ）の遺伝子群は、ミトコンドリアの内外の物質の輸送にかかわるタンパク質の遺伝子であり、酵母中に存在する。しかし、これらの遺伝子の発現が強化することで、ミトコンドリア膜上でのこれらキャリアタンパク質が増加し、これがミトコンドリア内で合成された５−アミノレブリン酸のミトコンドリア外への輸送を助けているものと考えられる。その結果、本発明にかかる遺伝子組み換え酵母では５−アミノレブリン酸の生産性が向上しているものと考えられる。本発明では、前述の（ａ）のＨＥＭ１の遺伝子と共に、この（ｂ）の遺伝子群の発現を増強する必要がある。
（ｂ）の遺伝子群は、ミトコンドリアの内外の物質の輸送にかかわるタンパク質の遺伝子であり、酵母中に存在する。しかし、これらの遺伝子の発現が強化することで、ミトコンドリア膜上でのこれらキャリアタンパク質が増加し、これがミトコンドリア内で合成された５−アミノレブリン酸のミトコンドリア外への輸送を助けているものと考えられる。その結果、本発明にかかる遺伝子組み換え酵母では５−アミノレブリン酸の生産性が向上しているものと考えられる。本発明では、前述の（ａ）のＨＥＭ１の遺伝子と共に、この（ｂ）の遺伝子群の発現を増強する必要がある。
前記の遺伝子（ａ）及び遺伝子（ｂ）は、公知であり、例えば、Saccharomyces cerevisiaeであれば、Saccharomyces cerevisiae Genome Databaseから得ることができる。また、当該公知のデータベースに基づいてＰＣＲ法などにより増幅することができる。
これらの遺伝子（ａ）及び遺伝子（ｂ）の発現を増強する手段としては、酵母中で発現するプロモーターの下流に遺伝子（ａ）及び／又は遺伝子（ｂ）を有するベクターで、酵母を形質転換すればよい。具体的には、酵母中で発現するプロモーターの下流に遺伝子（ａ）を有するベクターと、酵母中で発現するプロモーターの下流に遺伝子（ｂ）を有するベクターで酵母を形質転換する手段、酵母中で発現するプロモーターの下流に遺伝子（ａ）及び遺伝子（ｂ）を有するベクターで酵母を形質転換する手段が挙げられる。
このようなプロモーターとしては、例えば、ＰＧＫ１プロモーター、ＧＡＬ１プロモーター、ＧＡＬ１０プロモーター、ＰＨＯ５プロモーター、ＧＡＰプロモーター、ＡＤＨ１プロモーター、ＴＤＨ３プロモーター、ＴＥＦ１プロモーター、ＴＰＩ１プロモーター、ＰＹＫ１プロモーター、ＨＸＴ７プロモーターが挙げられる。その中でも、ＰＧＫ１プロモーターを用いることが好ましい。
前記のベクターとしては、プラスミドベクター、コスミドベクター、フォスミドベクター、ウイルスベクター、人工染色体ベクター等が挙げられるが、酵母中で発現するプロモーターを有するプラスミドベクターが知られていることから、プラスミドベクターが好ましい。
本発明の遺伝子組み換え酵母は、前記の遺伝子（ａ）及び（ｂ）のＤＮＡ断片を、前記のプロモーターとこれに対応するターミネーターの間にマルチクローニングサイトが導入されたプラスミドのマルチクローニングサイトに組み込み、これを用いて酵母を形質転換することで作製することができる。
形質転換手段としては、プロトプラスト法、金属処理（リチウム処理など）法等が用いられる。
形質転換手段としては、プロトプラスト法、金属処理（リチウム処理など）法等が用いられる。
本発明の遺伝子組み換え酵母の培養は、当業者に公知の一般的な方法から、それぞれの酵母に最適な培養条件を選択すればよい。例えば、培養温度としては、２５〜３７℃が好ましく、２７〜３３℃がより好ましく、３０℃にコントロールすることが特に好ましい。培地のｐＨとしては、ｐＨ２．５〜６．０が好ましく、ｐＨ２．５〜５．５がより好ましく、ｐＨ２．５〜４．０が特に好ましい。培地成分としては、窒素源としてのYeast nitrogen base w/o amino acidsと炭素源としてのグルコースを含有するＳＤ培地等、それぞれ適した培地を選択すればよい。
本発明の遺伝子組み換え酵母は、上記培養条件と同様の条件で培養することで、５−アミノレブリン酸を生産することができるが、その際にグリシンとレブリン酸を含有させることで生産性をより高めることができる。グリシンの含有量は３ｍＭ〜１００ｍＭであることが好ましく、４ｍＭ〜７ｍＭであることがより好ましい。また、レブリン酸の含有量は５ｍＭ〜１００ｍＭであることが好ましく、３０〜５０ｍＭ含有であることがより好ましい。
以下に本発明を実施例によって具体的に説明するが、本発明はこれら実施例によって限定されるものではない。
（製造例１）ＨＥＭ１遺伝子の発現を増強した酵母「ＹＰＨ４９９／ｐＧＫ４０５−ＨＥＭ１」の作製
Saccharomyces cerevisiaeの５−アミノレブリン酸合成酵素の遺伝子ＨＥＭ１のＤＮＡ断片を得るために、Saccharomyces cerevisiae Genome Databaseに登録されている遺伝子配列を参考にして、ＰＣＲのプライマーとして下記配列を設計した。
5′-GGCCgctagcATGCAACGCTCCATTTTTGC-3′ （配列番号１）
5′-GGCCggatccTTACTGCTTGATACCACTAGAAAC-3′ （配列番号２）
上記プライマーを用いて、Saccharomyces cerevisiae ＹＰＨ４９９株（ｌｅｕ２、ｕｒａ３）のゲノムＤＮＡをテンプレートとし、ＰＣＲ増幅を行い、その増幅物をＮｈｅＩおよびＢａｍＨＩで消化して、ＨＥＭ１遺伝子のＮｈｅＩ−ＢａｍＨＩ断片を得た。
この断片をＪ．Ｂｉｏｃｈｅｍ．（２００９）１４５：７０１−７０８に記載のｐＧＫ４０５のＰＧＫ１プロモーター（ＰＧＫ３’）とＰＧＫ１ターミネーター（ＰＧＫ５’）の間のＮｈｅＩ−ＢａｍＨＩ消化部位に連結し、ＨＥＭ１発現プラスミドｐＧＫ４０５−ＨＥＭ１を得た。
得られたプラスミドｐＧＫ４０５−ＨＥＭ１は、マーカー合成酵素遺伝子ＬＥＵ２中の制限酵素ＥｃｏＲＶで消化した後に、Saccharomyces cerevisiae ＹＰＨ４９９株を宿主酵母株とし、Ito H, Fukuda Y, Murata K, Kimura A (1983)Transformation of intact yeast cells treated with alkali cations. J Bacteriol 153:163-168に記載の方法で形質転換を行い、ＨＥＭ１の発現がＰＧＫ１プロモーターで強化された形質転換体「ＹＰＨ４９９／ｐＧＫ４０５−ＨＥＭ１」を得た。
Saccharomyces cerevisiaeの５−アミノレブリン酸合成酵素の遺伝子ＨＥＭ１のＤＮＡ断片を得るために、Saccharomyces cerevisiae Genome Databaseに登録されている遺伝子配列を参考にして、ＰＣＲのプライマーとして下記配列を設計した。
5′-GGCCgctagcATGCAACGCTCCATTTTTGC-3′ （配列番号１）
5′-GGCCggatccTTACTGCTTGATACCACTAGAAAC-3′ （配列番号２）
上記プライマーを用いて、Saccharomyces cerevisiae ＹＰＨ４９９株（ｌｅｕ２、ｕｒａ３）のゲノムＤＮＡをテンプレートとし、ＰＣＲ増幅を行い、その増幅物をＮｈｅＩおよびＢａｍＨＩで消化して、ＨＥＭ１遺伝子のＮｈｅＩ−ＢａｍＨＩ断片を得た。
この断片をＪ．Ｂｉｏｃｈｅｍ．（２００９）１４５：７０１−７０８に記載のｐＧＫ４０５のＰＧＫ１プロモーター（ＰＧＫ３’）とＰＧＫ１ターミネーター（ＰＧＫ５’）の間のＮｈｅＩ−ＢａｍＨＩ消化部位に連結し、ＨＥＭ１発現プラスミドｐＧＫ４０５−ＨＥＭ１を得た。
得られたプラスミドｐＧＫ４０５−ＨＥＭ１は、マーカー合成酵素遺伝子ＬＥＵ２中の制限酵素ＥｃｏＲＶで消化した後に、Saccharomyces cerevisiae ＹＰＨ４９９株を宿主酵母株とし、Ito H, Fukuda Y, Murata K, Kimura A (1983)Transformation of intact yeast cells treated with alkali cations. J Bacteriol 153:163-168に記載の方法で形質転換を行い、ＨＥＭ１の発現がＰＧＫ１プロモーターで強化された形質転換体「ＹＰＨ４９９／ｐＧＫ４０５−ＨＥＭ１」を得た。
（製造例２）ＨＥＭ１遺伝子の発現を増強し、さらにＭＤＬ１遺伝子を増強した酵母「ＹＰＨ４９９／ｐＧＫ４０５−ＨＥＭ１／ｐＧＫ４０６−ＭＤＬ１」の作製
Saccharomyces cerevisiaeのミトコンドリアキャリアーのＭＤＬ１遺伝子のＤＮＡ断片を得るために、Saccharomyces cerevisiae Genome Databaseに登録されている遺伝子配列を参考にして、ＰＣＲのプライマーとして下記配列を設計した。
5′-GGCCgctagcATGATTGTAAGAATGATACGTCTTTG-3′（配列番号３）
5′-GGCCgtcgacTTATACTTCCCGGGCAACACTATTGTCC-3′(配列番号４)
上記プライマーを用いて、Saccharomyces cerevisiae ＹＰＨ４９９株のゲノムＤＮＡをテンプレートとし、ＰＣＲ増幅を行い、その増幅物をＮｈｅＩおよびＳａｌＩで消化して、ＭＤＬ１遺伝子のＮｈｅＩ−ＳａｌＩ断片を得た。
この断片を非特許文献（Ｊ．Ｂｉｏｃｈｅｍ．（２００９）１４５：７０１−７０８）に記載のｐＧＫ４０６のＰＧＫ１プロモーター（ＰＧＫ３’）とＰＧＫ１ターミネーター（ ＰＧＫ５’）の間のＮｈｅＩ−ＳａｌＩ消化部位に連結し、ＭＤＬ１発現プラスミドｐＧＫ４０６−ＭＤＬ１を得た。
得られたプラスミドｐＧＫ４０６−ＭＤＬ１をマーカー合成酵素遺伝子ＵＲＡ３中の制限酵素ＮｃｏＩで消化した後、製造例１で得られたSaccharomyces cerevisiae ＹＰＨ４９９／ｐＧＫ４０５−ＨＥＭ１を宿主酵母株とし、製造例１と同様に形質転換を行い、ＭＤＬ１とＨＥＭ１の発現がＰＧＫ１プロモーターで強化された形質転換体「ＹＰＨ４９９／ｐＧＫ４０５−ＨＥＭ１／ｐＧＫ４０６−ＭＤＬ１」を得た。
Saccharomyces cerevisiaeのミトコンドリアキャリアーのＭＤＬ１遺伝子のＤＮＡ断片を得るために、Saccharomyces cerevisiae Genome Databaseに登録されている遺伝子配列を参考にして、ＰＣＲのプライマーとして下記配列を設計した。
5′-GGCCgctagcATGATTGTAAGAATGATACGTCTTTG-3′（配列番号３）
5′-GGCCgtcgacTTATACTTCCCGGGCAACACTATTGTCC-3′(配列番号４)
上記プライマーを用いて、Saccharomyces cerevisiae ＹＰＨ４９９株のゲノムＤＮＡをテンプレートとし、ＰＣＲ増幅を行い、その増幅物をＮｈｅＩおよびＳａｌＩで消化して、ＭＤＬ１遺伝子のＮｈｅＩ−ＳａｌＩ断片を得た。
この断片を非特許文献（Ｊ．Ｂｉｏｃｈｅｍ．（２００９）１４５：７０１−７０８）に記載のｐＧＫ４０６のＰＧＫ１プロモーター（ＰＧＫ３’）とＰＧＫ１ターミネーター（ ＰＧＫ５’）の間のＮｈｅＩ−ＳａｌＩ消化部位に連結し、ＭＤＬ１発現プラスミドｐＧＫ４０６−ＭＤＬ１を得た。
得られたプラスミドｐＧＫ４０６−ＭＤＬ１をマーカー合成酵素遺伝子ＵＲＡ３中の制限酵素ＮｃｏＩで消化した後、製造例１で得られたSaccharomyces cerevisiae ＹＰＨ４９９／ｐＧＫ４０５−ＨＥＭ１を宿主酵母株とし、製造例１と同様に形質転換を行い、ＭＤＬ１とＨＥＭ１の発現がＰＧＫ１プロモーターで強化された形質転換体「ＹＰＨ４９９／ｐＧＫ４０５−ＨＥＭ１／ｐＧＫ４０６−ＭＤＬ１」を得た。
（製造例３）ＨＥＭ１遺伝子の発現を増強し、さらにＪＥＮ１遺伝子の発現を増強した酵母「ＹＰＨ４９９／ｐＧＫ４０５−ＨＥＭ１／ｐＧＫ４０６−ＪＥＮ１」の作製
Saccharomyces cerevisiaeのミトコンドリアキャリアーのＪＥＮ１遺伝子のＤＮＡ断片を得るために、Saccharomyces cerevisiae Genome Databaseに登録されている遺伝子配列を参考にして、ＰＣＲのプライマーとして下記配列を設計した。
5′-GGCCgctagcATGTCGTCGTCAATTACAGATGAG-3′ （配列番号５）
5′-GGCCggatccTTAAACGGTCTCAATATGCTCCTC-3′ （配列番号６）
上記プライマーを用いて、Saccharomyces cerevisiae ＹＰＨ４９９株のゲノムＤＮＡをテンプレートとし、ＰＣＲ増幅を行い、その増幅物をＮｈｅＩおよびＢａｍＨＩで消化して、ＪＥＮ１遺伝子のＮｈｅＩ−ＢａｍＨＩ断片を得た。
この断片を非特許文献（Ｊ．Ｂｉｏｃｈｅｍ．（２００９）１４５：７０１−７０８）に記載のｐＧＫ４０６のＰＧＫ１プロモーター（ＰＧＫ３’）とＰＧＫ１ターミネーター（ＰＧＫ５’）の間のＮｈｅＩ−ＢａｍＨＩ消化部位に連結し、ＪＥＮ１発現プラスミドｐＧＫ４０６−ＪＥＮ１を得た。
得られたプラスミドｐＧＫ４０６−ＪＥＮ１をマーカー合成酵素遺伝子ＵＲＡ３中の制限酵素ＥｃｏＲＶで消化した後、製造例１で得られたSaccharomyces cerevisiae ＹＰＨ４９９／ｐＧＫ４０５−ＨＥＭ１を宿主酵母株とし、製造例１と同様に形質転換を行い、ＪＥＮ１とＨＥＭ１の発現がＰＧＫ１プロモーターで強化された形質転換体「ＹＰＨ４９９／ｐＧＫ４０５−ＨＥＭ１／ｐＧＫ４０６−ＪＥＮ１」を得た。
Saccharomyces cerevisiaeのミトコンドリアキャリアーのＪＥＮ１遺伝子のＤＮＡ断片を得るために、Saccharomyces cerevisiae Genome Databaseに登録されている遺伝子配列を参考にして、ＰＣＲのプライマーとして下記配列を設計した。
5′-GGCCgctagcATGTCGTCGTCAATTACAGATGAG-3′ （配列番号５）
5′-GGCCggatccTTAAACGGTCTCAATATGCTCCTC-3′ （配列番号６）
上記プライマーを用いて、Saccharomyces cerevisiae ＹＰＨ４９９株のゲノムＤＮＡをテンプレートとし、ＰＣＲ増幅を行い、その増幅物をＮｈｅＩおよびＢａｍＨＩで消化して、ＪＥＮ１遺伝子のＮｈｅＩ−ＢａｍＨＩ断片を得た。
この断片を非特許文献（Ｊ．Ｂｉｏｃｈｅｍ．（２００９）１４５：７０１−７０８）に記載のｐＧＫ４０６のＰＧＫ１プロモーター（ＰＧＫ３’）とＰＧＫ１ターミネーター（ＰＧＫ５’）の間のＮｈｅＩ−ＢａｍＨＩ消化部位に連結し、ＪＥＮ１発現プラスミドｐＧＫ４０６−ＪＥＮ１を得た。
得られたプラスミドｐＧＫ４０６−ＪＥＮ１をマーカー合成酵素遺伝子ＵＲＡ３中の制限酵素ＥｃｏＲＶで消化した後、製造例１で得られたSaccharomyces cerevisiae ＹＰＨ４９９／ｐＧＫ４０５−ＨＥＭ１を宿主酵母株とし、製造例１と同様に形質転換を行い、ＪＥＮ１とＨＥＭ１の発現がＰＧＫ１プロモーターで強化された形質転換体「ＹＰＨ４９９／ｐＧＫ４０５−ＨＥＭ１／ｐＧＫ４０６−ＪＥＮ１」を得た。
（製造例４）ＨＥＭ１遺伝子の発現を増強し、さらにＰＯＲ２遺伝子の発現を増強した酵母「ＹＰＨ４９９／ｐＧＫ４０５−ＨＥＭ１／ｐＧＫ４０６−ＰＯＲ２」の作製
Saccharomyces cerevisiaeのミトコンドリアキャリアーのＰＯＲ２遺伝子のＤＮＡ断片を得るために、Saccharomyces cerevisiae Genome Databaseに登録されている遺伝子配列を参考にして、ＰＣＲのプライマーとして下記配列を設計した。
5′-GGCCgctagcATGGCACTACGATTTTTCAACG-3′（配列番号７）
5′-GGCCggatccTCAGGGCGAGAACGATAGAGAG-3′(配列番号８)
上記プライマーを用いて、Saccharomyces cerevisiae ＹＰＨ４９９株のゲノムＤＮＡをテンプレートとし、ＰＣＲ増幅を行い、その増幅物をＮｈｅＩおよびＢａｍＨＩで消化して、ＰＯＲ２遺伝子のＮｈｅＩ−ＢａｍＨＩ断片を得た。
この断片を非特許文献（Ｊ．Ｂｉｏｃｈｅｍ．（２００９）１４５：７０１−７０８）に記載のｐＧＫ４０６のＰＧＫ１プロモーター（ＰＧＫ３’）とＰＧＫ１ターミネーター（ＰＧＫ５’）の間のＮｈｅＩ−ＢａｍＨＩ消化部位に連結し、ＰＯＲ２発現プラスミドｐＧＫ４０６−ＰＯＲ２を得た。
得られたプラスミドｐＧＫ４０６−ＰＯＲ２をマーカー合成酵素遺伝子ＵＲＡ３中の制限酵素ＥｃｏＲＶで消化した後、製造例１で得られたSaccharomyces cerevisiae ＹＰＨ４９９／ｐＧＫ４０５−ＨＥＭ１を宿主酵母株とし、製造例１と同様に形質転換を行い、ＰＯＲ２とＨＥＭ１の発現がＰＧＫ１プロモーターで強化された形質転換体「ＹＰＨ４９９／ｐＧＫ４０５−ＨＥＭ１／ｐＧＫ４０６−ＰＯＲ２」を得た。
Saccharomyces cerevisiaeのミトコンドリアキャリアーのＰＯＲ２遺伝子のＤＮＡ断片を得るために、Saccharomyces cerevisiae Genome Databaseに登録されている遺伝子配列を参考にして、ＰＣＲのプライマーとして下記配列を設計した。
5′-GGCCgctagcATGGCACTACGATTTTTCAACG-3′（配列番号７）
5′-GGCCggatccTCAGGGCGAGAACGATAGAGAG-3′(配列番号８)
上記プライマーを用いて、Saccharomyces cerevisiae ＹＰＨ４９９株のゲノムＤＮＡをテンプレートとし、ＰＣＲ増幅を行い、その増幅物をＮｈｅＩおよびＢａｍＨＩで消化して、ＰＯＲ２遺伝子のＮｈｅＩ−ＢａｍＨＩ断片を得た。
この断片を非特許文献（Ｊ．Ｂｉｏｃｈｅｍ．（２００９）１４５：７０１−７０８）に記載のｐＧＫ４０６のＰＧＫ１プロモーター（ＰＧＫ３’）とＰＧＫ１ターミネーター（ＰＧＫ５’）の間のＮｈｅＩ−ＢａｍＨＩ消化部位に連結し、ＰＯＲ２発現プラスミドｐＧＫ４０６−ＰＯＲ２を得た。
得られたプラスミドｐＧＫ４０６−ＰＯＲ２をマーカー合成酵素遺伝子ＵＲＡ３中の制限酵素ＥｃｏＲＶで消化した後、製造例１で得られたSaccharomyces cerevisiae ＹＰＨ４９９／ｐＧＫ４０５−ＨＥＭ１を宿主酵母株とし、製造例１と同様に形質転換を行い、ＰＯＲ２とＨＥＭ１の発現がＰＧＫ１プロモーターで強化された形質転換体「ＹＰＨ４９９／ｐＧＫ４０５−ＨＥＭ１／ｐＧＫ４０６−ＰＯＲ２」を得た。
（製造例５）ＨＥＭ１遺伝子の発現を増強し、さらにＤＩＣ１遺伝子の発現を増強した酵母「ＹＰＨ４９９／ｐＧＫ４０５−ＨＥＭ１／ｐＧＫ４０６−ＤＩＣ１」の作製
Saccharomyces cerevisiaeのミトコンドリアキャリアーのＤＩＣ１遺伝子のＤＮＡ断片を得るために、Saccharomyces cerevisiae Genome Databaseに登録されている遺伝子配列を参考にして、ＰＣＲのプライマーとして下記配列を設計した。
5′-GGCCgctagcATGTCAACCAACGCAAAAGAGTC-3′（配列番号９）
5′-GGCCggatccCTACTTGTCTTCCTTTGGCATG-3′(配列番号１０)
上記プライマーを用いて、Saccharomyces cerevisiae ＹＰＨ４９９株のゲノムＤＮＡをテンプレートとし、ＰＣＲ増幅を行い、その増幅物をＮｈｅＩおよびＢａｍＨＩで消化して、ＤＩＣ１遺伝子のＮｈｅＩ−ＢａｍＨＩ断片を得た。
この断片を非特許文献（Ｊ．Ｂｉｏｃｈｅｍ．（２００９）１４５：７０１−７０８）に記載のｐＧＫ４０６のＰＧＫ１プロモーター（ＰＧＫ３’）とＰＧＫ１ターミネーター（ＰＧＫ５’）の間のＮｈｅＩ−ＢａｍＨＩ消化部位に連結し、ＤＩＣ１発現プラスミドｐＧＫ４０６−ＤＩＣ１を得た。
得られたプラスミドｐＧＫ４０６−ＤＩＣ１をマーカー合成酵素遺伝子ＵＲＡ３中の制限酵素ＥｃｏＲＶで消化した後、製造例１で得られたSaccharomyces cerevisiae ＹＰＨ４９９／ｐＧＫ４０５−ＨＥＭ１を宿主酵母株とし、製造例１と同様に形質転換を行い、ＤＩＣ１とＨＥＭ１の発現がＰＧＫ１プロモーターで強化された形質転換体「ＹＰＨ４９９／ｐＧＫ４０５−ＨＥＭ１／ｐＧＫ４０６−ＤＩＣ１」を得た。
Saccharomyces cerevisiaeのミトコンドリアキャリアーのＤＩＣ１遺伝子のＤＮＡ断片を得るために、Saccharomyces cerevisiae Genome Databaseに登録されている遺伝子配列を参考にして、ＰＣＲのプライマーとして下記配列を設計した。
5′-GGCCgctagcATGTCAACCAACGCAAAAGAGTC-3′（配列番号９）
5′-GGCCggatccCTACTTGTCTTCCTTTGGCATG-3′(配列番号１０)
上記プライマーを用いて、Saccharomyces cerevisiae ＹＰＨ４９９株のゲノムＤＮＡをテンプレートとし、ＰＣＲ増幅を行い、その増幅物をＮｈｅＩおよびＢａｍＨＩで消化して、ＤＩＣ１遺伝子のＮｈｅＩ−ＢａｍＨＩ断片を得た。
この断片を非特許文献（Ｊ．Ｂｉｏｃｈｅｍ．（２００９）１４５：７０１−７０８）に記載のｐＧＫ４０６のＰＧＫ１プロモーター（ＰＧＫ３’）とＰＧＫ１ターミネーター（ＰＧＫ５’）の間のＮｈｅＩ−ＢａｍＨＩ消化部位に連結し、ＤＩＣ１発現プラスミドｐＧＫ４０６−ＤＩＣ１を得た。
得られたプラスミドｐＧＫ４０６−ＤＩＣ１をマーカー合成酵素遺伝子ＵＲＡ３中の制限酵素ＥｃｏＲＶで消化した後、製造例１で得られたSaccharomyces cerevisiae ＹＰＨ４９９／ｐＧＫ４０５−ＨＥＭ１を宿主酵母株とし、製造例１と同様に形質転換を行い、ＤＩＣ１とＨＥＭ１の発現がＰＧＫ１プロモーターで強化された形質転換体「ＹＰＨ４９９／ｐＧＫ４０５−ＨＥＭ１／ｐＧＫ４０６−ＤＩＣ１」を得た。
（製造例６）ＨＥＭ１遺伝子の発現を増強し、さらにＣＴＰ１遺伝子の発現を増強した酵母「ＹＰＨ４９９／ｐＧＫ４０５−ＨＥＭ１／ｐＧＫ４０６−ＣＴＰ１」の作製
Saccharomyces cerevisiaeのミトコンドリアキャリアーのＣＴＰ１遺伝子のＤＮＡ断片を得るために、Saccharomyces cerevisiae Genome Databaseに登録されている遺伝子配列を参考にして、ＰＣＲのプライマーとして下記配列を設計した。
5′-GGCCgtcgacAAGCTACCAAAAGTGACGTAGATCC-3′（配列番号１１）
5′-GGCCggatccCAGGCTAGCATAACTAAGACCTTTC-3′（配列番号１２)
上記プライマーを用いて、Saccharomyces cerevisiae ＹＰＨ４９９株のゲノムＤＮＡをテンプレートとし、ＰＣＲ増幅を行い、その増幅物をＮｈｅＩおよびＢａｍＨＩで消化して、ＣＴＰ１遺伝子のＮｈｅＩ−ＢａｍＨＩ断片を得た。
この断片を非特許文献（Ｊ．Ｂｉｏｃｈｅｍ．（２００９）１４５：７０１−７０８）に記載のｐＧＫ４０６のＰＧＫ１プロモーター（ＰＧＫ３’）とＰＧＫ１ターミネーター（ＰＧＫ５’）の間のＮｈｅＩ−ＢａｍＨＩ消化部位に連結し、ＣＴＰ１発現プラスミドｐＧＫ４０６−ＣＴＰ１を得た。
得られたプラスミドｐＧＫ４０６−ＣＴＰ１をマーカー合成酵素遺伝子ＵＲＡ３中の制限酵素ＥｃｏＲＶで消化した後、製造例１で得られたSaccharomyces cerevisiae ＹＰＨ４９９／ｐＧＫ４０５−ＨＥＭ１を宿主酵母株とし、製造例１と同様に形質転換を行い、ＣＴＰ１とＨＥＭ１の発現がＰＧＫ１プロモーターで強化された形質転換体「ＹＰＨ４９９／ｐＧＫ４０５−ＨＥＭ１／ｐＧＫ４０６−ＣＴＰ１」を得た。
Saccharomyces cerevisiaeのミトコンドリアキャリアーのＣＴＰ１遺伝子のＤＮＡ断片を得るために、Saccharomyces cerevisiae Genome Databaseに登録されている遺伝子配列を参考にして、ＰＣＲのプライマーとして下記配列を設計した。
5′-GGCCgtcgacAAGCTACCAAAAGTGACGTAGATCC-3′（配列番号１１）
5′-GGCCggatccCAGGCTAGCATAACTAAGACCTTTC-3′（配列番号１２)
上記プライマーを用いて、Saccharomyces cerevisiae ＹＰＨ４９９株のゲノムＤＮＡをテンプレートとし、ＰＣＲ増幅を行い、その増幅物をＮｈｅＩおよびＢａｍＨＩで消化して、ＣＴＰ１遺伝子のＮｈｅＩ−ＢａｍＨＩ断片を得た。
この断片を非特許文献（Ｊ．Ｂｉｏｃｈｅｍ．（２００９）１４５：７０１−７０８）に記載のｐＧＫ４０６のＰＧＫ１プロモーター（ＰＧＫ３’）とＰＧＫ１ターミネーター（ＰＧＫ５’）の間のＮｈｅＩ−ＢａｍＨＩ消化部位に連結し、ＣＴＰ１発現プラスミドｐＧＫ４０６−ＣＴＰ１を得た。
得られたプラスミドｐＧＫ４０６−ＣＴＰ１をマーカー合成酵素遺伝子ＵＲＡ３中の制限酵素ＥｃｏＲＶで消化した後、製造例１で得られたSaccharomyces cerevisiae ＹＰＨ４９９／ｐＧＫ４０５−ＨＥＭ１を宿主酵母株とし、製造例１と同様に形質転換を行い、ＣＴＰ１とＨＥＭ１の発現がＰＧＫ１プロモーターで強化された形質転換体「ＹＰＨ４９９／ｐＧＫ４０５−ＨＥＭ１／ｐＧＫ４０６−ＣＴＰ１」を得た。
（製造例７）ＨＥＭ１遺伝子の発現を増強し、さらにＹＰＲ０１１Ｃ遺伝子の発現を増強した酵母「ＹＰＨ４９９／ｐＧＫ４０５−ＨＥＭ１／ｐＧＫ４０６−ＹＰＲ０１１Ｃ」の作製
Saccharomyces cerevisiaeのミトコンドリアキャリアーのＹＰＲ０１１Ｃ遺伝子のＤＮＡ断片を得るために、Saccharomyces cerevisiae Genome Databaseに登録されている遺伝子配列を参考にして、ＰＣＲのプライマーとして下記配列を設計した。
5′-GGCCgctagcATGGCAGAAGTACTGACCGTCC-3′（配列番号１３）
5′-GGCCggatccTCACCAATTTCTTACAGAATCAC-3′ (配列番号１４)
上記プライマーを用いて、Saccharomyces cerevisiae ＹＰＨ４９９株のゲノムＤＮＡをテンプレートとし、ＰＣＲ増幅を行い、その増幅物をＳａｌＩおよびＢａｍＨＩで消化して、ＹＰＲ０１１Ｃ遺伝子のＳａｌＩ−ＢａｍＨＩ断片を得た。
この断片を非特許文献（Ｊ．Ｂｉｏｃｈｅｍ．（２００９）１４５：７０１−７０８）に記載のｐＧＫ４０６のＰＧＫ１プロモーター（ＰＧＫ３’）とＰＧＫ１ターミネーター（ＰＧＫ５’）の間のＳａｌＩ−ＢａｍＨＩ消化部位に連結し、ＹＰＲ０１１Ｃ発現プラスミドｐＧＫ４０６−ＹＰＲ０１１Ｃを得た。
得られたプラスミドｐＧＫ４０６−ＹＰＲ０１１Ｃをマーカー合成酵素遺伝子ＵＲＡ３中の制限酵素ＥｃｏＲＶで消化した後、製造例１で得られたSaccharomyces cerevisiae ＹＰＨ４９９／ＨＥＭ１株を宿主酵母株とし、製造例１と同様に形質転換を行い、ＰＧＫ１プロモーターによりＹＰＲ０１１とＨＥＭ１の発現が強化された形質転換体「ＹＰＨ４９９／ｐＧＫ４０５−ＨＥＭ１／ｐＧＫ４０６−ＹＰＲ０１１Ｃ」を得た。
Saccharomyces cerevisiaeのミトコンドリアキャリアーのＹＰＲ０１１Ｃ遺伝子のＤＮＡ断片を得るために、Saccharomyces cerevisiae Genome Databaseに登録されている遺伝子配列を参考にして、ＰＣＲのプライマーとして下記配列を設計した。
5′-GGCCgctagcATGGCAGAAGTACTGACCGTCC-3′（配列番号１３）
5′-GGCCggatccTCACCAATTTCTTACAGAATCAC-3′ (配列番号１４)
上記プライマーを用いて、Saccharomyces cerevisiae ＹＰＨ４９９株のゲノムＤＮＡをテンプレートとし、ＰＣＲ増幅を行い、その増幅物をＳａｌＩおよびＢａｍＨＩで消化して、ＹＰＲ０１１Ｃ遺伝子のＳａｌＩ−ＢａｍＨＩ断片を得た。
この断片を非特許文献（Ｊ．Ｂｉｏｃｈｅｍ．（２００９）１４５：７０１−７０８）に記載のｐＧＫ４０６のＰＧＫ１プロモーター（ＰＧＫ３’）とＰＧＫ１ターミネーター（ＰＧＫ５’）の間のＳａｌＩ−ＢａｍＨＩ消化部位に連結し、ＹＰＲ０１１Ｃ発現プラスミドｐＧＫ４０６−ＹＰＲ０１１Ｃを得た。
得られたプラスミドｐＧＫ４０６−ＹＰＲ０１１Ｃをマーカー合成酵素遺伝子ＵＲＡ３中の制限酵素ＥｃｏＲＶで消化した後、製造例１で得られたSaccharomyces cerevisiae ＹＰＨ４９９／ＨＥＭ１株を宿主酵母株とし、製造例１と同様に形質転換を行い、ＰＧＫ１プロモーターによりＹＰＲ０１１とＨＥＭ１の発現が強化された形質転換体「ＹＰＨ４９９／ｐＧＫ４０５−ＨＥＭ１／ｐＧＫ４０６−ＹＰＲ０１１Ｃ」を得た。
（製造例８）ＨＥＭ１遺伝子の発現を増強した酵母に、さらにｐＧＫ４０６のみを組み込んだ「ＹＰＨ４９９／ｐＧＫ４０５−ＨＥＭ１／ｐＧＫ４０６」の作製
製造例２〜８の比較製造例として、製造例２〜８でミトコンドリアキャリアーの遺伝子を含まないプラスミドｐＧＫ４０６そのものを制限酵素ＥｃｏＲＶで消化した後、製造例１で得られたSaccharomyces cerevisiae ＹＰＨ４９９／ｐＧＫ４０５−ＨＥＭ１を宿主酵母株とし、製造例１と同様にｐＧＫ４０６を組み込んだ形質転換体「ＹＰＨ４９９／ｐＧＫ４０５−ＨＥＭ１／ｐＧＫ４０６」を得た。
製造例２〜８の比較製造例として、製造例２〜８でミトコンドリアキャリアーの遺伝子を含まないプラスミドｐＧＫ４０６そのものを制限酵素ＥｃｏＲＶで消化した後、製造例１で得られたSaccharomyces cerevisiae ＹＰＨ４９９／ｐＧＫ４０５−ＨＥＭ１を宿主酵母株とし、製造例１と同様にｐＧＫ４０６を組み込んだ形質転換体「ＹＰＨ４９９／ｐＧＫ４０５−ＨＥＭ１／ｐＧＫ４０６」を得た。
（参考例１）ＨＥＭ１遺伝子の発現を強化した場合の５−アミノレブリン酸への生産
製造例８で取得した、ＨＥＭ１遺伝子の発現を増強した酵母ＹＰＨ４９９／ｐＧＫ４０５−ＨＥＭ１／ｐＧＫ４０６をＳＤ培地（６．７ｇ／Ｌ Ｙｅａｓｔ ｎｉｔｒｏｇｅｎ ｂａｓｅ ｗ／ｏ ａｍｉｎｏ ａｃｉｄｓ（Ｄｉｆｃｏ ｌａｂｏｒａｔｏｒｉｅｓ製）、２０ｇ／Ｌグルコース）５ｍｌで３０℃、攪拌２００ｒｐｍの条件で２４時間振盪することにより種母培養を行った。このようにして得られた培養液を、ＳＤ培地５０ｍｌを含む坂口フラスコへ、ＯＤ６００＝０．１５となるよう植菌し、３０℃、攪拌１２０ｒｐｍの条件で２４時間培養を行った。なお、培養終了時点での最終的なｐＨは参考例１、２、実施例１の全てでｐＨ２．７〜３．０であった。
また、比較のため、上記ＹＰＨ４９９／ｐＧＫ４０５−ＨＥＭ１／ｐＧＫ４０６に代えて、親株のSaccharomyces cerevisiae ＹＰＨ４９９株を使用して、上記と同様の方法で培養を行った。
これらの２４時間培養後の培養液について、培養液中の乾燥細胞濃度と、培養上清中の５−アミノレブリン酸濃度を、それぞれ下記方法により測定した。測定結果を（表１）に示す。
製造例８で取得した、ＨＥＭ１遺伝子の発現を増強した酵母ＹＰＨ４９９／ｐＧＫ４０５−ＨＥＭ１／ｐＧＫ４０６をＳＤ培地（６．７ｇ／Ｌ Ｙｅａｓｔ ｎｉｔｒｏｇｅｎ ｂａｓｅ ｗ／ｏ ａｍｉｎｏ ａｃｉｄｓ（Ｄｉｆｃｏ ｌａｂｏｒａｔｏｒｉｅｓ製）、２０ｇ／Ｌグルコース）５ｍｌで３０℃、攪拌２００ｒｐｍの条件で２４時間振盪することにより種母培養を行った。このようにして得られた培養液を、ＳＤ培地５０ｍｌを含む坂口フラスコへ、ＯＤ６００＝０．１５となるよう植菌し、３０℃、攪拌１２０ｒｐｍの条件で２４時間培養を行った。なお、培養終了時点での最終的なｐＨは参考例１、２、実施例１の全てでｐＨ２．７〜３．０であった。
また、比較のため、上記ＹＰＨ４９９／ｐＧＫ４０５−ＨＥＭ１／ｐＧＫ４０６に代えて、親株のSaccharomyces cerevisiae ＹＰＨ４９９株を使用して、上記と同様の方法で培養を行った。
これらの２４時間培養後の培養液について、培養液中の乾燥細胞濃度と、培養上清中の５−アミノレブリン酸濃度を、それぞれ下記方法により測定した。測定結果を（表１）に示す。
＜乾燥細胞濃度の測定＞
培養液の６００ｎｍの吸光度を測定し、換算係数０．３を乗ずることで、培養液当たりの乾燥細胞濃度を算出した。
培養液の６００ｎｍの吸光度を測定し、換算係数０．３を乗ずることで、培養液当たりの乾燥細胞濃度を算出した。
＜５−アミノレブリン酸濃度の測定＞
５−アミノレブリン酸は、下記方法で測定用のサンプルを調製し、Okayamaらの方法（ＣＬＩＮ．ＣＨＥＭ．、３６／８、１４９４−１４９７（１９９０））に従い、高速液体クロマトグラフィーにより下記条件で分析した。
測定サンプルの調製：
サンプルの調製は、培養液を１ｍＬ回収し、４℃、３０００×ｇにて、１０分間遠心分離を行い、培養液上清を得、これを水で１０倍希釈した。この水で１０倍に希釈した培養液上清に対し、７０倍量の試薬Ａ（１５％（ｖ／ｖ）アセチルアセトン、１０％（ｖ／ｖ）エタノール、４ｇ／Ｌ塩化ナトリウム水溶液）および１０倍量の試薬Ｂ（９％（ｖ／ｖ）ホルムアルデヒド水溶液）を添加し、沸騰水中で１５分反応させた。その後、氷冷し、測定用サンプルとした。
分析条件：
カラム；ＨＳＳＣ１８ＳＢ（Ｗａｔｅｒｓ社製）
溶離液；２．５％（ｖ／ｖ）酢酸水溶液：メタノール＝６：４、
検出器；蛍光検出器（Ｅｘ３６３ｎｍ、Ｅｍ４７３ｎｍ）、
カラム温度；４０℃
５−アミノレブリン酸は、下記方法で測定用のサンプルを調製し、Okayamaらの方法（ＣＬＩＮ．ＣＨＥＭ．、３６／８、１４９４−１４９７（１９９０））に従い、高速液体クロマトグラフィーにより下記条件で分析した。
測定サンプルの調製：
サンプルの調製は、培養液を１ｍＬ回収し、４℃、３０００×ｇにて、１０分間遠心分離を行い、培養液上清を得、これを水で１０倍希釈した。この水で１０倍に希釈した培養液上清に対し、７０倍量の試薬Ａ（１５％（ｖ／ｖ）アセチルアセトン、１０％（ｖ／ｖ）エタノール、４ｇ／Ｌ塩化ナトリウム水溶液）および１０倍量の試薬Ｂ（９％（ｖ／ｖ）ホルムアルデヒド水溶液）を添加し、沸騰水中で１５分反応させた。その後、氷冷し、測定用サンプルとした。
分析条件：
カラム；ＨＳＳＣ１８ＳＢ（Ｗａｔｅｒｓ社製）
溶離液；２．５％（ｖ／ｖ）酢酸水溶液：メタノール＝６：４、
検出器；蛍光検出器（Ｅｘ３６３ｎｍ、Ｅｍ４７３ｎｍ）、
カラム温度；４０℃
表１からわかるように、親株のＹＰＨ４９９では培養液中で５−アミノレブリン酸が検出されないのに対し、ＨＥＭ１遺伝子の発現を強化したＹＰＨ４９９／ｐＧＫ４０５−ＨＥＭ１／ｐＧＫ４０６では培養液中へ５−アミノレブリン酸の産生が観察されるようになった。
（参考例２）グリシンおよびレブリン酸の添加による５−アミノレブリン酸の生産
製造例８で取得した、ＨＥＭ１遺伝子の発現の強化したＹＰＨ４９９／ｐＧＫ４０５−ＨＥＭ１／ｐＧＫ４０６を参考例１と同様のＳＤ培地、またはＳＤ培地に５ｍＭグリシンと４０ｍＭレブリン酸を添加した培地を用いて２４時間培養を行った。
その後、参考例１と同様の方法で、培養液中の細胞濃度と、培養液上清中の５−アミノレブリン酸濃度を測定した。測定結果を（表２）に示す。
（表２）からわかるように、５ｍＭグリシンと４０ｍＭレブリン酸を添加したＳＤ培地を用いることにより、ＳＤ培地を用いた場合と比較して５−アミノレブリン産生量が向上した。
製造例８で取得した、ＨＥＭ１遺伝子の発現の強化したＹＰＨ４９９／ｐＧＫ４０５−ＨＥＭ１／ｐＧＫ４０６を参考例１と同様のＳＤ培地、またはＳＤ培地に５ｍＭグリシンと４０ｍＭレブリン酸を添加した培地を用いて２４時間培養を行った。
その後、参考例１と同様の方法で、培養液中の細胞濃度と、培養液上清中の５−アミノレブリン酸濃度を測定した。測定結果を（表２）に示す。
（表２）からわかるように、５ｍＭグリシンと４０ｍＭレブリン酸を添加したＳＤ培地を用いることにより、ＳＤ培地を用いた場合と比較して５−アミノレブリン産生量が向上した。
（実施例１〜６）ＨＥＭ１遺伝子の発現を増強し、さらに特定のミトコンドリアキャリアーの遺伝子の発現を増強した酵母による５−アミノレブリン酸の生産
製造例２〜７で作製した、ＨＥＭ１遺伝子と特定のミトコンドリアキャリアー遺伝子の発現を増強した各酵母と、これらの比較株として製造例８で作成したＨＥＭ１遺伝子のみを強化した酵母を、ＳＤ培地に５ｍＭグリシンと４０ｍＭレブリン酸を添加した培地を用いて参考例２と同様に培養し、２４時間培養後の培養液について、培養液中の乾燥細胞濃度と、培養上清中の５−アミノレブリン酸濃度を測定した。測定結果を（表３）及び（表４）に示す。
（表３）、（表４）の結果からわかるように、ＨＥＭ１遺伝子の発現に加え、ミトコンドリアキャリアーの遺伝子ＭＤＬ１、ＪＥＮ１、ＰＯＲ２、ＤＩＣ１、ＣＴＰ１およびＹＰＲ０１１Ｃの発現を増強することにより、５−アミノレブリン産生量が向上した。
製造例２〜７で作製した、ＨＥＭ１遺伝子と特定のミトコンドリアキャリアー遺伝子の発現を増強した各酵母と、これらの比較株として製造例８で作成したＨＥＭ１遺伝子のみを強化した酵母を、ＳＤ培地に５ｍＭグリシンと４０ｍＭレブリン酸を添加した培地を用いて参考例２と同様に培養し、２４時間培養後の培養液について、培養液中の乾燥細胞濃度と、培養上清中の５−アミノレブリン酸濃度を測定した。測定結果を（表３）及び（表４）に示す。
（表３）、（表４）の結果からわかるように、ＨＥＭ１遺伝子の発現に加え、ミトコンドリアキャリアーの遺伝子ＭＤＬ１、ＪＥＮ１、ＰＯＲ２、ＤＩＣ１、ＣＴＰ１およびＹＰＲ０１１Ｃの発現を増強することにより、５−アミノレブリン産生量が向上した。
Claims (4)
- （ａ）５−アミノレブリン酸合成酵素をコードする遺伝子ＨＥＭ１、並びに（ｂ）ミトコンドリア膜上のキャリアタンパク質をコードする遺伝子であるＭＤＬ１、ＪＥＮ１、ＰＯＲ２、ＤＩＣ１、ＣＴＰ１及びＹＰＲ０１１Ｃから選ばれる１種以上の発現が増強された遺伝子組み換え酵母であって、
酵母中で発現するプロモーターの下流に遺伝子（ａ）を有するベクターと酵母中で発現するプロモーターの下流に遺伝子（ｂ）を有するベクターで形質転換された遺伝子組み換え酵母、あるいは酵母中で発現するプロモーターの下流に遺伝子（ａ）及び遺伝子（ｂ）を有するベクターで形質転換された遺伝子組み換え酵母。 - 酵母中で発現するプロモーターが、ＰＧＫプロモーターである請求項１記載の遺伝子組み換え酵母。
- 酵母が、Saccharomyces cerevisiaeである請求項１又は２記載の遺伝子組み換え酵母。
- 請求項１〜３のいずれか１項記載の遺伝子組み換え酵母を培養することを特徴とする５−アミノレブリン酸又はその塩の製造法。
Priority Applications (1)
| Application Number | Priority Date | Filing Date | Title |
|---|---|---|---|
| JP2015094650A JP6499510B2 (ja) | 2015-05-07 | 2015-05-07 | 遺伝子組み換え酵母及びそれを用いた５−アミノレブリン酸の製造法 |
Applications Claiming Priority (1)
| Application Number | Priority Date | Filing Date | Title |
|---|---|---|---|
| JP2015094650A JP6499510B2 (ja) | 2015-05-07 | 2015-05-07 | 遺伝子組み換え酵母及びそれを用いた５−アミノレブリン酸の製造法 |
Publications (2)
| Publication Number | Publication Date |
|---|---|
| JP2016208902A JP2016208902A (ja) | 2016-12-15 |
| JP6499510B2 true JP6499510B2 (ja) | 2019-04-10 |
Family
ID=57548811
Family Applications (1)
| Application Number | Title | Priority Date | Filing Date |
|---|---|---|---|
| JP2015094650A Expired - Fee Related JP6499510B2 (ja) | 2015-05-07 | 2015-05-07 | 遺伝子組み換え酵母及びそれを用いた５−アミノレブリン酸の製造法 |
Country Status (1)
| Country | Link |
|---|---|
| JP (1) | JP6499510B2 (ja) |
Families Citing this family (2)
| Publication number | Priority date | Publication date | Assignee | Title |
|---|---|---|---|---|
| CN106967627A (zh) * | 2017-04-11 | 2017-07-21 | 济南大学 | 一种发酵生产ala的重组菌株及其制备方法 |
| CN115975831A (zh) * | 2022-09-29 | 2023-04-18 | 天津大学 | 一种高产5-氨基乙酰丙酸酿酒酵母工程菌株及其应用 |
Family Cites Families (3)
| Publication number | Priority date | Publication date | Assignee | Title |
|---|---|---|---|---|
| JP4919400B2 (ja) * | 2006-07-31 | 2012-04-18 | コスモ石油株式会社 | ５−アミノレブリン酸の製造方法 |
| CN102206606B (zh) * | 2011-03-31 | 2013-02-27 | 山东大学 | 一株重组大肠杆菌及其在生产5-氨基乙酰丙酸中的应用 |
| JP2014150747A (ja) * | 2013-02-06 | 2014-08-25 | Sekisui Chem Co Ltd | 変異微生物、並びに、コハク酸の生産方法 |
-
2015
- 2015-05-07 JP JP2015094650A patent/JP6499510B2/ja not_active Expired - Fee Related
Also Published As
| Publication number | Publication date |
|---|---|
| JP2016208902A (ja) | 2016-12-15 |
Similar Documents
| Publication | Publication Date | Title |
|---|---|---|
| Blumhoff et al. | Targeting enzymes to the right compartment: metabolic engineering for itaconic acid production by Aspergillus niger | |
| Andreev et al. | Cyanogen bromide cleavage of proteins in salt and buffer solutions | |
| Li et al. | Genetically encoded alkenyl–pyrrolysine analogues for thiol–ene reaction mediated site-specific protein labeling | |
| JP7246100B2 (ja) | 新規融合タンパク質の調製およびそのタンパク質合成の向上における使用 | |
| KR102089516B1 (ko) | Co 수화효소 및 이를 이용한 개미산의 제조방법 | |
| JP2022534032A (ja) | 最適化されたカンナビノイド合成酵素ポリペプチド | |
| CN109554414B (zh) | 金针菇基因Fvegt1、Fvegt2和Fvegt3在合成麦角硫因中的应用 | |
| WO2018161374A1 (zh) | 一种用于体外蛋白质合成的蛋白合成体系、试剂盒及其制备方法 | |
| TW202024332A (zh) | 吡咯賴氨酰-tRNA合成酶 | |
| JP6499510B2 (ja) | 遺伝子組み換え酵母及びそれを用いた５−アミノレブリン酸の製造法 | |
| JP6695802B2 (ja) | 変異酵素及びその用途 | |
| JP2011120576A (ja) | リジン残基とプロリン残基とが共に水酸化されたコラーゲンを産生する形質転換体 | |
| JPWO2016140349A1 (ja) | グルタチオンの製造方法 | |
| Shen et al. | Improvement of amorpha-4, 11-diene production by a yeast-conform variant of Vitreoscilla hemoglobin | |
| Oohora et al. | Supramolecular dimerization of a hexameric hemoprotein via multiple pyrene-pyrene interactions | |
| JP5540367B2 (ja) | シャペロニン変異体およびこれをコードするｄｎａ | |
| CN108424937B (zh) | 一种酶法合成丹参素的方法 | |
| Lv et al. | Cascaded de novo biosynthesis of lacto-proteins from CO 2 by engineered Pichia pastoris | |
| EP4067492A1 (en) | Polypeptide tag and application thereof in in vitro protein synthesis | |
| JPS6152299A (ja) | 酵母によるグルタチオンの製造方法 | |
| CN114686547A (zh) | 一种以双醋瑞因为供体的酶促合成乙酰辅酶a的方法 | |
| Xiong et al. | Inducible high level expression of a variant ΔD19A, D58A-ferredoxin-hydrogenase fusion increases photohydrogen production efficiency in the green alga Chlamydomonas reinhardtii | |
| JP2018201508A (ja) | グルタチオンストレス耐性酵母 | |
| WO2023109981A9 (zh) | 新型桡足类荧光素酶突变体及其应用 | |
| CN112759653A (zh) | 一种pkek融合蛋白及其制备方法与应用 |
Legal Events
| Date | Code | Title | Description |
|---|---|---|---|
| A621 | Written request for application examination |
Free format text: JAPANESE INTERMEDIATE CODE: A621 Effective date: 20180131 |
|
| A131 | Notification of reasons for refusal |
Free format text: JAPANESE INTERMEDIATE CODE: A131 Effective date: 20181002 |
|
| A521 | Request for written amendment filed |
Free format text: JAPANESE INTERMEDIATE CODE: A523 Effective date: 20181031 |
|
| A131 | Notification of reasons for refusal |
Free format text: JAPANESE INTERMEDIATE CODE: A131 Effective date: 20181211 |
|
| TRDD | Decision of grant or rejection written | ||
| A01 | Written decision to grant a patent or to grant a registration (utility model) |
Free format text: JAPANESE INTERMEDIATE CODE: A01 Effective date: 20190305 |
|
| A61 | First payment of annual fees (during grant procedure) |
Free format text: JAPANESE INTERMEDIATE CODE: A61 Effective date: 20190315 |
|
| R150 | Certificate of patent or registration of utility model |
Ref document number: 6499510 Country of ref document: JP Free format text: JAPANESE INTERMEDIATE CODE: R150 |
|
| LAPS | Cancellation because of no payment of annual fees |