JP2018201508A - グルタチオンストレス耐性酵母 - Google Patents
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Abstract
【課題】酵母は通常、菌体内に蓄積したグルタチオンによりストレスを受け、それがグルタチオン生産量を抑制する一因となっていた。本発明は、グルタチオンストレス耐性を酵母に付与させる因子とその生物学的プロセスを特定する。それにより、グルタチオン高生産酵母を取得し、グルタチオンを効率よく製造する。【解決手段】ＭＡＰＫ経路及び減数分裂のプロセスに属する遺伝子で酵母を形質転換する。具体的にはＲｉｍ１１、Ｂｍｈ１またはＷｈｉ２のアミノ酸配列をコードするＤＮＡで酵母を形質転換する。【選択図】なし
Description
本発明は、グルタチオンストレスに対する耐性を付与させた酵母を育種する方法に関する。
グルタチオンはグルタミン酸、システイン、グリシンから構成されるトリペプチドで、例えば大腸菌からヒトに至るまで広く保存された生理活性分子である。
グルタチオンは抗酸化作用、免疫賦活作用、解毒・肝機能改善作用、等の様々な機能性を発揮することから、医薬品、食品、化粧品の分野で注目されている（特許文献１）。
細胞におけるグルタチオンの機能は、鉄硫黄クラスタータンパク質の構成と成熟化、活性酸素種の消去、アミノ酸代謝、酸化還元バランスの恒常性維持によるタンパク質のフォールディング、等多岐に渡る（非特許文献１）。
グルタチオンは抗酸化作用、免疫賦活作用、解毒・肝機能改善作用、等の様々な機能性を発揮することから、医薬品、食品、化粧品の分野で注目されている（特許文献１）。
細胞におけるグルタチオンの機能は、鉄硫黄クラスタータンパク質の構成と成熟化、活性酸素種の消去、アミノ酸代謝、酸化還元バランスの恒常性維持によるタンパク質のフォールディング、等多岐に渡る（非特許文献１）。
近年のライブセルイメージング技術の発展に伴い、還元型グルタチオンと酸化型グルタチオンの量比がオルガネラごとに大きく異なり、グルタチオンの空間的バランスが高度に制御されていることが明らかになってきた。還元型グルタチオンと酸化型グルタチオンの量比は、例えば細胞質やミトコンドリア内膜では３，０００：１だが、小胞体では３：１〜１：１との報告がある（非特許文献２）。小胞体が酸化的環境にシフトしているのは、グルタチオンを介したプロテインジスルフィドイソメラーゼ等の働きで分泌タンパク質や膜タンパク質を正しくフォールディングさせるためである（非特許文献１）。
現在グルタチオンの工業的生産法は酵母を用いた発酵法が主流で、グルタチオンは酵母の細胞内に蓄積される。上述のようなグルタチオンの高い生理活性は、蓄積度合が過剰だと細胞毒性（グルタチオンストレス）があらわれることが知られていた（非特許文献３）。
それゆえに、グルタチオンストレスを低減するために、グルタチオンを積極的に液胞に輸送させることで、グルタチオン蓄積量と増殖性を同時改善させた報告（特許文献２）、また細胞毒性を回避するためにグルタチオンを細胞外（培地中）へ排出させ、グルタチオンの生産性を向上させた報告（非特許文献４）が存在する。
またグルタチオンの細胞毒性に関して更に詳細には、酵母内でのグルタチオンの過剰蓄積が、小胞体におけるタンパク質フォールディングやミトコンドリア活性に悪影響を及ぼすことが報告されている（非特許文献１）。
それゆえに、グルタチオンストレスを低減するために、グルタチオンを積極的に液胞に輸送させることで、グルタチオン蓄積量と増殖性を同時改善させた報告（特許文献２）、また細胞毒性を回避するためにグルタチオンを細胞外（培地中）へ排出させ、グルタチオンの生産性を向上させた報告（非特許文献４）が存在する。
またグルタチオンの細胞毒性に関して更に詳細には、酵母内でのグルタチオンの過剰蓄積が、小胞体におけるタンパク質フォールディングやミトコンドリア活性に悪影響を及ぼすことが報告されている（非特許文献１）。
しかしながらグルタチオンの細胞毒性に対して、耐性を付与させる因子は酵母に限らずあらゆる生物種でこれまで知られてない。従ってグルタチオンストレス耐性酵母の作出を通じたグルタチオンの生産性向上といった試みも未完である。
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上記背景技術を鑑み、本発明は
ｉ）グルタチオンストレス耐性を酵母に付与させる因子を特定すること
および
ｉｉ）酵母にグルタチオンストレス耐性を付与する生物学的プロセスを特定すること、
を含むグルタチオン高生産酵母の製造方法を提供することを課題とする。
ｉ）グルタチオンストレス耐性を酵母に付与させる因子を特定すること
および
ｉｉ）酵母にグルタチオンストレス耐性を付与する生物学的プロセスを特定すること、
を含むグルタチオン高生産酵母の製造方法を提供することを課題とする。
上述の課題を解決すべく、発明者らは酵母染色体マルチコピーライブラリーを用いて、多コピーでグルタチオンストレスを抑圧する遺伝子を探索した結果、グリコーゲンシンターゼキナーゼＲｉｍ１１をコードする遺伝子ＲＩＭ１１、１４−３−３タンパク質Ｂｍｈ１をコードする遺伝子ＢＭＨ１、および細胞分裂Ｇ１期を下方調整するタンパク質Ｗｈｉ２をコードする遺伝子ＷＨＩ２を見出すことができた。
さらに本発明者らはＲＮＡシーケンス法を実施した結果、これらの遺伝子の強発現化が酵母にグルタチオンストレス耐性を付与させた要因が下記（ａ）、（ｂ）の生物学的プロセスの変化であることを確認した。
（ａ）ＭＡＰＫ（Ｍｉｔｏｇｅｎ ａｃｔｉｖａｔｅｄ−ｐｒｏｔｅｉｎ ｋｉｎａｓｅ）経路の活性化
（ｂ）減数分裂段階への移行
加えて本発明者らは（ａ）ＭＡＰＫ経路の下流で機能するグリコーゲンシンターゼキナーゼＲｉｍ１１に着目した。Ｒｉｍ１１がリン酸化する基質として既知なＵｍｅ６、ならびに該Ｕｍｅ６と協調するＲｐｄ３とＳｉｎ３が、酵母にグルタチオンストレス耐性を付与する際に機能していることを、分子遺伝学的手法を用いて新規に見出した。本結果から、（ａ）ＭＡＰＫ経路に引き続き、エピジェネティクス機構の調整が、酵母にグルタチオンストレス耐性を付与させる要因あると結論付けるに至った。
さらに本発明者らはＲＮＡシーケンス法を実施した結果、これらの遺伝子の強発現化が酵母にグルタチオンストレス耐性を付与させた要因が下記（ａ）、（ｂ）の生物学的プロセスの変化であることを確認した。
（ａ）ＭＡＰＫ（Ｍｉｔｏｇｅｎ ａｃｔｉｖａｔｅｄ−ｐｒｏｔｅｉｎ ｋｉｎａｓｅ）経路の活性化
（ｂ）減数分裂段階への移行
加えて本発明者らは（ａ）ＭＡＰＫ経路の下流で機能するグリコーゲンシンターゼキナーゼＲｉｍ１１に着目した。Ｒｉｍ１１がリン酸化する基質として既知なＵｍｅ６、ならびに該Ｕｍｅ６と協調するＲｐｄ３とＳｉｎ３が、酵母にグルタチオンストレス耐性を付与する際に機能していることを、分子遺伝学的手法を用いて新規に見出した。本結果から、（ａ）ＭＡＰＫ経路に引き続き、エピジェネティクス機構の調整が、酵母にグルタチオンストレス耐性を付与させる要因あると結論付けるに至った。
すなわち本発明は、
（１）下記（ａ）、（ｂ）または（ｃ）の生物学的プロセスに属する遺伝子で親株を形質転換して得られる、親株と比べてグルタチオンストレス耐性の向上した酵母。
（ａ）Ｍｉｔｏｇｅｎ ａｃｔｉｖａｔｅｄ−ｐｒｏｔｅｉｎ ｋｉｎａｓｅ（ＭＡＰＫ）経路
（ｂ）減数分裂
（ｃ）エピジェネティクス機構
（２）下記（Ａ）〜（Ｃ）のいずれかのアミノ酸配列をコードするＤＮＡで親株を形質転換して得られる、親株と比べてグルタチオンストレス耐性の向上した酵母。
（Ａ）配列番号１のアミノ酸配列と６５％以上の相同性を有するアミノ酸配列
（Ｂ）配列番号２のアミノ酸配列と６５％以上の相同性を有するアミノ酸配列
（Ｃ）配列番号３のアミノ酸配列と６５％以上の相同性を有するアミノ酸配列
（３）前記（２）記載の酵母であって、かつ配列番号７のアミノ酸配列と６５％以上の相同性を有するアミノ酸配列をコードするＤＮＡで親株を形質転換して得られる酵母である、親株と比べてグルタチオンストレス耐性の向上した酵母。
（４）（ａ）ＭＡＰＫ経路の下流で機能する生物学的プロセスであって、細胞分裂段階を外部の生育環境変化に応答して適宜、体細胞分裂または減数分裂、あるいは分裂の一時停止期（Ｇ１停止, Ｇ２停止）に移行させる下記（Ｉ）の機構に属する遺伝子で親株を形質転換して得られる、親株と比べてグルタチオンストレス耐性の向上した酵母。
（Ｉ）エピジェネティクス機構
（５）下記（Ｄ）〜（Ｆ）のいずれかのアミノ酸配列をコードするＤＮＡで親株を形質転換して得られる、親株と比べてグルタチオンストレス耐性の向上した酵母。
（Ｄ）配列番号３３のアミノ酸配列と６５％以上の相同性を有するアミノ酸配列
（Ｅ）配列番号３４のアミノ酸配列と６５％以上の相同性を有するアミノ酸配列
（Ｆ）配列番号３５のアミノ酸配列と６５％以上の相同性を有するアミノ酸配列
（６）前記（１）〜（５）のいずれかに記載の酵母を培養する工程を含む、グルタチオンの製造方法。
に係るものである。
（１）下記（ａ）、（ｂ）または（ｃ）の生物学的プロセスに属する遺伝子で親株を形質転換して得られる、親株と比べてグルタチオンストレス耐性の向上した酵母。
（ａ）Ｍｉｔｏｇｅｎ ａｃｔｉｖａｔｅｄ−ｐｒｏｔｅｉｎ ｋｉｎａｓｅ（ＭＡＰＫ）経路
（ｂ）減数分裂
（ｃ）エピジェネティクス機構
（２）下記（Ａ）〜（Ｃ）のいずれかのアミノ酸配列をコードするＤＮＡで親株を形質転換して得られる、親株と比べてグルタチオンストレス耐性の向上した酵母。
（Ａ）配列番号１のアミノ酸配列と６５％以上の相同性を有するアミノ酸配列
（Ｂ）配列番号２のアミノ酸配列と６５％以上の相同性を有するアミノ酸配列
（Ｃ）配列番号３のアミノ酸配列と６５％以上の相同性を有するアミノ酸配列
（３）前記（２）記載の酵母であって、かつ配列番号７のアミノ酸配列と６５％以上の相同性を有するアミノ酸配列をコードするＤＮＡで親株を形質転換して得られる酵母である、親株と比べてグルタチオンストレス耐性の向上した酵母。
（４）（ａ）ＭＡＰＫ経路の下流で機能する生物学的プロセスであって、細胞分裂段階を外部の生育環境変化に応答して適宜、体細胞分裂または減数分裂、あるいは分裂の一時停止期（Ｇ１停止, Ｇ２停止）に移行させる下記（Ｉ）の機構に属する遺伝子で親株を形質転換して得られる、親株と比べてグルタチオンストレス耐性の向上した酵母。
（Ｉ）エピジェネティクス機構
（５）下記（Ｄ）〜（Ｆ）のいずれかのアミノ酸配列をコードするＤＮＡで親株を形質転換して得られる、親株と比べてグルタチオンストレス耐性の向上した酵母。
（Ｄ）配列番号３３のアミノ酸配列と６５％以上の相同性を有するアミノ酸配列
（Ｅ）配列番号３４のアミノ酸配列と６５％以上の相同性を有するアミノ酸配列
（Ｆ）配列番号３５のアミノ酸配列と６５％以上の相同性を有するアミノ酸配列
（６）前記（１）〜（５）のいずれかに記載の酵母を培養する工程を含む、グルタチオンの製造方法。
に係るものである。
本発明の方法によれば、酵母細胞内におけるグルタチオンの高蓄積によって誘導される細胞毒性に対して、宿主酵母にグルタチオンストレス耐性を獲得させることができる。当該形質を獲得させた酵母を育種することでグルタチオン高生産酵母を製造することができる。
本発明により得られたグルタチオン高生産酵母は、グルタチオンを高含有しながらも増殖性が野生型のそれと同等レベルにあるので、グルタチオンの工業的生産において、その生産性向上に寄与することが期待される。
本発明により得られたグルタチオン高生産酵母は、グルタチオンを高含有しながらも増殖性が野生型のそれと同等レベルにあるので、グルタチオンの工業的生産において、その生産性向上に寄与することが期待される。
以下、本発明を詳細に説明する。
本発明は、グリコーゲンシンターゼキナーゼＲｉｍ１１（配列番号１）、１４−３−３タンパク質Ｂｍｈ１（配列番号２）、並びに体細胞分裂Ｇ１期の下方調整因子Ｗｈｉ２（配列番号３）、各々をコードする遺伝子、具体的にはそれぞれＲＩＭ１１（配列番号４）、ＢＭＨ１（配列番号５）、ＷＨＩ２（配列番号６）が酵母にグルタチオンストレス耐性を付与することを新規に見出したものである。本発明によれば、これらいずれかの遺伝子発現量を上方調整させ、当該タンパク質の産生を増量させることで酵母にグルタチオンストレス耐性を付与させることができる。特に好ましくはＲｉｍ１１、次に好ましくはＢｍｈ１をそれぞれコードする遺伝子の発現向上である。
本発明は、グリコーゲンシンターゼキナーゼＲｉｍ１１（配列番号１）、１４−３−３タンパク質Ｂｍｈ１（配列番号２）、並びに体細胞分裂Ｇ１期の下方調整因子Ｗｈｉ２（配列番号３）、各々をコードする遺伝子、具体的にはそれぞれＲＩＭ１１（配列番号４）、ＢＭＨ１（配列番号５）、ＷＨＩ２（配列番号６）が酵母にグルタチオンストレス耐性を付与することを新規に見出したものである。本発明によれば、これらいずれかの遺伝子発現量を上方調整させ、当該タンパク質の産生を増量させることで酵母にグルタチオンストレス耐性を付与させることができる。特に好ましくはＲｉｍ１１、次に好ましくはＢｍｈ１をそれぞれコードする遺伝子の発現向上である。
大量産生させたグリコーゲンシンターゼキナーゼあるいは１４−３−３タンパク質、あるいは体細胞分裂Ｇ１期制御因子がグルタチオンストレス耐性を付与することは酵母をはじめあらゆる生物種でこれまで知られてない。
グリコーゲンシンターゼキナーゼの既知機能、例えば細胞分裂の制御や酸化ストレス応答（非特許文献７）、あるいは１４−３−３タンパク質の既知機能、例えばＭＡＰＫ経路の調節（非特許文献５）、あるいは細胞分裂制御因子の既知機能、例えば体細胞分裂Ｇ１期のチェックポイント（非特許文献６）と、非特許文献１が報告するグルタチオンストレスの作用機序、即ちミトコンドリア内在性酵素の活性低下や小胞体ストレス誘導、とは細胞生理学的に直接的に結びつくものではない。
グリコーゲンシンターゼキナーゼの既知機能、例えば細胞分裂の制御や酸化ストレス応答（非特許文献７）、あるいは１４−３−３タンパク質の既知機能、例えばＭＡＰＫ経路の調節（非特許文献５）、あるいは細胞分裂制御因子の既知機能、例えば体細胞分裂Ｇ１期のチェックポイント（非特許文献６）と、非特許文献１が報告するグルタチオンストレスの作用機序、即ちミトコンドリア内在性酵素の活性低下や小胞体ストレス誘導、とは細胞生理学的に直接的に結びつくものではない。
本発明は、さらにトランスクリプトーム解析により見出された、酵母のグルタチオンストレス耐性機構の作用機序に関するものである。
グリコーゲンシンターゼキナーゼファミリーの一員であるＲＩＭ１１遺伝子は、窒素飢餓に応答したＴｏｒ経路と、引き続き起こるＭＡＰＫ経路（分裂促進因子活性化タンパク質キナーゼ）を通じて活性化されることが知られている（非特許文献８）。またＲｉｍ１１は初期減数分裂期において、減数分裂開始因子（Ｉｎｉｔｉａｔｏｒ ｏｆ Ｍｅｉｏｓｉｓ，ＩＭＥ）であるＩｍｅ１とＩｍｅ２の制御に関与し、細胞の減数分裂フェーズへの移行を正に誘導することが報告されている（非特許文献９）。しかしながらＲＩＭ１１のこれら機能と、ＧＳＨストレスの作用機序とは容易に結びつくものではない。
グリコーゲンシンターゼキナーゼファミリーの一員であるＲＩＭ１１遺伝子は、窒素飢餓に応答したＴｏｒ経路と、引き続き起こるＭＡＰＫ経路（分裂促進因子活性化タンパク質キナーゼ）を通じて活性化されることが知られている（非特許文献８）。またＲｉｍ１１は初期減数分裂期において、減数分裂開始因子（Ｉｎｉｔｉａｔｏｒ ｏｆ Ｍｅｉｏｓｉｓ，ＩＭＥ）であるＩｍｅ１とＩｍｅ２の制御に関与し、細胞の減数分裂フェーズへの移行を正に誘導することが報告されている（非特許文献９）。しかしながらＲＩＭ１１のこれら機能と、ＧＳＨストレスの作用機序とは容易に結びつくものではない。
そこでＲＩＭ１１強発現酵母のＲＮＡシーケンス解析を実施したが、意外なことに、酵母にグルタチオンストレス耐性を付与させる生物学的プロセスとして、ＭＡＰＫ経路の亢進と体細胞分裂から減数分裂フェーズへの移行、が確認された。Ｒｉｍ１１の基質にはＵｍｅ６が報告されており、加えてＵｍｅ６と協調するタンパク質としてＲｐｄ３とＳｉｎ３がある。Ｕｍｅ６、Ｒｐｄ３、Ｓｉｎ３はヒストン脱アセチル化酵素複合体（Ｃｏｎｓｅｒｖｅｄ Ｈｉｓｔｏｎｅ Ｄｅａｃｅｔｙｌａｓｅ；ＨＤＡＣ）を構成し、環境変化に応答して遺伝子発現のタイミングを制御するエピジェネティクス機構の調整因子であることが知られている（非特許文献１２）
エピジェネティクス機構とグルタチオンの生理機能（酸化還元バランス維持、抗酸化能、解毒作用、およびグルタチオンストレス）とは、既知情報からは両者の関連性が見出せない。
しかしながら本発明者らは酵母の分子遺伝学的手法を用いることで、両機構に遺伝的相互作用が存在することを見出すに至った。当該関連性についても容易に推察できるものではなく、本知見を活かしたグルタチオンの高効率生産が産業的に資する効果は大きい。
上述の酵母染色体マルチコピーライブラリースクリーニングより、ＲＩＭ１１と同時に１４−３−３タンパク質遺伝子ＢＭＨ１が選抜されたが、興味深いことにＢｍｈ１も、Ｔｏｒシグナル経路下流のＭＡＰＫ経路で機能することが知られている（非特許文献６）。以上の結果は、ＭＡＰＫ経路が酵母にグルタチオンストレス耐性を付与させていることを裏付けるものである。
エピジェネティクス機構とグルタチオンの生理機能（酸化還元バランス維持、抗酸化能、解毒作用、およびグルタチオンストレス）とは、既知情報からは両者の関連性が見出せない。
しかしながら本発明者らは酵母の分子遺伝学的手法を用いることで、両機構に遺伝的相互作用が存在することを見出すに至った。当該関連性についても容易に推察できるものではなく、本知見を活かしたグルタチオンの高効率生産が産業的に資する効果は大きい。
上述の酵母染色体マルチコピーライブラリースクリーニングより、ＲＩＭ１１と同時に１４−３−３タンパク質遺伝子ＢＭＨ１が選抜されたが、興味深いことにＢｍｈ１も、Ｔｏｒシグナル経路下流のＭＡＰＫ経路で機能することが知られている（非特許文献６）。以上の結果は、ＭＡＰＫ経路が酵母にグルタチオンストレス耐性を付与させていることを裏付けるものである。
また窒素飢餓応答によって体細胞分裂Ｇ１期が停滞し、サイクリンタンパク質Ｃｌｎ３とＣｌｎ２が抑制されることが知られている。Ｃｌｎ２はＩｍｅ１の負のレギュレーターであるから、Ｃｌｎ２の機能が低下するとＩＭＥ１遺伝子がアップレギュレーションされ、減数分裂フェーズへの移行が促進される（非特許文献９）。酵母染色体マルチコピーライブラリースクリーニングでＷｈｉ２をコードする遺伝子ＷＨＩ２が見出されたが、当該タンパク質はＣｌｎ１とＣｌｎ２を下方調整するため（非特許文献７）、ＩＭＥ１遺伝子の発現が上方調整され、減数分裂段階への移行が促進されるだろう。以上の結果は、減数分裂段階への移行が、酵母にグルタチオンストレス耐性を付与させる要因である可能性が考えられる。
以上の生物学的プロセスを図１に描画した。
以上の生物学的プロセスを図１に描画した。
また本発明はグルタチオンの生産性を向上させた酵母の製造方法に関する。
グリコーゲンシンターゼキナーゼであるＲｉｍ１１（配列番号１）をコードする遺伝子を大量発現させると、酵母においてグルタチオン含量を増大させることができる。該遺伝子のほか、１４−３−３タンパク質であるＢｍｈ１（配列番号２）をコードする遺伝子、体細胞分裂Ｇ１期制御因子であるＷｈｉ２（配列番号３）をコードする遺伝子であってもよい。
グリコーゲンシンターゼキナーゼであるＲｉｍ１１（配列番号１）をコードする遺伝子を大量発現させると、酵母においてグルタチオン含量を増大させることができる。該遺伝子のほか、１４−３−３タンパク質であるＢｍｈ１（配列番号２）をコードする遺伝子、体細胞分裂Ｇ１期制御因子であるＷｈｉ２（配列番号３）をコードする遺伝子であってもよい。
さらに、エピジェネティクス機構の調整因子であることが知られているＵｍｅ６（配列番号３３）、Ｒｐｄ３（配列番号３４）、Ｓｉｎ３（配列番号３５）をコードする遺伝子でもよい。
また、本発明では、配列番号１〜３、３３〜３５のアミノ酸配列と６５％以上、好ましくは８０％以上、さらに好ましくは９０％以上の相同性を有するアミノ酸配列を発現させても良い。
またグルタチオン合成酵素−Ｉ（配列番号７）をコードする遺伝子ＧＳＨ１（配列番号８）を強発現させた酵母で、更にＲｉｍ１１、Ｂｍｈ１またはＷｈｉ２の遺伝子を過剰発現させると、グルタチオン含量を相乗的に増大させることができる。
これら方法に則り育種した酵母は、細胞内にグルタチオンを高含有するにもかかわらず、増殖性や菌体収量（単位糖重量あたりに取得される酵母菌体の重量、バイオマス）は野生型のそれと同等であることから、当該発明酵母はグルタチオン生産性の向上に期待できる。
これら方法に則り育種した酵母は、細胞内にグルタチオンを高含有するにもかかわらず、増殖性や菌体収量（単位糖重量あたりに取得される酵母菌体の重量、バイオマス）は野生型のそれと同等であることから、当該発明酵母はグルタチオン生産性の向上に期待できる。
更に、既報のグルタチオン高生産方法、例えば酵母を培養する培地にシステインおよび／またはグリシンを添加する方法（特許文献３）、グルタチオンレダクターゼ遺伝子の破壊やグルタチオンペルオキシダーゼ遺伝子の強発現化を施した手法（特許文献４）、ＭＥＴ３０遺伝子に変異を導入させる方法（特許文献５）、を本発明の酵母に施すことにより、より一層のグルタチオン含量の増大も期待される。
＜酵母の種類＞
本発明に用いる酵母は特に制限はなく、例えばサッカロマイセス・セレビシエ（Ｓａｃｃｈａｒｏｍｙｃｅｓ ｃｅｒｅｖｉｓｉａｅ）、サッカロマイセス・ルーキシー（Ｓａｃｃｈａｒｏｍｙｃｅｓ ｒｏｕｘｉｉ）、サッカロマイセス・フラギリス（Ｓａｃｃｈａｒｏｍｙｃｅｓ ｆｒａｇｉｌｉｓ）などのサッカロマイセス属、キャンディダ・ユティリス（Ｃａｎｄｉｄａ ｕｔｉｌｉｓ）、キャンディダ・トロピカリス（Ｃａｎｄｉｄａ ｔｒｏｐｉｃａｌｉｓ）、キャンディダ・グラブラータ（Ｃａｎｄｉｄａ ｇｌａｂｒａｔａ）、キャンディダ・マルトーサ（Ｃａｎｄｉｄａ ｍａｌｔｏｓａ）などのキャンディダ属、ジゴサッカロマイセス・ルーキシー（Ｚｙｇｏｓａｃｃｈａｒｏｍｙｃｅｓ ｒｏｕｘｉｉ）などのジゴサッカロマイセス属、などの酵母が挙げられる。
本発明に用いる酵母は特に制限はなく、例えばサッカロマイセス・セレビシエ（Ｓａｃｃｈａｒｏｍｙｃｅｓ ｃｅｒｅｖｉｓｉａｅ）、サッカロマイセス・ルーキシー（Ｓａｃｃｈａｒｏｍｙｃｅｓ ｒｏｕｘｉｉ）、サッカロマイセス・フラギリス（Ｓａｃｃｈａｒｏｍｙｃｅｓ ｆｒａｇｉｌｉｓ）などのサッカロマイセス属、キャンディダ・ユティリス（Ｃａｎｄｉｄａ ｕｔｉｌｉｓ）、キャンディダ・トロピカリス（Ｃａｎｄｉｄａ ｔｒｏｐｉｃａｌｉｓ）、キャンディダ・グラブラータ（Ｃａｎｄｉｄａ ｇｌａｂｒａｔａ）、キャンディダ・マルトーサ（Ｃａｎｄｉｄａ ｍａｌｔｏｓａ）などのキャンディダ属、ジゴサッカロマイセス・ルーキシー（Ｚｙｇｏｓａｃｃｈａｒｏｍｙｃｅｓ ｒｏｕｘｉｉ）などのジゴサッカロマイセス属、などの酵母が挙げられる。
＜遺伝子の大量発現方法＞
Ｒｉｍ１１をコードする遺伝子たとえばＲＩＭ１１を大量発現させる方法は当業者に周知であり、例えば、当該遺伝子をコードする塩基配列から成るＤＮＡを酵母で自己複製する多コピーベクター（例えば非特許文献１０）にクローニングした発現プラスミドを用いる方法や、当該遺伝子の重複ＤＮＡ断片を酵母ゲノムに組込んでコピー数を増加させる方法、あるいは当該遺伝子のプロモーターよりも強力なプロモーター制御下に該遺伝子を配置させることで発現量を上げる方法、等によって行うことができる。強力なプロモーターには、公知の高発現プロモーター、例えばＰＧＫ１、ＴＤＨ３、ＴＥＦ１、ＣＹＣ１、などの遺伝子の上流プロモーター配列を挙げることができる。
Ｒｉｍ１１をコードする遺伝子たとえばＲＩＭ１１を大量発現させる方法は当業者に周知であり、例えば、当該遺伝子をコードする塩基配列から成るＤＮＡを酵母で自己複製する多コピーベクター（例えば非特許文献１０）にクローニングした発現プラスミドを用いる方法や、当該遺伝子の重複ＤＮＡ断片を酵母ゲノムに組込んでコピー数を増加させる方法、あるいは当該遺伝子のプロモーターよりも強力なプロモーター制御下に該遺伝子を配置させることで発現量を上げる方法、等によって行うことができる。強力なプロモーターには、公知の高発現プロモーター、例えばＰＧＫ１、ＴＤＨ３、ＴＥＦ１、ＣＹＣ１、などの遺伝子の上流プロモーター配列を挙げることができる。
他にもニトロソグアニジンやエチルメタンスルフォネートなどの化学変異誘発剤処理、重粒子ビームや放射線、エックス線、ＵＶなどの照射、あるいは亜硝酸等、通常の突然変異誘発操作を用いても当該遺伝子の強発現化は可能である。
＜総グルタチオン含量の測定方法＞
当該方法は当業者に周知であり、例えば Ｔｉｅｔｚｅらの酵素を用いるレイトアッセイ（非特許文献１１）や、高速液体クロマトグラフィー（ＨＰＬＣ）を用いる方法（特許文献６）、質量分析計を用いる方法（非特許文献１）などが挙げられる。市販品であればＧＳＳＧ／ＧＳＨ Ｑｕａｎｔｉｆｉｃａｔｉｏｎ Ｋｉｔ（同仁化学研究所製）などが使用できる。なお、ここで云う総グルタチオン含量とは、還元型グルタチオン（ＧＳＨ）の含量と酸化型グルタチオン（ＧＳＳＧ）の含量を合算したものである。
当該方法は当業者に周知であり、例えば Ｔｉｅｔｚｅらの酵素を用いるレイトアッセイ（非特許文献１１）や、高速液体クロマトグラフィー（ＨＰＬＣ）を用いる方法（特許文献６）、質量分析計を用いる方法（非特許文献１）などが挙げられる。市販品であればＧＳＳＧ／ＧＳＨ Ｑｕａｎｔｉｆｉｃａｔｉｏｎ Ｋｉｔ（同仁化学研究所製）などが使用できる。なお、ここで云う総グルタチオン含量とは、還元型グルタチオン（ＧＳＨ）の含量と酸化型グルタチオン（ＧＳＳＧ）の含量を合算したものである。
例えばＴｉｅｔｚｅらの方法に準ずるならば、当該改変酵母菌体を遠心分離機等で集菌し、水等で洗浄後、５−スルホサリチル酸水溶液に懸濁する。グルタチオンの抽出条件としては公知の方法、すなわち加熱抽出法や酵素分解法、あるいはガラスビーズやホモジナイザーを用いた物理的破砕法によっても可能である。但し酵母の培養状態の変遷に伴い細胞壁組成が変化し、特に定常期においては細胞壁溶解酵素の反応性が低下することが知られているので、酵素分解法は本製法では避けることが好ましい。抽出液を遠心分離機や膜ろ過に供することで清澄化し、適宜水あるいは５−スルホサリチル酸水溶液で希釈してグルタチオン抽出液を調製する。但しグルタチオンはｐＨが弱酸性の溶液でより安定なので、５−スルホサリチル酸水溶液を用いることがより好まれる。
抽出液中の総グルタチオン含量については、還元型グルタチオンがＤＴＮＢ（５，５’−ｄｉｔｈｉｏｂｉｓ−２−ｎｉｔｒｏｂｅｎｚｏｉｃ ａｃｉｄ）を還元することにより生成するＴＮＢ（５−ｍｅｒｃａｐｔｏ−２−ｎｉｔｒｏｂｅｎｚｏｉｃ ａｃｉｄ）の吸光度ＯＤ４２０値の経時変化を追跡、測定することで求めることができる。
一方でＧＳＨ純品を５−スルホサリチル酸水溶液に溶解させたＧＳＨ標準溶液を調製し同水溶液で段階希釈する。上記ＤＴＮＢ反応と同時に得たＯＤ４２０値とＧＳＨ濃度希釈系列の関係から、検量線を描画する。グルタチオン抽出液は、この検量線に基づくことで総グルタチオン濃度と含量を算出することが出来る。
抽出液中の総グルタチオン含量については、還元型グルタチオンがＤＴＮＢ（５，５’−ｄｉｔｈｉｏｂｉｓ−２−ｎｉｔｒｏｂｅｎｚｏｉｃ ａｃｉｄ）を還元することにより生成するＴＮＢ（５−ｍｅｒｃａｐｔｏ−２−ｎｉｔｒｏｂｅｎｚｏｉｃ ａｃｉｄ）の吸光度ＯＤ４２０値の経時変化を追跡、測定することで求めることができる。
一方でＧＳＨ純品を５−スルホサリチル酸水溶液に溶解させたＧＳＨ標準溶液を調製し同水溶液で段階希釈する。上記ＤＴＮＢ反応と同時に得たＯＤ４２０値とＧＳＨ濃度希釈系列の関係から、検量線を描画する。グルタチオン抽出液は、この検量線に基づくことで総グルタチオン濃度と含量を算出することが出来る。
尚、本発明においては、Ｔｉｅｔｚｅらの方法である、グルタチオンレダクターゼ−ＤＴＮＢ法（以降「ＧＲ−ＤＴＮＢ法」）を用いた。
本発明におけるＯＤは、分光光度計を用いて測定した値であり、具体的には分光光度計（レシオビーム分光光度計U-5100：日立ハイテクサイエンス社製）を用いて測定した。またｐＨは、ｐＨメーターを用いて測定する。具体的には、ｐＨメーターＨＭ−３０Ｇ（東亜ディーケーケー社製）を用いて測定した。なお総グルタチオンの分析では、吸光度ＯＤ４２０値をプレートリーダーで測定すると良く、具体的にはＡＲＶＯ Ｘ３ ２０３０ Ｍｕｌｔｉｌａｂｅｌ Ｒｅａｄｅｒ（パーキンエルマー社製）を挙げる。
本発明におけるＯＤは、分光光度計を用いて測定した値であり、具体的には分光光度計（レシオビーム分光光度計U-5100：日立ハイテクサイエンス社製）を用いて測定した。またｐＨは、ｐＨメーターを用いて測定する。具体的には、ｐＨメーターＨＭ−３０Ｇ（東亜ディーケーケー社製）を用いて測定した。なお総グルタチオンの分析では、吸光度ＯＤ４２０値をプレートリーダーで測定すると良く、具体的にはＡＲＶＯ Ｘ３ ２０３０ Ｍｕｌｔｉｌａｂｅｌ Ｒｅａｄｅｒ（パーキンエルマー社製）を挙げる。
酵母によるグルタチオン生産性を評価する際、酵母菌体の増殖性を調べるが、当該グルタチオンストレス耐性酵母の成長曲線は、Ｃｏｍｐａｃｔ Ｒｏｃｋｉｎｇ Ｉｎｃｕｂａｔｏｒ ＴＶＳ０６２ＣＡ（アドバンテック社製）を使用して評価する。
以下実施例を挙げて本発明を詳細に説明するが、これらに限定されるものではない。
［実施例１］
（１）グルタチオントランスポーターＨＧＴ１（ＯＰＴ１）強発現用カセットの構築
サッカロマイセス・セレビシエＢＹ４７４１（Ｍａｔａ ｈｉｓ３Δ１ ｌｅｕ２Δ０ ｍｅｔ１５Δ０ ｕｒａ３Δ０）のゲノムＤＮＡを鋳型にして、二種類のプライマー（配列番号９と１０）を用いてＬＥＵ２遺伝子をＰＣＲ増幅し、増幅物を制限酵素Ｓｐｅ Ｉ，Ｂａｍ ＨＩで消化した。この断片をプラスミドｐＢｌｕｅｓｃｒｉｐｔ ＳＫ−ＩＩ（＋）のＳｐｅ Ｉ，Ｂａｍ ＨＩ消化部位に連結し、ＬＥＵ２プラスミドを得た。
当該ゲノムＤＮＡをテンプレートとし、二種類のプライマー（配列番号１１と１２）でＴＤＨ３遺伝子配列のプロモーター領域、すなわち開始コドン（ＡＴＧ）のアデニンを＋１塩基としたときの上流領域−６８０塩基から−１塩基までの塩基配列を増幅し、増幅物をＢａｍ ＨＩとＥｃｏ ＲＩで消化した。この断片をＬＥＵ２プラスミドのＢａｍ ＨＩ、Ｅｃｏ ＲＩ消化部位に連結し、ＬＥＵ２−ＴＤＨ３ｐｒプラスミドを得た。
さらに当該ゲノムＤＮＡをテンプレートとし、グルタチオントランスポーターＨＧＴ１（ＯＰＴ１）遺伝子の翻訳領域（ＯＲＦ）の一部を、二種類のプライマー（配列番号１３と１４）でＰＣＲ増幅し、増幅物をＥｃｏ ＲＩとＳａｌ Ｉで消化した。ＬＥＵ２−ＴＤＨ３ｐｒプラスミドのＥｃｏ ＲＩとＳａｌ Ｉ消化物に連結し、ＬＥＵ２−ＴＤＨ３ｐｒ−ＨＧＴ１プラスミドを得た。
最後に当該ゲノムＤＮＡをテンプレートとし、二種類のプライマー（配列番号１５と１６）でＨＧＴ１遺伝子配列のプロモーター領域の一部、すなわち上流領域−６９０塩基から−１９７塩基の塩基配列を増幅し、増幅物をＳａｃ ＩとＳｐｅ Ｉで消化した。この断片をＬＥＵ２−ＴＤＨ３ｐｒ−ＨＧＴ１プラスミドのＳａｃ Ｉ、Ｓｐｅ Ｉ消化部位に連結し、ＨＧＴ１ｐｒ−ＬＥＵ２−ＴＤＨ３ｐｒ−ＨＧＴ１プラスミドを構築した（図２）。
［実施例１］
（１）グルタチオントランスポーターＨＧＴ１（ＯＰＴ１）強発現用カセットの構築
サッカロマイセス・セレビシエＢＹ４７４１（Ｍａｔａ ｈｉｓ３Δ１ ｌｅｕ２Δ０ ｍｅｔ１５Δ０ ｕｒａ３Δ０）のゲノムＤＮＡを鋳型にして、二種類のプライマー（配列番号９と１０）を用いてＬＥＵ２遺伝子をＰＣＲ増幅し、増幅物を制限酵素Ｓｐｅ Ｉ，Ｂａｍ ＨＩで消化した。この断片をプラスミドｐＢｌｕｅｓｃｒｉｐｔ ＳＫ−ＩＩ（＋）のＳｐｅ Ｉ，Ｂａｍ ＨＩ消化部位に連結し、ＬＥＵ２プラスミドを得た。
当該ゲノムＤＮＡをテンプレートとし、二種類のプライマー（配列番号１１と１２）でＴＤＨ３遺伝子配列のプロモーター領域、すなわち開始コドン（ＡＴＧ）のアデニンを＋１塩基としたときの上流領域−６８０塩基から−１塩基までの塩基配列を増幅し、増幅物をＢａｍ ＨＩとＥｃｏ ＲＩで消化した。この断片をＬＥＵ２プラスミドのＢａｍ ＨＩ、Ｅｃｏ ＲＩ消化部位に連結し、ＬＥＵ２−ＴＤＨ３ｐｒプラスミドを得た。
さらに当該ゲノムＤＮＡをテンプレートとし、グルタチオントランスポーターＨＧＴ１（ＯＰＴ１）遺伝子の翻訳領域（ＯＲＦ）の一部を、二種類のプライマー（配列番号１３と１４）でＰＣＲ増幅し、増幅物をＥｃｏ ＲＩとＳａｌ Ｉで消化した。ＬＥＵ２−ＴＤＨ３ｐｒプラスミドのＥｃｏ ＲＩとＳａｌ Ｉ消化物に連結し、ＬＥＵ２−ＴＤＨ３ｐｒ−ＨＧＴ１プラスミドを得た。
最後に当該ゲノムＤＮＡをテンプレートとし、二種類のプライマー（配列番号１５と１６）でＨＧＴ１遺伝子配列のプロモーター領域の一部、すなわち上流領域−６９０塩基から−１９７塩基の塩基配列を増幅し、増幅物をＳａｃ ＩとＳｐｅ Ｉで消化した。この断片をＬＥＵ２−ＴＤＨ３ｐｒ−ＨＧＴ１プラスミドのＳａｃ Ｉ、Ｓｐｅ Ｉ消化部位に連結し、ＨＧＴ１ｐｒ−ＬＥＵ２−ＴＤＨ３ｐｒ−ＨＧＴ１プラスミドを構築した（図２）。
配列番号９
5’-ccggactagtaggagaacttctagtatatc-3’
配列番号１０
5’-ccggggatcctttctgacagagtaaaattc-3’
配列番号１１
5’-gccggatcccagttcgagtttatcattatc-3’
配列番号１２
5’-ggccgaattctttgtttgtttatgtgtgtt-3’
配列番号１３
5’-cggaattcatgagtaccatttatagggaga-3’
配列番号１４
5’-cggtcgactgattaccaccatttatcata-3’
配列番号１５
5’-cggagctcgagctgtgcaactcgagaca-3’
配列番号１６
5’-ggactagttctttcttcaacaacgattgct-3’
5’-ccggactagtaggagaacttctagtatatc-3’
配列番号１０
5’-ccggggatcctttctgacagagtaaaattc-3’
配列番号１１
5’-gccggatcccagttcgagtttatcattatc-3’
配列番号１２
5’-ggccgaattctttgtttgtttatgtgtgtt-3’
配列番号１３
5’-cggaattcatgagtaccatttatagggaga-3’
配列番号１４
5’-cggtcgactgattaccaccatttatcata-3’
配列番号１５
5’-cggagctcgagctgtgcaactcgagaca-3’
配列番号１６
5’-ggactagttctttcttcaacaacgattgct-3’
（２）ＨＧＴ１強化株の作製
上記ＨＧＴ１ｐｒ−ＬＥＵ２−ＴＤＨ３ｐｒ−ＨＧＴ１プラスミドを制限酵素Ｘｈｏ Ｉで消化し、ＬＥＵ２遺伝子が連結されたＨＧＴ１遺伝子の強発現カセットを得た。
サッカロマイセス・セレビシエＢＹ４７４１（Ｍａｔａ ｈｉｓ３Δ１ ｌｅｕ２Δ０ ｍｅｔ１５Δ０ ｕｒａ３Δ０）を宿主にして当該発現カセットのダブルクロスオーバーの染色体相同組換えで、酢酸リチウム法を用いて形質転換を行った（図２）。目的とする染色体組換え株は、ＬＥＵ２を選択マーカーとして、ロイシンを含まない選択培地（以降ＳＤ−ｌｅｕと表記）に塗布しコロニー形成させることで選抜した。
形質転換体を新しいＳＤ−ｌｅｕ寒天培地に線描してシングルコロニーアイソレーションしたのち、ロイシンを含まないＳＤ液体培地に植菌して増殖させ、還元型グルタチオンを添加したＳＤ寒天培地にスポットし、増殖しないこと、あるいは増殖遅延、を確認することでグルタチオンストレス感受性酵母の作製を確認した
上記ＨＧＴ１ｐｒ−ＬＥＵ２−ＴＤＨ３ｐｒ−ＨＧＴ１プラスミドを制限酵素Ｘｈｏ Ｉで消化し、ＬＥＵ２遺伝子が連結されたＨＧＴ１遺伝子の強発現カセットを得た。
サッカロマイセス・セレビシエＢＹ４７４１（Ｍａｔａ ｈｉｓ３Δ１ ｌｅｕ２Δ０ ｍｅｔ１５Δ０ ｕｒａ３Δ０）を宿主にして当該発現カセットのダブルクロスオーバーの染色体相同組換えで、酢酸リチウム法を用いて形質転換を行った（図２）。目的とする染色体組換え株は、ＬＥＵ２を選択マーカーとして、ロイシンを含まない選択培地（以降ＳＤ−ｌｅｕと表記）に塗布しコロニー形成させることで選抜した。
形質転換体を新しいＳＤ−ｌｅｕ寒天培地に線描してシングルコロニーアイソレーションしたのち、ロイシンを含まないＳＤ液体培地に植菌して増殖させ、還元型グルタチオンを添加したＳＤ寒天培地にスポットし、増殖しないこと、あるいは増殖遅延、を確認することでグルタチオンストレス感受性酵母の作製を確認した
（３）多コピーでグルタチオンストレスを抑圧する遺伝子のスクリーニング
前項（２）記載のグルタチオンストレス感受性酵母（ＨＧＴ１強化株）に、サッカロマイセス・セレビシエの染色体から構築した３ ｇの酵母染色体ライブラリー（２μ ＵＲＡ３）を酢酸リチウム法で導入した。ＧＳＨを含む６０枚のＳＤ−ｌｅｕ−ｕｒａ寒天培地に等量ずつ塗布し、一枚だけＧＳＨを含まないＳＤ−ｌｅｕ−ｕｒａ寒天培地に塗布した。３０℃で５日間インキュベーションしたところ、ＧＳＨを含まないＳＤ−ｌｅｕ−ｕｒａ寒天培地において約２，０００個の形質転換体が得られた。よって６０枚の、ＧＳＨを含むＳＤ−ｌｅｕ−ｕｒａ寒天培地でスクリーニングを実施したので、約１２０，０００個の形質転換体を評価したことになる。
結果として３種類の酵母変異体に関して、グルタチオンストレス負荷環境でも良好な増殖性が観察された。これら酵母変異体から抽出した３種類のプラスミドについて、二種類プライマー（配列番号１７と１８）を用いてｐＲＳ４２６に挿入されているサッカロマイセス・セレビシエ染色体由来ＤＮＡ塩基配列の一部を解読した。
前項（２）記載のグルタチオンストレス感受性酵母（ＨＧＴ１強化株）に、サッカロマイセス・セレビシエの染色体から構築した３ ｇの酵母染色体ライブラリー（２μ ＵＲＡ３）を酢酸リチウム法で導入した。ＧＳＨを含む６０枚のＳＤ−ｌｅｕ−ｕｒａ寒天培地に等量ずつ塗布し、一枚だけＧＳＨを含まないＳＤ−ｌｅｕ−ｕｒａ寒天培地に塗布した。３０℃で５日間インキュベーションしたところ、ＧＳＨを含まないＳＤ−ｌｅｕ−ｕｒａ寒天培地において約２，０００個の形質転換体が得られた。よって６０枚の、ＧＳＨを含むＳＤ−ｌｅｕ−ｕｒａ寒天培地でスクリーニングを実施したので、約１２０，０００個の形質転換体を評価したことになる。
結果として３種類の酵母変異体に関して、グルタチオンストレス負荷環境でも良好な増殖性が観察された。これら酵母変異体から抽出した３種類のプラスミドについて、二種類プライマー（配列番号１７と１８）を用いてｐＲＳ４２６に挿入されているサッカロマイセス・セレビシエ染色体由来ＤＮＡ塩基配列の一部を解読した。
配列番号１７
5’-taatacgactcactataggg-3’
配列番号１８
5’-aattaaccctcactaaagg-3’
5’-taatacgactcactataggg-3’
配列番号１８
5’-aattaaccctcactaaagg-3’
解読配列情報をＳＧＤ（Ｓａｃｃｈａｒｏｍｙｃｅｓ Ｇｅｎｏｍｅ Ｄａｔａｂａｓｅ）に照会したところ、染色体番号ＸＩＩＩ（Ｃｈｒ ＩＩＩ）、染色体番号Ｖ（Ｃｈｒ Ｖ）、染色体番号ＸＶ（Ｃｈｒ ＸＶ）、の染色体断片が挿入されていることが判明した。各染色体断片上に配座された遺伝子を以下に示す。
・染色体番号ＸＩＩＩ（Ｃｈｒ ＩＩＩ） ： ＳＩＰ５，ＲＩＭ１１，ＣＩＮ４，
ＰＳＯ２，ＧＡＴ２
・染色体番号Ｖ（Ｃｈｒ Ｖ） ： ＢＭＨ１，ＰＤＡ１，ＤＭＣ１，ＩＳＣ１０
・染色体番号ＸＶ（Ｃｈｒ ＸＶ） ： ＨＩＲ２，ＣＫＢ２，ＧＬＯ４，ＣＵＥ５，ＷＨＩ２
・染色体番号ＸＩＩＩ（Ｃｈｒ ＩＩＩ） ： ＳＩＰ５，ＲＩＭ１１，ＣＩＮ４，
ＰＳＯ２，ＧＡＴ２
・染色体番号Ｖ（Ｃｈｒ Ｖ） ： ＢＭＨ１，ＰＤＡ１，ＤＭＣ１，ＩＳＣ１０
・染色体番号ＸＶ（Ｃｈｒ ＸＶ） ： ＨＩＲ２，ＣＫＢ２，ＧＬＯ４，ＣＵＥ５，ＷＨＩ２
これら遺伝子について、サッカロマイセス・セレビシエＢＹ４７４１ゲノムを鋳型とし、ｐＲＳ４２６ベクター上に単独でクローニングした。
上記ＤＮＡ塩基配列を解析する手順と同様にしてｐＲＳ４２６ベクターに目的の遺伝子が単独で搭載されていることを確認した後、ＨＧＴ１強化株に導入してグルタチオンストレス耐性の有無を評価することで、本スクリーニングで得られた計３種類の染色体断片それぞれについて、多コピーでグルタチオンストレスを抑圧する遺伝子、以下３種類を同定した（図３）。
・染色体番号ＸＩＩＩ ： ＲＩＭ１１
・染色体番号Ｖ ： ＢＭＨ１
・染色体番号ＸＶ ： ＷＨＩ２
上記ＤＮＡ塩基配列を解析する手順と同様にしてｐＲＳ４２６ベクターに目的の遺伝子が単独で搭載されていることを確認した後、ＨＧＴ１強化株に導入してグルタチオンストレス耐性の有無を評価することで、本スクリーニングで得られた計３種類の染色体断片それぞれについて、多コピーでグルタチオンストレスを抑圧する遺伝子、以下３種類を同定した（図３）。
・染色体番号ＸＩＩＩ ： ＲＩＭ１１
・染色体番号Ｖ ： ＢＭＨ１
・染色体番号ＸＶ ： ＷＨＩ２
図３は、ネガティブコントロール（ｐＲＳ４２６、ライブラリーのベクター）と、グルタチオンストレス耐性を示す３種類の変異体について、グルタチオンストレス感受性を比較したものである。
スポットの菌体濁度は左からＯＤ６００＝２．５，０．２５，０．０２５，０．００２５，０．０００２５であり、各１０ μｌずつスポットし、３０℃で３日間保持した。
スポットの菌体濁度は左からＯＤ６００＝２．５，０．２５，０．０２５，０．００２５，０．０００２５であり、各１０ μｌずつスポットし、３０℃で３日間保持した。
［実施例２］
＜ＲＩＭ１１強発現株の作製＞
サッカロマイセス・セレビシエＢＹ４７４１（Ｍａｔａ ｈｉｓ３Δ１ ｌｅｕ２Δ０ ｍｅｔ１５Δ０ ｕｒａ３Δ０）のゲノムＤＮＡを鋳型にして、ＲＩＭ１１遺伝子（配列番号２）の、開始コドンから７７７塩基の領域を、二種類のプライマー（配列番号１９と２０）を用いてＰＣＲで増幅させた。一方でＴＤＨ３ｐｒを二種類のプライマー（配列番号２１と２２）でＰＣＲ増幅させた。なお配列番号１９と２２のプライマーは互いに相補な１５塩基配列を含むように合成した。
＜ＲＩＭ１１強発現株の作製＞
サッカロマイセス・セレビシエＢＹ４７４１（Ｍａｔａ ｈｉｓ３Δ１ ｌｅｕ２Δ０ ｍｅｔ１５Δ０ ｕｒａ３Δ０）のゲノムＤＮＡを鋳型にして、ＲＩＭ１１遺伝子（配列番号２）の、開始コドンから７７７塩基の領域を、二種類のプライマー（配列番号１９と２０）を用いてＰＣＲで増幅させた。一方でＴＤＨ３ｐｒを二種類のプライマー（配列番号２１と２２）でＰＣＲ増幅させた。なお配列番号１９と２２のプライマーは互いに相補な１５塩基配列を含むように合成した。
ＨＩＳ３遺伝子を搭載した酵母−大腸菌シャトルベクターｐＲＳ３０３をＳａｃ ＩとＢａｍ ＨＩで消化し、ＲＩＭ１１とＴＤＨ３ｐｒ、それぞれのＰＣＲ増幅産物と混合し、ＴａＫａＲａ／Ｃｌｏｎｔｅｃｈ製ＩｎＦｕｓｉｏｎ Ｃｌｏｎｉｎｇ Ｋｉｔを用いてツーピースライゲーションを行った。ライゲーション溶液で大腸菌を形質転換しアンピシリン耐性コロニーからプラスミド、ＴＤＨ３ｐｒ−ＲＩＭ１１−ｐＲＳ３０３を調製した。
配列番号１９
5’-acataaacaaacaaaatgaatattcaaagcaataattctc-3’
配列番号２０
5’-gcagcccgggggatcctggagtacctaagattttaatg-3’
配列番号２１
5’-tatagggcgaattggagctccagttcgagtttatcattatc-3’
配列番号２２
5’-tttgtttgtttatgtgtgtttattc-3’
5’-acataaacaaacaaaatgaatattcaaagcaataattctc-3’
配列番号２０
5’-gcagcccgggggatcctggagtacctaagattttaatg-3’
配列番号２１
5’-tatagggcgaattggagctccagttcgagtttatcattatc-3’
配列番号２２
5’-tttgtttgtttatgtgtgtttattc-3’
次に同ゲノムＤＮＡをテンプレートとし、ＲＩＭ１１遺伝子のプロモーター領域（開始コドンの上流−９６１塩基から−４８塩基まで、ＲＩＭ１１ｐｒと表記）を二種類のプライマー（配列番号２３と２４）を用いてＰＣＲで増幅させた。ＴＤＨ３ｐｒ−ＲＩＭ１１−ｐＲＳ３０３をＳａｌ ＩとＥｃｏ ＲＩで切断し、上記と同じキットを用いてＰＣＲ増幅産物と連結し、ＲＩＭ１１ｐｒ−ＴＤＨ３ｐｒ−ＲＩＭ１１−ｐＲＳ３０３を得た（図４）。
配列番号２３
5’-ggccgaattcactaagtattatcaggaaac-3’
配列番号２４
5’-ccaagtcgactaatgctatgtcaagatctt-3’
5’-ggccgaattcactaagtattatcaggaaac-3’
配列番号２４
5’-ccaagtcgactaatgctatgtcaagatctt-3’
＜ＧＳＨ１強発現株の作製＞
サッカロマイセス・セレビシエＢＹ４７４１（Ｍａｔａ ｈｉｓ３Δ１ ｌｅｕ２Δ０ ｍｅｔ１５Δ０ ｕｒａ３Δ０）のゲノムＤＮＡを鋳型にして、グルタチオン合成酵素−Ｉ遺伝子（ＧＳＨ１）（アミノ酸配列：配列番号７、塩基配列：配列番号８）の翻訳領域開始コドンから１，１１８塩基までの領域を、二種類のプライマー（配列番号２５と２６）を用いてＰＣＲで増幅させた。一方でＴＤＨ３ｐｒを二種類のプライマー（配列番号２７と２８）でＰＣＲ増幅させた。なお配列番号２５と２８のプライマーは互いに相補な１５塩基配列（下線）が重複するように合成した。
サッカロマイセス・セレビシエＢＹ４７４１（Ｍａｔａ ｈｉｓ３Δ１ ｌｅｕ２Δ０ ｍｅｔ１５Δ０ ｕｒａ３Δ０）のゲノムＤＮＡを鋳型にして、グルタチオン合成酵素−Ｉ遺伝子（ＧＳＨ１）（アミノ酸配列：配列番号７、塩基配列：配列番号８）の翻訳領域開始コドンから１，１１８塩基までの領域を、二種類のプライマー（配列番号２５と２６）を用いてＰＣＲで増幅させた。一方でＴＤＨ３ｐｒを二種類のプライマー（配列番号２７と２８）でＰＣＲ増幅させた。なお配列番号２５と２８のプライマーは互いに相補な１５塩基配列（下線）が重複するように合成した。
ＬＥＵ２遺伝子を搭載した酵母−大腸菌シャトルベクターｐＲＳ３０５をＳａｃ ＩとＢａｍ ＨＩで消化し、ＧＳＨ１とＴＤＨ３ｐｒ、それぞれのＰＣＲ増幅産物と混合し、ＴａＫａＲａ／Ｃｌｏｎｔｅｃｈ製ＩｎＦｕｓｉｏｎ Ｃｌｏｎｉｎｇ Ｋｉｔを用いて２ピースライゲーションを行った。ライゲーション溶液で大腸菌を形質転換しアンピシリン耐性コロニーからプラスミド、ＴＤＨ３ｐｒ−ＧＳＨ１−ｐＲＳ３０５を調製した。
配列番号２５
5’-acataaacaaacaaaatgggactcttagctttggg-3’
配列番号２６
5’-gcagcccgggggatccttcgacccacccaagaaaag-3’
配列番号２７
5’-tatagggcgaattggagctccagttcgagtttatcattatc-3’
配列番号２８
5’-tttgtttgtttatgtgtgtttattc-3’
5’-acataaacaaacaaaatgggactcttagctttggg-3’
配列番号２６
5’-gcagcccgggggatccttcgacccacccaagaaaag-3’
配列番号２７
5’-tatagggcgaattggagctccagttcgagtttatcattatc-3’
配列番号２８
5’-tttgtttgtttatgtgtgtttattc-3’
次に同ゲノムＤＮＡをテンプレートとし、ＧＳＨ１遺伝子のプロモーター領域（開始コドンの上流−１，０００塩基から−４４１塩基まで、ＧＳＨ１ｐｒと表記）を二種類のプライマー（配列番号２９と３０）を用いてＰＣＲで増幅させた。
ＴＤＨ３ｐｒ−ＧＳＨ１−ｐＲＳ３０５をＳｍａ ＩとＸｈｏ Ｉで切断し、上記と同じキットを用いてＰＣＲ増幅産物と連結し、ＧＳＨ１ｐｒ−ＴＤＨ３ｐｒ−ＧＳＨ１−ｐＲＳ３０５を得た（図５）。ＰＣＲ増幅配列についてはＤＮＡ塩基配列を解析することで例えば塩基置換や欠失、挿入等のエラーがないことを確認した。
ＴＤＨ３ｐｒ−ＧＳＨ１−ｐＲＳ３０５をＳｍａ ＩとＸｈｏ Ｉで切断し、上記と同じキットを用いてＰＣＲ増幅産物と連結し、ＧＳＨ１ｐｒ−ＴＤＨ３ｐｒ−ＧＳＨ１−ｐＲＳ３０５を得た（図５）。ＰＣＲ増幅配列についてはＤＮＡ塩基配列を解析することで例えば塩基置換や欠失、挿入等のエラーがないことを確認した。
配列番号２９
5’-aaggatcccccgggctgcaggctcatcacggaactgtaac-3’
配列番号３０
5’-cgggccccccctcgagctccaactaccaaggttgt-3’
5’-aaggatcccccgggctgcaggctcatcacggaactgtaac-3’
配列番号３０
5’-cgggccccccctcgagctccaactaccaaggttgt-3’
酢酸リチウム法を用いることにより、当該プラスミドでＮｃｏ ＩとＨｉｎｄ ＩＩＩで消化したＧＳＨ１過剰発現カセットで、サッカロマイセス・セレビシエＢＹ４７４１（Ｍａｔａ ｈｉｓ３Δ１ ｌｅｕ２Δ０ ｍｅｔ１５Δ０ ｕｒａ３Δ０）を形質転換し、ロイシンを含まない選択培地ＳＤ−ｌｅｕにスプレッドした。ＬＥＵ２を選択マーカーとして、コロニー形成した株を選抜することで、ＧＳＨ１強発現株（ＢＹ ＧＳＨ１と表記する）を作製した。
前記のプラスミド、ＲＩＭ１１ｐｒ−ＴＤＨ３ｐｒ−ＲＩＭ１１−ｐＲＳ３０３（図４）を利用して、ＲＩＭ１１強発現ＤＮＡ断片を、サッカロマイセス・セレビシエＢＹ４７４１（Ｍａｔａ ｈｉｓ３Δ１ ｌｅｕ２Δ０ ｍｅｔ１５Δ０ ｕｒａ３Δ０）あるいは前記のＢＹ ＧＳＨ１に染色体相同組換えで導入した。
前者についてはヒスチジンを含まない選択培地ＳＤ−ｈｉｓにスプレッドした。ＨＩＳ３を選択マーカーとして、コロニー形成した株を選抜することで、ＲＩＭ１１強発現株（ＢＹ ＲＩＭ１１と表記）を作製した。
後者についてはロイシンとヒスチジンを含まない選択培地ＳＤ−ｌｅｕ−ｈｉｓにスプレッドした。ＬＥＵ２とＨＩＳ３を選択マーカーとして、コロニー形成した株を選抜することで、ＧＳＨ１強発現かつＲＩＭ１１強発現株（ＢＹ ＧＳＨ１ ＲＩＭ１１）を作製した。
後者についてはロイシンとヒスチジンを含まない選択培地ＳＤ−ｌｅｕ−ｈｉｓにスプレッドした。ＬＥＵ２とＨＩＳ３を選択マーカーとして、コロニー形成した株を選抜することで、ＧＳＨ１強発現かつＲＩＭ１１強発現株（ＢＹ ＧＳＨ１ ＲＩＭ１１）を作製した。
＜グルタチオンストレス耐性酵母（ＲＩＭ１１強化株）のＲＮＡシーケンス分析＞
［実施例３］
（１）グルタチオンストレス耐性酵母、ＢＹ ＨＧＴ１ ＲＩＭ１１の作出
実施例２記載のプラスミド、ＲＩＭ１１ｐｒ−ＴＤＨ３ｐｒ−ＲＩＭ１１−ｐＲＳ３０３（図４）を利用して、ＲＩＭ１１強発現ＤＮＡ断片を、実施例１（２）記載のＢＹ ＨＧＴ１に染色体相同組換えで導入し、グルタチオンストレス耐性酵母、ＢＹ ＨＧＴ１ ＲＩＭ１１、を作製した。
［実施例３］
（１）グルタチオンストレス耐性酵母、ＢＹ ＨＧＴ１ ＲＩＭ１１の作出
実施例２記載のプラスミド、ＲＩＭ１１ｐｒ−ＴＤＨ３ｐｒ−ＲＩＭ１１−ｐＲＳ３０３（図４）を利用して、ＲＩＭ１１強発現ＤＮＡ断片を、実施例１（２）記載のＢＹ ＨＧＴ１に染色体相同組換えで導入し、グルタチオンストレス耐性酵母、ＢＹ ＨＧＴ１ ＲＩＭ１１、を作製した。
（２）全ＲＮＡの調製
ＢＹ ＨＧＴ１ ＲＩＭ１１株からホットフェノール法により全ＲＮＡを抽出した。以下に手順を示す。
１０ ｍｌのＳＤカザミノ酸培地（組成は実施例４に記載）に、ＯＤ６００＝０．２５となるようにＢＹ ＨＧＴ１ ＲＩＭ１１前培養液を添加した。同じものを２本準備した。３０℃でＯＤ６００＝１まで振とう培養し、片方の培養液に還元型グルタチオン（ＧＳＨ）を終濃度５００ μＭとなるように無菌的に添加し引き続き３０℃で振とうさせた。
ＢＹ ＨＧＴ１ ＲＩＭ１１株からホットフェノール法により全ＲＮＡを抽出した。以下に手順を示す。
１０ ｍｌのＳＤカザミノ酸培地（組成は実施例４に記載）に、ＯＤ６００＝０．２５となるようにＢＹ ＨＧＴ１ ＲＩＭ１１前培養液を添加した。同じものを２本準備した。３０℃でＯＤ６００＝１まで振とう培養し、片方の培養液に還元型グルタチオン（ＧＳＨ）を終濃度５００ μＭとなるように無菌的に添加し引き続き３０℃で振とうさせた。
ＧＳＨ添加から２時間後、遠心分離で上清を除き酵母細胞を集め、即座に液体窒素に漬けて瞬間凍結した。６５℃のＴＥＳ Ｂｕｆｆｅｒ（１０ ｍＭ Ｔｒｉｓ−ＨＣｌ（ｐＨ ７．５）， １０ ｍＭ ＥＤＴＡ， ０．５％ ＳＤＳ）を５００ μｌ加え、即座に、６５℃の水飽和酸性フェノール（分子生物学用、和光純薬工業（製））、５００ μｌも添加しボルテックスで１分間はげしく混合させ、−２０℃で保存した。
該−２０℃保存サンプル（計２本）を６５℃で３０分間インキュベーションした。遠心分離して２００ μｌの上清を回収し、７５０ μｌのトリゾールＬＳ（インビトロジェン社製）を添加して混合し室温で５分間静置した。２００ μｌのクロロホルムを加え混合し、遠心分離操作により３００ μｌの上清を回収した後、５００ μｌのイソプロパノールを加えて混合した。
このうち沈殿含めた７００ μｌをＲＮｅａｓｙ Ｍｉｎｉ Ｋｉｔ（ＱＩＡＧＥＮ）に供し、キット付属の標準手順書に則して精製し、ＲＮａｓｅフリー水で溶解して全ＲＮＡ水溶液を得た。
（３）ライブラリー調製
市販のキット、ＴｒｕＳｅｑ ＲＮＡ Ｓａｍｐｌｅ Ｐｒｅｐ Ｋｉｔ ｖ２（イルミナ社製）、を用いてライブラリーを作製した。
市販のキット、ＴｒｕＳｅｑ ＲＮＡ Ｓａｍｐｌｅ Ｐｒｅｐ Ｋｉｔ ｖ２（イルミナ社製）、を用いてライブラリーを作製した。
（４）シーケンス解読
Ｉｌｌｕｍｉｎａ ＨｉＳｅｑ ４０００（イルミナ社製）を用い、上記ｃＤＮＡ断片の両端から１００塩基ずつを解読した（ペアエンド法）。
ＴｏｐＨａｔ（Ｂｏｗｔｉｅ ａｌｉｇｎｅｒ）を用いてサッカロマイセス・セレビシエのリファレンス、ＧＣＦ＿０００１４６０５４．２、にマッピングした。
培養液にＧＳＨを添加して２時間後に全ＲＮＡを抽出したサンプルを「ＧＳＨ＿ｐｏｓｉ＿２ｈｒ」と表記し、左記と同時にサンプリングしたＧＳＨを添加してない全ＲＮＡ抽出サンプルを「ＧＳＨ＿ｎｅｇａ＿２ｈｒ」と表記する。
表１にＲＮＡシーケンスにおけるトータルリード数とマッピングされたリード数、ならびにその割合、を示した。
Ｉｌｌｕｍｉｎａ ＨｉＳｅｑ ４０００（イルミナ社製）を用い、上記ｃＤＮＡ断片の両端から１００塩基ずつを解読した（ペアエンド法）。
ＴｏｐＨａｔ（Ｂｏｗｔｉｅ ａｌｉｇｎｅｒ）を用いてサッカロマイセス・セレビシエのリファレンス、ＧＣＦ＿０００１４６０５４．２、にマッピングした。
培養液にＧＳＨを添加して２時間後に全ＲＮＡを抽出したサンプルを「ＧＳＨ＿ｐｏｓｉ＿２ｈｒ」と表記し、左記と同時にサンプリングしたＧＳＨを添加してない全ＲＮＡ抽出サンプルを「ＧＳＨ＿ｎｅｇａ＿２ｈｒ」と表記する。
表１にＲＮＡシーケンスにおけるトータルリード数とマッピングされたリード数、ならびにその割合、を示した。
（５）データ解析
Ｃｕｆｆｌｉｎｋｓソフトウェアを用いて、「ＧＳＨ＿ｐｏｓｉ＿２ｈｒ」と「ＧＳＨ＿ｎｅｇａ＿２ｈｒ」という二つの群間についてＤＥＧ（Ｄｉｆｆｅｒｅｎｔｉａｌｌｙ ｅｘｐｒｅｓｓｅｄ ｇｅｎｅｓ）解析した。ＫＥＧＧ ｐａｔｈｗａｙデータベース（http://www.genome.jp/kegg/pathway.html）より、統計的に有意な生物学的プロセスとしてＭＡＰＫ経路や減数分裂、が抽出された。
Ｃｕｆｆｌｉｎｋｓソフトウェアを用いて、「ＧＳＨ＿ｐｏｓｉ＿２ｈｒ」と「ＧＳＨ＿ｎｅｇａ＿２ｈｒ」という二つの群間についてＤＥＧ（Ｄｉｆｆｅｒｅｎｔｉａｌｌｙ ｅｘｐｒｅｓｓｅｄ ｇｅｎｅｓ）解析した。ＫＥＧＧ ｐａｔｈｗａｙデータベース（http://www.genome.jp/kegg/pathway.html）より、統計的に有意な生物学的プロセスとしてＭＡＰＫ経路や減数分裂、が抽出された。
＜ＲＩＭ１１遺伝子発現強化株のグルタチオン生産＞
［実施例４］
前記ＢＹ ＲＩＭ１１およびＢＹ ＧＳＨ１ ＲＩＭ１１株をＳＤカザミノ酸培地（１．７ ｇ／Ｌ Ｙｅａｓｔ ｎｉｔｒｏｇｅｎ ｂａｓｅ ｗ／ｏ Ａｍｉｎｏ Ａｃｉｄｓ ａｎｄ Ａｍｍｏｎｉｕｍ Ｓｕｌｆａｔｅ、２ ｇ／Ｌ Ｖｉｔａｍｉｎ Ａｓｓａｙ Ｃａｓａｍｉｎｏ Ａｃｉｄｓ（以上Ｄｉｆｃｏ ｌａｂｏｒａｔｏｒｉｅｓ社製）、５ ｇ／Ｌ Ａｍｍｏｎｉｕｍ Ｓｕｌｆａｔｅ、２０ ｇ／Ｌ グルコース（以上和光純薬工業（株）製）、Ａｄｅｎｉｎｅ Ｓｕｌｆａｔｅ ２０ ｍｇ／Ｌ、Ｕｒａｃｉｌ ２０ ｍｇ／Ｌ（以上Ｓｉｇｍａ Ａｌｄｒｉｃｈ社製）、Ｔｒｙｐｔｏｐｈａｎ ２０ ｍｇ／Ｌ（和光純薬工業（株）製））、１０ ｍｌで３０℃、一晩振盪することにより種母培養を行った。
［実施例４］
前記ＢＹ ＲＩＭ１１およびＢＹ ＧＳＨ１ ＲＩＭ１１株をＳＤカザミノ酸培地（１．７ ｇ／Ｌ Ｙｅａｓｔ ｎｉｔｒｏｇｅｎ ｂａｓｅ ｗ／ｏ Ａｍｉｎｏ Ａｃｉｄｓ ａｎｄ Ａｍｍｏｎｉｕｍ Ｓｕｌｆａｔｅ、２ ｇ／Ｌ Ｖｉｔａｍｉｎ Ａｓｓａｙ Ｃａｓａｍｉｎｏ Ａｃｉｄｓ（以上Ｄｉｆｃｏ ｌａｂｏｒａｔｏｒｉｅｓ社製）、５ ｇ／Ｌ Ａｍｍｏｎｉｕｍ Ｓｕｌｆａｔｅ、２０ ｇ／Ｌ グルコース（以上和光純薬工業（株）製）、Ａｄｅｎｉｎｅ Ｓｕｌｆａｔｅ ２０ ｍｇ／Ｌ、Ｕｒａｃｉｌ ２０ ｍｇ／Ｌ（以上Ｓｉｇｍａ Ａｌｄｒｉｃｈ社製）、Ｔｒｙｐｔｏｐｈａｎ ２０ ｍｇ／Ｌ（和光純薬工業（株）製））、１０ ｍｌで３０℃、一晩振盪することにより種母培養を行った。
次に、上記と同じ組成の新しいＳＤカザミノ酸培地、１０ ｍｌを含むＬ字試験管にＯＤ６００＝０．２５となるように種母培養液を植菌し、３０℃で撹拌６０ ｒｐｍの条件で７時間培養を行い（このときの培養段階は対数増殖期）、培養液の一部をＯＤ・Ｕｎｉｔｓ＝５［ｃｍ・ｍｌ］となるように遠心分離操作で回収した。残りは同じ条件で培養を継続し、種母培養液添加から１８時間後（このときの培養段階は定常期）に培養液をＯＤ・Ｕｎｉｔｓ＝５［ｃｍ・ｍｌ］となるように遠心分離機で回収した。
［比較例１］
比較対象として、ＢＹ４７４１とＢＹ ＧＳＨ１も上記［実施例４］と同様の手順で培養し菌体を回収した。
比較対象として、ＢＹ４７４１とＢＹ ＧＳＨ１も上記［実施例４］と同様の手順で培養し菌体を回収した。
［実施例５］
＜ＢＹ ＲＩＭ１１およびＢＹ ＧＳＨ１ ＲＩＭ１１のグルタチオン抽出液の調製＞
菌体を０．１％Ｗ／Ｗの５−スルホサリチル酸水溶液（５−ＳＳＡ）で二回洗浄し、８０ μｌの１％Ｗ／Ｗ ５−ＳＳＡを加え懸濁した。９５℃で５分間熱処理して菌体内のグルタチオンを抽出し、冷却後、遠心分離して回収した上清を−２０℃で保存した。当該抽出液を融解後、水で１０倍希釈して０．１％Ｗ／Ｗ ５−ＳＳＡ グルタチオン抽出液を調製した。該抽出液の総グルタチオン濃度はグルタチオンレダクターゼ−ＤＴＮＢ法（ＧＲ−ＤＴＮＢ法）で分析した。
＜ＢＹ ＲＩＭ１１およびＢＹ ＧＳＨ１ ＲＩＭ１１のグルタチオン抽出液の調製＞
菌体を０．１％Ｗ／Ｗの５−スルホサリチル酸水溶液（５−ＳＳＡ）で二回洗浄し、８０ μｌの１％Ｗ／Ｗ ５−ＳＳＡを加え懸濁した。９５℃で５分間熱処理して菌体内のグルタチオンを抽出し、冷却後、遠心分離して回収した上清を−２０℃で保存した。当該抽出液を融解後、水で１０倍希釈して０．１％Ｗ／Ｗ ５−ＳＳＡ グルタチオン抽出液を調製した。該抽出液の総グルタチオン濃度はグルタチオンレダクターゼ−ＤＴＮＢ法（ＧＲ−ＤＴＮＢ法）で分析した。
［比較例２］
＜ＢＹ４７４１およびＢＹ ＧＳＨ１のグルタチオン抽出液の調製＞
比較対象として、ＢＹ４７４１とＢＹ ＧＳＨ１、それぞれのグルタチオン抽出液を上記実施例５と同様の手順に従い調製した。
＜ＢＹ４７４１およびＢＹ ＧＳＨ１のグルタチオン抽出液の調製＞
比較対象として、ＢＹ４７４１とＢＹ ＧＳＨ１、それぞれのグルタチオン抽出液を上記実施例５と同様の手順に従い調製した。
［実施例６］
＜ＢＹ ＲＩＭ１１およびＢＹ ＧＳＨ１ ＲＩＭ１１抽出液の総グルタチオン分析＞
実施例５で得たグルタチオン抽出液のうち、１０ μｌを分取して７０ μｌの５−ＳＳＡ水溶液で希釈した。ここに以下組成の反応液を１２０ μｌ添加してマイクロプレートリーダーを用いて５分毎に３回、ＯＤが４２０ ｎｍの吸光度の変化を測定した。なお各サンプル三連で実施し、測定値はその平均値とした。
一方で、還元型グルタチオンの０．１％Ｗ／Ｗ５−ＳＳＡ水溶液を準備し、０．１％Ｗ／Ｗ５−ＳＳＡ水溶液で適宜希釈して段階的に濃度が異なるグルタチオン標準溶液を調製した。これらも三連で５分毎に３回、上述分析用サンプルと同時にＯＤ４２０の吸光度を測定し、該数値差とグルタチオン濃度から検量線を描画した。
各分析サンプルの吸光度差の大きさと上記検量線、希釈倍率と抽出液量８０ μｌを乗することにより、ＯＤ・Ｕｎｉｔｓ＝５．０［ｃｍ・ｍｌ］におけるＢＹ ＲＩＭ１１およびＢＹ ＧＳＨ１ ＲＩＭ１１抽出液中の総グルタチオン含量を算出した。
＜ＢＹ ＲＩＭ１１およびＢＹ ＧＳＨ１ ＲＩＭ１１抽出液の総グルタチオン分析＞
実施例５で得たグルタチオン抽出液のうち、１０ μｌを分取して７０ μｌの５−ＳＳＡ水溶液で希釈した。ここに以下組成の反応液を１２０ μｌ添加してマイクロプレートリーダーを用いて５分毎に３回、ＯＤが４２０ ｎｍの吸光度の変化を測定した。なお各サンプル三連で実施し、測定値はその平均値とした。
一方で、還元型グルタチオンの０．１％Ｗ／Ｗ５−ＳＳＡ水溶液を準備し、０．１％Ｗ／Ｗ５−ＳＳＡ水溶液で適宜希釈して段階的に濃度が異なるグルタチオン標準溶液を調製した。これらも三連で５分毎に３回、上述分析用サンプルと同時にＯＤ４２０の吸光度を測定し、該数値差とグルタチオン濃度から検量線を描画した。
各分析サンプルの吸光度差の大きさと上記検量線、希釈倍率と抽出液量８０ μｌを乗することにより、ＯＤ・Ｕｎｉｔｓ＝５．０［ｃｍ・ｍｌ］におけるＢＹ ＲＩＭ１１およびＢＹ ＧＳＨ１ ＲＩＭ１１抽出液中の総グルタチオン含量を算出した。
［比較例３］
＜ＢＹ４７４１およびＢＹ ＧＳＨ１抽出液の総グルタチオン分析＞
比較対照として、ＢＹ４７４１とＢＹ ＧＳＨ１、それぞれの総グルタチオン含量を上記実施例６と同様の手順で算出した。以上の結果を図６に示す。
＜ＢＹ４７４１およびＢＹ ＧＳＨ１抽出液の総グルタチオン分析＞
比較対照として、ＢＹ４７４１とＢＹ ＧＳＨ１、それぞれの総グルタチオン含量を上記実施例６と同様の手順で算出した。以上の結果を図６に示す。
ＧＲ−ＤＴＮＢ法の反応液の組成：
（１）リン酸カリウム緩衝液（ｐＨ ７．５）の調製
ａ） ０．１ Ｍ Ｐｏｔａｓｓｉｕｍ Ｄｉｈｙｄｒｏｇｅｎ Ｐｈｏｓｐｈａｔｅ
ｂ） ０．１ Ｍ Ｄｉｐｏｔａｓｓｉｕｍ Ｈｙｄｒｏｇｅｎ Ｐｈｏｓｐｈａｔｅ
ａ）とｂ）を混合してｐＨ ７．５に調整した。
ｃ）０．００５ Ｍ ＥＤＴＡ・２Ｎａ・２Ｈ２Ｏ （同仁化学研究所製）
（１）リン酸カリウム緩衝液（ｐＨ ７．５）の調製
ａ） ０．１ Ｍ Ｐｏｔａｓｓｉｕｍ Ｄｉｈｙｄｒｏｇｅｎ Ｐｈｏｓｐｈａｔｅ
ｂ） ０．１ Ｍ Ｄｉｐｏｔａｓｓｉｕｍ Ｈｙｄｒｏｇｅｎ Ｐｈｏｓｐｈａｔｅ
ａ）とｂ）を混合してｐＨ ７．５に調整した。
ｃ）０．００５ Ｍ ＥＤＴＡ・２Ｎａ・２Ｈ２Ｏ （同仁化学研究所製）
（２）反応液の調製
前記リン酸カリウム緩衝液（ｐＨ ７．５）１２ ｍｌに対し２ ｍｇのβ−ＮＡＤＰＨ（オリエンタル酵母工業製）と８ ｍｇのＤＴＮＢ（同仁化学研究所製）を添加して溶解後、グルタチオンレダクターゼ（オリエンタル酵母工業製）を１．２ μｌ添加した。反応液は分析前に用時調製した。
前記リン酸カリウム緩衝液（ｐＨ ７．５）１２ ｍｌに対し２ ｍｇのβ−ＮＡＤＰＨ（オリエンタル酵母工業製）と８ ｍｇのＤＴＮＢ（同仁化学研究所製）を添加して溶解後、グルタチオンレダクターゼ（オリエンタル酵母工業製）を１．２ μｌ添加した。反応液は分析前に用時調製した。
[実施例７]
＜ＲＩＭ１１強化株、他の増殖性＞
実施例４および比較例１で使用した３種類の変異体と、ＢＹ４７４１について、
種母培養液をＯＤ６００＝０．１となるように新しいＳＤカザミノ酸培地に植菌し、３０℃、７０ ｒｐｍ−１で振盪培養した。結果を図７に示す。
図７より、ＢＹ ＧＳＨ１はＢＹ４７４１（野生型）よりも増殖の立ち上がりが遅く、定常期の菌体数（バイオマス）も小さかった。一方でＢＹ ＧＳＨ１ ＲＩＭ１１はＢＹ ＧＳＨ１と比べて増殖速度と菌体数の点で、共に改善が見られた。
＜ＲＩＭ１１強化株、他の増殖性＞
実施例４および比較例１で使用した３種類の変異体と、ＢＹ４７４１について、
種母培養液をＯＤ６００＝０．１となるように新しいＳＤカザミノ酸培地に植菌し、３０℃、７０ ｒｐｍ−１で振盪培養した。結果を図７に示す。
図７より、ＢＹ ＧＳＨ１はＢＹ４７４１（野生型）よりも増殖の立ち上がりが遅く、定常期の菌体数（バイオマス）も小さかった。一方でＢＹ ＧＳＨ１ ＲＩＭ１１はＢＹ ＧＳＨ１と比べて増殖速度と菌体数の点で、共に改善が見られた。
以上実施例６の図６と、実施例７の図７の結果より、グルタチオンストレス耐性を付与させることで、酵母のグルタチオン生産性を向上させることが出来ることを確認した。
［実施例８］
ＲＩＭ１１遺伝子、ＩＭＥ１遺伝子、ならびにＵＭＥ６遺伝子破壊株（ＯｐｅｎＢｉｏｓｙｓｔｅｍｓ社製）、それぞれを実施例１記載のグルタチオントランスポーターＨＧＴ１強発現用カセットで形質転換した。ＬＥＵ２を選択マーカーとして、ＳＤ−ｌｅｕに塗布しコロニー形成させることで選抜した。このようにしてΔｒｉｍ１１ ＨＧＴ１、Δｉｍｅ１ ＨＧＴ１、ならびにΔｕｍｅ６ ＨＧＴ１を得た。
図８より、Δｕｍｅ６ ＨＧＴ１はグルタチオンストレス高感受性に陥ったことから、Ｕｍｅ６が酵母にグルタチオンストレス耐性の付与に関与することが新規に判明した。
ＲＩＭ１１遺伝子、ＩＭＥ１遺伝子、ならびにＵＭＥ６遺伝子破壊株（ＯｐｅｎＢｉｏｓｙｓｔｅｍｓ社製）、それぞれを実施例１記載のグルタチオントランスポーターＨＧＴ１強発現用カセットで形質転換した。ＬＥＵ２を選択マーカーとして、ＳＤ−ｌｅｕに塗布しコロニー形成させることで選抜した。このようにしてΔｒｉｍ１１ ＨＧＴ１、Δｉｍｅ１ ＨＧＴ１、ならびにΔｕｍｅ６ ＨＧＴ１を得た。
図８より、Δｕｍｅ６ ＨＧＴ１はグルタチオンストレス高感受性に陥ったことから、Ｕｍｅ６が酵母にグルタチオンストレス耐性の付与に関与することが新規に判明した。
［実施例９］
図９記載の各変異体をＳＤカザミノ酸液体培地中に菌体濁度ＯＤ６００＝０．１となるように植菌し、３０℃、７０ ｒｐｍ−１で振とう培養した。
図９より、グルタチオンストレス誘導条件（ｗｉｔｈ ＧＳＨ）でΔｒｉｍ１１ ＨＧＴ１とΔｕｍｅ６ ＨＧＴ１の増殖性が著しく低下した。上記[実施例８]の結果も併せて、Ｒｉｍ１１とＵｍｅ６がグルタチオンストレス耐性の発現に機能することが確認された。
図９記載の各変異体をＳＤカザミノ酸液体培地中に菌体濁度ＯＤ６００＝０．１となるように植菌し、３０℃、７０ ｒｐｍ−１で振とう培養した。
図９より、グルタチオンストレス誘導条件（ｗｉｔｈ ＧＳＨ）でΔｒｉｍ１１ ＨＧＴ１とΔｕｍｅ６ ＨＧＴ１の増殖性が著しく低下した。上記[実施例８]の結果も併せて、Ｒｉｍ１１とＵｍｅ６がグルタチオンストレス耐性の発現に機能することが確認された。
［実施例１０］
上記実施例８で、対象とする酵母菌株をＳＩＮ３遺伝子破壊株（ＯｐｅｎＢｉｏｓｙｓｔｅｍｓ社製）にしたこと以外は、実施例８記載の方法に順ずる。このようにして
Δｓｉｎ３ ＨＧＴ１を得た。配列番号３１と３２に記載の二種類のプライマーを用い、ｐＲＳ３０６（ＵＲＡ３）を鋳型にしてＵＲＡ３遺伝子をＰＣＲ増幅した。該増幅産物でΔｓｉｎ３ ＨＧＴ１を形質転換し、ＳＤ−Ｕｒａ寒天培地に塗布した。ＲＰＤ３遺伝子の翻訳領域がＰＣＲ増幅産物で組換えられ、遺伝子機能が破壊されたΔｒｐｄ３Δｓｉｎ３ ＨＧＴ１を、ＵＲＡ３遺伝子を選択マーカーとして選抜した。
図１０のスポットアッセイは、実施例８に記載の方法と同様に行った。
図１０より、Δｓｉｎ３ ＨＧＴ１のグルタチオン感受性はＢＹ ＨＧＴ１よりも大きく、Δｒｐｄ３Δｓｉｎ３ ＨＧＴ１では、より高感受性だった。
以上、実施例８〜１０の結果より、エピジェネティクス機構で互いに協調して機能するＵｍｅ６、ＲＰＤ３、ＳＩＮ３が、酵母にグルタチオンストレス耐性を付与する際に重要であることが明らかになった。
上記実施例８で、対象とする酵母菌株をＳＩＮ３遺伝子破壊株（ＯｐｅｎＢｉｏｓｙｓｔｅｍｓ社製）にしたこと以外は、実施例８記載の方法に順ずる。このようにして
Δｓｉｎ３ ＨＧＴ１を得た。配列番号３１と３２に記載の二種類のプライマーを用い、ｐＲＳ３０６（ＵＲＡ３）を鋳型にしてＵＲＡ３遺伝子をＰＣＲ増幅した。該増幅産物でΔｓｉｎ３ ＨＧＴ１を形質転換し、ＳＤ−Ｕｒａ寒天培地に塗布した。ＲＰＤ３遺伝子の翻訳領域がＰＣＲ増幅産物で組換えられ、遺伝子機能が破壊されたΔｒｐｄ３Δｓｉｎ３ ＨＧＴ１を、ＵＲＡ３遺伝子を選択マーカーとして選抜した。
図１０のスポットアッセイは、実施例８に記載の方法と同様に行った。
図１０より、Δｓｉｎ３ ＨＧＴ１のグルタチオン感受性はＢＹ ＨＧＴ１よりも大きく、Δｒｐｄ３Δｓｉｎ３ ＨＧＴ１では、より高感受性だった。
以上、実施例８〜１０の結果より、エピジェネティクス機構で互いに協調して機能するＵｍｅ６、ＲＰＤ３、ＳＩＮ３が、酵母にグルタチオンストレス耐性を付与する際に重要であることが明らかになった。
配列番号３１
5’-caattgcgccatacaaaacattcgtggctacaactcgatatccgtgcagcttaactatgcggcatcagag-3’
配列番号３２
5’-atgtaaataacacatataggcaattttcttcgaaacgtatgggacgcggtcctgatgcggtattttctcc-3’
5’-caattgcgccatacaaaacattcgtggctacaactcgatatccgtgcagcttaactatgcggcatcagag-3’
配列番号３２
5’-atgtaaataacacatataggcaattttcttcgaaacgtatgggacgcggtcctgatgcggtattttctcc-3’
Claims (6)
- 下記（ａ）、（ｂ）または（ｃ）の生物学的プロセスに属する遺伝子で親株を形質転換して得られる、親株と比べてグルタチオンストレス耐性の向上した酵母。
（ａ）Ｍｉｔｏｇｅｎ ａｃｔｉｖａｔｅｄ−ｐｒｏｔｅｉｎ ｋｉｎａｓｅ（ＭＡＰＫ）経路
（ｂ）減数分裂
（ｃ）エピジェネティクス機構 - 請求項１の生物学的プロセスに属する遺伝子が、下記（Ａ）〜（Ｃ）のいずれかのアミノ酸配列をコードするＤＮＡで親株を形質転換して得られる、親株と比べてグルタチオンストレス耐性の向上した酵母。
（Ａ）配列番号１のアミノ酸配列と６５％以上の相同性を有するアミノ酸配列
（Ｂ）配列番号２のアミノ酸配列と６５％以上の相同性を有するアミノ酸配列
（Ｃ）配列番号３のアミノ酸配列と６５％以上の相同性を有するアミノ酸配列 - 請求項２記載の酵母であって、かつ配列番号７のアミノ酸配列と６５％以上の相同性を有するアミノ酸配列をコードするＤＮＡで親株を形質転換して得られる酵母である、親株と比べてグルタチオンストレス耐性の向上した酵母。
- （ａ）ＭＡＰＫ経路の下流で機能する生物学的プロセスであって、細胞分裂段階を外部の生育環境変化に応答して適宜、体細胞分裂または減数分裂、あるいは分裂の一時停止期（Ｇ１停止, Ｇ２停止）に移行させる下記（Ｉ）の機構に属する遺伝子で親株を形質転換して得られる、親株と比べてグルタチオンストレス耐性の向上した酵母。
（Ｉ）エピジェネティクス機構 - 請求項４の生物学的プロセスに属する遺伝子が、下記（Ｄ）〜（Ｆ）のいずれかのアミノ酸配列をコードするＤＮＡで親株を形質転換して得られる、親株と比べてグルタチオンストレス耐性の向上した酵母。
（Ｄ）配列番号３３のアミノ酸配列と６５％以上の相同性を有するアミノ酸配列
（Ｅ）配列番号３４のアミノ酸配列と６５％以上の相同性を有するアミノ酸配列
（Ｆ）配列番号３５のアミノ酸配列と６５％以上の相同性を有するアミノ酸配列
- 請求項１〜５のいずれかに記載の酵母を培養する工程を含む、グルタチオンの製造方法。
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|---|---|
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Cited By (1)
| Publication number | Priority date | Publication date | Assignee | Title |
|---|---|---|---|---|
| JP2023503128A (ja) * | 2020-04-03 | 2023-01-26 | シージェイ チェイルジェダン コーポレーション | 新規なプロモーター及びそれを用いたグルタチオン生産方法 |
-
2018
- 2018-06-07 JP JP2018109210A patent/JP2018201508A/ja active Pending
Non-Patent Citations (4)
| Title |
|---|
| FEBS LETT., vol. 302, no. 2, JPN6022011660, 1992, pages 145 - 150, ISSN: 0004992032 * |
| GENETICS, vol. 206, JPN6022011663, 2 May 2017 (2017-05-02), pages 829 - 842, ISSN: 0004992030 * |
| J. GEN. MICROBIOL., vol. 131, JPN6022011659, 1985, pages 1797 - 1806, ISSN: 0004992033 * |
| MOL. CELL. BIOL., vol. 10, no. 11, JPN6022011662, 1990, pages 5927 - 5936, ISSN: 0004992031 * |
Cited By (2)
| Publication number | Priority date | Publication date | Assignee | Title |
|---|---|---|---|---|
| JP2023503128A (ja) * | 2020-04-03 | 2023-01-26 | シージェイ チェイルジェダン コーポレーション | 新規なプロモーター及びそれを用いたグルタチオン生産方法 |
| JP7467627B2 (ja) | 2020-04-03 | 2024-04-15 | シージェイ チェイルジェダン コーポレーション | 新規なプロモーター及びそれを用いたグルタチオン生産方法 |
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