JP6695802B2 - 変異酵素及びその用途 - Google Patents
変異酵素及びその用途 Download PDFInfo
- Publication number
- JP6695802B2 JP6695802B2 JP2016545444A JP2016545444A JP6695802B2 JP 6695802 B2 JP6695802 B2 JP 6695802B2 JP 2016545444 A JP2016545444 A JP 2016545444A JP 2016545444 A JP2016545444 A JP 2016545444A JP 6695802 B2 JP6695802 B2 JP 6695802B2
- Authority
- JP
- Japan
- Prior art keywords
- amino acid
- acid sequence
- enzyme
- seq
- mutant
- Prior art date
- Legal status (The legal status is an assumption and is not a legal conclusion. Google has not performed a legal analysis and makes no representation as to the accuracy of the status listed.)
- Active
Links
- 102000004190 Enzymes Human genes 0.000 title claims description 166
- 108090000790 Enzymes Proteins 0.000 title claims description 166
- 229940088598 enzyme Drugs 0.000 claims description 165
- 239000004366 Glucose oxidase Substances 0.000 claims description 143
- 108010015776 Glucose oxidase Proteins 0.000 claims description 143
- 229940116332 glucose oxidase Drugs 0.000 claims description 143
- 235000019420 glucose oxidase Nutrition 0.000 claims description 143
- 235000001014 amino acid Nutrition 0.000 claims description 126
- 150000001413 amino acids Chemical class 0.000 claims description 118
- 125000003275 alpha amino acid group Chemical group 0.000 claims description 107
- 238000000034 method Methods 0.000 claims description 63
- WQZGKKKJIJFFOK-GASJEMHNSA-N Glucose Natural products OC[C@H]1OC(O)[C@H](O)[C@@H](O)[C@@H]1O WQZGKKKJIJFFOK-GASJEMHNSA-N 0.000 claims description 56
- 108090000623 proteins and genes Proteins 0.000 claims description 56
- 239000008103 glucose Substances 0.000 claims description 55
- 150000007523 nucleic acids Chemical class 0.000 claims description 53
- 102000039446 nucleic acids Human genes 0.000 claims description 49
- 108020004707 nucleic acids Proteins 0.000 claims description 49
- 108010050375 Glucose 1-Dehydrogenase Proteins 0.000 claims description 43
- 238000006467 substitution reaction Methods 0.000 claims description 37
- 230000000694 effects Effects 0.000 claims description 36
- 241000228245 Aspergillus niger Species 0.000 claims description 35
- 238000005259 measurement Methods 0.000 claims description 21
- 244000005700 microbiome Species 0.000 claims description 19
- 239000004475 Arginine Substances 0.000 claims description 18
- ODKSFYDXXFIFQN-UHFFFAOYSA-N arginine Natural products OC(=O)C(N)CCCNC(N)=N ODKSFYDXXFIFQN-UHFFFAOYSA-N 0.000 claims description 18
- 230000014509 gene expression Effects 0.000 claims description 16
- 239000013598 vector Substances 0.000 claims description 15
- WHUUTDBJXJRKMK-UHFFFAOYSA-N Glutamic acid Natural products OC(=O)C(N)CCC(O)=O WHUUTDBJXJRKMK-UHFFFAOYSA-N 0.000 claims description 13
- ONIBWKKTOPOVIA-UHFFFAOYSA-N Proline Natural products OC(=O)C1CCCN1 ONIBWKKTOPOVIA-UHFFFAOYSA-N 0.000 claims description 13
- 239000003153 chemical reaction reagent Substances 0.000 claims description 13
- 235000013922 glutamic acid Nutrition 0.000 claims description 13
- 239000004220 glutamic acid Substances 0.000 claims description 13
- WHUUTDBJXJRKMK-VKHMYHEASA-N L-glutamic acid Chemical compound OC(=O)[C@@H](N)CCC(O)=O WHUUTDBJXJRKMK-VKHMYHEASA-N 0.000 claims description 12
- ZDXPYRJPNDTMRX-VKHMYHEASA-N L-glutamine Chemical compound OC(=O)[C@@H](N)CCC(N)=O ZDXPYRJPNDTMRX-VKHMYHEASA-N 0.000 claims description 12
- ZDXPYRJPNDTMRX-UHFFFAOYSA-N glutamine Natural products OC(=O)C(N)CCC(N)=O ZDXPYRJPNDTMRX-UHFFFAOYSA-N 0.000 claims description 12
- 241000228143 Penicillium Species 0.000 claims description 11
- 108020004511 Recombinant DNA Proteins 0.000 claims description 9
- FWMNVWWHGCHHJJ-SKKKGAJSSA-N 4-amino-1-[(2r)-6-amino-2-[[(2r)-2-[[(2r)-2-[[(2r)-2-amino-3-phenylpropanoyl]amino]-3-phenylpropanoyl]amino]-4-methylpentanoyl]amino]hexanoyl]piperidine-4-carboxylic acid Chemical compound C([C@H](C(=O)N[C@H](CC(C)C)C(=O)N[C@H](CCCCN)C(=O)N1CCC(N)(CC1)C(O)=O)NC(=O)[C@H](N)CC=1C=CC=CC=1)C1=CC=CC=C1 FWMNVWWHGCHHJJ-SKKKGAJSSA-N 0.000 claims description 8
- ODKSFYDXXFIFQN-BYPYZUCNSA-P L-argininium(2+) Chemical compound NC(=[NH2+])NCCC[C@H]([NH3+])C(O)=O ODKSFYDXXFIFQN-BYPYZUCNSA-P 0.000 claims description 8
- 238000013461 design Methods 0.000 claims description 7
- 238000002360 preparation method Methods 0.000 claims description 7
- 125000000637 arginyl group Chemical group N[C@@H](CCCNC(N)=N)C(=O)* 0.000 claims description 6
- 238000000691 measurement method Methods 0.000 claims description 3
- 239000002994 raw material Substances 0.000 claims description 3
- 108090000854 Oxidoreductases Proteins 0.000 claims 1
- 102000004316 Oxidoreductases Human genes 0.000 claims 1
- 229940024606 amino acid Drugs 0.000 description 103
- 230000035772 mutation Effects 0.000 description 46
- 239000000758 substrate Substances 0.000 description 34
- 239000002585 base Substances 0.000 description 24
- 102000004169 proteins and genes Human genes 0.000 description 24
- 210000004027 cell Anatomy 0.000 description 23
- 235000018102 proteins Nutrition 0.000 description 22
- 230000014616 translation Effects 0.000 description 18
- 230000000875 corresponding effect Effects 0.000 description 16
- 235000009697 arginine Nutrition 0.000 description 15
- 239000013604 expression vector Substances 0.000 description 12
- 239000000243 solution Substances 0.000 description 12
- 239000000047 product Substances 0.000 description 11
- 235000013930 proline Nutrition 0.000 description 10
- 238000013518 transcription Methods 0.000 description 10
- 230000035897 transcription Effects 0.000 description 10
- 238000013519 translation Methods 0.000 description 10
- 239000013078 crystal Substances 0.000 description 9
- 235000004554 glutamine Nutrition 0.000 description 9
- 239000002773 nucleotide Substances 0.000 description 9
- 125000003729 nucleotide group Chemical group 0.000 description 9
- 108020004414 DNA Proteins 0.000 description 8
- XUJNEKJLAYXESH-REOHCLBHSA-N L-Cysteine Chemical compound SC[C@H](N)C(O)=O XUJNEKJLAYXESH-REOHCLBHSA-N 0.000 description 8
- XUJNEKJLAYXESH-UHFFFAOYSA-N cysteine Natural products SCC(N)C(O)=O XUJNEKJLAYXESH-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 8
- 235000018417 cysteine Nutrition 0.000 description 8
- 238000000338 in vitro Methods 0.000 description 8
- 238000001243 protein synthesis Methods 0.000 description 8
- 241000588724 Escherichia coli Species 0.000 description 7
- 238000006243 chemical reaction Methods 0.000 description 7
- 230000000813 microbial effect Effects 0.000 description 7
- DCXYFEDJOCDNAF-UHFFFAOYSA-N Asparagine Chemical compound OC(=O)C(N)CC(N)=O DCXYFEDJOCDNAF-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 6
- SRBFZHDQGSBBOR-IOVATXLUSA-N D-xylopyranose Chemical compound O[C@@H]1COC(O)[C@H](O)[C@H]1O SRBFZHDQGSBBOR-IOVATXLUSA-N 0.000 description 6
- LFQSCWFLJHTTHZ-UHFFFAOYSA-N Ethanol Chemical compound CCO LFQSCWFLJHTTHZ-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 6
- 239000000523 sample Substances 0.000 description 6
- 240000006439 Aspergillus oryzae Species 0.000 description 5
- 235000002247 Aspergillus oryzae Nutrition 0.000 description 5
- DHMQDGOQFOQNFH-UHFFFAOYSA-N Glycine Natural products NCC(O)=O DHMQDGOQFOQNFH-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 5
- ONIBWKKTOPOVIA-BYPYZUCNSA-N L-Proline Chemical compound OC(=O)[C@@H]1CCCN1 ONIBWKKTOPOVIA-BYPYZUCNSA-N 0.000 description 5
- 241000235343 Saccharomycetales Species 0.000 description 5
- 230000015572 biosynthetic process Effects 0.000 description 5
- 239000008280 blood Substances 0.000 description 5
- 210000004369 blood Anatomy 0.000 description 5
- 239000000284 extract Substances 0.000 description 5
- 238000010353 genetic engineering Methods 0.000 description 5
- 238000003780 insertion Methods 0.000 description 5
- 230000037431 insertion Effects 0.000 description 5
- 238000010369 molecular cloning Methods 0.000 description 5
- ZHNUHDYFZUAESO-UHFFFAOYSA-N Formamide Chemical compound NC=O ZHNUHDYFZUAESO-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 4
- ISWSIDIOOBJBQZ-UHFFFAOYSA-N Phenol Chemical compound OC1=CC=CC=C1 ISWSIDIOOBJBQZ-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 4
- MTCFGRXMJLQNBG-UHFFFAOYSA-N Serine Natural products OCC(N)C(O)=O MTCFGRXMJLQNBG-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 4
- FAPWRFPIFSIZLT-UHFFFAOYSA-M Sodium chloride Chemical compound [Na+].[Cl-] FAPWRFPIFSIZLT-UHFFFAOYSA-M 0.000 description 4
- 238000002835 absorbance Methods 0.000 description 4
- QVGXLLKOCUKJST-UHFFFAOYSA-N atomic oxygen Chemical compound [O] QVGXLLKOCUKJST-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 4
- 239000007853 buffer solution Substances 0.000 description 4
- OSASVXMJTNOKOY-UHFFFAOYSA-N chlorobutanol Chemical compound CC(C)(O)C(Cl)(Cl)Cl OSASVXMJTNOKOY-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 4
- 230000000295 complement effect Effects 0.000 description 4
- 230000006872 improvement Effects 0.000 description 4
- 229910052760 oxygen Inorganic materials 0.000 description 4
- 239000001301 oxygen Substances 0.000 description 4
- 239000013612 plasmid Substances 0.000 description 4
- 239000003755 preservative agent Substances 0.000 description 4
- 235000004400 serine Nutrition 0.000 description 4
- HEMHJVSKTPXQMS-UHFFFAOYSA-M sodium hydroxide Inorganic materials [OH-].[Na+] HEMHJVSKTPXQMS-UHFFFAOYSA-M 0.000 description 4
- 238000003786 synthesis reaction Methods 0.000 description 4
- MTCFGRXMJLQNBG-REOHCLBHSA-N (2S)-2-Amino-3-hydroxypropansäure Chemical compound OC[C@H](N)C(O)=O MTCFGRXMJLQNBG-REOHCLBHSA-N 0.000 description 3
- 108091032973 (ribonucleotides)n+m Proteins 0.000 description 3
- CSCPPACGZOOCGX-UHFFFAOYSA-N Acetone Chemical compound CC(C)=O CSCPPACGZOOCGX-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 3
- PEDCQBHIVMGVHV-UHFFFAOYSA-N Glycerine Chemical compound OCC(O)CO PEDCQBHIVMGVHV-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 3
- 239000004471 Glycine Substances 0.000 description 3
- AGPKZVBTJJNPAG-WHFBIAKZSA-N L-isoleucine Chemical compound CC[C@H](C)[C@H](N)C(O)=O AGPKZVBTJJNPAG-WHFBIAKZSA-N 0.000 description 3
- ROHFNLRQFUQHCH-YFKPBYRVSA-N L-leucine Chemical compound CC(C)C[C@H](N)C(O)=O ROHFNLRQFUQHCH-YFKPBYRVSA-N 0.000 description 3
- FFEARJCKVFRZRR-BYPYZUCNSA-N L-methionine Chemical compound CSCC[C@H](N)C(O)=O FFEARJCKVFRZRR-BYPYZUCNSA-N 0.000 description 3
- AYFVYJQAPQTCCC-GBXIJSLDSA-N L-threonine Chemical compound C[C@@H](O)[C@H](N)C(O)=O AYFVYJQAPQTCCC-GBXIJSLDSA-N 0.000 description 3
- QIVBCDIJIAJPQS-VIFPVBQESA-N L-tryptophane Chemical compound C1=CC=C2C(C[C@H](N)C(O)=O)=CNC2=C1 QIVBCDIJIAJPQS-VIFPVBQESA-N 0.000 description 3
- KZSNJWFQEVHDMF-BYPYZUCNSA-N L-valine Chemical compound CC(C)[C@H](N)C(O)=O KZSNJWFQEVHDMF-BYPYZUCNSA-N 0.000 description 3
- ROHFNLRQFUQHCH-UHFFFAOYSA-N Leucine Natural products CC(C)CC(N)C(O)=O ROHFNLRQFUQHCH-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 3
- OKKJLVBELUTLKV-UHFFFAOYSA-N Methanol Chemical compound OC OKKJLVBELUTLKV-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 3
- DNIAPMSPPWPWGF-UHFFFAOYSA-N Propylene glycol Chemical compound CC(O)CO DNIAPMSPPWPWGF-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 3
- 240000004808 Saccharomyces cerevisiae Species 0.000 description 3
- 235000014680 Saccharomyces cerevisiae Nutrition 0.000 description 3
- AYFVYJQAPQTCCC-UHFFFAOYSA-N Threonine Natural products CC(O)C(N)C(O)=O AYFVYJQAPQTCCC-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 3
- 239000004473 Threonine Substances 0.000 description 3
- QIVBCDIJIAJPQS-UHFFFAOYSA-N Tryptophan Natural products C1=CC=C2C(CC(N)C(O)=O)=CNC2=C1 QIVBCDIJIAJPQS-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 3
- KZSNJWFQEVHDMF-UHFFFAOYSA-N Valine Natural products CC(C)C(N)C(O)=O KZSNJWFQEVHDMF-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 3
- 238000013459 approach Methods 0.000 description 3
- PYMYPHUHKUWMLA-UHFFFAOYSA-N arabinose Natural products OCC(O)C(O)C(O)C=O PYMYPHUHKUWMLA-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 3
- 235000009582 asparagine Nutrition 0.000 description 3
- 229960001230 asparagine Drugs 0.000 description 3
- 238000003556 assay Methods 0.000 description 3
- SRBFZHDQGSBBOR-UHFFFAOYSA-N beta-D-Pyranose-Lyxose Natural products OC1COC(O)C(O)C1O SRBFZHDQGSBBOR-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 3
- 229910052799 carbon Inorganic materials 0.000 description 3
- 239000005515 coenzyme Substances 0.000 description 3
- 238000002447 crystallographic data Methods 0.000 description 3
- 238000012217 deletion Methods 0.000 description 3
- 230000037430 deletion Effects 0.000 description 3
- 238000011156 evaluation Methods 0.000 description 3
- 235000013305 food Nutrition 0.000 description 3
- 230000006870 function Effects 0.000 description 3
- AGPKZVBTJJNPAG-UHFFFAOYSA-N isoleucine Natural products CCC(C)C(N)C(O)=O AGPKZVBTJJNPAG-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 3
- 229960000310 isoleucine Drugs 0.000 description 3
- 238000009630 liquid culture Methods 0.000 description 3
- 238000004519 manufacturing process Methods 0.000 description 3
- 239000003550 marker Substances 0.000 description 3
- 108020004999 messenger RNA Proteins 0.000 description 3
- 229930182817 methionine Natural products 0.000 description 3
- 238000012986 modification Methods 0.000 description 3
- 230000004048 modification Effects 0.000 description 3
- 239000008363 phosphate buffer Substances 0.000 description 3
- 125000001500 prolyl group Chemical group [H]N1C([H])(C(=O)[*])C([H])([H])C([H])([H])C1([H])[H] 0.000 description 3
- MMXZSJMASHPLLR-UHFFFAOYSA-N pyrroloquinoline quinone Chemical compound C12=C(C(O)=O)C=C(C(O)=O)N=C2C(=O)C(=O)C2=C1NC(C(=O)O)=C2 MMXZSJMASHPLLR-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 3
- 239000000126 substance Substances 0.000 description 3
- 239000004474 valine Substances 0.000 description 3
- AZQWKYJCGOJGHM-UHFFFAOYSA-N 1,4-benzoquinone Chemical compound O=C1C=CC(=O)C=C1 AZQWKYJCGOJGHM-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 2
- OWEGMIWEEQEYGQ-UHFFFAOYSA-N 100676-05-9 Natural products OC1C(O)C(O)C(CO)OC1OCC1C(O)C(O)C(O)C(OC2C(OC(O)C(O)C2O)CO)O1 OWEGMIWEEQEYGQ-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 2
- GUBGYTABKSRVRQ-XLOQQCSPSA-N Alpha-Lactose Chemical compound O[C@@H]1[C@@H](O)[C@@H](O)[C@@H](CO)O[C@H]1O[C@@H]1[C@@H](CO)O[C@H](O)[C@H](O)[C@H]1O GUBGYTABKSRVRQ-XLOQQCSPSA-N 0.000 description 2
- CIWBSHSKHKDKBQ-JLAZNSOCSA-N Ascorbic acid Chemical compound OC[C@H](O)[C@H]1OC(=O)C(O)=C1O CIWBSHSKHKDKBQ-JLAZNSOCSA-N 0.000 description 2
- IJGRMHOSHXDMSA-UHFFFAOYSA-N Atomic nitrogen Chemical compound N#N IJGRMHOSHXDMSA-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 2
- 241000972773 Aulopiformes Species 0.000 description 2
- 108020004705 Codon Proteins 0.000 description 2
- FBPFZTCFMRRESA-KVTDHHQDSA-N D-Mannitol Chemical compound OC[C@@H](O)[C@@H](O)[C@H](O)[C@H](O)CO FBPFZTCFMRRESA-KVTDHHQDSA-N 0.000 description 2
- 229920002271 DEAE-Sepharose Polymers 0.000 description 2
- 102000012410 DNA Ligases Human genes 0.000 description 2
- 108010061982 DNA Ligases Proteins 0.000 description 2
- 108010014303 DNA-directed DNA polymerase Proteins 0.000 description 2
- 102000016928 DNA-directed DNA polymerase Human genes 0.000 description 2
- 101710088194 Dehydrogenase Proteins 0.000 description 2
- 101150090421 GO gene Proteins 0.000 description 2
- 108700028146 Genetic Enhancer Elements Proteins 0.000 description 2
- 239000006173 Good's buffer Substances 0.000 description 2
- QIGBRXMKCJKVMJ-UHFFFAOYSA-N Hydroquinone Chemical compound OC1=CC=C(O)C=C1 QIGBRXMKCJKVMJ-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 2
- XEEYBQQBJWHFJM-UHFFFAOYSA-N Iron Chemical compound [Fe] XEEYBQQBJWHFJM-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 2
- GUBGYTABKSRVRQ-QKKXKWKRSA-N Lactose Natural products OC[C@H]1O[C@@H](O[C@H]2[C@H](O)[C@@H](O)C(O)O[C@@H]2CO)[C@H](O)[C@@H](O)[C@H]1O GUBGYTABKSRVRQ-QKKXKWKRSA-N 0.000 description 2
- GUBGYTABKSRVRQ-PICCSMPSSA-N Maltose Natural products O[C@@H]1[C@@H](O)[C@H](O)[C@@H](CO)O[C@@H]1O[C@@H]1[C@@H](CO)OC(O)[C@H](O)[C@H]1O GUBGYTABKSRVRQ-PICCSMPSSA-N 0.000 description 2
- DRBBFCLWYRJSJZ-UHFFFAOYSA-N N-phosphocreatine Chemical compound OC(=O)CN(C)C(=N)NP(O)(O)=O DRBBFCLWYRJSJZ-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 2
- 229910019142 PO4 Inorganic materials 0.000 description 2
- 241000894166 Penicillium amagasakiense Species 0.000 description 2
- 102000005877 Peptide Initiation Factors Human genes 0.000 description 2
- 108010044843 Peptide Initiation Factors Proteins 0.000 description 2
- LCTONWCANYUPML-UHFFFAOYSA-N Pyruvic acid Chemical compound CC(=O)C(O)=O LCTONWCANYUPML-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 2
- 229930006000 Sucrose Natural products 0.000 description 2
- CZMRCDWAGMRECN-UGDNZRGBSA-N Sucrose Chemical compound O[C@H]1[C@H](O)[C@@H](CO)O[C@@]1(CO)O[C@@H]1[C@H](O)[C@@H](O)[C@H](O)[C@@H](CO)O1 CZMRCDWAGMRECN-UGDNZRGBSA-N 0.000 description 2
- 108020004566 Transfer RNA Proteins 0.000 description 2
- GSEJCLTVZPLZKY-UHFFFAOYSA-N Triethanolamine Chemical compound OCCN(CCO)CCO GSEJCLTVZPLZKY-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 2
- 229920004890 Triton X-100 Polymers 0.000 description 2
- 239000013504 Triton X-100 Substances 0.000 description 2
- 238000007792 addition Methods 0.000 description 2
- 125000000539 amino acid group Chemical group 0.000 description 2
- 238000004458 analytical method Methods 0.000 description 2
- 230000008901 benefit Effects 0.000 description 2
- 229960000686 benzalkonium chloride Drugs 0.000 description 2
- CADWTSSKOVRVJC-UHFFFAOYSA-N benzyl(dimethyl)azanium;chloride Chemical compound [Cl-].C[NH+](C)CC1=CC=CC=C1 CADWTSSKOVRVJC-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 2
- WQZGKKKJIJFFOK-VFUOTHLCSA-N beta-D-glucose Chemical compound OC[C@H]1O[C@@H](O)[C@H](O)[C@@H](O)[C@@H]1O WQZGKKKJIJFFOK-VFUOTHLCSA-N 0.000 description 2
- GUBGYTABKSRVRQ-QUYVBRFLSA-N beta-maltose Chemical compound OC[C@H]1O[C@H](O[C@H]2[C@H](O)[C@@H](O)[C@H](O)O[C@@H]2CO)[C@H](O)[C@@H](O)[C@@H]1O GUBGYTABKSRVRQ-QUYVBRFLSA-N 0.000 description 2
- 238000002306 biochemical method Methods 0.000 description 2
- 239000000872 buffer Substances 0.000 description 2
- 230000008859 change Effects 0.000 description 2
- 229960004926 chlorobutanol Drugs 0.000 description 2
- 238000012790 confirmation Methods 0.000 description 2
- 239000012228 culture supernatant Substances 0.000 description 2
- 238000012258 culturing Methods 0.000 description 2
- 229960000633 dextran sulfate Drugs 0.000 description 2
- 238000002474 experimental method Methods 0.000 description 2
- 235000019162 flavin adenine dinucleotide Nutrition 0.000 description 2
- 239000011714 flavin adenine dinucleotide Substances 0.000 description 2
- 238000002523 gelfiltration Methods 0.000 description 2
- 238000009396 hybridization Methods 0.000 description 2
- 239000008101 lactose Substances 0.000 description 2
- 239000007788 liquid Substances 0.000 description 2
- 239000012528 membrane Substances 0.000 description 2
- 229910052751 metal Inorganic materials 0.000 description 2
- 239000002184 metal Substances 0.000 description 2
- LXCFILQKKLGQFO-UHFFFAOYSA-N methylparaben Chemical compound COC(=O)C1=CC=C(O)C=C1 LXCFILQKKLGQFO-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 2
- 238000001823 molecular biology technique Methods 0.000 description 2
- 229910052757 nitrogen Inorganic materials 0.000 description 2
- 239000000546 pharmaceutical excipient Substances 0.000 description 2
- 235000021317 phosphate Nutrition 0.000 description 2
- 239000008055 phosphate buffer solution Substances 0.000 description 2
- BASFCYQUMIYNBI-UHFFFAOYSA-N platinum Chemical compound [Pt] BASFCYQUMIYNBI-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 2
- 230000002335 preservative effect Effects 0.000 description 2
- 230000001737 promoting effect Effects 0.000 description 2
- 230000004853 protein function Effects 0.000 description 2
- 239000012264 purified product Substances 0.000 description 2
- 238000011160 research Methods 0.000 description 2
- 108091008146 restriction endonucleases Proteins 0.000 description 2
- 210000003705 ribosome Anatomy 0.000 description 2
- 235000019515 salmon Nutrition 0.000 description 2
- 239000011780 sodium chloride Substances 0.000 description 2
- 239000001509 sodium citrate Substances 0.000 description 2
- NLJMYIDDQXHKNR-UHFFFAOYSA-K sodium citrate Chemical compound O.O.[Na+].[Na+].[Na+].[O-]C(=O)CC(O)(CC([O-])=O)C([O-])=O NLJMYIDDQXHKNR-UHFFFAOYSA-K 0.000 description 2
- 239000002904 solvent Substances 0.000 description 2
- 239000003381 stabilizer Substances 0.000 description 2
- 238000012916 structural analysis Methods 0.000 description 2
- 239000005720 sucrose Substances 0.000 description 2
- HDTRYLNUVZCQOY-UHFFFAOYSA-N α-D-glucopyranosyl-α-D-glucopyranoside Natural products OC1C(O)C(O)C(CO)OC1OC1C(O)C(O)C(O)C(CO)O1 HDTRYLNUVZCQOY-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 1
- IHPYMWDTONKSCO-UHFFFAOYSA-N 2,2'-piperazine-1,4-diylbisethanesulfonic acid Chemical compound OS(=O)(=O)CCN1CCN(CCS(O)(=O)=O)CC1 IHPYMWDTONKSCO-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 1
- QKNYBSVHEMOAJP-UHFFFAOYSA-N 2-amino-2-(hydroxymethyl)propane-1,3-diol;hydron;chloride Chemical compound Cl.OCC(N)(CO)CO QKNYBSVHEMOAJP-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 1
- GUPXYSSGJWIURR-UHFFFAOYSA-N 3-octoxypropane-1,2-diol Chemical compound CCCCCCCCOCC(O)CO GUPXYSSGJWIURR-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 1
- QTBSBXVTEAMEQO-UHFFFAOYSA-M Acetate Chemical compound CC([O-])=O QTBSBXVTEAMEQO-UHFFFAOYSA-M 0.000 description 1
- 102000052866 Amino Acyl-tRNA Synthetases Human genes 0.000 description 1
- 108700028939 Amino Acyl-tRNA Synthetases Proteins 0.000 description 1
- 101100179048 Arabidopsis thaliana IAA3 gene Proteins 0.000 description 1
- 241001465318 Aspergillus terreus Species 0.000 description 1
- 238000012935 Averaging Methods 0.000 description 1
- 241000894006 Bacteria Species 0.000 description 1
- 108010077805 Bacterial Proteins Proteins 0.000 description 1
- OYPRJOBELJOOCE-UHFFFAOYSA-N Calcium Chemical compound [Ca] OYPRJOBELJOOCE-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 1
- UXVMQQNJUSDDNG-UHFFFAOYSA-L Calcium chloride Chemical compound [Cl-].[Cl-].[Ca+2] UXVMQQNJUSDDNG-UHFFFAOYSA-L 0.000 description 1
- OKTJSMMVPCPJKN-UHFFFAOYSA-N Carbon Chemical compound [C] OKTJSMMVPCPJKN-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 1
- KRKNYBCHXYNGOX-UHFFFAOYSA-K Citrate Chemical compound [O-]C(=O)CC(O)(CC([O-])=O)C([O-])=O KRKNYBCHXYNGOX-UHFFFAOYSA-K 0.000 description 1
- 241001133184 Colletotrichum agaves Species 0.000 description 1
- FBPFZTCFMRRESA-FSIIMWSLSA-N D-Glucitol Natural products OC[C@H](O)[C@H](O)[C@@H](O)[C@H](O)CO FBPFZTCFMRRESA-FSIIMWSLSA-N 0.000 description 1
- FBPFZTCFMRRESA-JGWLITMVSA-N D-glucitol Chemical compound OC[C@H](O)[C@@H](O)[C@H](O)[C@H](O)CO FBPFZTCFMRRESA-JGWLITMVSA-N 0.000 description 1
- 239000004375 Dextrin Substances 0.000 description 1
- 229920001353 Dextrin Polymers 0.000 description 1
- 239000004278 EU approved seasoning Substances 0.000 description 1
- 241000196324 Embryophyta Species 0.000 description 1
- 241001198387 Escherichia coli BL21(DE3) Species 0.000 description 1
- 241000620209 Escherichia coli DH5[alpha] Species 0.000 description 1
- 241000701959 Escherichia virus Lambda Species 0.000 description 1
- 241001524679 Escherichia virus M13 Species 0.000 description 1
- 108060002716 Exonuclease Proteins 0.000 description 1
- 108700007698 Genetic Terminator Regions Proteins 0.000 description 1
- 241000238631 Hexapoda Species 0.000 description 1
- 241000235058 Komagataella pastoris Species 0.000 description 1
- 239000007987 MES buffer Substances 0.000 description 1
- 239000007993 MOPS buffer Substances 0.000 description 1
- FYYHWMGAXLPEAU-UHFFFAOYSA-N Magnesium Chemical compound [Mg] FYYHWMGAXLPEAU-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 1
- PWHULOQIROXLJO-UHFFFAOYSA-N Manganese Chemical compound [Mn] PWHULOQIROXLJO-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 1
- 241000235395 Mucor Species 0.000 description 1
- 102000016943 Muramidase Human genes 0.000 description 1
- 108010014251 Muramidase Proteins 0.000 description 1
- 108010062010 N-Acetylmuramoyl-L-alanine Amidase Proteins 0.000 description 1
- 239000007990 PIPES buffer Substances 0.000 description 1
- 239000001888 Peptone Substances 0.000 description 1
- 108010080698 Peptones Proteins 0.000 description 1
- ZLMJMSJWJFRBEC-UHFFFAOYSA-N Potassium Chemical compound [K] ZLMJMSJWJFRBEC-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 1
- 108091058545 Secretory proteins Proteins 0.000 description 1
- 102000040739 Secretory proteins Human genes 0.000 description 1
- 229920005654 Sephadex Polymers 0.000 description 1
- 239000012507 Sephadex™ Substances 0.000 description 1
- 229920002684 Sepharose Polymers 0.000 description 1
- PMZURENOXWZQFD-UHFFFAOYSA-L Sodium Sulfate Chemical compound [Na+].[Na+].[O-]S([O-])(=O)=O PMZURENOXWZQFD-UHFFFAOYSA-L 0.000 description 1
- 235000019764 Soybean Meal Nutrition 0.000 description 1
- 229920002472 Starch Polymers 0.000 description 1
- 108010006785 Taq Polymerase Proteins 0.000 description 1
- HDTRYLNUVZCQOY-WSWWMNSNSA-N Trehalose Natural products O[C@@H]1[C@@H](O)[C@@H](O)[C@@H](CO)O[C@@H]1O[C@@H]1[C@H](O)[C@@H](O)[C@@H](O)[C@@H](CO)O1 HDTRYLNUVZCQOY-WSWWMNSNSA-N 0.000 description 1
- 238000002441 X-ray diffraction Methods 0.000 description 1
- 238000000333 X-ray scattering Methods 0.000 description 1
- HCHKCACWOHOZIP-UHFFFAOYSA-N Zinc Chemical compound [Zn] HCHKCACWOHOZIP-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 1
- 239000000205 acacia gum Substances 0.000 description 1
- 239000002253 acid Substances 0.000 description 1
- 239000004480 active ingredient Substances 0.000 description 1
- 238000005377 adsorption chromatography Methods 0.000 description 1
- 238000001042 affinity chromatography Methods 0.000 description 1
- 235000013334 alcoholic beverage Nutrition 0.000 description 1
- 239000003513 alkali Substances 0.000 description 1
- HDTRYLNUVZCQOY-LIZSDCNHSA-N alpha,alpha-trehalose Chemical compound O[C@@H]1[C@@H](O)[C@H](O)[C@@H](CO)O[C@@H]1O[C@@H]1[C@H](O)[C@@H](O)[C@H](O)[C@@H](CO)O1 HDTRYLNUVZCQOY-LIZSDCNHSA-N 0.000 description 1
- BFNBIHQBYMNNAN-UHFFFAOYSA-N ammonium sulfate Chemical compound N.N.OS(O)(=O)=O BFNBIHQBYMNNAN-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 1
- 229910052921 ammonium sulfate Inorganic materials 0.000 description 1
- 235000011130 ammonium sulphate Nutrition 0.000 description 1
- 239000011668 ascorbic acid Substances 0.000 description 1
- 235000010323 ascorbic acid Nutrition 0.000 description 1
- 229960005070 ascorbic acid Drugs 0.000 description 1
- 230000037429 base substitution Effects 0.000 description 1
- 235000013405 beer Nutrition 0.000 description 1
- 238000009529 body temperature measurement Methods 0.000 description 1
- 239000011575 calcium Substances 0.000 description 1
- 229910052791 calcium Inorganic materials 0.000 description 1
- 239000001110 calcium chloride Substances 0.000 description 1
- 229910001628 calcium chloride Inorganic materials 0.000 description 1
- 239000001506 calcium phosphate Substances 0.000 description 1
- 229910000389 calcium phosphate Inorganic materials 0.000 description 1
- 235000011010 calcium phosphates Nutrition 0.000 description 1
- 229940041514 candida albicans extract Drugs 0.000 description 1
- 150000001722 carbon compounds Chemical class 0.000 description 1
- 150000004649 carbonic acid derivatives Chemical class 0.000 description 1
- 239000005018 casein Substances 0.000 description 1
- BECPQYXYKAMYBN-UHFFFAOYSA-N casein, tech. Chemical compound NCCCCC(C(O)=O)N=C(O)C(CC(O)=O)N=C(O)C(CCC(O)=N)N=C(O)C(CC(C)C)N=C(O)C(CCC(O)=O)N=C(O)C(CC(O)=O)N=C(O)C(CCC(O)=O)N=C(O)C(C(C)O)N=C(O)C(CCC(O)=N)N=C(O)C(CCC(O)=N)N=C(O)C(CCC(O)=N)N=C(O)C(CCC(O)=O)N=C(O)C(CCC(O)=O)N=C(O)C(COP(O)(O)=O)N=C(O)C(CCC(O)=N)N=C(O)C(N)CC1=CC=CC=C1 BECPQYXYKAMYBN-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 1
- 235000021240 caseins Nutrition 0.000 description 1
- 239000013592 cell lysate Substances 0.000 description 1
- 210000004671 cell-free system Anatomy 0.000 description 1
- 238000012512 characterization method Methods 0.000 description 1
- 239000003795 chemical substances by application Substances 0.000 description 1
- 238000004587 chromatography analysis Methods 0.000 description 1
- 238000010367 cloning Methods 0.000 description 1
- 238000000975 co-precipitation Methods 0.000 description 1
- 150000001875 compounds Chemical class 0.000 description 1
- 235000009508 confectionery Nutrition 0.000 description 1
- 238000007796 conventional method Methods 0.000 description 1
- 239000002537 cosmetic Substances 0.000 description 1
- 238000002425 crystallisation Methods 0.000 description 1
- 230000008025 crystallization Effects 0.000 description 1
- 230000006378 damage Effects 0.000 description 1
- 238000004925 denaturation Methods 0.000 description 1
- 230000036425 denaturation Effects 0.000 description 1
- 230000001419 dependent effect Effects 0.000 description 1
- 238000011033 desalting Methods 0.000 description 1
- 238000011161 development Methods 0.000 description 1
- 235000019425 dextrin Nutrition 0.000 description 1
- 238000000502 dialysis Methods 0.000 description 1
- 235000015872 dietary supplement Nutrition 0.000 description 1
- 238000004520 electroporation Methods 0.000 description 1
- 230000002708 enhancing effect Effects 0.000 description 1
- 238000006911 enzymatic reaction Methods 0.000 description 1
- 102000013165 exonuclease Human genes 0.000 description 1
- 238000000855 fermentation Methods 0.000 description 1
- 230000004151 fermentation Effects 0.000 description 1
- 235000019985 fermented beverage Nutrition 0.000 description 1
- 235000021107 fermented food Nutrition 0.000 description 1
- 238000001914 filtration Methods 0.000 description 1
- VWWQXMAJTJZDQX-UYBVJOGSSA-N flavin adenine dinucleotide Chemical compound C1=NC2=C(N)N=CN=C2N1[C@@H]([C@H](O)[C@@H]1O)O[C@@H]1CO[P@](O)(=O)O[P@@](O)(=O)OC[C@@H](O)[C@@H](O)[C@@H](O)CN1C2=NC(=O)NC(=O)C2=NC2=C1C=C(C)C(C)=C2 VWWQXMAJTJZDQX-UYBVJOGSSA-N 0.000 description 1
- 229940093632 flavin-adenine dinucleotide Drugs 0.000 description 1
- 235000011194 food seasoning agent Nutrition 0.000 description 1
- 239000012634 fragment Substances 0.000 description 1
- 238000004108 freeze drying Methods 0.000 description 1
- 125000000291 glutamic acid group Chemical group N[C@@H](CCC(O)=O)C(=O)* 0.000 description 1
- 125000003630 glycyl group Chemical group [H]N([H])C([H])([H])C(*)=O 0.000 description 1
- 238000009499 grossing Methods 0.000 description 1
- 238000010438 heat treatment Methods 0.000 description 1
- 125000000487 histidyl group Chemical group [H]N([H])C(C(=O)O*)C([H])([H])C1=C([H])N([H])C([H])=N1 0.000 description 1
- 239000012535 impurity Substances 0.000 description 1
- 238000011534 incubation Methods 0.000 description 1
- 230000006698 induction Effects 0.000 description 1
- 229910052740 iodine Inorganic materials 0.000 description 1
- 238000004255 ion exchange chromatography Methods 0.000 description 1
- 229910052742 iron Inorganic materials 0.000 description 1
- 238000002372 labelling Methods 0.000 description 1
- 239000003446 ligand Substances 0.000 description 1
- 238000001638 lipofection Methods 0.000 description 1
- 239000004325 lysozyme Substances 0.000 description 1
- 229960000274 lysozyme Drugs 0.000 description 1
- 235000010335 lysozyme Nutrition 0.000 description 1
- 239000011777 magnesium Substances 0.000 description 1
- 229910052749 magnesium Inorganic materials 0.000 description 1
- 210000004962 mammalian cell Anatomy 0.000 description 1
- 229910052748 manganese Inorganic materials 0.000 description 1
- 239000011572 manganese Substances 0.000 description 1
- 235000010355 mannitol Nutrition 0.000 description 1
- 235000013372 meat Nutrition 0.000 description 1
- 238000010297 mechanical methods and process Methods 0.000 description 1
- 230000010534 mechanism of action Effects 0.000 description 1
- QSHDDOUJBYECFT-UHFFFAOYSA-N mercury Chemical compound [Hg] QSHDDOUJBYECFT-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 1
- 229910052753 mercury Inorganic materials 0.000 description 1
- 108010057757 methionyl-tRNA formyltransferase Proteins 0.000 description 1
- 235000010270 methyl p-hydroxybenzoate Nutrition 0.000 description 1
- 239000004292 methyl p-hydroxybenzoate Substances 0.000 description 1
- 229960002216 methylparaben Drugs 0.000 description 1
- 235000013379 molasses Nutrition 0.000 description 1
- 238000012544 monitoring process Methods 0.000 description 1
- 229910017464 nitrogen compound Inorganic materials 0.000 description 1
- 150000002830 nitrogen compounds Chemical class 0.000 description 1
- 230000002018 overexpression Effects 0.000 description 1
- 235000019319 peptone Nutrition 0.000 description 1
- 229960003742 phenol Drugs 0.000 description 1
- WVDDGKGOMKODPV-ZQBYOMGUSA-N phenyl(114C)methanol Chemical compound O[14CH2]C1=CC=CC=C1 WVDDGKGOMKODPV-ZQBYOMGUSA-N 0.000 description 1
- NBIIXXVUZAFLBC-UHFFFAOYSA-K phosphate Chemical compound [O-]P([O-])([O-])=O NBIIXXVUZAFLBC-UHFFFAOYSA-K 0.000 description 1
- 239000010452 phosphate Substances 0.000 description 1
- 150000003013 phosphoric acid derivatives Chemical class 0.000 description 1
- 229910052698 phosphorus Inorganic materials 0.000 description 1
- 239000002504 physiological saline solution Substances 0.000 description 1
- 229910052697 platinum Inorganic materials 0.000 description 1
- 229920001184 polypeptide Polymers 0.000 description 1
- 239000011591 potassium Substances 0.000 description 1
- 229910052700 potassium Inorganic materials 0.000 description 1
- 239000000843 powder Substances 0.000 description 1
- 238000001556 precipitation Methods 0.000 description 1
- 230000008569 process Effects 0.000 description 1
- 102000004196 processed proteins & peptides Human genes 0.000 description 1
- 108090000765 processed proteins & peptides Proteins 0.000 description 1
- 238000000746 purification Methods 0.000 description 1
- 229940107700 pyruvic acid Drugs 0.000 description 1
- 230000009257 reactivity Effects 0.000 description 1
- 238000006479 redox reaction Methods 0.000 description 1
- 235000021067 refined food Nutrition 0.000 description 1
- 238000005185 salting out Methods 0.000 description 1
- 150000003839 salts Chemical class 0.000 description 1
- 238000012216 screening Methods 0.000 description 1
- 238000000926 separation method Methods 0.000 description 1
- 238000002741 site-directed mutagenesis Methods 0.000 description 1
- 229910052938 sodium sulfate Inorganic materials 0.000 description 1
- 235000011152 sodium sulphate Nutrition 0.000 description 1
- 235000014214 soft drink Nutrition 0.000 description 1
- 239000000600 sorbitol Substances 0.000 description 1
- 239000004455 soybean meal Substances 0.000 description 1
- 238000001694 spray drying Methods 0.000 description 1
- 239000012086 standard solution Substances 0.000 description 1
- 239000008107 starch Substances 0.000 description 1
- 235000019698 starch Nutrition 0.000 description 1
- 229910052717 sulfur Inorganic materials 0.000 description 1
- 150000003467 sulfuric acid derivatives Chemical class 0.000 description 1
- 239000000725 suspension Substances 0.000 description 1
- 230000005469 synchrotron radiation Effects 0.000 description 1
- 238000012360 testing method Methods 0.000 description 1
- 238000009210 therapy by ultrasound Methods 0.000 description 1
- 238000001890 transfection Methods 0.000 description 1
- 230000009466 transformation Effects 0.000 description 1
- QORWJWZARLRLPR-UHFFFAOYSA-H tricalcium bis(phosphate) Chemical compound [Ca+2].[Ca+2].[Ca+2].[O-]P([O-])([O-])=O.[O-]P([O-])([O-])=O QORWJWZARLRLPR-UHFFFAOYSA-H 0.000 description 1
- 229910052721 tungsten Inorganic materials 0.000 description 1
- 238000001291 vacuum drying Methods 0.000 description 1
- 229910052720 vanadium Inorganic materials 0.000 description 1
- 239000000052 vinegar Substances 0.000 description 1
- 235000021419 vinegar Nutrition 0.000 description 1
- 239000011782 vitamin Substances 0.000 description 1
- 235000013343 vitamin Nutrition 0.000 description 1
- 229940088594 vitamin Drugs 0.000 description 1
- 229930003231 vitamin Natural products 0.000 description 1
- XLYOFNOQVPJJNP-UHFFFAOYSA-N water Substances O XLYOFNOQVPJJNP-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 1
- 239000012138 yeast extract Substances 0.000 description 1
- 229910052725 zinc Inorganic materials 0.000 description 1
- 239000011701 zinc Substances 0.000 description 1
Images
Classifications
-
- C—CHEMISTRY; METALLURGY
- C12—BIOCHEMISTRY; BEER; SPIRITS; WINE; VINEGAR; MICROBIOLOGY; ENZYMOLOGY; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING
- C12N—MICROORGANISMS OR ENZYMES; COMPOSITIONS THEREOF; PROPAGATING, PRESERVING, OR MAINTAINING MICROORGANISMS; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING; CULTURE MEDIA
- C12N5/00—Undifferentiated human, animal or plant cells, e.g. cell lines; Tissues; Cultivation or maintenance thereof; Culture media therefor
- C12N5/10—Cells modified by introduction of foreign genetic material
-
- C—CHEMISTRY; METALLURGY
- C12—BIOCHEMISTRY; BEER; SPIRITS; WINE; VINEGAR; MICROBIOLOGY; ENZYMOLOGY; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING
- C12N—MICROORGANISMS OR ENZYMES; COMPOSITIONS THEREOF; PROPAGATING, PRESERVING, OR MAINTAINING MICROORGANISMS; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING; CULTURE MEDIA
- C12N15/00—Mutation or genetic engineering; DNA or RNA concerning genetic engineering, vectors, e.g. plasmids, or their isolation, preparation or purification; Use of hosts therefor
- C12N15/09—Recombinant DNA-technology
-
- C—CHEMISTRY; METALLURGY
- C12—BIOCHEMISTRY; BEER; SPIRITS; WINE; VINEGAR; MICROBIOLOGY; ENZYMOLOGY; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING
- C12Q—MEASURING OR TESTING PROCESSES INVOLVING ENZYMES, NUCLEIC ACIDS OR MICROORGANISMS; COMPOSITIONS OR TEST PAPERS THEREFOR; PROCESSES OF PREPARING SUCH COMPOSITIONS; CONDITION-RESPONSIVE CONTROL IN MICROBIOLOGICAL OR ENZYMOLOGICAL PROCESSES
- C12Q1/00—Measuring or testing processes involving enzymes, nucleic acids or microorganisms; Compositions therefor; Processes of preparing such compositions
- C12Q1/26—Measuring or testing processes involving enzymes, nucleic acids or microorganisms; Compositions therefor; Processes of preparing such compositions involving oxidoreductase
- C12Q1/28—Measuring or testing processes involving enzymes, nucleic acids or microorganisms; Compositions therefor; Processes of preparing such compositions involving oxidoreductase involving peroxidase
Landscapes
- Health & Medical Sciences (AREA)
- Life Sciences & Earth Sciences (AREA)
- Chemical & Material Sciences (AREA)
- Engineering & Computer Science (AREA)
- Organic Chemistry (AREA)
- Genetics & Genomics (AREA)
- Wood Science & Technology (AREA)
- Zoology (AREA)
- Biotechnology (AREA)
- Bioinformatics & Cheminformatics (AREA)
- Biomedical Technology (AREA)
- General Engineering & Computer Science (AREA)
- Microbiology (AREA)
- Biochemistry (AREA)
- General Health & Medical Sciences (AREA)
- Physics & Mathematics (AREA)
- Molecular Biology (AREA)
- Proteomics, Peptides & Aminoacids (AREA)
- Biophysics (AREA)
- Analytical Chemistry (AREA)
- Immunology (AREA)
- Plant Pathology (AREA)
- Cell Biology (AREA)
- Micro-Organisms Or Cultivation Processes Thereof (AREA)
- Enzymes And Modification Thereof (AREA)
- Measuring Or Testing Involving Enzymes Or Micro-Organisms (AREA)
- Preparation Of Compounds By Using Micro-Organisms (AREA)
Description
[1]微生物由来グルコースオキシダーゼのアミノ酸配列において、以下の(1)のアミノ酸が他のアミノ酸に置換されたアミノ酸配列からなる変異酵素:
(1)配列番号1に示すアミノ酸配列の444位アミノ酸に相当するアミノ酸。
[2]置換後のアミノ酸が、アルギニン、グルタミン酸、グルタミン、ロイシン、メチオニン、スレオニン、トリプトファン、システイン、バリン又はイソロイシンである、[1]に記載の変異酵素。
[3]置換後のアミノ酸が、アルギニン、グルタミン酸又はグルタミンである、[1]に記載の変異酵素。
[4]置換後のアミノ酸が、アルギニンである、[1]に記載の変異酵素。
[5]微生物由来グルコースオキシダーゼのアミノ酸配列において、前記(1)のアミノ酸に加えて、以下の(2)のアミノ酸が他のアミノ酸に置換されたアミノ酸配列からなる、[1]〜[4]のいずれか一項に記載の変異酵素:
(2)配列番号1に示すアミノ酸配列の582位アミノ酸に相当するアミノ酸。
[6]前記(2)のアミノ酸について、置換後のアミノ酸が、グリシン、システイン、プロリン、セリン、グルタミン、アスパラギン又はグルタミン酸である、[5]に記載の変異酵素。
[7]微生物由来グルコースオキシダーゼのアミノ酸配列が配列番号1、2又は15のアミノ酸配列である、[1]〜[6]のいずれか一項に記載の変異酵素。
[8]配列番号3又は4のアミノ酸配列からなる、[1]に記載の変異酵素。
[9][1]〜[8]のいずれか一項に記載の変異酵素をコードする遺伝子。
[10]配列番号5又は6の塩基配列を含む、[9]に記載の遺伝子。
[11][9]又は[10]に記載の遺伝子を含む組換えDNA。
[12][9]又は[10]に記載の遺伝子を含む組換えベクター。
[13][11]に記載の組換えDNAを保有する微生物。
[14][1]〜[8]のいずれか一項に記載の変異酵素を用いて試料中のグルコースを測定することを特徴とする、グルコース測定法。
[15][1]〜[8]のいずれか一項に記載の変異酵素を含むことを特徴とするグルコース測定用試薬。
[16][15]に記載のグルコース測定用試薬を含む、グルコース測定用キット。
[17][1]〜[8]のいずれか一項に記載の変異酵素を用いて工業製品又はその原料中のグルコース量を低下させることを特徴とする方法。
[18][1]〜[8]のいずれか一項に記載の変異酵素を含有する酵素剤。
[19]以下のステップ(i)及び(ii)を含む、変異酵素の設計法:
(i)微生物由来グルコースオキシダーゼである変異対象酵素のアミノ酸配列において、以下の(1)のアミノ酸を特定するステップ:
(1)配列番号1に示すアミノ酸配列の444位アミノ酸に相当するアミノ酸;
(ii)変異対象酵素のアミノ酸配列を基にして、ステップ(i)で特定されたアミノ酸配列が他のアミノ酸に置換されたアミノ酸配列を構築するステップ。
[20]ステップ(i)において、前記(1)のアミノ酸に加えて、以下の(2)のアミノ酸を特定する、[19]に記載の設計法:
(2)配列番号1に示すアミノ酸配列の582位アミノ酸に相当するアミノ酸。
[21]微生物由来グルコースオキシダーゼが、アスペルギルス・ニガー又はペニシリウム・アマガサキエンスのグルコースオキシダーゼである、[19]又は[20]に記載の設計法。
[22]グルコースオキシダーゼのアミノ酸配列が配列番号1又は2のアミノ酸配列である、[21]に記載の設計法。
[23]以下のステップ(I)〜(III)を含む、変異酵素の調製法:
(I)配列番号3又は4のアミノ酸配列、又は[19]〜[22]のいずれか一項に記載の設計法によって構築されたアミノ酸配列をコードする核酸を用意するステップ;
(II)前記核酸を発現させるステップ、及び
(III)発現産物を回収するステップ。
(用語)
用語「変異酵素」とは、本明細書が開示する手法によって、「基になる酵素」を変異ないし改変して得られる酵素である。「変異酵素」、「変異型酵素」及び「改変型酵素」は置換可能に用いられる。基になる酵素は典型的には野生型酵素である。但し、既に人為的操作が施されている酵素を「基になる酵素」として本発明に適用することを妨げるものではない。尚、「基になる酵素」のことを本明細書では「変異対象酵素」又は「標的酵素」とも呼ぶ。
本発明の第1の局面は微生物由来のグルコースオキシダーゼ(GO)を変異させた酵素(以下「変異GO」とも呼ぶ)に関する。本発明の変異GOは、微生物由来のGO(変異対象酵素)のアミノ酸配列において、以下の(1)のアミノ酸が他のアミノ酸に置換されたアミノ酸配列を有する。
(1)配列番号1に示すアミノ酸配列の444位アミノ酸に相当するアミノ酸
(1)タンパク質を結晶化する。結晶化は、立体構造決定のためには欠かせないが、それ以外にも、タンパク質の高純度の精製法、高密度で安定な保存法として産業上の有用性もある。この場合、リガンドとして基質もしくはそのアナログ化合物を結合したタンパク質を結晶化すると良い。
(2)作製した結晶にX線を照射して回折データを収集する。なお、タンパク質結晶はX線照射によりダメージを受け回折能が劣化するケースが多々ある。その場合、結晶を急激に−173℃程度に冷却し、その状態で回折データを収集する低温測定技術が最近普及してきた。なお、最終的に、構造決定に利用する高分解能データを収集するために、輝度の高いシンクロトロン放射光が利用される。
(3)結晶構造解析を行うには、回折データに加えて、位相情報が必要になる。目的のタンパク質に対して、類縁のタンパク質の結晶構造が未知の場合、分子置換法で構造決定することは不可能であり、重原子同型置換法により位相問題が解決されなくてはならない。重原子同型置換法は、水銀や白金等原子番号が大きな金属原子を結晶に導入し、金属原子の大きなX線散乱能のX線回折データへの寄与を利用して位相情報を得る方法である。決定された位相は、結晶中の溶媒領域の電子密度を平滑化することにより改善することが可能である。溶媒領域の水分子は揺らぎが大きいために電子密度がほとんど観測されないので、この領域の電子密度を0に近似することにより、真の電子密度に近づくことができ、ひいては位相が改善されるのである。また、非対称単位に複数の分子が含まれている場合、これらの分子の電子密度を平均化することにより位相が更に大幅に改善される。このようにして改善された位相を用いて計算した電子密度図にタンパク質のモデルをフィットさせる。このプロセスは、コンピューターグラフィックス上で、MSI社(アメリカ)のQUANTA等のプログラムを用いて行われる。この後、MSI社のX-PLOR等のプログラムを用いて、構造精密化を行い、構造解析は完了する。目的のタンパク質に対して、類縁のタンパク質の結晶構造が既知の場合は、既知タンパク質の原子座標を用いて分子置換法により決定できる。分子置換と構造精密化はプログラム CNS_SOLVE ver.11などを用いて行うことができる。
(2)配列番号1に示すアミノ酸配列の582位アミノ酸に相当するアミノ酸
本発明の第2の局面は本発明の変異GOに関連する核酸を提供する。即ち、変異GOをコードする遺伝子、変異GOをコードする核酸を同定するためのプローブとして用いることができる核酸、変異GOをコードする核酸を増幅又は突然変異等させるためのプライマーとして用いることができる核酸が提供される。
本発明の第3の局面は変異GOの用途に関する。この局面ではまず、変異GOを用いたグルコース測定法が提供される。本発明のグルコース測定法では本酵素による酸化還元反応を利用して試料中のグルコース量を測定する。本発明は例えば血糖値の測定、食品(調味料や飲料など)中のグルコース濃度の測定などに利用される。また、発酵食品(例えば食酢)又は発酵飲料(例えばビールや酒)の製造工程において発酵度を調べるために本発明を利用してもよい。
本発明の別の局面は変異酵素の設計法に関する。本発明の設計法では、以下のステップ(i)及び(ii)を実施する。
ステップ(i):微生物由来グルコースオキシダーゼ(微生物由来GO)である変異対象酵素のアミノ酸配列において、以下の(1)のアミノ酸を特定する。
(1)配列番号1に示すアミノ酸配列の444位アミノ酸に相当するアミノ酸
アスペルギルス・ニガー(Aspergillus niger)のGO: 配列番号1のアミノ酸配列
ペニシリウム・アマガサキエンス(Penicillium amagasakiense)のGO: 配列番号2のアミノ酸配列
(2)配列番号1に示すアミノ酸配列の582位アミノ酸に相当するアミノ酸
ステップ(ii):変異対象酵素のアミノ酸配列を基にして、ステップ(i)で特定されたアミノ酸配列が他のアミノ酸に置換されたアミノ酸配列を構築する。
本発明の更なる局面は変異酵素の調製法に関する。本発明の変異酵素調製法の一態様では、本発明者らが取得に成功した変異GOを遺伝子工学的手法で調製する。この態様の場合、配列番号3又は4のアミノ酸配列をコードする核酸を用意する(ステップ(I))。ここで、「特定のアミノ酸配列をコードする核酸」は、それを発現させた場合に当該アミノ酸配列を有するポリペプチドが得られる核酸であり、当該アミノ酸配列に対応する塩基配列からなる核酸は勿論のこと、そのような核酸に余分な配列(アミノ酸配列をコードする配列であっても、アミノ酸配列をコードしない配列であってもよい)が付加されていてもよい。また、コドンの縮重も考慮される。「配列番号3又は4のアミノ酸配列をコードする核酸」は、本明細書又は添付の配列表が開示する配列情報を参考にし、標準的な遺伝子工学的手法、分子生物学的手法、生化学的手法などを用いることによって、単離された状態に調製することができる。ここで、配列番号3又は4のアミノ酸配列はいずれも、アスペルギルス・ニガー由来GOのアミノ酸配列に変異を施したものである。従って、アスペルギルス・ニガー由来GOをコードする遺伝子(配列番号7)に対して必要な変異を加えることによっても、配列番号3又は4のアミノ酸配列をコードする核酸(遺伝子)を得ることができる。位置特異的塩基配列置換のための方法は当該技術分野において数多く知られており(例えば、Molecular Cloning, Third Edition, Cold Spring Harbor Laboratory Press, New Yorkを参照)、その中から適切な方法を選択して用いることができる。位置特異的変異導入法として、位置特異的アミノ酸飽和変異法を採用することができる。位置特異的アミノ酸飽和変異法は、タンパクの立体構造を基に、求める機能の関与する位置を推定し、アミノ酸飽和変異を導入する「Semi-rational,semi-random」手法である(J.Mol.Biol.331,585-592(2003))。例えば、Quick change(ストラタジーン社)等のキット、Overlap extention PCR(Nucleic Acid Res. 16,7351-7367(1988))を用いて位置特異的アミノ酸飽和変異を導入することが可能である。PCRに用いるDNAポリメラーゼはTaqポリメラーゼ等を用いることができる。但し、KOD-PLUS-(東洋紡社)、Pfu turbo(ストラタジーン社)などの精度の高いDNAポリメラーゼを用いることが好ましい。
基質親和性を改善するにあたり、変異酵素GOM2の変異箇所それぞれにおける周辺のアミノ酸に対して、複数種のアミノ酸に置換するよう設計した変異を導入し、S444への変異導入により、GDH化を示すことを見出した。
アスペルギルス・ニガーGO-1号菌(天野エンザイム社保有)からGen Elute Plant Genomic DNA kit(シグマ社)を用いてゲノムDNAを抽出した後、PCRによりGO遺伝子を取得した。PCR後の増幅産物をpYES2に挿入してpYES-GO-K-P-2プラスミドとし、構築したpYES-GO-K-P-2プラスミドを鋳型として、S444へ複数種のアミノ酸に置換するよう設計した変異グルコースオキシダーゼを有するプラスミドを構築した。変異導入後のプラスミドを大腸菌DH5αに形質転換後、プラスミド抽出を行い、変異ライブラリーを作製した。得られたライブラリーをサッカロマイセス・セレビシエINVSc1(インビトロジェン社)に形質転換し、生育してきたコロニーをについて、液体培養を行い、GO活性及びGDH活性を調べた。液体培養での発現はpYES2のマニュアルを参考にした。
<GOアッセイ用試薬>
フェノール含有リン酸緩衝液 21mL
1mol/L グルコース 3mL
25u/mL PO-3 5mL
0.4g/dL 4-A.A 1mL
<GDHアッセイ用試薬>
50mM PIPES-NaOH(cont. 0.1% Triton X-100) pH 7.0 23mL
1mol/L グルコース 3mL
3mmol/L PMS 3mL
6.6mmol/L NTB 1mL
上記の結果を踏まえ、444位アミノ酸がセリンからアルギニンに置換され、582位アミノ酸がバリンからプロリンに置換された多重変異体(S444R,V582P:「GOM6」と呼称する)のグルコースに対する親和性を、多重変異体(GOM2)と比較しつつ以下の方法で評価した。
多重変異体(GOM6)の基質特異性を以下の通り評価した。即ち、各試薬200μL対して基質親和性確認の実験で用いた精製酵素20μL添加し、37℃で反応させた。反応開始後5分と10分に吸光度を測定し、吸光度差からGDH活性を求めた。各基質を用いた場合のGDH活性を、グルコースを基質とした場合のGDH活性(100%)に対する比率で表した。
<基質特異性確認GDHアッセイ用試薬>
50mM PIPES-NaOH(cont. 0.1% Triton X-100) pH 7.0 23mL
1mol/L 基質 3mL
3mmol/L PMS 3mL
6.6mmol/L NTB 1mL
特定に成功した変異箇所(S444、V582)の汎用性を検証するために、他のGOに関して多重変異体を調製した。具体的には、公共のデータベースに登録されているアスペルギルス・ニガー由来のGO(gi 121529、配列番号15)の多重変異体1cf3M6(S444R,V582P)と、ペニシリウム・アマガサキエンス由来のGO(配列番号2)の多重変異体1pgeM6(N444R,V582P)を調製し、GDH活性及びGO活性、基質親和性、並びに基質特異性を検討した。また、GOM6との間で置換後のアミノ酸が異なる多重変異体GOM7(S444Q,V582P)及びGOM8(S444E,V582P)についてもその特性を調べた。各多重変異体の調製法及び活性測定法などは上記の実験に準じた。
Claims (17)
- アスペルギルス・ニガー又はペニシリウム・アマガサキエンスのグルコースオキシダーゼのアミノ酸配列において、以下の(1)のアミノ酸置換と以下の(2)のアミノ酸置換が行われたアミノ酸配列からなる変異酵素:
(1)配列番号1に示すアミノ酸配列の444位アミノ酸に相当するアミノ酸のアルギニン、グルタミン酸又はグルタミンへの置換、
(2)配列番号1に示すアミノ酸配列の582位アミノ酸に相当するアミノ酸のプロリンへの置換。 - 微生物由来グルコースオキシダーゼのアミノ酸配列において、以下の(1)のアミノ酸置換と以下の(2)のアミノ酸置換が行われたアミノ酸配列であり、配列番号1、2又は15のアミノ酸配列と90%以上の同一性を示すアミノ酸配列からなる変異酵素であって、前記グルコースオキシダーゼと比較してGDH活性/GO活性が高まっている変異酵素:
(1)配列番号1に示すアミノ酸配列の444位アミノ酸に相当するアミノ酸のアルギニン、グルタミン酸又はグルタミンへの置換、
(2)配列番号1に示すアミノ酸配列の582位アミノ酸に相当するアミノ酸のプロリンへの置換。 - グルコースオキシダーゼのアミノ酸配列が配列番号1、2又は15のアミノ酸配列である、請求項1又は2に記載の変異酵素。
- 配列番号4のアミノ酸配列からなる、請求項1又は2に記載の変異酵素。
- 請求項1〜4のいずれか一項に記載の変異酵素をコードする遺伝子。
- 配列番号6の塩基配列を含む、請求項5に記載の遺伝子。
- 請求項5又は6に記載の遺伝子を含む組換えDNA。
- 請求項5又は6に記載の遺伝子を含む組換えベクター。
- 請求項7に記載の組換えDNAを保有する微生物。
- 請求項1〜4のいずれか一項に記載の変異酵素を用いて試料中のグルコースを測定することを特徴とする、グルコース測定法。
- 請求項1〜4のいずれか一項に記載の変異酵素を含むことを特徴とするグルコース測定用試薬。
- 請求項11に記載のグルコース測定用試薬を含む、グルコース測定用キット。
- 請求項1〜4のいずれか一項に記載の変異酵素を用いて工業製品又はその原料中のグルコース量を低下させることを特徴とする方法。
- 請求項1〜4のいずれか一項に記載の変異酵素を含有する酵素剤。
- 以下のステップ(i)及び(ii)を含む、変異酵素の設計法:
(i)アスペルギルス・ニガー又はペニシリウム・アマガサキエンスのグルコースオキシダーゼである変異対象酵素のアミノ酸配列において、以下の(1)のアミノ酸と(2)のアミノ酸を特定するステップ:
(1)配列番号1に示すアミノ酸配列の444位アミノ酸に相当するアミノ酸、
(2)配列番号1に示すアミノ酸配列の582位アミノ酸に相当するアミノ酸;
(ii)変異対象酵素のアミノ酸配列を基にして、ステップ(i)で特定された(1)のアミノ酸がアルギニン、グルタミン酸又はグルタミンに置換され、且つステップ(i)で特定された(2)のアミノ酸がプロリンに置換されたアミノ酸配列を構築するステップ。 - グルコースオキシダーゼのアミノ酸配列が配列番号1又は2のアミノ酸配列である、請求項15に記載の設計法。
- 以下のステップ(I)〜(III)を含む、変異酵素の調製法:
(I)配列番号4のアミノ酸配列、又は請求項15又は16に記載の設計法によって構築されたアミノ酸配列をコードする核酸を用意するステップ;
(II)前記核酸を発現させるステップ、及び
(III)発現産物を回収するステップ。
Applications Claiming Priority (5)
Application Number | Priority Date | Filing Date | Title |
---|---|---|---|
JP2014176042 | 2014-08-29 | ||
JP2014176042 | 2014-08-29 | ||
JP2014233291 | 2014-11-18 | ||
JP2014233291 | 2014-11-18 | ||
PCT/JP2015/073060 WO2016031611A1 (ja) | 2014-08-29 | 2015-08-17 | 変異酵素及びその用途 |
Publications (2)
Publication Number | Publication Date |
---|---|
JPWO2016031611A1 JPWO2016031611A1 (ja) | 2017-06-15 |
JP6695802B2 true JP6695802B2 (ja) | 2020-05-20 |
Family
ID=55399507
Family Applications (1)
Application Number | Title | Priority Date | Filing Date |
---|---|---|---|
JP2016545444A Active JP6695802B2 (ja) | 2014-08-29 | 2015-08-17 | 変異酵素及びその用途 |
Country Status (2)
Country | Link |
---|---|
JP (1) | JP6695802B2 (ja) |
WO (1) | WO2016031611A1 (ja) |
Families Citing this family (5)
Publication number | Priority date | Publication date | Assignee | Title |
---|---|---|---|---|
CN108893453B (zh) * | 2018-06-04 | 2020-05-22 | 中国农业科学院饲料研究所 | 葡萄糖氧化酶god突变体及其基因和应用 |
CN110577939B (zh) * | 2018-06-07 | 2021-01-26 | 青岛红樱桃生物技术有限公司 | 耐热性提高的葡萄糖氧化酶突变体及其编码基因和应用 |
CN110628738B (zh) * | 2019-09-27 | 2021-01-12 | 华东理工大学 | 提高葡萄糖氧化酶活性的方法、突变体及其应用 |
WO2023225459A2 (en) | 2022-05-14 | 2023-11-23 | Novozymes A/S | Compositions and methods for preventing, treating, supressing and/or eliminating phytopathogenic infestations and infections |
CN115181734A (zh) * | 2022-08-29 | 2022-10-14 | 上海茵肽信息科技有限公司 | 一种基于饱和突变和复合评估设计的高热稳定性的新型葡萄糖氧化酶 |
Family Cites Families (2)
Publication number | Priority date | Publication date | Assignee | Title |
---|---|---|---|---|
US8883434B2 (en) * | 2009-12-05 | 2014-11-11 | Amano Enzyme Inc. | Mutant enzyme and application thereof |
EP2562250A1 (en) * | 2011-08-25 | 2013-02-27 | Roche Diagnostics GmbH | Glucose oxidase |
-
2015
- 2015-08-17 WO PCT/JP2015/073060 patent/WO2016031611A1/ja active Application Filing
- 2015-08-17 JP JP2016545444A patent/JP6695802B2/ja active Active
Also Published As
Publication number | Publication date |
---|---|
JPWO2016031611A1 (ja) | 2017-06-15 |
WO2016031611A1 (ja) | 2016-03-03 |
Similar Documents
Publication | Publication Date | Title |
---|---|---|
JP6059784B2 (ja) | 変異酵素及びその用途 | |
JP6460152B2 (ja) | 新規なグルコース脱水素酵素 | |
US9260699B2 (en) | Glucose dehydrogenase | |
JP6695802B2 (ja) | 変異酵素及びその用途 | |
US9487758B2 (en) | Glucose dehydrogenase | |
JP4836017B2 (ja) | 糸状菌由来グルコースデヒドロゲナーゼを組換え体で高発現するための方法 | |
JP6207168B2 (ja) | 新規なグルコース脱水素酵素 | |
JP6605489B2 (ja) | デヒドロゲナーゼ化した変異酵素及びその用途 | |
JP7044709B2 (ja) | グルコースデヒドロゲナーゼ | |
WO2019230614A1 (ja) | グルコースデヒドロゲナーゼの改良 | |
WO2021182508A1 (ja) | グルコースデヒドロゲナーゼ | |
WO2020116330A1 (ja) | グルコースデヒドロゲナーゼ | |
JP5793841B2 (ja) | フラビンアデニンジヌクレオチド依存性グルコースデヒドロゲナーゼの比活性を向上する方法 |
Legal Events
Date | Code | Title | Description |
---|---|---|---|
A621 | Written request for application examination |
Free format text: JAPANESE INTERMEDIATE CODE: A621 Effective date: 20180619 |
|
A131 | Notification of reasons for refusal |
Free format text: JAPANESE INTERMEDIATE CODE: A131 Effective date: 20190515 |
|
A521 | Request for written amendment filed |
Free format text: JAPANESE INTERMEDIATE CODE: A523 Effective date: 20190702 |
|
A131 | Notification of reasons for refusal |
Free format text: JAPANESE INTERMEDIATE CODE: A131 Effective date: 20190930 |
|
A521 | Request for written amendment filed |
Free format text: JAPANESE INTERMEDIATE CODE: A523 Effective date: 20191119 |
|
TRDD | Decision of grant or rejection written | ||
A01 | Written decision to grant a patent or to grant a registration (utility model) |
Free format text: JAPANESE INTERMEDIATE CODE: A01 Effective date: 20200407 |
|
A61 | First payment of annual fees (during grant procedure) |
Free format text: JAPANESE INTERMEDIATE CODE: A61 Effective date: 20200422 |
|
R150 | Certificate of patent or registration of utility model |
Ref document number: 6695802 Country of ref document: JP Free format text: JAPANESE INTERMEDIATE CODE: R150 |
|
R250 | Receipt of annual fees |
Free format text: JAPANESE INTERMEDIATE CODE: R250 |
|
R250 | Receipt of annual fees |
Free format text: JAPANESE INTERMEDIATE CODE: R250 |