CN104928226A - 一株重组谷氨酸棒杆菌及其在生产5-氨基乙酰丙酸中的应用 - Google Patents

Abstract

本发明公开了一株重组谷氨酸棒杆菌，该菌株命名为谷氨酸棒杆菌SEAL，其基因型为：谷氨酸棒杆菌ATCC13032/pec-SthemA^M-EchemL。本发明还公开了所述重组谷氨酸棒杆菌在发酵生产5-氨基乙酰丙酸中的应用。实验证实本发明所述的重组菌株SEAL能以葡萄糖作为唯一碳源发酵生产5-氨基乙酰丙酸(5-ALA)，且其5-ALA产量为0.8g/L，在所有参试菌中最高，提示其具有很好的工业开发和应用前景。

Description

一株重组谷氨酸棒杆菌及其在生产5-氨基乙酰丙酸中的应用

技术领域

本发明涉及基因工程和微生物代谢工程领域，具体地说，涉及一株重组谷氨酸棒杆菌及其在生产5-氨基乙酰丙酸(5-ALA)中的应用。

背景技术

5-氨基乙酰丙酸(5-aminolevulinic acid,5-ALA)分子式为C₅O₃NH₉，其分子量为131.13，熔点为118℃。5-ALA在农业上具有广泛的应用。研究表明它是无公害的天然物质，具有生物降解性，因此主要应用于绿色除草剂、植物生长调节剂、杀虫剂等方面。5-ALA作为一种无公害的新型农药，由于其在环境中易降解，无残留，对哺乳动物无毒性，因而受到越来越多的关注。另外，在医学领域，5-ALA作为一种安全、选择、渗透性好的光动力学药物，已经应用于皮肤癌、膀胱癌、消化道癌、肺癌等的诊断与光动力治疗(PDT)中。

目前，5-ALA主要是通过化学方法合成的。其化学合成主要集中在以马尿酸和琥珀酸为原料的合成工艺研究、以糠醛等杂环物质为原料的合成工艺研究及以乙酰丙酸或其衍生物为原料的合成工艺研究。但是化学合成具有工艺步骤多、分离提纯难、副产物多、5-ALA得率低等问题，从而造成生产成本高。除此之外，化学合成涉及很多有毒试剂，对环境也会造成污染。所以随着社会和科学技术的发展，以廉价的可再生资源为底物，利用微生物发酵生产5-ALA已是未来的趋势。目前市场上，葡萄糖价格为4500元/吨，5-ALA价格为80000000元/吨。所以以廉价的葡萄糖作为原料发酵产5-ALA，成本上具有极大的优势，并且还能减少对环境的污染，值得研发和推广。

国外的一些文献报道，通过诱变育种法对光合细菌球形红细菌(Rhodobacter sphaeroides)诱变，能够筛选出5-ALA高产菌株，利用其发酵生产5-氨基乙酰丙酸，5-ALA产量达到了7.2g/L。然而由于光合细菌发酵中采用光照，从而增加了成本，不适合大规模工业发酵生产。随着基因工程技术的成熟，人们已经采用基因重组技术将R.sphaeroides中的5-ALA合成酶基因(hemA)在野生型大肠杆菌中表达。Mariet和Zeikus获得大肠杆菌(Escherichia coli)重组菌株，5-ALA发酵产量达到了3.79g/L。Xie等人利用含有R.sphaeroides的5-ALA合成酶基因的重组大肠杆菌，经过发酵优化，5-ALA产量达到5.2g/L。2011年，Kang等人开始C5途径的研究，他们将来自于亚利桑那沙门氏菌(Salmonella arizonae)的hemA基因(编码glutamyl-tRNA reductase)突变后，与hemL基因(编码glutamate-1-semialdehydeaminotransferase)在E.coli中共表达，同时表达了一个由rhtA基因编码的5-ALA转运蛋白，使得5-ALA的产量达4.13g/L。在这些工艺研究中所使用的前提物质琥珀酸和甘氨酸主要是通过化学合成法制备，所以其生物转化5-ALA成本较高，同时由于高浓度的甘氨酸(＞1.7g/L)能够造成对菌体生长的抑制，使生物转化工艺相对复杂。另外，生物转化中所用的培养基为昂贵的LB培养基，这也成为5-ALA工业化的瓶颈。所以如何降低发酵成本及简化发酵工艺，成为5-ALA工业生产的关键问题。

同时，上述5-ALA生产方法主要采用的是模式菌株大肠杆菌，主要包括其C4-途径，即通过表达5-ALA合成酶生物转化琥珀酸和甘氨酸来生产5-ALA，或者是利用大肠杆菌的C5-途径，即表达外源的hemA和hemL基因以谷氨酸作为前提物质来生产5-ALA。既然5-ALA的C5-合成途径的前提物质是谷氨酸，要是采用能天然生产谷氨酸并且具有安全性的菌株谷氨酸棒杆菌(Corynebaererium glutamicum)的话，则可无需过多的考虑如何提高上游代谢途径的谷氨酸产量的环节，这不仅能简化发酵工艺途径，还能大大降低发酵成本以及设备支出，使工业生产5-ALA的成本显著下降；另外，谷氨酸棒杆菌广泛应用于食品发酵，具有一定的安全性，利用谷氨酸棒杆菌发酵生产的5-ALA产品对进一步开发其医药价值具有积极的作用。然而，经检索，关于重组谷氨酸棒杆菌及其构建和其在生产5-氨基乙酰丙酸(5-ALA)中的应用的专利及文献还未见报道。

发明内容

针对目前5-ALA生产中的缺陷，本发明要解决的问题是提供一株重组谷氨酸棒杆菌及其在生产5-氨基乙酰丙酸(5-ALA)中的应用。

本发明的技术方案是基于谷氨酸棒杆菌的C5途径，主要是在谷氨酸棒杆菌中过量表达ALA的C5合成途径中协同表达的编码glutamyl-tRNA reductase突变体的基因hemA^M和glutamate-1-semialdehyde aminotransferase的基因hemL，其中，hemA^M来源于亚利桑那沙门沙门氏菌，hemL来源于大肠杆菌，构建得到一株重组谷氨酸棒杆菌SEAL；同时还过量表达了来源于谷氨酸棒杆菌或沙门氏菌中的hemA基因及其突变体和来源于大肠杆菌或谷氨酸棒杆菌中的hemL基因，并利用所构建的重组菌在无机盐培养基CGXII内以葡萄糖作为唯一碳源来发酵生产5-氨基乙酰丙酸(5-ALA)。

本发明所述的重组谷氨酸棒杆菌，其特征在于，该重组谷氨酸棒杆菌命名为谷氨酸棒杆菌SEAL，其基因型为：谷氨酸棒杆菌ATCC13032/pec-SthemA^M-EchemL，由如下方法制得：先克隆得到EchemL基因和突变基因SthemA^M，构建含SthemA^M和EchemL基因的共表达载体pec-SthemA^M-EchemL，将所构建的重组质粒pec-SthemA^M-EchemL电转入野生型谷氨酸棒杆菌中，得到过量表达SthemA^M和EchemL基因的重组谷氨酸棒杆菌，命名为谷氨酸棒杆菌SEAL；其中，所述EchemL基因来源于大肠杆菌，所述SthemA^M是来源于亚利桑那沙门沙门氏菌的hemA基因的突变体，所述表达SthemA^M和EchemL基因的载体为穿梭质粒pECXK99E，所述野生型谷氨酸棒杆菌是谷氨酸棒杆菌ATCC13032。

本发明所述重组谷氨酸棒杆菌在发酵生产5-氨基乙酰丙酸中的应用。

上述应用方法是：利用所述重组谷氨酸棒杆菌在无机盐培养基CGXII中发酵葡萄糖来生产5-氨基乙酰丙酸；其中，

所述无机盐培养基CGXII配方为：

20g/L(NH4)₂SO₄,5g/L尿素,1g/L KH₂PO₄,1g/L K₂HPO₄,0.25g/L MgSO₄﹒7H₂O,42g/L 3-吗啉丙磺酸,10mg/L CaCl₂,10mg/L FeSO₄﹒7H₂O,10mg/L MnSO₄﹒H₂O,1mg/L ZnSO₄﹒7H₂O,0.2mg/L CuSO₄,0.02mg/L NiCl₂﹒6H₂O,0.2mg/L biotin,40g/L葡萄糖,0.03mg/L柠檬酸钠，0.5mM IPTG，50μg/mL卡那霉素；

所述发酵葡萄糖的发酵条件为：

菌种接种量以体积百分比计为10±2％，发酵温度为30±1℃，pH为6.5～7.0，转速为180±20rpm，发酵时间为108±2h。

进一步的，发酵温度优选30℃，pH优选6.5，转速优选180rpm，发酵时间为108h。

本发明所述重组谷氨酸棒杆菌在生产5-ALA中的应用，具体方法是：

摇瓶发酵：从LB平板上挑取谷氨酸棒杆菌SEAL单菌落接入50mL含有卡那霉素的LB液体培养基中30℃，180rpm过夜培养。取适当体积的菌悬液4℃，12000rpm离心1min，收集菌体，并用无菌的生理盐水洗涤一次，用CGXII培养基重悬后接入含有40g/L葡萄糖的CGXII培养基中30℃，180rpm进行5-ALA发酵，初始OD为0.8-1.0左右，IPTG浓度为0.5mM，每12h取样测定菌体浓度及5-ALA产量，然后利用比色法检测5-ALA的浓度，用4M无菌的NaOH溶液调节pH至6.5-7.0之间，发酵时间为108±2h。

5-ALA检测方法：将样品稀释至400μL，加入200μL的乙酸盐缓冲液，100μL的乙酰丙酮，然后煮沸15min。冷却至室温，然后加入700μL的改良Ehrlich’s试剂，反应20min，利用分光光度计554nm下检测。

本发明将能够协同表达的hemA和hemL基因进行构建，得到一株重组谷氨酸棒杆菌SEAL，并利用该重组菌以葡萄糖作为唯一碳源发酵生产5-氨基乙酰丙酸(5-ALA)，具有非常重要的工业应用价值。本发明中利用能天然生产谷氨酸并且具有安全性的菌株谷氨酸棒杆菌，无需过多的考虑如何提高上游代谢途径的谷氨酸产量的环节，这不仅能简化发酵工艺途径，还能大大降低发酵成本以及设备支出，使工业生产5-ALA的成本显著下降；实验证实本发明所述的重组菌株SEAL的5-ALA产量为0.8g/L，在所有参试菌中最高(见图1)，提示其具有很好的工业开发和应用前景。

附图说明

图1.各重组菌株的5-ALA产量比较。

其中，PECXK是含有空质粒pECXK99E的重组菌株，CGAL是含有质粒pec-CghemA-CghemL的重组菌株，CEAL是含有质粒pec-CghemA-EchemL的重组菌株，SCAL是含有质粒pec-SthemA^M-CghemL的重组菌株，SEAL是含有质粒pec-SthemA^M-EchemL的重组菌株。

具体实施方式

一般性说明：实施例所涉及的酶均购自TaKaRa公司，质粒提取试剂盒购自天根公司，琼脂糖凝胶回收DNA片段试剂盒购自申能博彩公司，操作完全按照相应说明述进行。质粒构建中基因测序由华大基因公司完成。5-ALA标准样品及其他试剂均购自Sigma公司。DH5α感受态细胞购自全式金生物技术有限公司。谷氨酸棒杆菌ATCC13032来源于ATCC(美国典型培养物保藏中心)。

LB液体培养基(1L)：酵母粉5g，蛋白胨10g，NaCl 10g，pH 7.0。

LBG培养基：LB培养基中加入2％(W/V)的葡萄糖，用于谷氨酸棒杆菌的普通培养及菌株构建保存等。

BHIS(山梨醇脑心浸液肉汤培养基)：酵母膏2.5g/L，蛋白胨5g/L，氯化钠5g/L，脑心浸液18.5g/L，山梨醇91g/L；谷氨酸棒杆菌电转化感受态制备培养基。

5-ALA检测方法：将样品稀释至400μL，加入200μL的乙酸盐缓冲液，100μL的乙酰丙酮，然后煮沸15min。冷却至室温，然后加入700μL的改良Ehrlich’s试剂，反应20min，利用分光光度计554nm下检测。

乙酸盐缓冲液组成为(1L)：57mL冰乙酸，82g无水醋酸钠。

改良Ehrlich’s试剂：在50mL的量筒中加入30mL的冰乙酸，1g对-二甲氨基苯甲醛，8mL 70％高氯酸，然后定容50mL。

实施例1、重组谷氨酸棒杆菌菌株SEAL的构建及其发酵生产5-ALA

分别根据NCBI公布的沙门氏菌和大肠杆菌基因组序列，利用带有同源臂和突变位点的特异性引物

SthemA^M-F：

5′-GCTCGGTACCCGGGGATCCTCTAGAGTCGAAAGGAGGATATACATATGACCAAGAAGCTTTTAG-3′

和SthemA^M-R：

5′-CAGACTTACTCATTATATCCTCCTTCTACTCCAGCCCGAGGCT-3′，

以沙门氏菌基因组为模板进行PCR，克隆得到SthemA^M基因，其中在N端的Thr-2和Leu-3之间插入两个赖氨酸，即AAGAAG，用于定点突变。同时利用引物

Echeml-F:

5′-AAGGAGGATATACATATGAGTAAGTCTG-3′

和Echeml-R:

5′-AACAGCCAAGCTTGCATGCCTGCAGGTCGATCACAACTTCGCAAACACC-3′，

以大肠杆菌基因组为模板进行PCR，克隆得到EchemL基因。将克隆得到的基因片段与BamHI单酶切并且回收纯化后的质粒载体pECXK99E采用Gibson的组装方法进行连接，各组装片段是等摩尔比加入的，其连接体系为30μL：

SthemA^M片段：4.0μL

EchemL片段：4.0μL

pECXK99E载体：7.0μL

2×Gibson Assembly体系：15μL

50℃连接60h后，将30μL的连接产物转化DH5α感受态细胞，挑取转化子，提取质粒验证，然后进一步测序验证，从而获得重组质粒pec-SthemA^M-EchemL。

具体DH5α转化过程为：将30μL的含重组质粒pec-SthemA^M-EchemL的连接液加入100μL的DH5α感受态细胞中，混匀。冰浴30min，42℃热击90s,冰浴2min，加入900μL的LB培养基，37℃,180rpm，孵化1h，涂布卡那霉素抗性平板，培养16h，挑取转化子，提取质粒验证，并进一步测序验证，从而获得重组质粒pec-SthemA^M-EchemL。然后将该质粒电转入野生型谷氨酸棒杆菌ATCC13032，具体电转过程为：取5μL预冷质粒加入谷氨酸棒杆菌感受态细胞中混匀，然后加入于预冷的电击杯中，12.5KV/cm 5ms电击1次，立即加入46℃预热的恢复用BHIS培养基1mL混匀，46℃金属浴静止放置6min，30℃150rpm培养1h，4000rpm离心2min，涂布卡那霉素抗性平板，培养36h，挑取转化子，从而获得重组菌株谷氨酸棒杆菌ATCC13032/pec-SthemA^M-EchemL(命名为SEAL)。

重组菌株谷氨酸棒杆菌ATCC13032/pec-SthemA^M-EchemL(命名为SEAL)的发酵：

从LB平板上挑取单菌落接入50mL含有卡那霉素的LB液体培养基中30℃，180rpm过夜培养。取适当体积的菌悬液4℃，12000rpm离心1min，收集菌体，并用无菌的生理盐水洗涤一次，用CGXII培养基重悬后接入含有40g/L葡萄糖的CGXII培养基中，30℃，180rpm进行发酵制备5-ALA，初始OD为0.8-1.0，IPTG浓度为0.5mM，每12h取样测定菌体浓度及5-ALA产量，然后利用比色法检测5-ALA的浓度，用4M无菌的NaOH溶液调节pH至6.5-7.0之间，108h结束发酵。

其中，上述使用的无机盐培养基CGXII配方为：20g/L(NH4)₂SO₄,5g/L尿素,1g/L KH₂PO₄,1g/L K₂HPO₄,0.25g/L MgSO₄﹒7H₂O,42g/L 3-吗啉丙磺酸(3-morpholinopropanesulfonic acid，简称MOPS),10mg/L CaCl₂,10mg/L FeSO₄﹒7H₂O,10mg/L MnSO₄﹒H₂O,1mg/L ZnSO₄﹒7H₂O,0.2mg/L CuSO₄,0.02mg/L NiCl₂﹒6H₂O,0.2mg/L biotin(pH 7),40g/L glucose,0.03mg/L柠檬酸钠，0.5mM IPTG，50μg/mL卡那霉素。卡那霉素的添加是为了维持质粒的稳定。

5-ALA检测方法具体如下：将样品稀释至400μL，加入200μL的乙酸盐缓冲液，100μL的乙酰丙酮，然后煮沸15min。冷却至室温，然后加入700μL的改良Ehrlich’s试剂，反应20min，利用分光光度计554nm下检测。108h结束发酵后，所测得的重组菌株SEAL的5-ALA产量最高能达到0.8g/L。

实施例2、重组谷氨酸棒杆菌菌株CGAL的构建及其发酵生产5-ALA

根据NCBI公布的谷氨酸棒杆菌基因组序列，利用带有同源臂的特异性引物

CghemA-F:

5′-GCTCGGTACCCGGGGATCCTCTAGAGTCGAAAGGAGGATATACATATGGTGAGTGTACTCATC-3′

和CghemA-R:

5′-TGTCATGTGCGTCATATGTATATCCTCCTTGTTACTCCCTCGTTTGTG-3′，

以谷氨酸棒杆菌基因组作为模板，克隆得到CghemA基因。同时，利用引物

CghemL-F:5′-AAGGAGGATATACATATGACGCACATGACATCG-3′

和CghemL-R:

5′-AACAGCCAAGCTTGCATGCCTGCAGGTCGATCATGATGCCTTCGCTTC-3′，

以谷氨酸棒杆菌基因组作为模板，克隆得到CghemL基因。将得到的CghemA和CghemL片段及BamHI单酶切并且回收纯化后的质粒载体pECXK99E采用Gibson的组装方法进行连接，各组装片段是等摩尔比加入的，其连接体系为30μL：

CghemA片段：4.5μL

CghemA片段：4.5μL

pECXK99E载体：6μL

2×Gibson Assembly体系：15μL

50℃连接60h后，将30μL的连接液转化大肠杆菌DH5α感受态细胞。转化过程为：将30μL的连接液加入100μL的DH5α感受态细胞中，混匀。冰浴30min，42℃热击90s,冰浴2min，加入900μL的LB培养基，37℃,180rpm，孵化1h，涂布卡那霉素抗性平板，培养16h，挑取转化子，提取质粒验证，并进一步测序验证，从而获得重组质粒pec-CghemA-CghemL。然后将该质粒电转入野生型谷氨酸棒杆菌ATCC13032，具体电转过程为：取5μL预冷质粒加入谷氨酸棒杆菌感受态细胞中混匀，然后加入于预冷的电击杯中，12.5KV/cm 5ms电击1次，立即加入46℃预热的恢复用BHIS培养基1mL混匀，46℃金属浴静止放置6min，30℃150rpm培养1h，4000rpm离心2min，涂布卡那霉素抗性平板，培养36h，挑取转化子，从而获得重组菌株谷氨酸棒杆菌ATCC13032/pec-CghemA-CghemL(命名为CGAL)。

该重组菌株的发酵：从LB平板上挑取单菌落接入50mL含有卡那霉素的LB液体培养基中30℃，180rpm过夜培养。取适当体积的菌悬液4℃，12000rpm离心1min，收集菌体，并用无菌的生理盐水洗涤一次，用CGXII培养基重悬后接入含有40g/L葡萄糖的CGXII培养基中，30℃，180rpm进行发酵制备5-ALA，初始OD为0.8-1.0左右，IPTG浓度为0.5mM，每12h取样测定菌体浓度及5-ALA产量，然后利用比色法检测5-ALA的浓度，用4M无菌的NaOH溶液调节pH至6.5-7.0之间，108h结束发酵。

其中，所述无机盐培养基CGXII配方为：20g/L(NH4)₂SO₄,5g/L urea,1g/L KH₂PO₄,1g/LK₂HPO₄,0.25g/L MgSO₄﹒7H₂O,42g/L 3-morpholinopropanesulfonic acid(MOPS),10mg/LCaCl₂,10mg/L FeSO₄﹒7H₂O,10mg/L MnSO₄﹒H₂O,1mg/L ZnSO₄﹒7H₂O,0.2mg/L CuSO₄,0.02mg/L NiCl₂﹒6H₂O,0.2mg/L biotin(pH 7),40g/L glucose,0.03mg/L柠檬酸钠，0.5mMIPTG，50μg/mL卡那霉素。

5-ALA检测方法具体如下：将样品稀释至400μL，加入200μL的乙酸盐缓冲液，100μL的乙酰丙酮，然后煮沸15min。冷却至室温，然后加入700μL的改良Ehrlich’s试剂，反应20min，利用分光光度计554nm下检测。108h结束发酵后，所测得的重组菌株CGAL的5-ALA产量是0.05g/L。

实施例3、重组谷氨酸棒杆菌菌株CEAL的构建及其发酵生产5-ALA

根据NCBI公布的大肠杆菌和谷氨酸棒杆菌基因组序列，利用带有同源臂的特异性引物

CghemA-F:

5′-GCTCGGTACCCGGGGATCCTCTAGAGTCGAAAGGAGGATATACATATGGTGAGTGTACTCATC-3′

和CghemA-R:

5′-TGTCATGTGCGTCATATGTATATCCTCCTTGTTACTCCCTCGTTTGTG-3′，

以谷氨酸棒杆菌基因组作为模板，克隆得到CghemA基因。同时，利用引物

CEhemL-F:

5′-AAGGAGGATATACATATGAGTAAGTCTG-3′

和CEhemL-R:

5′-AACAGCCAAGCTTGCATGCCTGCAGGTCGATCACAACTTCGCAAACACC-3′，

以大肠杆菌基因组作为模板，克隆得到EchemL基因。将克隆得到的基因片段与BamHI单酶切并且回收纯化后的质粒载体pECXK99E采用Gibson的组装方法进行连接，各组装片段是等摩尔比加入的，其连接体系为30μL：

CghemA片段：4.5μL

EchemL片段：4.0μL

pECXK99E载体：6.5μL

2×Gibson Assembly体系：15μL

50℃连接60h后，将30μL的连接液转化大肠杆菌DH5α感受态细胞。转化过程为：将30μL的连接液加入100μL的DH5α感受态细胞中，混匀。冰浴30min，42℃热击90s,冰浴2min，加入900μL的LB培养基，37℃,180rpm，孵化1h，涂布卡那霉素抗性平板，培养16h，挑取转化子，提取质粒验证，并进一步测序验证，从而获得重组质粒pec-CghemA-EchemL。然后将该质粒电转入野生型谷氨酸棒杆菌ATCC13032，具体电转过程为：取5μL预冷质粒加入谷氨酸棒杆菌感受态细胞中混匀，然后加入于预冷的电击杯中，12.5KV/cm 5ms电击1次，立即加入46℃预热的恢复用BHIS培养基1mL混匀，46℃金属浴静止放置6min，30℃150rpm培养1h，4000rpm离心2min，涂布卡那霉素抗性平板，培养36h，挑取转化子，从而获得重组菌株谷氨酸棒杆菌ATCC13032/pec-CghemA-EchemL(命名为CEAL)。

该重组菌株的发酵：从LB平板上挑取单菌落接入50mL含有卡那霉素的LB液体培养基中30℃，180rpm过夜培养。取适当体积的菌悬液4℃，12000rpm离心1min，收集菌体，并用无菌的生理盐水洗涤一次，用CGXII培养基重悬后接入含有40g/L葡萄糖的CGXII培养基中，30℃，180rpm进行发酵制备5-ALA，初始OD为0.8-1.0左右，IPTG浓度为0.5mM，每12h取样测定菌体浓度及5-ALA产量，然后利用比色法检测5-ALA的浓度，用4M无菌的NaOH溶液调节pH至6.5-7.0之间，108h结束发酵。

其中，所述无机盐培养基CGXII配方为：20g/L(NH4)₂SO₄,5g/L urea,1g/L KH₂PO₄,1g/LK₂HPO₄,0.25g/L MgSO₄﹒7H₂O,42g/L 3-morpholinopropanesulfonic acid(MOPS),10mg/LCaCl₂,10mg/L FeSO₄﹒7H₂O,10mg/L MnSO₄﹒H₂O,1mg/L ZnSO₄﹒7H₂O,0.2mg/L CuSO₄,0.02mg/L NiCl₂﹒6H₂O,0.2mg/L biotin(pH 7),40g/L glucose,0.03mg/L柠檬酸钠，0.5mMIPTG，50μg/mL卡那霉素。

5-ALA检测方法具体如下：将样品稀释至400μL，加入200μL的乙酸盐缓冲液，100μL的乙酰丙酮，然后煮沸15min。冷却至室温，然后加入700μL的改良Ehrlich’s试剂，反应20min，利用分光光度计554nm下检测。108h结束发酵后，所测得的重组菌株CEAL的5-ALA产量是0.17g/L。

实施例4、重组谷氨酸棒杆菌菌株SCAL的构建及其发酵生产5-ALA

根据NCBI公布的沙门氏菌基因组序列，利用带有同源臂和突变位点的特异性引物

SthemA^M-F：

5′-GCTCGGTACCCGGGGATCCTCTAGAGTCGAAAGGAGGATATACATATGACCAAGAAGCTTTTAG-3′

和SthemA^M-R：

5′-TGTCATGTGCGTCATATGTATATCCTCCTTCTACTCCAGCCCGAGGCT-3′，

以沙门氏菌基因组基因组为模板进行PCR，克隆得到SthemA^M基因。同时，根据NCBI公布的谷氨酸棒杆菌基因组序列，利用特异性引物

CghemL-F:

5′-AAGGAGGATATACATATGACGCACATGACATCG-3′

和CghemL-R:

5′-AACAGCCAAGCTTGCATGCCTGCAGGTCGATCATGATGCCTTCGCTTC-3′，

以谷氨酸棒杆菌基因组作为模板进行PCR，克隆得到CghemL基因。将克隆得到的基因片段与BamHI单酶切并且回收纯化后的质粒载体pECXK99E采用Gibson的组装方法进行连接，各组装片段是等摩尔比加入的，其连接体系为30μL：

SthemA^M片段：4.0μL

CghemL片段：4.0μL

pECXK99E载体：7.0μL

2×Gibson Assembly体系：15μL

50℃连接60h后，将30μL的连接液转化大肠杆菌DH5α感受态细胞。转化过程为：将30μL的连接液加入100μL的DH5α感受态细胞中，混匀。冰浴30min，42℃热击90s,冰浴2min，加入900μL的LB培养基，37℃,180rpm，孵化1h，涂布卡那霉素抗性平板，培养16h，挑取转化子，提取质粒验证，并进一步测序验证，从而获得重组质粒pec-SthemA^M-CghemL。然后将该质粒电转入野生型谷氨酸棒杆菌ATCC13032，具体电转过程为：取5μL预冷质粒加入谷氨酸棒杆菌感受态细胞中混匀，然后加入于预冷的电击杯中，12.5KV/cm 5ms电击1次，立即加入46℃预热的恢复用BHIS培养基1mL混匀，46℃金属浴静止放置6min，30℃150rpm培养1h，4000rpm离心2min，涂布卡那霉素抗性平板，培养36h，挑取转化子，从而获得重组菌株谷氨酸棒杆菌ATCC13032/pec-SthemA^M-CghemL(命名为SCAL)。

该重组菌株的发酵：从LB平板上挑取单菌落接入50mL含有卡那霉素的LB液体培养基中30℃，180rpm过夜培养。取适当体积的菌悬液4℃，12000rpm离心1min，收集菌体，并用无菌的生理盐水洗涤一次，用CGXII培养基重悬后接入含有40g/L葡萄糖的CGXII培养基中，30℃，180rpm进行发酵制备5-ALA，初始OD为0.8-1.0左右，IPTG浓度为0.5mM，每12h取样测定菌体浓度及5-ALA产量，然后利用比色法检测5-ALA的浓度，用4M无菌的NaOH溶液调节pH至6.5-7.0之间，108h结束发酵。

其中，所述无机盐培养基CGXII配方为：20g/L(NH4)₂SO₄,5g/L urea,1g/L KH₂PO₄,1g/LK₂HPO₄,0.25g/L MgSO₄﹒7H₂O,42g/L 3-morpholinopropanesulfonic acid(MOPS),10mg/LCaCl₂,10mg/L FeSO₄﹒7H₂O,10mg/L MnSO₄﹒H₂O,1mg/L ZnSO₄﹒7H₂O,0.2mg/L CuSO₄,0.02mg/L NiCl₂﹒6H₂O,0.2mg/L biotin(pH 7),40g/L glucose,0.03mg/L柠檬酸钠，0.5mMIPTG，50μg/mL卡那霉素。

5-ALA检测方法具体如下：将样品稀释至400μL，加入200μL的乙酸盐缓冲液，100μL的乙酰丙酮，然后煮沸15min。冷却至室温，然后加入700μL的改良Ehrlich’s试剂，反应20min，利用分光光度计554nm下检测。108h结束发酵后，所测得的重组菌株SCAL的5-ALA产量是0.05g/L。

.上述各重组菌株的5-ALA产量比较见图1。其中，PECXK是含有空质粒pECXK99E的重组菌株，CGAL是含有质粒pec-CghemA-CghemL的重组菌株，CEAL是含有质粒pec-CghemA-EchemL的重组菌株，SCAL是含有质粒pec-SthemA^M-CghemL的重组菌株，SEAL是含有质粒pec-SthemA^M-EchemL的重组菌株。

Claims (3)

1.一株重组谷氨酸棒杆菌，其特征在于，所述重组谷氨酸棒杆菌命名为谷氨酸棒杆菌SEAL，其基因型为：谷氨酸棒杆菌ATCC13032/pec-SthemA^M-EchemL，由如下方法制得：先克隆得到EchemL基因和突变基因SthemA^M，构建含SthemA^M和EchemL基因的共表达载体pec-SthemA^M-EchemL，将所构建的重组质粒pec-SthemA^M-EchemL电转入野生型谷氨酸棒杆菌中，得到过量表达SthemA^M和EchemL基因的重组谷氨酸棒杆菌，命名为谷氨酸棒杆菌SEAL；其中，所述EchemL基因来源于大肠杆菌，所述SthemA^M是来源于亚利桑那沙门沙门氏菌的hemA基因的突变体，所述表达SthemA^M和EchemL基因的载体为穿梭质粒pECXK99E，所述野生型谷氨酸棒杆菌是谷氨酸棒杆菌ATCC13032。

2.权利要求1所述重组谷氨酸棒杆菌在发酵生产5-氨基乙酰丙酸中的应用。

3.如权利要求2所述的应用，其特征在于：利用所述重组谷氨酸棒杆菌在无机盐培养基CGXII中发酵葡萄糖来生产5-氨基乙酰丙酸；其中，

所述无机盐培养基CGXII配方为：

20g/L(NH4)₂SO₄,5g/L尿素,1g/L KH₂PO₄,1g/L K₂HPO₄,0.25g/L MgSO₄﹒7H₂O,42g/L 3-吗啉丙磺酸,10mg/L CaCl₂,10mg/L FeSO₄﹒7H₂O,10mg/L MnSO₄﹒H₂O,1mg/L ZnSO₄﹒7H₂O,0.2mg/L CuSO₄,0.02mg/L NiCl₂﹒6H₂O,0.2mg/L biotin,40g/L葡萄糖,0.03mg/L柠檬酸钠，0.5mM IPTG，50μg/mL卡那霉素；

所述发酵葡萄糖的发酵条件为：

菌种接种量以体积百分比计为10±2％，发酵温度为30±1℃，pH为6.5～7.0，转速为180±20rpm，发酵时间为108±2h。