CN108251396B

CN108251396B - 5-氨基乙酰丙酸合成酶突变体及其宿主细胞和应用

Info

Publication number: CN108251396B
Application number: CN201810191516.7A
Authority: CN
Inventors: 郑平; 赵晶; 谭子瑊; 陈久洲; 饶德明; 孙际宾; 马延和
Original assignee: Tianjin Institute of Industrial Biotechnology of CAS
Current assignee: Tianjin Institute of Industrial Biotechnology of CAS
Priority date: 2018-03-08
Filing date: 2018-03-08
Publication date: 2022-04-01
Anticipated expiration: 2038-03-08
Also published as: CN112831483A; CN108251396A; CN112831483B

Abstract

本发明提供一种5‑氨基乙酰丙酸合成酶(ALA合成酶)，所述ALA合成酶的氨基酸序列在对应于SEQ ID NO:1所示氨基酸序列的第40位、第365位、第75位、第29位、第44位的氨基酸残基发生了突变。本发明的ALA合成酶不仅显著提高了活性，同时也部分解除了血红素的反馈抑制。同时，本发明还提供了制备和改造该酶的方法，含有该酶的表达载体、宿主细胞以及该酶在ALA生产中的应用。

Description

5-氨基乙酰丙酸合成酶突变体及其宿主细胞和应用

技术领域

本发明涉及生物技术领域。具体地说，本发明涉及5-氨基乙酰丙酸合成酶的突变体及其宿主细胞和应用。

背景技术

5-氨基乙酰丙酸(5-minolevulinic acid，ALA)是生物体合成血红素、叶绿素、VB12等四吡咯化合物的前体，广泛存在于动物、植物和微生物中。ALA在医药、农业、饲料和保健食品等领域应用广泛，是极具开发价值的高附加值生物基化学品。目前ALA主要通过化学合成法生产，原料成本和污染物排放量高，导致其生产成本高昂，限制了其在农业、饲料等领域的规模化应用。近年来，通过微生物发酵生产ALA已经得到了产业化应用。ALA的生物合成途径主要有两条，一条是在ALA合成酶的作用下以琥珀酰CoA和甘氨酸为前体合成ALA，称为C4途径，另一条是以谷氨酰tRNA为前体通过两步反应合成ALA，称为C5途径。由于只涉及一步酶促催化反应，目前C4途径被广泛用于ALA高产工程菌株的构建。

ALA合成酶是C4途径合成ALA以及四吡咯化合物的关键酶和限速酶，其酶学性质的好坏直接影响ALA合成的效率。近年来，包括放射形土壤杆菌(Agrobacteriumradiobacter，CN1322132C)、嗜酸柏拉红菌(Rhodoblastus acidophilus，CN1974758B)、类球红细菌(Rhodobacter sphaeroides，CN103146694B)、沼泽红假单胞菌(Rhodopseudomonas palustris，CN103981203B)等大量不同来源的ALA合成酶被克隆鉴定并用于ALA高产菌株的构建。然而，上述ALA合成酶均为不同生物体内天然存在的酶源，本身酶学性质存在热稳定性差(Meng et al.Biotechnology Letters,2015,37(11):2247-2253)和受终产物血红素反馈抑制(Zhang et al.Biotechnology Letters,2013,35(5):763-768)等问题，限制了其在工业微生物领域中的应用。嗜热菌来源的ALA合成酶虽然具有较高的热稳定性，但是其比活力或底物亲和力则大幅低于上述常用的ALA合成酶，(Meng etal.Biotechnology Letters,2015,37(11):2247-2253)难以在工程菌中应用。

近年来，随着酶工程和蛋白质工程技术的快速发展，通过理性设计提高酶的催化活性等性质已被广泛应用。但是目前关于在ALA合成酶的理性设计和改造方面的研究并不多，仅有的报道主要涉及真核生物来源的ALA合成酶，Turbeville等将两个小鼠来源的ALA合成酶融合表达后可提高其催化效率(Turbeville et al.Archives of Biochemistry&Biophysics,2011,511(1):107-117)，Lendrihas等通过构建小鼠红细胞中ALA合成酶II的突变体库，筛选得到了酶活提高的ALA合成酶突变体(Lendrihas et al.Journal ofBiological Chemistry,2010,285(18):13704)。上述研究虽然获得了酶活提高的ALA合成酶，但并未研究突变酶的热稳定性和抗血红素反馈抑制能力，且没有用于ALA的生物合成。

此外，作为ALA合成过程中的关键酶，ALA合成酶活性、热稳定性和解除血红素反馈抑制等性质的提高可以加快工程菌ALA合成的催化效率，减少自身蛋白合成和降解过程中能量的损耗，进而提升工程菌的稳定性和生产性能，降低ALA生产成本，对促进ALA在农牧等领域的应用有重要的价值。

因此，本领域急需开发活性高、热稳定性好且解除血红素反馈抑制的ALA合成酶，实现ALA的低成本生物法生产。

发明内容

本发明的目的在于提供一种各性能得到全面提升的ALA合成酶，以及利用得到的ALA合成酶进行ALA生产的方法。

在第一方面，本发明提供一种ALA合成酶，

(a)所述ALA合成酶的氨基酸序列在对应于SEQ ID NO:1所示氨基酸序列的第40位的氨基酸残基为非精氨酸，和/或第365位的氨基酸残基为非精氨酸；

或

(b)所述ALA合成酶的氨基酸序列在对应于SEQ ID NO:1所示氨基酸序列的第40位的氨基酸残基为非精氨酸，并且第75位氨基酸残基为非半胱氨酸；

或

(c)所述ALA合成酶的氨基酸序列在对应于SEQ ID NO:1所示氨基酸序列的第365位的氨基酸残基为非精氨酸，并且第29位的氨基酸残基为非组氨酸或第44位为非丙氨酸或第75位为非半胱氨酸。

在优选的实施方式中，所述ALA合成酶的氨基酸序列与SEQ ID NO:1所示氨基酸序列具有90％以上，优选95％以上，更优选96％、97％、98％、99％的同源性。

在优选的实施方式中，所述ALA合成酶：

a.具有如SEQ ID NO:1所示氨基酸序列，且第40位的氨基酸残基为非精氨酸，和/或第365位的氨基酸残基为非精氨酸；

b.具有a)所限定的序列经过一个或几个氨基酸残基，优选1-20个、更优选1-15个、更优选1-10个、更优选1-3个、最优选1个氨基酸残基的取代、缺失或添加而形成的序列，且基本具有a)所限定的ALA合成酶功能的由a)衍生的ALA合成酶；或

c.具有a)所限定的序列，经过在a)所限定的序列的任一端的一个或几个氨基酸残基，优选1-20个、更优选1-15个、更优选1-10个、更优选1-3个、最优选1个氨基酸残基的缺失或添加，优选添加而形成的序列，且基本具有a)所限定的ALA合成酶功能的由a)衍生的ALA合成酶。

在优选的实施方式中，所述ALA合成酶：

a.在对应于SEQ ID NO:1所示的氨基酸序列，第40位的氨基酸残基选自以下氨基酸的一种：Gly、Pro、Ala，优选Gly；和/或

在第365位的氨基酸残基选自以下氨基酸的一种：Lys、Arg、Gln、Asn；优选Lys；

b.在对应于SEQ ID NO:1所示的氨基酸序列，第40位的氨基酸残基选自以下氨基酸的一种：Gly、Pro、Ala，优选Gly；和

在第75位的氨基酸残基选自以下氨基酸的一种：Ala、Val、Leu、Ile；优选Ala；

c.在对应于SEQ ID NO:1所示的氨基酸序列，第365位的氨基酸残基选自以下氨基酸的一种：Lys、Arg、Gln、Asn；优选Lys；和

在第29位的氨基酸残基选自以下氨基酸的一种：Arg、Lys、Gln、Asn；优选Arg；

d.在对应于SEQ ID NO:1所示的氨基酸序列，第365位的氨基酸残基选自以下氨基酸的一种：Lys、Arg、Gln、Asn；优选Lys；和

在第44位的氨基酸残基选自以下氨基酸的一种：Pro、Ala；优选Pro；

e.在对应于SEQ ID NO:1所示的氨基酸序列，第365位的氨基酸残基选自以下氨基酸的一种：Lys、Arg、Gln、Asn；优选Lys；和

在第75位的氨基酸残基选自以下氨基酸的一种：Ala、Val、Leu、Ile；优选Ala。

在优选的实施方式中，所述ALA合成酶：

a.具有SEQ ID NO:1所示的氨基酸序列，并且

在第40位的氨基酸残基选自以下氨基酸的一种：Gly、Pro、Ala，优选Gly；和/或

b.具有SEQ ID NO:1所示的氨基酸序列，并且

在第40位的氨基酸残基选自以下氨基酸的一种：Gly、Pro、Ala，优选Gly；和

c.具有SEQ ID NO:1所示的氨基酸序列，并且

在第365位的氨基酸残基选自以下氨基酸的一种：Lys、Arg、Gln、Asn；优选Lys；和

d.具有SEQ ID NO:1所示的氨基酸序列，并且

e.具有SEQ ID NO:1所示的氨基酸序列，并且

或

f.包含a-e中任一项所限定的序列经过一个或几个氨基酸残基，优选1-20个、更优选1-15个、更优选1-10个、更优选1-3个、最优选1个氨基酸残基的取代、缺失或添加而形成的序列，且基本具有a-e中任一项所限定的ALA合成酶功能的由a-e衍生的ALA酶；

或

g.具有a-e中任一项所限定的序列，经过在a-e中任一项所限定的序列的任一端的一个或几个氨基酸残基，优选1-20个、更优选1-15个、更优选1-10个、更优选1-3个、最优选1个氨基酸残基的缺失或添加，优选添加而形成的序列，且基本具有a-e中任一项所限定的ALA合成酶功能的由a-e中任一项衍生的ALA酶。

在优选的实施方式中，所述ALA合成酶的氨基酸序列如SEQ ID NO:1所示，并且

a.在第40位的氨基酸残基为Gly；和/或

在第365位的氨基酸残基为Lys；

或

b.在第40位的氨基酸残基为Gly；和

在第75位的氨基酸残基为Ala；

c.在第365位的氨基酸残基为Lys；和

在第29位的氨基酸残基为Arg；

d.在第365位的氨基酸残基为优选Lys；和

在第44位的氨基酸残基为Pro；

e.在第365位的氨基酸残基为Lys；和

在第75位的氨基酸残基为Ala。

在优选的实施方式中，所述ALA合成酶耐受血红素的反馈抑制能力增强。

在第二方面，本发明提供第一方面所述的ALA合成酶的编码核酸序列。

在第三方面，本发明提供包含第一方面所述的ALA合成酶编码核酸序列的表达载体。

在第四方面，本发明提供一种宿主细胞，所述宿主细胞含有第一方面所述的ALA合成酶。

在优选的实施方式中，所述宿主细胞包含第三方面所述的表达载体或在其基因组中整合有第二方面所述的编码核酸序列。

在进一步的优选实施方式中，所述宿主细胞是大肠杆菌(Escherichia coli)、谷氨酸棒杆菌(Corynebacterium glutamicum)、球形红细菌(Rhodobacter sphaeroides)、沼泽红假单胞菌(Rhodopseudomonas palustris)；更优选大肠杆菌或谷氨酸棒状杆菌。

在第五方面，本发明提供第一方面所述的ALA合成酶、或第二方面所述的编码核酸序列、或第三方面所述的表达载体、或第四方面所述的宿主细胞在生产ALA中的应用。

在第六方面，本发明提供一种制备ALA的方法，所述方法包括以下步骤：

a.培养第四方面所述的宿主细胞，使之产生ALA；和

b.任选从培养液中分离步骤a产生的ALA。

在第七方面，本发明提供一种制备ALA的方法，所述方法包括以下步骤：

a.利用第一方面所述的ALA合成酶，催化合成ALA，例如从琥珀酰CoA和甘氨酸合成ALA；和

b.任选从以上反应体系中分离ALA。

在第八方面，本发明提供第一方面所述的ALA合成酶的制备方法，所述方法包括以下步骤：

a.得到第一方面所述的ALA合成酶的编码序列；

b.将a得到的编码序列直接转染合适的宿主细胞或经载体引入合适的宿主细胞；

c.培养b得到的宿主细胞；

d.从步骤c得到的培养体系中分离所述宿主细胞产生的ALA合成酶。

在优选的实施方式中，所述对应于SEQ ID NO:1所示氨基酸序列的第40位的氨基酸残基选自以下氨基酸的一种：Gly、Pro、Ala，优选Gly；和/或第365位的氨基酸残基选自以下氨基酸的一种：Lys、Arg、Gln、Asn；优选Lys；

在优选的实施方式中，所述对应于SEQ ID NO:1所示氨基酸序列的第40位的氨基酸残基选自以下氨基酸的一种：Gly、Pro、Ala，优选Gly；并且第75位的氨基酸残基选自以下氨基酸的一种：Ala、Val、Leu、Ile；优选Ala；

在优选的实施方式中，所述对应于SEQ ID NO:1所示氨基酸序列的第365位的氨基酸残基选自以下氨基酸的一种：Lys、Arg、Gln、Asn；优选Lys；并且

第29位的氨基酸残基选自以下氨基酸的一种：Arg、Lys、Gln、Asn；优选Arg；或

第44位的氨基酸残基选自以下氨基酸的一种：Pro、Ala；优选Pro；或

第75位的氨基酸残基选自以下氨基酸的一种：Ala、Val、Leu、Ile；优选Ala。

在优选的实施方式中，所述方法还包括测定得到的ALA合成酶的活性以及解除血红素反馈抑制的能力。

在第九方面，本发明提供改造ALA合成酶以便提高其活性的方法，所述方法包括以下步骤：

a.将待改造的ALA合成酶的氨基酸序列与SEQ ID NO:1所示氨基酸序列作比对；和

b.改造所述待改造ALA合成酶的编码序列，使得编码的氨基酸序列中对应于SEQID NO:1所示氨基酸序列的第40位的氨基酸残基为非精氨酸，和/或第365位的氨基酸残基为非精氨酸；

或

对应于SEQ ID NO:1所示氨基酸序列的第40位的氨基酸残基为非精氨酸，并且第75位氨基酸残基为非半胱氨酸；

或

对应于SEQ ID NO:1所示氨基酸序列的第365位的氨基酸残基为非精氨酸，并且第29位的氨基酸残基为非组氨酸或第44位为非丙氨酸或第75位为非半胱氨酸；

c.将b得到的编码序列直接转染合适的宿主细胞或经载体引入合适的宿主细胞；

d.培养c得到的宿主细胞；和

e.从步骤d得到的培养体系中分离所述宿主细胞产生的ALA合成酶。

在优选的实施方式中，所述对应于SEQ ID NO:1所示氨基酸序列的第40位的氨基酸残基选自以下氨基酸的一种：Gly、Pro、Ala，优选Gly；和/或

第365位的氨基酸残基选自以下氨基酸的一种：Lys、Arg、Gln、Asn；优选Lys；

第75位的氨基酸残基选自以下氨基酸的一种：Ala、Val、Leu、Ile；优选Ala；

第29位的氨基酸残基选自以下氨基酸的一种：Arg、Lys、Gln、Asn；优选Arg；

第44位的氨基酸残基选自以下氨基酸的一种：Pro、Ala；优选Pro。

在优选的实施方式中，经改造的ALA合成酶不仅活性得到提高，其在胞内进行ALA生产得到的ALA产量也明显提高。

应理解，在本发明范围内中，本发明的上述各技术特征和在下文(如实施例)中具体描述的各技术特征之间都可以互相组合，从而构成新的或优选的技术方案。限于篇幅，在此不再一一累述。

具体实施方式

发明人经过广泛而深入的研究，出乎意料地发现对SEQ ID NO:1所示氨基酸序列的第40位、第365位、第75位、第29位或第44位的氨基酸残基进行突变，获得的ALA合成酶不仅提高了酶活性，对血红素反馈抑制的耐受性也得到提高，从而整体提升了所述ALA合成酶在生产ALA中的应用价值。在此基础上完成了本发明。

本发明的ALA合成酶

本文所用的术语“本发明的ALA合成酶”和“本发明的多肽”可互换使用，并具有本领域普通技术人员通常理解的含义。本发明的ALA合成酶具有催化从琥珀酰CoA和甘氨酸合成ALA合成的活性。

本发明的ALA合成酶是通过对SEQ ID NO:1所示氨基酸序列进行突变得到，得到的突变体不仅具备优异的活性，还能显著解除血红素的反馈抑制。本发明的ALA合成酶可以来源于各物种，包括但不限于放射形土壤杆菌(Agrobacterium radiobacter)、嗜酸柏拉红菌(Rhodoblastus acidophilus)、类球红细菌(Rhodobacter sphaeroides)、沼泽红假单胞菌(Rhodopseudomonas palustris)；优选沼泽红假单胞菌。

具体地说，本发明的ALA合成酶的氨基酸序列在对应于SEQ ID NO:1所示氨基酸序列的第40位的氨基酸残基为非精氨酸，和/或第365位的氨基酸残基为非精氨酸；或者，在对应于SEQ ID NO:1所示氨基酸序列的第40位的氨基酸残基为非精氨酸，并且第75位氨基酸残基为非半胱氨酸；或者在对应于SEQ ID NO:1所示氨基酸序列的第365位的氨基酸残基为非精氨酸，并且第29位的氨基酸残基为非组氨酸或第44位为非丙氨酸或第75位为非半胱氨酸。

本领域技术人员知晓，为提升活性而对野生型多肽进行突变，找到能实现所需目的的位点更为重要。因此，基于本发明的教导，本领域技术人员会对SEQ ID NO:1所示氨基酸序列的第40位、第365位、第75位、第29位或第44位的氨基酸残基或某氨基酸序列中对应于SEQ ID NO:1所示氨基酸序列的第40位、第365位、第75位、第29位或第44位的氨基酸残基进行突变，并检测突变体的相关活性。在具体的实施方式中，本发明的ALA合成酶在对应于SEQ ID NO:1所示氨基酸序列的第40位的氨基酸残基可以突变为(但不限于)：Gly、Pro或Ala，优选Gly；第365位的氨基酸残基可以突变为(但不限于)：Lys、Arg、Gln或Asn；优选Lys；第75位的氨基酸残基可以突变为(但不限于)：Ala、Val、Leu或Ile；优选Ala；第29位的氨基酸残基可以突变为(但不限于)：Arg、Lys、Gln、Asn；优选Arg；第44位的氨基酸残基可以突变为(但不限于)：Pro或Ala；优选Pro。

此外，本领域普通技术人员也不难知晓，在多肽的某些区域，例如非重要区域改变少数氨基酸残基基本上不会改变生物活性，例如，适当替换某些氨基酸得到的序列并不会影响其活性(可参见Watson等，Molecular Biology of The Gene，第四版，1987，TheBenjamin/Cummings Pub.Co.P224)。因此，本领域普通技术人员能够实施这种替换并且确保所得分子仍具有所需生物活性。

因此，对本发明的ALA合成酶作进一步突变而得到仍具备ALA合成酶的功能和活性的进一步突变体是显而易见的。例如，本领域技术人员公知在多肽的任一端增加或减少数个氨基酸残基，例如优选1-20个、更优选1-15个、更优选1-10个、更优选1-3个、最优选1个氨基酸残基不会影响得到的突变体的功能。例如，为便于纯化，技术人员往往在得到的蛋白的任一端带上6×His标签，而这种蛋白与不具备6×His标签的蛋白具有相同的功能。

因此，本发明应包括本发明的ALA合成酶的保守性突变体。这些保守性突变体可以根据，例如下表所示进行氨基酸替换而产生。

初始残基	代表性的取代残基	优选的取代残基
			Ala(A)	Val；Leu；Ile	Val
Arg(R)	Lys；Gln；Asn	Lys
			Asn(N)	Gln；His；Lys；Arg	Gln
Asp(D)	Glu	Glu
			Cys(C)	Ser	Ser
Gln(Q)	Asn	Asn
			Glu(E)	Asp	Asp
Gly(G)	Pro；Ala	Ala
			His(H)	Asn；Gln；Lys；Arg	Arg
Ile(I)	Leu；Val；Met；Ala；Phe	Leu
			Leu(L)	Ile；Val；Met；Ala；Phe	Ile
Lys(K)	Arg；Gln；Asn	Arg
			Met(M)	Leu；Phe；Ile	Leu
Phe(F)	Leu；Val；Ile；Ala；Tyr	Leu
			Pro(P)	Ala	Ala
Ser(S)	Thr	Thr
			Thr(T)	Ser	Ser
Trp(W)	Tyr；Phe	Tyr
			Tyr(Y)	Trp；Phe；Thr；Ser	Phe
Val(V)	Ile；Leu；Met；Phe；Ala	Leu

本发明还提供了编码本发明多肽的多核苷酸。术语“编码多肽的多核苷酸”可以是包括编码此多肽的多核苷酸，也可以是还包括附加编码和/或非编码序列的多核苷酸。

因此，本文所用的“含有”，“具有”或“包括”包括了“包含”、“主要由……构成”、“基本上由……构成”、和“由……构成”；“主要由……构成”、“基本上由……构成”和“由……构成”属于“含有”、“具有”或“包括”的下位概念。

“对应于”

本文所用的术语“对应于”具有本领域普通技术人员通常理解的意义。具体地说，“对应于”表示两条序列经同源性或序列相同性比对后，一条序列与另一条序列中的指定位置相对应的位置。因此，例如，就“对应于SEQ ID NO:1所示氨基酸序列的第40位的氨基酸残基”而言，如果在SEQ ID NO:1所示氨基酸序列的一端加上6×His标签，那么所得突变体中对应于SEQ ID NO:1所示氨基酸序列的第40位就可能是第46位。

在具体的实施方式中，所述同源性或序列相同性可以是90％以上，优选95％以上，更优选96％、97％、98％、99％的同源性。

本领域普通技术人员公知的测定序列同源性或相同性的方法包括但不限于：计算机分子生物学(Computational Molecular Biology)，Lesk，A.M.编，牛津大学出版社，纽约，1988；生物计算：信息学和基因组项目(Biocomputing:Informatics and GenomeProjects)，Smith，D.W.编，学术出版社，纽约，1993；序列数据的计算机分析(ComputerAnalysis of Sequence Data)，第一部分，Griffin，A.M.和Griffin，H.G.编，HumanaPress，新泽西，1994；分子生物学中的序列分析(Sequence Analysis in MolecularBiology)，von Heinje，G.，学术出版社，1987和序列分析引物(Sequence AnalysisPrimer)，Gribskov，M.与Devereux，J.编M Stockton Press，纽约，1991和Carillo，H.与Lipman，D.，SIAM J.Applied Math.，48:1073(1988)。测定相同性的优选方法要在测试的序列之间得到最大的匹配。测定相同性的方法编译在公众可获得的计算机程序中。优选的测定两条序列之间相同性的计算机程序方法包括但不限于：GCG程序包(Devereux，J.等，1984)、BLASTP、BLASTN和FASTA(Altschul，S，F.等，1990)。公众可从NCBI和其它来源得到BLASTX程序(BLAST手册，Altschul，S.等，NCBI NLM NIH Bethesda，Md.20894；Altschul，S.等，1990)。熟知的Smith Waterman算法也可用于测定相同性。

宿主细胞

本文所用的术语“宿主细胞”是具有本领域普通技术人员通常理解的含义，即，能够产生本发明ALA合成酶的宿主细胞。换言之，本发明可以利用任何宿主细胞，只要本发明的ALA合成酶能在该宿主细胞中表达。

例如，适用于本发明的宿主细胞来自(但不限于)大肠杆菌(Escherichia coli)、谷氨酸棒杆菌(Corynebacterium glutamicum)、球形红细菌(Rhodobacter sphaeroides)、沼泽红假单胞菌(Rhodopseudomonas palustris)；更优选大肠杆菌或谷氨酸棒状杆菌。

解除血红素反馈抑制

本领域技术人员应理解，本文所用的术语“解除血红素反馈抑制”是指一种原本受到血红素反馈抑制的酶，在经过改造后令其受血红素抑制程度降低。这种降低是通过两种酶在相同血红素浓度下的抑制程度比较获得的。“解除血红素反馈抑制”包含了反馈抑制的部分解除到全部解除。而抑制程度是指在一定浓度的血红素存在下，与不存在血红素时相比，ALA合成酶活性损失(即受到抑制)的比例。

在具体的实施方式中，在2.5μM的血红素存在下，所述的ALA合成酶至少保留80％以上的相对酶活。

固定化酶

本文所用的术语“固定化酶”具有本领域普通技术人员常规理解的含义。具体地说，该术语表示水溶性酶经物理或化学方法处理后，使酶与水不溶性大分子载体结合或把酶包埋在其中，使得酶在水中形成溶性凝胶或半透膜的微囊体从而导致流动性降低。

固定化的酶仍具有酶活性，在催化反应中以固相状态作用于底物。酶经固定化后一般稳定性增加，易从反应系统中分离，且易于控制，能反复多次使用。便于运输和贮存，有利于自动化生产。固定化酶是近十余年发展起来的酶应用技术，在工业生产、化学分析和医药等方面有诱人的应用前景。

本领域普通技术人员鉴于本文的教导，不难将本发明的ALA合成酶处理成固定化酶或以全细胞催化的形式，用于催化从甘氨酸和琥珀酰CoA产生ALA。

本发明的应用与优点

1.本发明的ALA合成酶可以在工业上应用以实现低成本产生ALA；

2.本发明的ALA合成酶不仅具备高活性，更能有效解除血红素的反馈抑制，在工业上的应用前景广阔；

3.本发明提供了改造ALA合成酶的点突变位点，这些位点的突变不仅可以有效提高待改造的ALA合成酶的酶活，还能解除血红素的反馈抑制。

下面结合具体实施例，进一步阐述本发明。应理解，这些实施例仅用于说明本发明而不用于限制本发明的范围。下列实施例中未注明具体条件的实验方法，通常按照常规条件如Sambrook等人，分子克隆：实验室手册(New York:Cold Spring Harbor LaboratoryPress,1989)中所述的条件，或按照制造厂商所建议的条件。

材料与方法

本发明实施例所用的DNA聚合酶购自大连宝生物公司的Pyrobest；限制性内切酶及DNA连接酶等均购自Fermentas公司；

酵母粉和蛋白胨购自英国Oxoid公司产品；甘氨酸和IPTG购自Promega公司；ALA和对二甲氨基苯甲醛等购自Sigma公司；高氯血红素、琼脂粉和抗生素购自北京索来宝；葡萄糖、冰醋酸、高氯酸、三氯乙酸、乙酰丙酮氯仿以及其他常用化学试剂均购自国药。

质粒提取试剂盒和琼脂糖凝胶电泳回收试剂盒均购自上海生工，相关操作均严格按照说明书执行；

质粒构建测序验证由金唯智完成；

E.coil DH5α感受态细胞、E.coil BL21(DE3)感受态细胞购自北京全式金公司。

LB培养基成分：酵母粉5g/L，蛋白胨10g/L，NaCl 10g/L，固体培养基中添加2％的琼脂粉。

抗生素浓度为：氨苄青霉素100μg/mL、卡那霉素50μg/mL。

ALA的检测方法：200μL稀释的发酵液或酶活力测定反应终止后样品加入100μL pH4.6乙酸钠缓冲液，然后加入5μL乙酰丙酮，100℃水浴温育15min，冷却至室温后加入等体积的Ehrlish’s试剂(42mL冰醋酸，8mL 70％高氯酸，1g二甲氨基苯甲醛)混匀，显色10min后测553nm波长下的吸光度。

实施例1.ALA合成酶突变载体的构建

利用Stratagene系列

定点突变试剂盒，设计2对引物(见表1)，以pET21a-hemA(构建过程参考Zhang et al.Biotechnology Letters,2013,35(5):763-768)野生型质粒为模板，利用上述引物进行PCR扩增，分别将HemA第40位和第365位的精氨酸(R)突变为甘氨酸(G)和赖氨酸(K)，PCR反应条件为：95℃5min，10个循环(95℃30s,74℃-65℃30s,68℃7min)，13个循环(95℃30s,65℃30s,68℃7min)，68℃10min。PCR扩增体系(50μL)：模板1μL，上下游引物各2μL，dNTP mix 1μL，10×Pyrobest Buffer 5μL，灭菌的双蒸水38.5μL，Pyrobest DNA聚合酶0.5μL。采用胶回收试剂盒对PCR产物进行纯化和回收。转化子由金唯智公司进行测序，测序正确的表达载体分别命名为pET21a-R40G和pET21a-R365K。

表1.引物序列

引物名称	序列编号	引物序列(5’-3’)
			R40G-F	SEQ ID NO:2	CACCACGGTCCTGAGGGCGCCGGCGATGTGAC
R40G-R	SEQ ID NO:3	CTCAGGACCGTGGTGCGTGGCGC
			R365K-F	SEQ ID NO:4	GTGCCGAAAGGCACCGAGCGCCTTCGGATCAC
R365K-R	SEQ ID NO:5	CGGTGCCTTTCGGCACGGTCGGATAGTTGATC

实施例2.ALA合成酶突变酶酶学性质的检测

分别将pET21a-hemA、pET21a-R40G和pET21a-R365K突变体质粒转化至E.coliBL21(DE3)，获得重组菌株BL21(DE3)/pET21a-hemA、BL21(DE3)/pET21a-R40G、BL21(DE3)/pET21a-R365K，用于不同酶的表达和酶学性质检测。

将上述重组菌单菌落分别接种5mL含有100μg/mL氨苄青霉素的LB液体培养基，37℃，220rpm培养12h。转接装有100mL含有100μg/mL氨苄青霉素的LB液体培养基的500mL三角瓶，37℃，220rpm培养OD₆₀₀至0.6-0.8后加入终浓度为0.1mM的IPTG，20℃诱导培养22h后收集细胞并保存与-80℃。具体纯化步骤如下所述：

(1)将已经离心收集，-80℃保存菌体用10mL Tris-HCl buffer(含0.1mM PLP)重悬；

(2)超声破碎细胞：超声破壁条件：30％功率，共破壁时间30min，工作2s停6s；

(3)目的蛋白的纯化：将细胞裂解液在4℃，12000rpm离心20min，上清液转移至预冷的15mL离心管中。取600μL上清液分次加入GE公司的His SpinTrap columns使目标蛋白与层析介质结合，用含50mM，70mM咪唑的缓冲液(20mM磷酸钠，0.5M氯化钠，50/70mM咪唑，pH7.4)依次清洗3次，2次，最后用200μL 500mM咪唑缓冲液(20mM磷酸钠，0.5M氯化钠，500mM咪唑，pH 7.4)洗脱蛋白两次，收集洗脱液，并重复一次；

(4)目的蛋白除盐及浓缩：将含有目标蛋白的洗脱液，全部置于Millipore公司的10kDa超滤管中，加入缓冲液(50mM Tris-HCl，100mM NaCl，pH7.5)至4mL刻度处，4℃，7,500g离心20min；弃废液，再次加入缓冲液至4mL刻度处，重复至稀释倍数大于1000(3次)。蛋白溶液转移至预冷的1.5mL离心管中；

(5)蛋白浓度测定参照说明书使用Thermo Scientific公司的BCA蛋白定量试剂盒完成。

酶活力测定：测定反应在总体积为200μL的50mM Tris-HCl缓冲液(pH 7.5，含100mM NaCl)体系中进行，酶反应体系中反应液各组分浓度如表2所示。酶反应体系中加入20uL浓度为20μg/mL的酶，金属浴中37℃震荡反应6min后向体系中加入100μL的10％三氯乙酸溶液终止反应。之后检测酶反应体系中ALA的生成量。ALA的检测方法如“材料与方法”部分所述。酶活力单位U定义为：37℃时，每分钟内产生1μmol ALA所需的酶量。

表2.ALA合成酶活性测定反应体系中各组分浓度

组分	加入体积
		甘氨酸(1M)	40μL
琥珀酰辅酶A(10mM)	4μL
		磷酸吡哆醛(10mM)	2μL
ALA合成酶(20μg/mL)	20μL
		Tris-HCl(50mM,pH 7.5，含100mM NaCl)	134μL

稳定性测定(稳定性使用37℃一小时剩余酶活力进行表征)：用50mM Tris-HCl缓冲液(pH 7.5，含100mM NaCl，0.1mM PLP)将ALA合成酶稀释至20μg/mL后，37℃水浴孵育一小时，按照上述方法测定剩余的酶活力。

解除血红素反馈抑制能力测定：在反应体系中加入终浓度2.5μM血红素，并按照上述方法测定此时剩余的酶活力，与没有血红素添加时的酶活力对比，用以表征ALA合成酶突变酶解除血红素反馈抑制的能力。

表3.ALA合成酶突变体纯酶酶活力、稳定性和解除血红素反馈抑制能力

实施例3.ALA合成酶突变酶在ALA合成中的应用

将上述重组菌单菌落分别接种5mL含有100μg/mL氨苄青霉素的LB液体培养基，37℃，220rpm培养12h。按照初始OD为0.05转接装有50mL发酵培养基的250mL三角瓶，37℃，220rpm培养3h后加入终浓度为0.05mM的IPTG，诱导培养24h后收集发酵液，检测ALA的浓度。其中摇瓶发酵培养基配方为：葡萄糖15g/L，酵母粉2.0g/L，Na₂HPO₄·12H₂O 17.1g/L，KH₂PO₄3.0g/L，NaCl 0.5g/L，NH₄Cl 1.0g/L，MgSO₄ 2.0mM，CaCl₂ 0.1mM，甘氨酸4g/L，调pH至7.0。氨苄青霉素终浓度为100μg/mL。ALA的检测和葡萄糖分析方法如“材料与方法”部分所述。重组菌发酵结果见表4，2个突变体对应产量均笔对照菌株提高10％。

表4.ALA合成酶突变酶对ALA合成的影响

不同菌株	ALA相对产量
		HemA	1.0
R40G	1.1
		R365K	1.1

实施例4.组合突变酶载体的构建

采用实施例1相同的方法，引物为表5所述，在单突变体基础上逐一构建双突变。在R40G突变体基础上构建R40G/C75A双突变表达质粒，命名为pET21a-R40G/C75A。在R365K突变体基础上构建R365K/C75A双突变表达质粒，命名为pET21a-R365K/C75A。同时，利用Stratagene系列

定点突变试剂盒，以已构建的pZWA1(构建过程参考饶德明等.生物技术通报,2017,33(1):148-156)质粒为模板，采用表5中引物进行PCR扩增，将HemA第365位的精氨酸(R)突变为赖氨酸(K)，所得表达突变体的质粒命名为pEC-XK99E-R365K。在R365K突变体基础上采用表1与表5中的引物进行PCR扩增，分别构建H29R/R365K、R40G/R365K和A44P/R365K双突变表达质粒，命名为pEC-XK99E-H29R/R365K、pEC-XK99E-R40G/R365K和pEC-XK99E-A44P/R365K。以上质粒由金唯智公司进行测序验证。

表5.引物序列

引物名称	序列编号	引物序列(5’-3’)
			C75A-F	SEQ ID NO:6	GACAGCGCCGGCGCCGGCGCCGGCGGCAC
C75A-R	SEQ ID NO:7	GCCGGCGCCGGCGCTGTCCAGCGCCTCGTG
			H29R-F	SEQ ID NO:8	GCTGATCTGGAACGTCGTGCCGGCTCGTTCCCG
H29R-R	SEQ ID NO:9	CGGGAACGAGCCGGCACGACGTTCCAGATCAGC
			A44P-F	SEQ ID NO:10	CACCGGCCTGAGGGCCCGGGCGATGTGACGGTG
A44P-R	SEQ ID NO:11	CACCGTCACATCGCCCGGGCCCTCAGGCCGGTG

实施例5.组合突变ALA合成酶的酶活性质研究及在ALA合成中的应用

为了验证过表达组合突变ALA合成酶的性能及其对ALA合成的影响，分别将上述载体中的pET21a-R40G/C75A和pET21a-R365K/C75A转入E.coli BL21(DE3)菌株中。转化产物涂布氨苄青霉素抗性的平板，过夜培养后挑取阳性克隆提取质粒验证，分别获得重组菌BL21(DE3)/pET21a-R40G/C75A和BL21(DE3)/pET21a-R365K/C75A。工程菌株解除血红素反馈抑制的验证参照实施例2的方法进行，最终的检测数据如表6所示。同时，所有工程菌及对照采用实施例3相同的摇瓶发酵体系评价工程菌的性能，最终溶液中ALA产量见表7所示。与表达野生型HemA的菌株相比相比，R40G/C75A突变体的产量是野生型的1.3倍，R365K/C75A突变体的产量是野生型的1.4倍。

表6组合突变ALA合成酶解除血红色反馈抑制的能力

表7.组合突变ALA合成酶对ALA合成的影响

不同菌株	相对产量
		HemA	1.0
R40G	1.1
		R365K	1.1
C75A/R40G	1.3
		C75A/R365K	1.4

谷氨酸棒杆菌中验证组合突变ALA合成酶对ALA合成的影响，分别将上述载体中的pEC-XK99E-H29R/R365K、pEC-XK99E-R40G/R365K和pEC-XK99E-A44P/R365K转入C.glutamicum ATCC 13032菌株。转化产物涂布卡那霉素抗性的平板，过夜培养后挑取阳性克隆提取质粒验证，分别获得重组菌13032/pEC-XK99E-H29R/R365K、13032/pEC-XK99E-R40G/R365K和13032/pEC-XK99E-A44P/R365K。

将上述重组菌单菌落分别接种5mL含有50μg/mL卡那霉素的液体培养基(葡萄糖20g/L、NaCl 10g/L、蛋白胨10g/L、酵母粉5g/L)，30℃，200rpm培养12h。按照初始OD为0.5转接装有50mL发酵培养基(Na₂HPO₄·12H₂O 17.1g/L、KH₂PO₄ 3.0g/L、NH₄Cl 1.0g/L、NaCl0.5g/L、酵母粉2g/L、MgSO₄ 2mM、CaCl₂ 0.1mM、葡萄糖50g/L、甘氨酸4g/L、根据需要添加卡那霉素50μg/mL)的500mL三角瓶，30℃，220rpm培养3h后加入终浓度为0.05mM的IPTG，诱导培养24h后收集发酵液，检测ALA的浓度。ALA的检测和葡萄糖分析方法如“材料与方法”部分所述。

摇瓶发酵结果见表8，与表达野生型RP-HemA相比，H29R/R365K突变体的产量是野生型的1.17倍，R40G/R365K突变体的产量是野生型的1.13倍，A44P/R365K突变体的产量是野生型的1.13倍。

表8.组合突变ALA合成酶对ALA合成的影响

ALA合成酶	相对产量
		HemA	1.00
H29R/R365K	1.17
		R40G/R365K	1.13
A44P/R365K	1.13

在本发明提及的所有文献都在本申请中引用作为参考，就如同每一篇文献被单独引用作为参考那样。此外应理解，在阅读了本发明的上述讲授内容之后，本领域技术人员可以对本发明作各种改动或修改，这些等价形式同样落于本申请所附权利要求书所限定的范围。

序列表

<110> 中国科学院天津工业生物技术研究所

<120> 5-氨基乙酰丙酸合成酶突变体及其宿主细胞和应用

<130> P2018-0376

<160> 11

<170> PatentIn version 3.5

<210> 1

<211> 403

<212> PRT

<213> 沼泽红假单胞菌(Rhodopseudomonas palustris)

<400> 1

Met Asn Tyr Glu Ala Tyr Phe Arg Arg Gln Leu Asp Gly Leu His Arg

1 5 10 15

Glu Gly Arg Tyr Arg Val Phe Ala Asp Leu Glu Arg His Ala Gly Ser

20 25 30

Phe Pro Arg Ala Thr His His Arg Pro Glu Gly Ala Gly Asp Val Thr

35 40 45

Val Trp Cys Ser Asn Asp Tyr Leu Gly Met Gly Gln His Pro Ala Val

50 55 60

Leu Thr Ala Met His Glu Ala Leu Asp Ser Cys Gly Ala Gly Ala Gly

65 70 75 80

Gly Thr Arg Asn Ile Ala Gly Thr Asn His Tyr His Val Leu Leu Glu

85 90 95

Gln Glu Leu Ala Ala Leu His Gly Lys Glu Ser Ala Leu Leu Phe Thr

100 105 110

Ser Gly Tyr Val Ser Asn Trp Ala Ser Leu Ser Thr Leu Ala Ser Arg

115 120 125

Met Pro Gly Cys Val Ile Leu Ser Asp Glu Leu Asn His Ala Ser Met

130 135 140

Ile Glu Gly Ile Arg His Ser Arg Ser Glu Thr Arg Ile Phe Ala His

145 150 155 160

Asn Asp Pro Arg Asp Leu Glu Arg Lys Leu Ala Asp Leu Asp Pro His

165 170 175

Ala Pro Lys Leu Val Ala Phe Glu Ser Val Tyr Ser Met Asp Gly Asp

180 185 190

Ile Ala Pro Ile Ala Glu Ile Cys Asp Val Ala Asp Ala His Asn Ala

195 200 205

Met Thr Tyr Leu Asp Glu Val His Gly Val Gly Leu Tyr Gly Pro Asn

210 215 220

Gly Gly Gly Ile Ala Asp Arg Glu Gly Ile Ser His Arg Leu Thr Ile

225 230 235 240

Ile Glu Gly Thr Leu Ala Lys Ala Phe Gly Val Val Gly Gly Tyr Ile

245 250 255

Ala Gly Ser Ser Ala Val Cys Asp Phe Val Arg Ser Phe Ala Ser Gly

260 265 270

Phe Ile Phe Ser Thr Ser Pro Pro Pro Ala Val Ala Ala Gly Ala Leu

275 280 285

Ala Ser Ile Arg His Leu Arg Ala Ser Ser Ala Glu Arg Glu Arg His

290 295 300

Gln Asp Arg Val Ala Arg Leu Arg Ala Arg Leu Asp Gln Ala Gly Val

305 310 315 320

Ala His Met Pro Asn Pro Ser His Ile Val Pro Val Met Val Gly Asp

325 330 335

Ala Ala Leu Cys Lys Gln Ile Ser Asp Glu Leu Ile Ser Arg Tyr Gly

340 345 350

Ile Tyr Val Gln Pro Ile Asn Tyr Pro Thr Val Pro Arg Gly Thr Glu

355 360 365

Arg Leu Arg Ile Thr Pro Ser Pro Gln His Thr Asp Ala Asp Ile Glu

370 375 380

His Leu Val Gln Ala Leu Ser Glu Ile Trp Thr Arg Val Gly Leu Ala

385 390 395 400

Lys Ala Ala

<210> 2

<211> 32

<212> DNA

<213> 人工序列(Artificial sequence)

<400> 2

caccacggtc ctgagggcgc cggcgatgtg ac 32

<210> 3

<211> 23

<212> DNA

<213> 人工序列(Artificial sequence)

<400> 3

ctcaggaccg tggtgcgtgg cgc 23

<210> 4

<211> 32

<212> DNA

<213> 人工序列(Artificial sequence)

<400> 4

gtgccgaaag gcaccgagcg ccttcggatc ac 32

<210> 5

<211> 32

<212> DNA

<213> 人工序列(Artificial sequence)

<400> 5

cggtgccttt cggcacggtc ggatagttga tc 32

<210> 6

<211> 29

<212> DNA

<213> 人工序列(Artificial sequence)

<400> 6

gacagcgccg gcgccggcgc cggcggcac 29

<210> 7

<211> 30

<212> DNA

<213> 人工序列(Artificial sequence)

<400> 7

gccggcgccg gcgctgtcca gcgcctcgtg 30

<210> 8

<211> 33

<212> DNA

<213> 人工序列(Artificial sequence)

<400> 8

gctgatctgg aacgtcgtgc cggctcgttc ccg 33

<210> 9

<211> 33

<212> DNA

<213> 人工序列(Artificial sequence)

<400> 9

cgggaacgag ccggcacgac gttccagatc agc 33

<210> 10

<211> 33

<212> DNA

<213> 人工序列(Artificial sequence)

<400> 10

caccggcctg agggcccggg cgatgtgacg gtg 33

<210> 11

<211> 33

<212> DNA

<213> 人工序列(Artificial sequence)

<400> 11

caccgtcaca tcgcccgggc cctcaggccg gtg 33

Claims

1.一种ALA合成酶，其特征在于：

(a) 所述ALA合成酶的氨基酸序列如SEQ ID NO: 1所示，但第40位的氨基酸残基为甘氨酸；

或

(b) 所述ALA合成酶的氨基酸序列如SEQ ID NO: 1所示，但第40位的氨基酸残基为甘氨酸，并且第75位氨基酸残基为丙氨酸。

2.编码权利要求1所述的ALA合成酶的核苷酸序列。

3.包含编码权利要求1所述的ALA合成酶的核苷酸序列的表达载体。

4.一种宿主细胞，所述宿主细胞含有权利要求1所述的ALA合成酶。

5. 如权利要求4所述的宿主细胞，其特征在于，所述宿主细胞是大肠杆菌(Escherichia coli)、谷氨酸棒杆菌(Corynebacterium glutamicum)、球形红细菌(Rhodobacter sphaeroides)、沼泽红假单胞菌(Rhodopseudomonas palustris)。

6.如权利要求5所述的宿主细胞，其特征在于，所述宿主细胞是大肠杆菌或谷氨酸棒状杆菌。

7.权利要求1所述的ALA合成酶、或权利要求2所述的核苷酸序列、或权利要求3所述的表达载体、或权利要求4-5中任一项所述的宿主细胞在生产ALA中的应用。

8. 一种制备ALA的方法，所述方法包括以下步骤：

a. 培养权利要求4-6中任一项所述的宿主细胞，使之产生ALA；和

b. 任选从培养液中分离步骤a产生的ALA。

9. 一种制备ALA的方法，所述方法包括以下步骤：

a. 利用权利要求1所述的ALA合成酶，催化合成ALA；和

b. 任选从以上反应体系中分离ALA。

10.权利要求1所述的ALA合成酶的制备方法，所述方法包括以下步骤：

a. 得到编码权利要求1所述的ALA合成酶的核苷酸序列；

b. 将a得到的核苷酸序列直接转染合适的宿主细胞或经载体引入合适的宿主细胞；

c. 培养b得到的宿主细胞；

d. 从步骤c得到的培养体系中分离所述宿主细胞产生的ALA合成酶。

11. 如权利要求10所述的制备方法，其特征在于，所述ALA合成酶的氨基酸序列如SEQID NO: 1所示，但第40位的氨基酸残基为甘氨酸。

12. 如权利要求10所述的制备方法，其特征在于，所述ALA合成酶的氨基酸序列如SEQID NO: 1所示，但第40位的氨基酸残基为甘氨酸，并且第75位氨基酸残基为丙氨酸。

13.如权利要求10-12中任一项所述的制备方法，其特征在于，所述方法还包括测定得到的ALA合成酶的活性以及解除血红素反馈抑制的能力。

14.改造ALA合成酶以便提高其活性的方法，所述方法包括以下步骤：

a. 改造编码所述待改造ALA合成酶的核苷酸序列，使得编码的氨基酸序列如SEQ IDNO: 1所示，但第40位的氨基酸残基为Gly；

或

如SEQ ID NO: 1所示，但第40位的氨基酸残基为Gly，并且第75位氨基酸残基为Ala；

c. 培养b得到的宿主细胞；和

15.如权利要求14所述的方法，其特征在于，所述方法还包括测定得到的ALA合成酶的活性以及解除血红素反馈抑制的能力。