CN107531763B

CN107531763B - 一种用于生物合成异戊二烯和异戊烯的酶及其突变体

Info

Publication number: CN107531763B
Application number: CN201680012121.5A
Authority: CN
Inventors: 马延和; 葛德永; 薛燕芬
Original assignee: Institute of Microbiology of CAS
Current assignee: Institute of Microbiology of CAS
Priority date: 2016-02-04
Filing date: 2016-02-04
Publication date: 2020-11-20
Anticipated expiration: 2036-02-04
Also published as: CN107531763A; WO2017132924A1; US20180087040A1; US10287569B2

Abstract

提供一种能够以4‑羟基‑3‑甲基‑2‑丁烯基‑焦磷酸(HMBPP)为底物产生异戊二烯的多肽、编码该多肽的核酸、含有该核酸的载体和细胞。还提供使用该多肽来生产异戊二烯的方法，以及制备该多肽的方法。

Description

一种用于生物合成异戊二烯和异戊烯的酶及其突变体

技术领域

本发明涉及分子生物学技术领域，特别是异戊二烯的生物合成领域。具体而言，本发明提供了一种能够以4-羟基-3-甲基-2-丁烯基-焦磷酸(HMBPP)为底物产生异戊二烯的多肽，编码所述多肽的核酸，含有所述核酸的载体和细胞。此外，本发明还提供了使用所述多肽来生产异戊二烯的方法，以及制备所述多肽的方法。

背景技术

异戊二烯是一种重要的化工原料，其主要用于生产橡胶，并且还可用于精细化学品(例如异戊烯氯、芳樟醇、月桂烯以及维生素A、E、K等)的合成。目前，工业应用的异戊二烯及异戊烯几乎全部来源于石油衍生原料。然而，随着工业上对异戊二烯需求的日益增加以及世界石油资源的逐渐枯竭，迫切需要一种可用于生产异戊二烯的替代来源。在此背景下，异戊二烯的生物合成法由于其无污染、可再生等优点引起人们的广泛关注及研究，并且也取得了初步的进展。在2010年，美国杰能科公司及固特异公司合作开发出了一种生物合成异戊二烯的方法，其核心就是，构建工程菌，并利用该工程菌把可再生的糖类转化为异戊二烯；并且，该方法的异戊二烯产量达到了60g/L。

目前的研究表明，生物主要是通过下述途径来合成异戊二烯：先通过代谢途径合成异戊二烯的前体二甲烯丙基焦磷酸(DMAPP)，然后在异戊二烯合酶(IspS；EC 4.2.3.27)的催化下，将DMAPP转化为异戊二烯。DMAPP及其同分异构体异戊烯基焦磷酸(IPP)是目前发现的所有异戊二烯类化合物的前体，并且它们在生物体内可通过两种不同的途径来合成：DXP途径和MVA途径。DXP途径包括，首先把丙酮酸和甘油醛-3-磷酸缩合为1-脱氧-D-木酮糖5-磷酸(DXP)；随后通过5个酶反应将DXP转化为4-羟基-3-甲基-2-丁烯基-焦磷酸(HMBPP)；然后在HMBPP还原酶(IspH)的作用下，将HMBPP转化为DMAPP和IPP。MVA途径则以乙酰辅酶A为单一原料，并且通过连续的7个酶反应来生成DMAPP。有关异戊二烯的生物合成(特别是DXP途径和MVA途径)的详细介绍还参见例如Tomohisa Kuzuyama,Biosci.Biotechnol.Biochem.,66(8),1619-1627,2002；Thomas D.Sharkey et al.,PlantPhysiology,February 2005,Vol.137,pp.700-712；和US8507235B2。

通常认为，异戊二烯合酶(IspS；EC 4.2.3.27)是生物合成异戊二烯最后一步所需要的酶。目前，已分离并鉴定了一种植物来源的IspS。该酶以DMAPP为底物，通过催化消除底物的焦磷酸基团来生成异戊二烯。尽管很多植物中都存在IspS，但它们的同源性都很高，且Km值都比较大，达到mM级。此外，研究还发现，IspS的底物(DMAPP及IPP)在细胞中的高浓度积累对工程菌的生长具有毒性作用。因此，使用IspS来生物合成异戊二烯的方法仍存在着不足。

因此，本领域需要开发新的生物合成异戊二烯的方法。

发明内容

本发明人在嗜碱芽孢杆菌N16-5(Bacillus sp.N16-5)中发现了一种新的酶，其具有多种活性，包括：(a)以HMBPP为底物生成DMAPP和IPP；(b)以HMBPP为底物生成异戊二烯；和，(c)以DMAPP底物生成异戊烯(2-甲基-2-丁烯和3-甲基-1-丁烯)。进一步，本发明人对该酶进行了改造，获得了两种突变体(H131N和E133Q)。这两种突变体丧失了以HMBPP为底物生成DMAPP和IPP的活性以及生成异戊烯的活性，但均保留了以HMBPP为底物生成异戊二烯的活性，并且其在细胞内生产异戊二烯的能力强于野生型酶(异戊二烯的产量提高了3-4倍)。基于此，本发明人开发了新的合成异戊二烯和异戊烯的方法。

因此，在一个方面，本发明提供了一种多肽，其具有以4-羟基-3-甲基-2-丁烯基-焦磷酸(HMBPP)为底物产生异戊二烯的活性，并且其具有选自下列的氨基酸序列：

(1)如SEQ ID NO:2所示的氨基酸序列；

(2)与SEQ ID NO:2具有至少90％同一性的氨基酸序列；和

(3)与SEQ ID NO:2相异在于一个或几个氨基酸残基的置换、缺失或添加的氨基酸序列。

在某些优选的实施方案中，本发明多肽的氨基酸序列与SEQ ID NO:2具有至少90％同一性，优选至少91％同一性、至少92％同一性、至少93％同一性、至少94％同一性、至少95％同一性、至少96％同一性、至少97％同一性、至少98％同一性、或至少99％同一性。

在某些优选的实施方案中，本发明多肽的氨基酸序列与SEQ ID NO:2相异在于一个或几个(例如，1个、2个、3个、4个、5个、6个、7个、8个或9个)氨基酸残基的置换、缺失或添加。

在某些优选的实施方案中，本发明多肽的氨基酸序列与SEQ ID NO:2相异在于一个或几个(例如，1个、2个、3个、4个、5个、6个、7个、8个或9个)氨基酸残基的保守置换。

在某些优选的实施方案中，本发明多肽的氨基酸序列为SEQ ID NO:2或者与SEQID NO:2相异在于一个或几个(例如1个)氨基酸残基的置换。例如，在某些优选的实施方案中，本发明多肽的氨基酸序列与SEQ ID NO:2相异在于，位于SEQ ID NO:2的第131位或第133位的氨基酸置换。在某些优选的实施方案中，本发明多肽的氨基酸序列与SEQ ID NO:2相异在于：位于SEQ ID NO:2的第131位的组氨酸被突变为天冬酰胺；或，位于SEQ ID NO:2的第133位的谷氨酸被突变为谷氨酰胺。

在某些优选的实施方案中，本发明多肽具有选自SEQ ID NO:2、3和4的氨基酸序列。

在某些优选的实施方案中，本发明的多肽还具有以二甲烯丙基焦磷酸(DMAPP)为底物产生2-甲基-2-丁烯和3-甲基-1-丁烯的活性。

在某些优选的实施方案中，本发明的多肽不具有以二甲烯丙基焦磷酸(DMAPP)为底物产生2-甲基-2-丁烯和3-甲基-1-丁烯的活性。

在另一个方面，本发明提供了一种分离的核酸，其编码如上所述的多肽。在另一个方面，本发明提供了一种载体，其包含所述分离的核酸。在某些优选的实施方案中，本发明的分离的核酸编码具有选自SEQ ID NO:2、3和4的氨基酸序列的多肽。可用于插入目的多核苷酸的载体是本领域公知的，包括但不限于克隆载体和表达载体。在一个实施方案中，载体是例如质粒，粘粒，噬菌体等等。

在另一个方面，本发明还涉及包含上述分离的核酸或载体的宿主细胞。此类宿主细胞包括但不限于，原核细胞例如大肠杆菌细胞和芽孢杆菌细胞(例如嗜碱性芽孢杆菌，枯草芽孢杆菌)，以及真核细胞例如酵母细胞，昆虫细胞，植物细胞和动物细胞。

在某些优选的实施方案中，所述分离的核酸相对于所述细胞而言是异源的。在某些优选的实施方案中，所述分离的核酸相对于所述细胞而言是外源的。

在某些优选的实施方案中，所述细胞还包含编码电子传递体(例如铁氧化还原蛋白)和/或电子传递体传递电子所需的酶(例如铁氧化还原蛋白还原酶)的核酸或者表达电子传递体(例如铁氧化还原蛋白)和/或电子传递体传递电子所需的酶(例如铁氧化还原蛋白还原酶)。例如，所述细胞可以还包含编码铁氧化还原蛋白和铁氧化还原蛋白还原酶的核酸，或者表达铁氧化还原蛋白和铁氧化还原蛋白还原酶。在某些优选的实施方案中，所述电子传递体和/或电子传递体传递电子所需的酶相对于所述细胞而言是内源的。在某些优选的实施方案中，所述电子传递体和/或电子传递体传递电子所需的酶相对于所述细胞而言是外源的。例如，所述铁氧化还原蛋白和/或铁氧化还原蛋白还原酶相对于所述细胞而言是内源的或外源的。在某些优选的实施方案中，所述细胞还包含外源导入的编码铁氧化还原蛋白的核酸，和/或，外源导入的编码铁氧化还原蛋白还原酶的核酸。在某些优选的实施方案中，所述铁氧化还原蛋白还原酶为铁氧化还原蛋白-NADP⁺还原酶(EC1.18.1.2)。

在某些优选的实施方案中，所述细胞还表达DXP途径的多肽。优选地，所述DXP途径的多肽选自，1-脱氧-D-木酮糖-5-磷酸合酶(DXS；EC 2.2.1.7)，1-脱氧-D-木酮糖-5-磷酸还原异构酶(DXR；EC 1.1.1.267)，2-C-甲基-D-赤藓醇4-磷酸胞苷酰转移酶(MCT；EC2.7.7.60)，4-(胞苷5'-二磷酸)-2-C-甲基-D-赤藓醇激酶(CMK；EC 2.7.1.148)，2-C-甲基-D-赤藓醇2,4-环二磷酸合酶(MCS；EC 4.6.1.12)，4-羟基-3-甲基-2-(E)-丁烯基二磷酸合酶(IspG；EC 1.17.7.1)，以及其任何组合。在某些优选的实施方案中，所述DXP途径的多肽相对于所述细胞而言是内源的。在某些优选的实施方案中，所述DXP途径的多肽相对于所述细胞而言是外源的。

在某些优选的实施方案中，所述细胞还表达异戊二烯合酶(IspS；EC 4.2.3.27)。在某些优选的实施方案中，所述细胞不表达异戊二烯合酶(IspS；EC 4.2.3.27)。

在某些优选的实施方案中，所述细胞为原核细胞，例如大肠杆菌或芽孢杆菌或蓝藻。

在另一个方面，本发明还涉及一种组合物，其包含本发明的多肽、HMBPP、NADPH或NADH、电子传递体(例如铁氧化还原蛋白)，以及电子传递体传递电子所需的酶(例如铁氧化还原蛋白还原酶)。在某些优选的实施方案中，所述组合物包含所述多肽、HMBPP、NADPH、铁氧化还原蛋白和铁氧化还原蛋白还原酶(例如铁氧化还原蛋白-NADP⁺还原酶)。本发明的此类组合物可用于在体外合成异戊二烯。

在另一个方面，本发明还涉及一种组合物，其包含具有SEQ ID NO:2所示的氨基酸序列的多肽、DMAPP、NADPH或NADH、电子传递体(例如铁氧化还原蛋白)，以及电子传递体传递电子所需的酶(例如铁氧化还原蛋白还原酶)。在某些优选的实施方案中，所述组合物包含具有SEQ ID NO:2所示的氨基酸序列的多肽、DMAPP、NADPH、铁氧化还原蛋白和铁氧化还原蛋白还原酶(例如铁氧化还原蛋白-NADP⁺还原酶)。本发明的此类组合物可用于在体外合成异戊烯(例如3-甲基-1-丁烯和/或2-甲基-2-丁烯)。

在另一个方面，本发明提供了一种生产异戊二烯的方法，其包括，使用本发明的多肽，将HMBPP转化为异戊二烯。

在某些优选的实施方案中，所述方法包括，(a)将所述多肽、HMBPP、NADPH或NADH、电子传递体(例如铁氧化还原蛋白)，以及电子传递体传递电子所需的酶(例如铁氧化还原蛋白还原酶)混合并温育(例如在20-40℃进行温育，例如在室温或37℃进行温育)；和，(b)收集步骤(a)产生的异戊二烯。在某些优选的实施方案中，在步骤(a)中，将所述多肽、HMBPP、NADPH、铁氧化还原蛋白和铁氧化还原蛋白还原酶(例如铁氧化还原蛋白-NADP⁺还原酶)混合并温育，例如在20-40℃进行温育(例如在室温或37℃进行温育)，以产生异戊二烯。在某些优选的实施方案中，所述多肽具有SEQ ID NO:3或4所示的氨基酸序列。

在某些优选的实施方案中，所述方法不涉及异戊二烯合酶(IspS；EC 4.2.3.27)的使用。在某些优选的实施方案中，所述方法用于体外生产异戊二烯。

在另一个方面，本发明提供了一种生产异戊二烯的方法，其包括，(a)培养细胞，所述细胞表达外源导入的本发明的多肽；和，(b)收集步骤(a)产生的异戊二烯。

在某些优选的实施方案中，在步骤(a)中，在适合产生异戊二烯的条件下培养细胞。例如，为了促进细胞产生异戊二烯，可以给细胞提供下列中的任一项或多项：(1)维持或促进细胞生长的培养基；(2)本发明多肽的底物，HMBPP；(3)电子传递体(例如铁氧化还原蛋白)；(4)电子传递体传递电子所需的酶(例如铁氧化还原蛋白还原酶)；和(5)NADPH或NADH。

用于培养细胞的各种合适的培养基是本领域技术人员公知的，并且是市售可得的。

在某些优选的实施方案中，所述细胞还表达电子传递体(例如铁氧化还原蛋白)和/或电子传递体传递电子所需的酶(例如铁氧化还原蛋白还原酶)。例如，所述细胞还表达铁氧化还原蛋白和铁氧化还原蛋白还原酶。在某些优选的实施方案中，所述电子传递体和/或电子传递体传递电子所需的酶相对于所述细胞而言是内源的。在某些优选的实施方案中，所述电子传递体和/或电子传递体传递电子所需的酶相对于所述细胞而言是外源的。例如，所述铁氧化还原蛋白和/或铁氧化还原蛋白还原酶相对于所述细胞而言可以是内源的或外源的。在某些优选的实施方案中，所述铁氧化还原蛋白还原酶为铁氧化还原蛋白-NADP⁺还原酶(EC 1.18.1.2)。

在某些情况下，所述细胞天然表达铁氧化还原蛋白和铁氧化还原蛋白还原酶。在此类细胞中，可以无需外源导入编码铁氧化还原蛋白和铁氧化还原蛋白还原酶的核酸。然而，特别优选地，在此类细胞中，进一步导入编码铁氧化还原蛋白和铁氧化还原蛋白还原酶的核酸，以提高铁氧化还原蛋白和铁氧化还原蛋白还原酶的表达，从而进一步提高本发明多肽的活性。在某些情况下，所述细胞不表达铁氧化还原蛋白和铁氧化还原蛋白还原酶。在此类细胞中，特别优选地，导入编码铁氧化还原蛋白和铁氧化还原蛋白还原酶的核酸，以为本发明多肽提供高效的电子供体。

在某些优选的实施方案中，可以在细胞培养基中添加HMBPP，以提供本发明多肽所需的底物。在某些优选的实施方案中，通过在细胞中建立DXP途径来促使细胞合成HMBPP，并由此提供本发明多肽所需的底物。例如，可通过在细胞中表达DXP途径的一种或多种多肽来促使细胞合成HMBPP，从而提供本发明多肽所需的底物。

因此，在某些优选的实施方案中，所述细胞还表达DXP途径的多肽。在某些优选的实施方案中，所述DXP途径的多肽选自，1-脱氧-D-木酮糖-5-磷酸合酶(DXS；EC 2.2.1.7)，1-脱氧-D-木酮糖-5-磷酸还原异构酶(DXR；EC 1.1.1.267)，2-C-甲基-D-赤藓醇4-磷酸胞苷酰转移酶(MCT；EC 2.7.7.60)，4-(胞苷5'-二磷酸)-2-C-甲基-D-赤藓醇激酶(CMK；EC2.7.1.148)，2-C-甲基-D-赤藓醇2,4-环二磷酸合酶(MCS；EC 4.6.1.12)，4-羟基-3-甲基-2-(E)-丁烯基二磷酸合酶(IspG；EC 1.17.7.1)，以及其任何组合。在某些优选的实施方案中，所述细胞表达上述DXP途径多肽中的1种，2种，3种，4种，5种或6种。

在某些优选的实施方案中，所述DXP途径的多肽相对于所述细胞而言是内源的。在某些优选的实施方案中，所述DXP途径的多肽相对于所述细胞而言是外源的。

在某些优选的实施方案中，所述细胞还表达异戊二烯合酶(IspS；EC 4.2.3.27)。在此类细胞中，所述细胞可以通过多种途径来生物合成异戊二烯。在某些优选的实施方案中，所述细胞不表达异戊二烯合酶(IspS；EC 4.2.3.27)。

在某些优选的实施方案中，所述细胞选自，原核细胞例如大肠杆菌细胞和芽孢杆菌细胞(例如嗜碱性芽孢杆菌，枯草芽孢杆菌)，以及真核细胞例如酵母细胞，昆虫细胞，植物细胞和动物细胞。然而，特别优选地，所述细胞为原核细胞，例如大肠杆菌或芽孢杆菌或蓝藻。

在某些优选的实施方案中，所述方法用于生物合成异戊二烯。

在另一个方面，本发明提供了一种生产异戊烯(例如3-甲基-1-丁烯和/或2-甲基-2-丁烯)的方法，其包括，使用具有SEQ ID NO:2所示的氨基酸序列的多肽，将DMAPP转化为异戊烯。

在某些优选的实施方案中，所述方法包括，(a)将所述多肽、DMAPP、NADPH或NADH、电子传递体(例如铁氧化还原蛋白)和电子传递体传递电子所需的酶(例如铁氧化还原蛋白还原酶)混合并温育；和，(b)收集步骤(a)产生的异戊烯。在某些优选的实施方案中，在步骤(a)中，将所述多肽、DMAPP、NADPH、铁氧化还原蛋白和铁氧化还原蛋白还原酶(例如铁氧化还原蛋白-NADP⁺还原酶)混合并温育，例如在20-40℃进行温育(例如在室温或37℃进行温育)，以产生异戊烯。在某些优选的实施方案中，所述方法用于体外生产异戊烯。

在另一个方面，本发明提供了一种生产异戊烯(例如3-甲基-1-丁烯和/或2-甲基-2-丁烯)的方法，其包括，(a)培养细胞，所述细胞表达外源导入的、具有SEQ ID NO:2所示的氨基酸序列的多肽；和，(b)收集步骤(a)产生的异戊烯。

在某些优选的实施方案中，在步骤(a)中，在适合产生异戊烯(例如3-甲基-1-丁烯和/或2-甲基-2-丁烯)的条件下培养细胞。例如，为了促进细胞产生异戊烯，可以给细胞提供下列中的任一项或多项：(1)维持或促进细胞生长的培养基；(2)本发明多肽的底物，DMAPP；(3)电子传递体(例如铁氧化还原蛋白)；(4)电子传递体传递电子所需的酶(例如铁氧化还原蛋白还原酶)；和(5)NADPH或NADH。

在某些优选的实施方案中，可以在细胞培养基中添加DMAPP，以提供本发明多肽所需的底物。在某些优选的实施方案中，通过在细胞中建立DXP途径来促使细胞合成DMAPP，并由此提供本发明多肽所需的底物。例如，可通过在细胞中表达DXP途径的一种或多种多肽来促使细胞合成DMAPP，从而提供本发明多肽所需的底物。

在某些优选的实施方案中，所述细胞还表达异戊烯基二磷酸异构酶(IDI；EC5.3.3.2)。在某些优选的实施方案中，所述异戊烯基二磷酸异构酶相对于所述细胞而言是内源的。在某些优选的实施方案中，所述异戊烯基二磷酸异构酶相对于所述细胞而言是外源的。

在某些优选的实施方案中，所述方法用于生物合成异戊烯(例如3-甲基-1-丁烯和/或2-甲基-2-丁烯)。

在另一个方面，本发明提供了一种制备本发明多肽的方法，其包括，(a)培养宿主细胞，所述宿主细胞包含并表达编码所述多肽的核酸；和，(b)收集所述细胞表达的所述多肽。

用于蛋白表达的各种宿主细胞是本领域技术人员公知的，其包括但不限于，原核细胞例如大肠杆菌细胞，以及真核细胞例如酵母细胞，昆虫细胞，植物细胞和动物细胞(如哺乳动物细胞，例如小鼠细胞、人细胞等)。特别优选地，所述宿主细胞为大肠杆菌。

相关术语的定义和解释

在本发明中，除非另有说明，否则本文中使用的科学和技术名词具有本领域技术人员所通常理解的含义。并且，本文中所用的相关实验室操作步骤均为相应领域内广泛使用的常规步骤。同时，为了更好地理解本发明，下面提供相关术语的定义和解释。

如本文中所使用的，术语“HMBPP”是指4-羟基-3-甲基-2-丁烯基-焦磷酸，其结构式如下面的式I所示：

如本文中所使用的，术语“DMAPP”是指二甲烯丙基焦磷酸，其结构式如下面的式II所示：

如本文中所使用的，术语“2M2B”是指2-甲基-2-丁烯，其结构式为

如本文中所使用的，术语“3M1B”是指3-甲基-1-丁烯，其结构式为

如本文中所使用的，术语“异戊二烯”是指2-甲基-1,3-丁二烯，其结构式为

如本文中所使用的，术语“同一性”用于指两个多肽之间或两个核酸之间序列的匹配情况。当两个进行比较的序列中的某个位置都被相同的碱基或氨基酸单体亚单元占据时(例如，两个DNA分子的每一个中的某个位置都被腺嘌呤占据，或两个多肽的每一个中的某个位置都被赖氨酸占据)，那么各分子在该位置上是同一的。两个序列之间的“百分数同一性”是由这两个序列共有的匹配位置数目除以进行比较的位置数目×100的函数。例如，如果两个序列的10个位置中有6个匹配，那么这两个序列具有60％的同一性。例如，DNA序列CTGACT和CAGGTT共有50％的同一性(总共6个位置中有3个位置匹配)。通常，在将两个序列比对以产生最大同一性时进行比较。这样的比对可通过使用，例如，可通过计算机程序例如Align程序(DNAstar,Inc)方便地进行的Needleman等人(1970)J.Mol.Biol.48：443-453的方法来实现。还可使用已整合入ALIGN程序(版本2.0)的E.Meyers和W.Miller(Comput.ApplBiosci.，4:11-17(1988))的算法，使用PAM120权重残基表(weight residue table)、12的缺口长度罚分和4的缺口罚分来测定两个氨基酸序列之间的百分数同一性。此外，可使用已整合入GCG软件包(可在www.gcg.com上获得)的GAP程序中的Needleman和Wunsch(J MoIBiol.48:444-453(1970))算法，使用Blossum 62矩阵或PAM250矩阵以及16、14、12、10、8、6或4的缺口权重(gap weight)和1、2、3、4、5或6的长度权重来测定两个氨基酸序列之间的百分数同一性。

如本文中使用的，术语“保守置换”意指不会不利地影响或改变包含氨基酸序列的蛋白/多肽的必要特性的氨基酸置换。例如，可通过本领域内已知的标准技术例如定点诱变和PCR介导的诱变引入保守置换。保守氨基酸置换包括用具有相似侧链的氨基酸残基替代氨基酸残基的置换，例如用在物理学上或功能上与相应的氨基酸残基相似(例如具有相似大小、形状、电荷、化学性质，包括形成共价键或氢键的能力等)的残基进行的置换。已在本领域内定义了具有相似侧链的氨基酸残基的家族。这些家族包括具有碱性侧链(例如，赖氨酸、精氨酸和组氨酸)、酸性侧链(例如天冬氨酸、谷氨酸)、不带电荷的极性侧链(例如甘氨酸、天冬酰胺、谷氨酰胺、丝氨酸、苏氨酸、酪氨酸、半胱氨酸、色氨酸)、非极性侧链(例如丙氨酸、缬氨酸、亮氨酸、异亮氨酸、脯氨酸、苯丙氨酸、甲硫氨酸)、β分支侧链(例如，苏氨酸、缬氨酸、异亮氨酸)和芳香族侧链(例如，酪氨酸、苯丙氨酸、色氨酸、组氨酸)的氨基酸。因此，保守置换通常是指，用来自相同侧链家族的另一个氨基酸残基替代相应的氨基酸残基。鉴定氨基酸保守置换的方法在本领域内是熟知的(参见，例如，Brummell等人，Biochem.32:1180-1187(1993)；Kobayashi等人Protein Eng.12(10):879-884(1999)；和Burks等人Proc.Natl Acad.Set USA 94:412-417(1997)，其通过引用并入本文)。

在本申请中，已证实如SEQ ID NO:2所示的IspH蛋白能够将HMBPP转化为异戊二烯。与此同时，对已知多肽进行突变以获得其变体的方法已在现有技术中进行了详细描述，并且示例性地描述于本申请中。例如，本说明书的实施例提供了制备所述IspH蛋白的突变体的方法，并制备获得了2种突变体(H131N和E133Q)。另外，测定某一多肽是否具有将HMBPP转化为异戊二烯的活性的方法是本领域技术人员已知的，并且也详细描述于本申请中。例如，本说明书的实施例提供了测试H131N和E133Q是否能够以HMBPP为底物生成异戊二烯的方法，并且已证实，H131N和E133Q均具有将HMBPP转化为异戊二烯的活性。因此，通过重复本发明的这些方法，可以制备所述IspH蛋白的具有将HMBPP转化为异戊二烯的活性的其他突变体。因此，本发明的多肽不限于如SEQ ID NO:2所示的IspH蛋白以及其突变体H131N和E133Q，并且意欲涵盖IspH蛋白的所有其他突变体，只要此类突变体仍然保留将HMBPP转化为异戊二烯的活性。

如本文中使用的，表述“核酸/多肽相对于细胞是异源的”意指，所述核酸/多肽不天然存在于所述细胞中。也即，所述细胞在天然状态下不包含或表达所述核酸/多肽。

如本文中使用的，表述“核酸/多肽相对于细胞是内源的”意指，所述核酸/多肽天然存在于所述细胞中。也即，所述细胞在天然状态下包含或表达所述核酸/多肽。

如本文中使用的，表述“核酸/多肽相对于细胞是外源的”意指，所述核酸/多肽是通过人工方式外源导入所述细胞中。应当理解，此类核酸/多肽可以不天然存在于所述细胞中(即，相对于所述细胞是异源的)，其用于在细胞中引入异源的核酸/多肽；或者，也可以与天然存在于所述细胞中的内源核酸/多肽相同，其用于增加所述细胞中的内源核酸/多肽的拷贝数或表达。

如本文中使用的，术语“电子传递体”是指，在电子传递链中参与电子传递的蛋白。通常，电子传递体既能够作为电子受体接受电子，又能够作为电子供体提供电子，从而能够实现电子的传递。此类电子传递体是本领域技术人员公知的，并且包括但不限于，铁氧化还原蛋白和黄素氧化还原蛋白。此外，在电子传递体传递电子的过程中，通常需要氧化还原酶(其在本文中被称为，电子传递体传递电子所需的酶)的参与。例如，铁氧化还原蛋白的电子传递通常需要铁氧化还原蛋白还原酶的参与；黄素氧化还原蛋白的电子传递通常需要黄素氧化还原蛋白还原酶的参与。电子传递体传递电子所需的酶也是本领域技术人员公知的，例如但不限于铁氧化还原蛋白还原酶和黄素氧化还原蛋白还原酶。

如本文中使用的，术语“铁氧化还原蛋白还原酶”是指能够催化铁氧化还原蛋白的氧化还原反应的酶，其包括两种类型：

(1)铁氧化还原蛋白-NADP⁺还原酶，其IntEnz登录号为EC1.18.1.2，并且能够催化下述反应：

2还原型铁氧化还原蛋白

氧化型铁氧化还原蛋白+NADPH；和

(2)铁氧化还原蛋白-NAD⁺还原酶，其IntEnz登录号为EC1.18.1.3，并且能够催化下述反应：

2还原型铁氧化还原蛋白

氧化型铁氧化还原蛋白+NADH。

在本发明中，铁氧化还原蛋白还原酶优选为铁氧化还原蛋白-NADP⁺还原酶(EC1.18.1.2)。

如本文中使用的，术语“DXP途径的多肽”是指，参与DXP途径的多肽。DXP途径是指，生物体中以丙酮酸和甘油醛-3-磷酸为原料合成DMAPP的途径，其包括下述步骤：(1)将丙酮酸和甘油醛-3-磷酸缩合为1-脱氧-D-木酮糖5-磷酸(DXP)；(2)将DXP转化为2-C-甲基-D-赤藓醇4-磷酸(MEP)；(3)将MEP转化为4-(胞苷5'-二磷酸)-2-C-甲基-D-赤藓醇(CDP-ME)；(4)将CDP-ME转化为2-磷酸-4-(胞苷5'-二磷酸)-2-C-甲基-D-赤藓醇(CDP-ME2P)；(5)将CDP-ME2P转化为2-C-甲基-D-赤藓醇2,4-环二磷酸(MECDP)；(6)将MECDP转化为HMBPP；和(7)将HMBPP转化为DMAPP和IPP。关于DXP途径的详细描述可参见例如，Tomohisa Kuzuyama,Biosci.Biotechnol.Biochem.,66(8),1619-1627,2002；Thomas D.Sharkey et al.,PlantPhysiology,February 2005,Vol.137,pp.700-712；和US8507235B2。

参与DXP途径的多肽包括但不限于，1-脱氧-D-木酮糖-5-磷酸合酶(DXS；EC2.2.1.7)，1-脱氧-D-木酮糖-5-磷酸还原异构酶(DXR；EC 1.1.1.267)，2-C-甲基-D-赤藓醇4-磷酸胞苷酰转移酶(MCT；EC2.7.7.60)，4-(胞苷5'-二磷酸)-2-C-甲基-D-赤藓醇激酶(CMK；EC2.7.1.148)，2-C-甲基-D-赤藓醇2,4-环二磷酸合酶(MCS；EC4.6.1.12)，4-羟基-3-甲基-2-(E)-丁烯基二磷酸合酶(IspG；EC1.17.7.1)。关于这些多肽(酶)的详细描述可参见公共数据库IntEnz(http://www.ebi.ac.uk/intenz/)。

如本文中使用的，术语“异戊二烯合酶(IspS)”是指，能够以DMAPP为底物产生异戊二烯的酶，其IntEnz登录号为EC 4.2.3.27。

如本文中使用的，术语“异戊烯基二磷酸异构酶(IDI)”是指，能够催化DMAPP和IPP之间的异构反应的酶，其也称为IPP异构酶，IntEnz登录号为EC 5.3.3.2。

发明的有益效果

本发明的多肽(酶)能够以HMBPP为底物直接生成异戊二烯。与现有技术中公开的基于MEP途径生产异戊二烯的方法和酶相比，本发明的技术方案具有以下有益效果：

(1)本发明的生产异戊二烯的方法无需DMAPP的参与，能够避免对宿主细胞的生长具有毒性的DMAPP和IPP在宿主细胞内的积累；

(2)本发明的生产异戊二烯的方法减少了一步酶促反应，无需异戊二烯合酶(IspS)的参与，简化了流程，提高了效率。

下面将结合附图和实施例对本发明的实施方案进行详细描述，但是本领域技术人员将理解，下列附图和实施例仅用于说明本发明，而不是对本发明的范围的限定。根据附图和优选实施方案的下列详细描述，本发明的各种目的和有利方面对于本领域技术人员来说将变得显然。

附图说明

图1显示了实施例2中表达和纯化的蛋白的SDS-PAGE检测结果，其中，泳道M：分子量标记；泳道1：铁氧化还原蛋白-NADP⁺还原酶；泳道2：IspH蛋白；泳道3：铁氧化还原蛋白。结果显示，本发明的IspH蛋白能够在大肠杆菌中高表达，其分子量为约35kD，并且在纯化后具有高纯度，如图1泳道2中的单一电泳条带所示。此外，图1的结果还显示，通过实施例2的方法获得了高纯度的铁氧化还原蛋白(分子量为约11kD，如图1泳道3中的单一电泳条带所示)和铁氧化还原蛋白-NADP⁺还原酶(分子量为约36kD，如图1泳道1中的单一电泳条带所示)。

图2显示了经纯化的IspH蛋白的全波长广谱扫描结果，其中，横坐标表示波长，纵坐标表示吸光度。结果显示，本发明的IspH蛋白在410nm处有一最大吸收峰，在320nm处有一肩峰。这表明，该蛋白含有铁硫中心。

图3显示了实施例3中表达和纯化的突变体蛋白H131N和E133Q的SDS-PAGE电泳检测结果，其中泳道M：分子量标记；泳道1：突变体蛋白H131N；泳道2：突变体蛋白E133Q。结果显示，本发明的突变体蛋白H131N和E133Q能够在大肠杆菌中高表达，其分子量均为约35kD，并且在纯化后具有高纯度。

图4显示了IspH蛋白将DMAPP转化为异戊烯的酶促反应的Michaelis-Menten曲线，其中，横坐标表示DMAPP的浓度(mM)，纵坐标表示反应速率(nmol min^-1mg^-1)。图4中的小图显示了所述酶促反应的Lineweaver-Burk曲线，其中，横坐标表示DMAPP的浓度的倒数，纵坐标表示反应速率的倒数。结果显示，野生型IspH蛋白以DMAPP为底物生成异戊烯的最大反应活性为约6.2nmol min^-1mg^-1，Km为约275μM。

图5为显示本发明IspH蛋白的三种活性的示意图，其中，Glucose:葡萄糖；MVApathway:MVA途径；DXP pathway:DXP途径；HMBPP：4-羟基-3-甲基-2-丁烯基-焦磷酸；DMAPP：二甲烯丙基焦磷酸；IPP:异戊烯基焦磷酸；IDI：异戊烯基二磷酸异构酶；IspS：异戊二烯合酶；2M2B：2-甲基-2-丁烯；3M1B：3-甲基-1-丁烯。

图6显示了经培养的野生型嗜碱芽孢杆菌N16-5(WT)和重组细胞WNH(pMH)的顶空气体的GC特征谱，其中，3-甲基-1-丁烯(3M1B)，2-甲基-2-丁烯(2M2B)和异戊二烯的滞留时间分别为4.5min，5.5min，和11.3min。结果显示，野生型嗜碱芽孢杆菌N16-5能够产生异戊二烯，以及微量的2-甲基-2-丁烯和3-甲基-1-丁烯；并且，过表达IspH蛋白的重组细胞WNH的2-甲基-2-丁烯和3-甲基-1-丁烯的产量显著提高，但异戊二烯的产量仅略有提升。

图7显示了野生型嗜碱芽孢杆菌N16-5(WT)、重组细胞WNH、H131N和E133Q的异戊二烯产量的比较。结果显示，与野生型嗜碱芽孢杆菌N16-5相比，重组细胞WNH的异戊二烯产量略有提升，但重组细胞H131N和E133Q的异戊二烯产量均显著提高，分别约为野生型菌株的3倍和4倍。

图8a显示了嗜碱芽孢杆菌N16-5的野生型菌株和突变体菌株Δfer和Δfld的生长情况。结果显示，这3种菌株均能够在Horikoshi-I培养基中正常生长，其生长情况无显著差异。图8b显示了嗜碱芽孢杆菌N16-5的野生型菌株和突变体菌株Δfer和Δfld的异戊二烯产量的比较。结果显示，突变体菌株Δfer的异戊二烯产量显著低于野生型菌株(仅为野生型菌株的约50％)；而突变体菌株Δfld的异戊二烯产量则略微低于野生型菌株。这些实验结果表明，铁氧化还原蛋白和黄素氧化还原蛋白均可用作IspH蛋白生产异戊二烯所需的电子供体(即，当缺失铁氧化还原蛋白时，黄素氧化还原蛋白可用作电子供体；反之亦然)；但是，铁氧化还原蛋白对于IspH蛋白的该催化活性而言是更优选、更高效的。

图9显示了经培养的重组大肠杆菌细胞STV165HF的顶空气体的GC特征谱(图9A)，以及标准品(3-甲基-1-丁烯，2-甲基-2-丁烯，2-甲基-1-丁烯和异戊二烯)的GC特征谱(图9B)，其中，所使用的GC检测条件为：进样口温度180℃，柱温100℃，检测器温度200℃；并且，峰a为3-甲基-1-丁烯的特征峰；峰b为2-甲基-2-丁烯的特征峰；峰c为2-甲基-1-丁烯的特征峰；峰d为异戊二烯的特征峰。

图10显示了图9A中峰1组分与标准品3-甲基-1-丁烯(图10A)、峰2组分与标准品2-甲基-2-丁烯(图10B)、峰3组分与标准品异戊二烯(图10C)的质谱分析结果的比较；其中，在图10A-10C中，横坐标轴上方的图显示了待测组分(峰1、峰2、峰3)的质谱分析结果，而横坐标轴下方的图显示了标准品(3-甲基-1-丁烯、2-甲基-2-丁烯、异戊二烯)的质谱分析结果。

图9-10的实验结果显示，过表达IspH蛋白的重组大肠杆菌细胞STV165HF能够产生显著量的异戊二烯(峰3)，2-甲基-2-丁烯(峰2)和3-甲基-1-丁烯(峰1)。

图11显示了经培养的重组大肠杆菌细胞STV165HF-H131N(图11A)和STV165HF-E133Q(图11B)的顶空气体的GC特征谱；其中，所使用的GC检测条件为：进样口温度180℃，柱温130℃，检测器温度200℃；并且，经质谱分析确认，图11A-11B所测定的顶空气体包含异戊二烯，但不包含异戊烯。这些实验结果表明，过表达突变体蛋白H131N或E133Q的重组大肠杆菌细胞均能够产生显著量的异戊二烯，且均不产生异戊烯。

序列信息

本发明涉及的序列的信息提供于下面的表1中。

表1：序列的描述

序列1(SEQ ID NO:1)：

atggaggttttgaaaatttccccacggggttattgttacggcgtggtagatgctatggtt 60

atggctaaacaagctgctgaaaatccagatttaccacggcctatctatatattaggaatg 120

attgttcacaataaacatgtgacagatgcctttgatgaagagggtattatcacgcttgac 180

ggtccaaacagattagagattattaagcaagttgataaaggaaccgttatttttacggca 240

catggcgtttcgccagaagtacgaactatcgctaaagaaaaaggattaacgacgatcgat 300

gccacatgtccagatgtaaccgtcactcacgacctaattcgaaataaaatggaagagggc 360

tacgagtttatctacattggtaagaaaggacaccccgagccagaaggcgctatcggtgtt 420

gctccagacattgtttatttagtagaaaatgttgaagatgtagaaagacttcagctgaaa 480

ggcaataaaattcttataacaaaccagacgacaatgagtcaatgggatgtctctcacatc 540

attaaagctgcgaaaaacaaataccctgaagcagaggtccataacgaaatttgcatggct 600

actcaagttcgtcaagaagctgttgctgaacaagctggagaagctgatttactaattgtt 660

gtgggtgatccgaaaagtaataactctaatcgtctcgcacaagtatcgatggacattacc 720

ggaacacctgcctacagaatagcaaatgttaatgaactcaatcttgaatggcttaaaggg 780

atcaaaaaagtggcagtcactgctggggctagcacacccactcctgttacaaaagaagtg 840

attgctttcatcgaaaagtttaatgaagatgacccccacacatgggatacgacgagtact 900

gttaaattaacaaaaattctccctaaagtgagaaagaaaaaagcggagcgggcctaa 957

序列2(SEQ ID NO:2)：

MEVLKISPRGYCYGVVDAMVMAKQAAENPDLPRPIYILGMIVHNKHVTDAFDEEGIITLDGPNRLEIIKQVDKGTVIFTAHGVSPEVRTIAKEKGLTTIDATCPDVTVTHDLIRNKMEEGYEFIYIGKKGHPEPEGAIGVAPDIVYLVENVEDVERLQLKGNKILITNQTTMSQWDVSHIIKAAKNKYPEAEVHNEICMATQVRQEAVAEQAGEADLLIVVGDPKSNNSNRLAQVSMDITGTPAYRIANVNELNLEWLKGIKKVAVTAGASTPTPVTKEVIAFIEKFNEDDPHTWDTTSTVKLTKILPKVRKKKAERA

序列3(SEQ ID NO:3)：

MEVLKISPRGYCYGVVDAMVMAKQAAENPDLPRPIYILGMIVHNKHVTDAFDEEGIITLDGPNRLEIIKQVDKGTVIFTAHGVSPEVRTIAKEKGLTTIDATCPDVTVTHDLIRNKMEEGYEFIYIGKKGNPEPEGAIGVAPDIVYLVENVEDVERLQLKGNKILITNQTTMSQWDVSHIIKAAKNKYPEAEVHNEICMATQVRQEAVAEQAGEADLLIVVGDPKSNNSNRLAQVSMDITGTPAYRIANVNELNLEWLKGIKKVAVTAGASTPTPVTKEVIAFIEKFNEDDPHTWDTTSTVKLTKILPKVRKKKAERA

序列4(SEQ ID NO:4)：

MEVLKISPRGYCYGVVDAMVMAKQAAENPDLPRPIYILGMIVHNKHVTDAFDEEGIITLDGPNRLEIIKQVDKGTVIFTAHGVSPEVRTIAKEKGLTTIDATCPDVTVTHDLIRNKMEEGYEFIYIGKKGHPQPEGAIGVAPDIVYLVENVEDVERLQLKGNKILITNQTTMSQWDVSHIIKAAKNKYPEAEVHNEICMATQVRQEAVAEQAGEADLLIVVGDPKSNNSNRLAQVSMDITGTPAYRIANVNELNLEWLKGIKKVAVTAGASTPTPVTKEVIAFIEKFNEDDPHTWDTTSTVKLTKILPKVRKKKAERA

序列5(SEQ ID NO:5)：

CATGCCATGGAGGTTTTGAAAATTTCC

序列6(SEQ ID NO:6)：

CCGCTCGAGTGGCCCGCTCCGCTTTTTTCTTTC

序列7(SEQ ID NO:7)：

CTACATTGGTAAGAAAGGAAACCCCGAGCCAGAAGGCG

序列8(SEQ ID NO:8)：

CGCCTTCTGGCTCGGGGTTTCCTTTCTTACCAATGTAG

序列9(SEQ ID NO:9)：

GTAAGAAAGGACACCCCCAGCCAGAAGGCGCTATC

序列10(SEQ ID NO:10)：

GATAGCGCCTTCTGGCTGGGGGTGTCCTTTCTTAC

具体实施方式

现参照下列意在举例说明本发明(而非限定本发明)的实施例来描述本发明。

除非特别指明，本发明中所使用的分子生物学实验方法基本上参照J.Sambrook等人，分子克隆：实验室手册，第2版，冷泉港实验室出版社，1989，以及F.M.Ausubel等人，精编分子生物学实验指南，第3版，John Wiley&Sons,Inc.，1995中所述的方法进行；所使用的检测方法均是本领域的常规检测方法，其按照相关文献中记载的步骤或者按照所使用仪器的制造商推荐的步骤来进行。本领域技术人员知晓，实施例以举例方式描述本发明，且不意欲限制本发明所要求保护的范围。

实施例1.基因的克隆

将嗜碱芽孢杆菌N16-5(Bacillus sp.N16-5)(获自中国普通微生物菌种保藏管理中心，CGMCC)培养于含有2％NaCl的Horikoshi-I培养基(pH 10.0)(参见，Horikoshi K.，Microbiol Mol Biol Rev.1999；63:735–50)中。使用DNA提取试剂盒(E.Z.N.A.^TMBacterial DNA IsolationKit,Omega，USA)，提取嗜碱芽孢杆菌N16-5的基因组DNA。以提取的基因组DNA为模板，使用下列引物进行PCR扩增：上游引物275F：5’-CATGCCATGGAGGTTTTGAAAATTTCC-3’(SEQ ID NO:5)，其中划线部分表示NcoI酶切位点；以及，下游引物275R：5’-CCGCTCGAGTGGCCCGCTCCGCTTTTTTCTTTC-3’(SEQ ID NO:6)，其中划线部分表示XhoI酶切位点。PCR反应体系为50μL，反应条件为：94℃预变性3min；30个循环的(94℃变性1min，58℃退火30s，72℃延伸1.5min)；72℃延伸5min。

PCR产物用试剂盒(E.Z.N.A.^TM Bacterial DNA Isolation Kit,Omega，USA)进行纯化，并用NcoI和XhoI进行酶切，随后连接入经NcoI和XhoI酶切的载体pET28a(TaKaRa公司)中，并最终转化到大肠杆菌DH5α中。在LB培养基中培养经转化的大肠杆菌DH5α，从中提取质粒，并对质粒进行测序验证。测序结果显示，插入载体pET28a中的基因(IspH基因)具有如SEQ ID NO:1所示的序列，其编码的蛋白(IspH蛋白)具有如SEQ ID NO:2所示的氨基酸序列。将所构建的质粒命名为pET-H。

实施例2.多肽的表达与纯化

大肠杆菌的isc(iron-sulfur cluster)操纵子所编码的蛋白有助于本发明IspH蛋白的[4Fe-4S]中心在蛋白质内的正确构建。因此，为了使表达的IspH蛋白具有高活性，首先在大肠杆菌中高表达isc操纵子。简言之，将isc操纵子连接到pSTV28载体中，并转化入大肠杆菌BL21(DE)，以增加该操纵子在宿主细胞中的拷贝数，提高该操纵子所编码的蛋白的表达(Grawert,T.et al.IspH protein of Escherichia coli:studies on iron-sulfurcluster implementation and catalysis.Journal of the American ChemicalSociety126,12847-12855(2004))。随后，将如上构建的pET-H质粒转入到高表达isc操纵子的大肠杆菌中。

经转化的大肠杆菌培养于含有25mg/L的氯霉素和50mg/L的卡那霉素的LB培养基中，并在37℃培养至OD值为0.6左右。随后，向培养物中加入半胱氨酸(1mM)，FeCl₃(0.1mM)和0.1mM IPTG，并在18℃、低速振荡的条件下继续培养宿主细胞16h。培养结束后，离心收集菌体，用蒸馏水洗涤2次，并于-80℃保存备用。

在厌氧条件下纯化菌体中表达的蛋白。简言之，用BugBuster ProteinExtraction Reagent(Merck,Germany)裂解收集的菌体。随后，将菌体裂解液以16000g离心20min，并收集上清，弃去沉淀。由于所表达的IspH蛋白在氨基端含有6个组氨酸标签(该组氨酸标签由pET28a载体自身携带的序列编码，且位于重组载体所表达的蛋白的N端)，因此，按照制造商的说明书，使用Ni-NTA柱(Merck,Germany)和脱盐柱(Sangon Biotech,China)来对上清中的IspH蛋白进行纯化。经纯化的IspH蛋白显示为褐色，保存于-80℃，备用。

另外，还使用与上述类似的方法表达和纯化了铁氧化还原蛋白(ferredoxin)和铁氧化还原蛋白-NADP⁺还原酶(ferredoxin-NADP+-reductase，FNR)。简言之，将编码铁氧化还原蛋白和铁氧化还原蛋白-NADP⁺还原酶的DNA片段分别克隆入载体pET28a中，然后转化入大肠杆菌进行表达。随后，将大肠杆菌裂解，并使用Ni-NTA柱(Merck,Germany)和脱盐柱(Sangon Biotech,China)对大肠杆菌所表达的蛋白进行纯化。经纯化的铁氧化还原蛋白和铁氧化还原蛋白-NADP⁺还原酶分别保存于-80℃，备用。

使用SDS-PAGE来对经纯化的蛋白进行检测。结果示于图1中。结果显示，本发明的IspH蛋白能够在大肠杆菌中高表达，其分子量为约35kD，并且经上述纯化步骤后具有高纯度，如图1泳道2中的单一电泳条带所示。类似地，图1的结果还显示，通过上述方法获得了高纯度的铁氧化还原蛋白(分子量为约11kD，如图1泳道3中的单一电泳条带所示)和铁氧化还原蛋白-NADP⁺还原酶(分子量为约36kD，如图1泳道1中的单一电泳条带所示)。

另外，还对经纯化的IspH蛋白进行全波长广谱扫描。结果示于图2中。图2的结果显示，本发明的IspH蛋白在410nm处有一最大吸收峰，在320nm处有一肩峰。这表明，该蛋白含有铁硫中心。

实施例3.IspH突变体的制备

采用定点突变的方法来制备IspH蛋白的两个突变体，H131N和E133Q，其中，突变体H131N(其序列如SEQ ID NO:3所示)与IspH蛋白的区别在于，位于SEQ ID NO:2第131位的组氨酸被突变为天冬酰胺；突变体E133Q(其序列如SEQ ID NO:4所示)与IspH蛋白的区别在于，位于SEQ ID NO:2的第133位的谷氨酸被突变为谷氨酰胺。

简言之，以质粒pET-H为模板，使用下述引物进行全质粒PCR：

用于构建突变体H131N的引物对：

H131N-F：CTACATTGGTAAGAAAGGAaACCCCGAGCCAGAAGGCG(SEQ ID NO:7)，

H131N-R：CGCCTTCTGGCTCGGGGTtTCCTTTCTTACCAATGTAG(SEQ ID NO:8)；

用于构建突变体E133Q的引物对：

E133Q-F:GTAAGAAAGGACACCCCcAGCCAGAAGGCGCTATC(SEQ ID NO:9)，

E133Q-R:GATAGCGCCTTCTGGCTgGGGGTGTCCTTTCTTAC(SEQ ID NO:10)。

扩增产物用DpnI酶在37℃下处理2h，然后转化入大肠杆菌DMT菌株(北京全式金生物技术有限公司)中。在LB培养基中培养经转化的大肠杆菌DMT菌株，从中提取质粒，并对质粒进行测序验证。随后，将具有正确序列的质粒转化入高表达isc操纵子的大肠杆菌中，以表达突变体蛋白。突变体蛋白的表达及纯化方法如实施例2所述。

使用SDS-PAGE来对经纯化的突变体蛋白H131N和E133Q进行检测。结果示于图3中。结果显示，本发明的突变体蛋白H131N和E133Q能够在大肠杆菌中高表达，其分子量均为约35kD，并且经上述纯化步骤后具有高纯度。

实施例4.体外活性的检测

(1)以HMBPP为底物的活性检测

在厌氧条件下，在密封的5ml色谱管中，进行IspH蛋白及其突变体的活性检测，其中，反应体系包含：150mM NaCl,20mM Tris–HCl(pH7.8),2mM DTT,1mM NADPH,1mM HMBPP,20μM铁氧化还原蛋白，5μM铁氧化还原蛋白-NADP⁺还原酶，和0.5μM如上获得的IspH蛋白或其突变体(H131N和E133Q)；总反应体积为500μl；反应条件为在37℃温育1h。

反应结束后，收集色谱管顶空的气体，并进行气相色谱-质谱分析(GC-MS)。简言之，使用配备有Agilent HP-PLOT Al2O3/S GC柱(25m,0.32mm,8.00μm,7inch cage)的Agilent Technologies 7890B GC/5977A MSD来对气体进行分析，其中，使用氦气作为载体气体，其流速为2ml/min。随后，将获自测试样品的实验数据(峰滞留时间、峰面积和质谱图等)与标准品(异戊二烯、3-甲基-1-丁烯和2-甲基-2-丁烯)的实验数据进行比较，以鉴定气体成分并进行定量分析。

另外，还在反应后对色谱管中的反应液进行分析，以确定是否产生了IPP和DMAPP。由于DMAPP在酸性条件下可以自发生成异戊二烯，因此，可通过测定反应液在酸性条件下产生的异戊二烯的量来确定反应液中DMAPP的量。简言之，在厌氧条件下，取50μL反应液于另一5ml色谱管中，用冷水稀释至500μL，并加入等体积的8M H₂SO₄；随后，立即密封色谱管，并将其在37℃温育30min。温育后，通过如上所述的GC-MS法来测定顶空气体中异戊二烯的量，以确定反应液中是否存在DMAPP。

实验结果示于表2中。结果显示，野生型IspH蛋白及其突变体(H131N和E133Q)均能够催化HMBPP转化为异戊二烯，并且三者的催化能力无显著差异。此外，结果还显示，在包含野生型IspH蛋白的反应体系中，生成了异戊烯(3-甲基-1-丁烯和2-甲基-2-丁烯)；而在包含突变体蛋白(H131N和E133Q)的反应体系中，则检测不到异戊烯的生成。此外，结果还显示，包含野生型IspH蛋白的反应液在酸性条件下生成了异戊二烯(这表明反应液中存在DMAPP)；相反地，包含突变体蛋白(H131N和E133Q)的反应液在酸性条件下基本上无异戊二烯生成(这表明反应液中基本上不存在DMAPP)。

表2：反应体系的顶空气体以及反应液经酸处理后的顶空气体的定量分析

	野生型IspH	IspH-H131N	IspH-E133Q
				反应体系产生的异戊二烯(μg L<sup>-1</sup>OD<sup>-1</sup>)	104.4	100.2	106.4
有无3-甲基-1-丁烯的生成	有	无	无
				有无2-甲基-2-丁烯的生成	有	无	无
酸处理反应液而产生的异戊二烯(μg L<sup>-1</sup>OD<sup>-1</sup>)	696.3	10.1	6.1

这些结果表明，野生型IspH能够以HMBPP底物生成异戊二烯、异戊烯、IPP和DMAPP；相比之下，突变体蛋白H131N和E133Q只能够将HMBPP转化为异戊二烯，而基本上无法生成异戊烯、IPP和DMAPP。

(2)以DMAPP/IPP为底物的活性检测

在厌氧条件下，在密封的5ml色谱管中，进行IspH蛋白及其突变体的活性检测，其中，反应体系包含：150mM NaCl,20mM Tris–HCl(pH7.8),2mM DTT,1mM NADPH,1mM DMAPP,20μM铁氧化还原蛋白,5μM铁氧化还原蛋白-NADP⁺还原酶，以及0.5μM如上获得的IspH蛋白或其突变体(H131N和E133Q)；总反应体积为500μl；反应条件为在37℃温育1h。

反应结束后，收集色谱管顶空的气体，并如上所述进行气相色谱-质谱分析(GC-MS)。实验结果显示，野生型IspH蛋白以DMAPP底物生成异戊烯，即，2-甲基-2-丁烯和3-甲基-1-丁烯(二者比例为约7:1-8:1)。相比之下，突变体蛋白H131N和E133Q已丧失了该活性，无法将DMAPP转化为异戊烯。

另外，还以IPP为底物重复了上述实验。实验结果显示，野生型IspH蛋白、突变体蛋白(H131N和E133Q)对于IPP均不具有催化活性。

为了测定野生型IspH蛋白的动力学参数，还使用不同浓度(0，0.1，0.2，0.3，0.4，0.5，1.0mM)的DMAPP来重复上述实验。实验结果示于图4中。实验结果显示，野生型IspH蛋白以DMAPP为底物生成异戊烯的最大反应活性为约6.2nmol min^-1mg^-1，Km为约275μM。

为了进一步确定实验(1)中的野生型IspH蛋白用于生成异戊烯的底物是HMBPP还是DMAPP，我们还测定了实验(1)中不同阶段，含有野生型IspH蛋白的反应体系的顶空气体的成分。结果显示，在反应早期，该反应体系的顶空气体中仅包含异戊二烯，而不包含异戊烯(2-甲基-2-丁烯和3-甲基-1-丁烯)。随着反应的进行，反应体系的顶空气体中才开始包含异戊烯。这一实验结果表明，(i)野生型IspH蛋白能够将HMBPP转化为异戊二烯；和，(ii)野生型IspH蛋白并不具有将HMBPP直接转化为异戊烯的能力；但是，它能够将HMBPP转化为DMAPP，并进一步将DMAPP转化为异戊烯。

从上述实验结果来看，本发明的野生型IspH蛋白具有三种催化活性(图5)：(a)以HMBPP为底物生成DMAPP和IPP；(b)以HMBPP为底物生成异戊二烯；和，(c)以DMAPP底物生成异戊烯(2-甲基-2-丁烯和3-甲基-1-丁烯)。相比之下，突变体蛋白H131N和E133Q仅保留了以HMBPP为底物产生异戊二烯的能力，而基本上丧失了其他活性(即，基本上不能将HMBPP转化成IPP和DMAPP，也不能将DMAPP转化成2-甲基-2-丁烯和3-甲基-1-丁烯)。

实施例5.胞内活性的检测

将本发明IspH蛋白所源自的嗜碱芽孢杆菌N16-5菌株选择作为宿主细胞，在其中过表达IspH蛋白及其突变体(H131N和E133Q)，并检测由所述宿主细胞产生的气体，以确定IspH蛋白及其突变体的胞内活性。

简言之，将编码IspH蛋白或其突变体(H131N或E133Q)的DNA片段与pLDH(乳酸脱氢酶的启动子)融合，并克隆入pMK4载体中，以构建表达载体；随后，通过原生质体转化法将构建的表达载体转入到嗜碱芽孢杆菌N16-5中，以构建重组宿主细胞。通过上述方法，构建了3种重组细胞：重组细胞WNH，其为过表达野生型IspH蛋白的嗜碱芽孢杆菌N16-5；重组细胞H131N，其为过表达突变体H131N的嗜碱芽孢杆菌N16-5；及重组细胞E133Q，其为过表达表达突变体E133Q的嗜碱芽孢杆菌N16-5。

将所构建的重组细胞接种于密封的培养瓶中，并在37℃培养12h。随后，取培养瓶中的1mL顶空气体，进行GC-MS分析。GC-MS分析的详细方法如上文所述。另外，在该实验中，将野生型嗜碱芽孢杆菌N16-5(WT)用作对照。

实验结果示于图6-7和表3中。图6显示了经培养的野生型嗜碱芽孢杆菌N16-5(WT)和重组细胞WNH(pMH)的顶空气体的GC特征谱，其中，3-甲基-1-丁烯(3M1B)，2-甲基-2-丁烯(2M2B)和异戊二烯的滞留时间分别为4.5min，5.5min，和11.3min。结果显示，野生型嗜碱芽孢杆菌N16-5能够产生异戊二烯，以及微量的2-甲基-2-丁烯和3-甲基-1-丁烯；并且，过表达野生型IspH蛋白的重组细胞WNH的2-甲基-2-丁烯和3-甲基-1-丁烯的产量显著提高，但异戊二烯的产量仅略有提升。另外，结果还显示，重组细胞H131N和E133Q的异戊烯产量与野生型嗜碱芽孢杆菌N16-5相比未发生显著变化(表3)。

表3显示了野生型嗜碱芽孢杆菌N16-5(WT)、重组细胞WNH、H131N和E133Q的异戊烯产量和异戊二烯产量的比较。结果显示，与野生型嗜碱芽孢杆菌N16-5相比，重组细胞WNH的异戊烯产量显著提高，而异戊二烯产量略有提升；重组细胞H131N和E133Q的异戊二烯产量显著提高(分别约为野生型菌株的3倍和4倍)，但异戊烯产量无显著变化。

表3：各种菌株的异戊烯产量和异戊二烯产量的比较

另外，嗜碱芽孢杆菌N16-5能够表达电子传递体，铁氧化还原蛋白和黄素氧化还原蛋白。为了观察IspH蛋白的活性对这两种电子传递体的依赖性，我们制备了嗜碱芽孢杆菌N16-5的两个突变株：Δfer，其缺失了编码铁氧化还原蛋白的fer基因；和，Δfld，其缺失了编码黄素氧化还原蛋白的fld基因。培养这两个突变株，并将其生长情况和异戊二烯的产量与野生型嗜碱芽孢杆菌N16-5进行比较。实验结果示于图8中。

另外，还使用大肠杆菌来检测IspH蛋白及其突变体(H131N和E133Q)的胞内活性。

简言之，将编码IspH蛋白和铁氧化还原蛋白的DNA片段克隆入pSTV28载体中，以构建表达载体pSTV165HF。随后，将所构建的表达载体转化入大肠杆菌Trans109菌株(TransGen Biotech)，以构建重组细胞STV165HF，其为过表达IspH蛋白和铁氧化还原蛋白的大肠杆菌。

另外，还使用类似方法构建了重组细胞STV165HF-H131N，其为过表达突变体蛋白H131N和铁氧化还原蛋白的大肠杆菌；以及，重组细胞STV165HF-E133Q，其为过表达突变体蛋白E133Q和铁氧化还原蛋白的大肠杆菌。

将所构建的重组细胞接种于密封的培养瓶中，并在37℃培养10h。随后，取培养瓶中的1mL顶空气体，进行GC-MS分析。GC-MS分析的详细方法如上文所述。

实验结果示于图9-11中。图9显示了经培养的重组大肠杆菌细胞STV165HF的顶空气体的GC特征谱(图9A)，以及标准品(3-甲基-1-丁烯，2-甲基-2-丁烯，2-甲基-1-丁烯和异戊二烯)的GC特征谱(图9B)，其中，所使用的GC检测条件为：进样口温度180℃，柱温100℃，检测器温度200℃；并且，峰a为3-甲基-1-丁烯的特征峰；峰b为2-甲基-2-丁烯的特征峰；峰c为2-甲基-1-丁烯的特征峰；峰d为异戊二烯的特征峰。

图10显示了图9A中峰1组分与标准品3-甲基-1-丁烯(图10A)、峰2组分与标准品2-甲基-2-丁烯(图10B)、峰3组分与标准品异戊二烯(图10C)的质谱分析结果的比较，其中，在图10A-10C中，横坐标轴上方的图显示了待测组分(峰1、峰2、峰3)的质谱分析结果，而横坐标轴下方的图显示了标准品(3-甲基-1-丁烯、2-甲基-2-丁烯、异戊二烯)的质谱分析结果。

图11显示了经培养的重组大肠杆菌细胞STV165HF-H131N(图11A)和STV165HF-E133Q(图11B)的顶空气体的GC特征谱，其中，所使用的GC检测条件为：进样口温度180℃，柱温130℃，检测器温度200℃。进一步，通过质谱分析来鉴定图11A-11B的各个峰中的组分。结果显示，图11A-11B所测定的顶空气体中包含异戊二烯，但不包含异戊烯。因此，这些实验结果表明，过表达突变体蛋白H131N或E133Q的重组大肠杆菌细胞均能够产生显著量的异戊二烯，且均不产生异戊烯。

上述实验结果表明，本发明的IspH蛋白及其突变体可用于构建能够生物合成异戊二烯的重组工程细菌。此外，本发明的IspH蛋白还可用于构建能够生物合成异戊烯(2-甲基-2-丁烯和3-甲基-1-丁烯)的重组工程细菌。

尽管本发明的具体实施方式已经得到详细的描述，但本领域技术人员将理解：根据已经公开的所有教导，可以对细节进行各种修改和变动，并且这些改变均在本发明的保护范围之内。本发明的全部范围由所附权利要求及其任何等同物给出。

序列表

<110> 中国科学院微生物研究所

<120> 一种用于生物合成异戊二烯和异戊烯的酶及其突变体

<130> IDC160173XSQ

<160> 10

<170> PatentIn version 3.5

<210> 1

<211> 957

<212> DNA

<213> 芽孢杆菌N16-5 (Bacillus sp. N16-5)

<400> 1

atggaggttt tgaaaatttc cccacggggt tattgttacg gcgtggtaga tgctatggtt 60

atggctaaac aagctgctga aaatccagat ttaccacggc ctatctatat attaggaatg 120

attgttcaca ataaacatgt gacagatgcc tttgatgaag agggtattat cacgcttgac 180

ggtccaaaca gattagagat tattaagcaa gttgataaag gaaccgttat ttttacggca 240

catggcgttt cgccagaagt acgaactatc gctaaagaaa aaggattaac gacgatcgat 300

gccacatgtc cagatgtaac cgtcactcac gacctaattc gaaataaaat ggaagagggc 360

tacgagttta tctacattgg taagaaagga caccccgagc cagaaggcgc tatcggtgtt 420

gctccagaca ttgtttattt agtagaaaat gttgaagatg tagaaagact tcagctgaaa 480

ggcaataaaa ttcttataac aaaccagacg acaatgagtc aatgggatgt ctctcacatc 540

attaaagctg cgaaaaacaa ataccctgaa gcagaggtcc ataacgaaat ttgcatggct 600

actcaagttc gtcaagaagc tgttgctgaa caagctggag aagctgattt actaattgtt 660

gtgggtgatc cgaaaagtaa taactctaat cgtctcgcac aagtatcgat ggacattacc 720

ggaacacctg cctacagaat agcaaatgtt aatgaactca atcttgaatg gcttaaaggg 780

atcaaaaaag tggcagtcac tgctggggct agcacaccca ctcctgttac aaaagaagtg 840

attgctttca tcgaaaagtt taatgaagat gacccccaca catgggatac gacgagtact 900

gttaaattaa caaaaattct ccctaaagtg agaaagaaaa aagcggagcg ggcctaa 957

<210> 2

<211> 318

<212> PRT

<213> 芽孢杆菌N16-5 (Bacillus sp. N16-5)

<400> 2

Met Glu Val Leu Lys Ile Ser Pro Arg Gly Tyr Cys Tyr Gly Val Val

1 5 10 15

Asp Ala Met Val Met Ala Lys Gln Ala Ala Glu Asn Pro Asp Leu Pro

20 25 30

Arg Pro Ile Tyr Ile Leu Gly Met Ile Val His Asn Lys His Val Thr

35 40 45

Asp Ala Phe Asp Glu Glu Gly Ile Ile Thr Leu Asp Gly Pro Asn Arg

50 55 60

Leu Glu Ile Ile Lys Gln Val Asp Lys Gly Thr Val Ile Phe Thr Ala

65 70 75 80

His Gly Val Ser Pro Glu Val Arg Thr Ile Ala Lys Glu Lys Gly Leu

85 90 95

Thr Thr Ile Asp Ala Thr Cys Pro Asp Val Thr Val Thr His Asp Leu

100 105 110

Ile Arg Asn Lys Met Glu Glu Gly Tyr Glu Phe Ile Tyr Ile Gly Lys

115 120 125

Lys Gly His Pro Glu Pro Glu Gly Ala Ile Gly Val Ala Pro Asp Ile

130 135 140

Val Tyr Leu Val Glu Asn Val Glu Asp Val Glu Arg Leu Gln Leu Lys

145 150 155 160

Gly Asn Lys Ile Leu Ile Thr Asn Gln Thr Thr Met Ser Gln Trp Asp

165 170 175

Val Ser His Ile Ile Lys Ala Ala Lys Asn Lys Tyr Pro Glu Ala Glu

180 185 190

Val His Asn Glu Ile Cys Met Ala Thr Gln Val Arg Gln Glu Ala Val

195 200 205

Ala Glu Gln Ala Gly Glu Ala Asp Leu Leu Ile Val Val Gly Asp Pro

210 215 220

Lys Ser Asn Asn Ser Asn Arg Leu Ala Gln Val Ser Met Asp Ile Thr

225 230 235 240

Gly Thr Pro Ala Tyr Arg Ile Ala Asn Val Asn Glu Leu Asn Leu Glu

245 250 255

Trp Leu Lys Gly Ile Lys Lys Val Ala Val Thr Ala Gly Ala Ser Thr

260 265 270

Pro Thr Pro Val Thr Lys Glu Val Ile Ala Phe Ile Glu Lys Phe Asn

275 280 285

Glu Asp Asp Pro His Thr Trp Asp Thr Thr Ser Thr Val Lys Leu Thr

290 295 300

Lys Ile Leu Pro Lys Val Arg Lys Lys Lys Ala Glu Arg Ala

305 310 315

<210> 3

<211> 318

<212> PRT

<213> 人工序列

<220>

<223> 突变体蛋白H131N

<400> 3

Met Glu Val Leu Lys Ile Ser Pro Arg Gly Tyr Cys Tyr Gly Val Val

1 5 10 15

Asp Ala Met Val Met Ala Lys Gln Ala Ala Glu Asn Pro Asp Leu Pro

20 25 30

Arg Pro Ile Tyr Ile Leu Gly Met Ile Val His Asn Lys His Val Thr

35 40 45

Asp Ala Phe Asp Glu Glu Gly Ile Ile Thr Leu Asp Gly Pro Asn Arg

50 55 60

Leu Glu Ile Ile Lys Gln Val Asp Lys Gly Thr Val Ile Phe Thr Ala

65 70 75 80

His Gly Val Ser Pro Glu Val Arg Thr Ile Ala Lys Glu Lys Gly Leu

85 90 95

Thr Thr Ile Asp Ala Thr Cys Pro Asp Val Thr Val Thr His Asp Leu

100 105 110

Ile Arg Asn Lys Met Glu Glu Gly Tyr Glu Phe Ile Tyr Ile Gly Lys

115 120 125

Lys Gly Asn Pro Glu Pro Glu Gly Ala Ile Gly Val Ala Pro Asp Ile

130 135 140

Val Tyr Leu Val Glu Asn Val Glu Asp Val Glu Arg Leu Gln Leu Lys

145 150 155 160

Gly Asn Lys Ile Leu Ile Thr Asn Gln Thr Thr Met Ser Gln Trp Asp

165 170 175

Val Ser His Ile Ile Lys Ala Ala Lys Asn Lys Tyr Pro Glu Ala Glu

180 185 190

Val His Asn Glu Ile Cys Met Ala Thr Gln Val Arg Gln Glu Ala Val

195 200 205

Ala Glu Gln Ala Gly Glu Ala Asp Leu Leu Ile Val Val Gly Asp Pro

210 215 220

Lys Ser Asn Asn Ser Asn Arg Leu Ala Gln Val Ser Met Asp Ile Thr

225 230 235 240

Gly Thr Pro Ala Tyr Arg Ile Ala Asn Val Asn Glu Leu Asn Leu Glu

245 250 255

Trp Leu Lys Gly Ile Lys Lys Val Ala Val Thr Ala Gly Ala Ser Thr

260 265 270

Pro Thr Pro Val Thr Lys Glu Val Ile Ala Phe Ile Glu Lys Phe Asn

275 280 285

Glu Asp Asp Pro His Thr Trp Asp Thr Thr Ser Thr Val Lys Leu Thr

290 295 300

Lys Ile Leu Pro Lys Val Arg Lys Lys Lys Ala Glu Arg Ala

305 310 315

<210> 4

<211> 318

<212> PRT

<213> 人工序列

<220>

<223> 突变体蛋白E133Q

<400> 4

Met Glu Val Leu Lys Ile Ser Pro Arg Gly Tyr Cys Tyr Gly Val Val

1 5 10 15

Asp Ala Met Val Met Ala Lys Gln Ala Ala Glu Asn Pro Asp Leu Pro

20 25 30

Arg Pro Ile Tyr Ile Leu Gly Met Ile Val His Asn Lys His Val Thr

35 40 45

Asp Ala Phe Asp Glu Glu Gly Ile Ile Thr Leu Asp Gly Pro Asn Arg

50 55 60

Leu Glu Ile Ile Lys Gln Val Asp Lys Gly Thr Val Ile Phe Thr Ala

65 70 75 80

His Gly Val Ser Pro Glu Val Arg Thr Ile Ala Lys Glu Lys Gly Leu

85 90 95

Thr Thr Ile Asp Ala Thr Cys Pro Asp Val Thr Val Thr His Asp Leu

100 105 110

Ile Arg Asn Lys Met Glu Glu Gly Tyr Glu Phe Ile Tyr Ile Gly Lys

115 120 125

Lys Gly His Pro Gln Pro Glu Gly Ala Ile Gly Val Ala Pro Asp Ile

130 135 140

Val Tyr Leu Val Glu Asn Val Glu Asp Val Glu Arg Leu Gln Leu Lys

145 150 155 160

Gly Asn Lys Ile Leu Ile Thr Asn Gln Thr Thr Met Ser Gln Trp Asp

165 170 175

Val Ser His Ile Ile Lys Ala Ala Lys Asn Lys Tyr Pro Glu Ala Glu

180 185 190

Val His Asn Glu Ile Cys Met Ala Thr Gln Val Arg Gln Glu Ala Val

195 200 205

Ala Glu Gln Ala Gly Glu Ala Asp Leu Leu Ile Val Val Gly Asp Pro

210 215 220

Lys Ser Asn Asn Ser Asn Arg Leu Ala Gln Val Ser Met Asp Ile Thr

225 230 235 240

Gly Thr Pro Ala Tyr Arg Ile Ala Asn Val Asn Glu Leu Asn Leu Glu

245 250 255

Trp Leu Lys Gly Ile Lys Lys Val Ala Val Thr Ala Gly Ala Ser Thr

260 265 270

Pro Thr Pro Val Thr Lys Glu Val Ile Ala Phe Ile Glu Lys Phe Asn

275 280 285

Glu Asp Asp Pro His Thr Trp Asp Thr Thr Ser Thr Val Lys Leu Thr

290 295 300

Lys Ile Leu Pro Lys Val Arg Lys Lys Lys Ala Glu Arg Ala

305 310 315

<210> 5

<211> 27

<212> DNA

<213> 人工序列

<220>

<223> 引物

<400> 5

catgccatgg aggttttgaa aatttcc 27

<210> 6

<211> 33

<212> DNA

<213> 人工序列

<220>

<223> 引物

<400> 6

ccgctcgagt ggcccgctcc gcttttttct ttc 33

<210> 7

<211> 38

<212> DNA

<213> 人工序列

<220>

<223> 引物

<400> 7

ctacattggt aagaaaggaa accccgagcc agaaggcg 38

<210> 8

<211> 38

<212> DNA

<213> 人工序列

<220>

<223> 引物

<400> 8

cgccttctgg ctcggggttt cctttcttac caatgtag 38

<210> 9

<211> 35

<212> DNA

<213> 人工序列

<220>

<223> 引物

<400> 9

gtaagaaagg acacccccag ccagaaggcg ctatc 35

<210> 10

<211> 35

<212> DNA

<213> 人工序列

<220>

<223> 引物

<400> 10

gatagcgcct tctggctggg ggtgtccttt cttac 35

Claims

1.一种多肽，其具有以4-羟基-3-甲基-2-丁烯基-焦磷酸(HMBPP)为底物产生异戊二烯的活性，所述多肽的氨基酸序列为SEQ ID NO:2、3或4。

2.一种分离的核酸，其编码权利要求1的多肽。

3.包含权利要求2的分离的核酸的载体。

4.一种细胞，其包含权利要求2的分离的核酸和/或权利要求3的载体，其中，所述分离的核酸相对于所述细胞而言是异源的或外源的。

5.权利要求4的细胞，其中，所述细胞还包含编码电子传递体和/或电子传递体传递电子所需的酶的核酸，或者所述细胞还表达电子传递体和/或电子传递体传递电子所需的酶。

6.权利要求5的细胞，其中，所述电子传递体为铁氧化还原蛋白。

7.权利要求5的细胞，其中，所述电子传递体传递电子所需的酶为铁氧化还原蛋白还原酶。

8.权利要求4的细胞，其中，所述细胞还包含编码铁氧化还原蛋白和铁氧化还原蛋白还原酶的核酸，或者所述细胞还表达铁氧化还原蛋白和铁氧化还原蛋白还原酶。

9.权利要求5的细胞，其中，所述电子传递体和/或电子传递体传递电子所需的酶相对于所述细胞而言是内源的或外源的。

10.权利要求8的细胞，其中，所述铁氧化还原蛋白和/或铁氧化还原蛋白还原酶相对于所述细胞而言是内源的或外源的。

11.权利要求8的细胞，其中，所述铁氧化还原蛋白还原酶为铁氧化还原蛋白-NADP⁺还原酶(EC 1.18.1.2)。

12.权利要求4-11任一项的细胞，其中，所述细胞还表达DXP途径的多肽。

13.权利要求12的细胞，其中，所述DXP途径的多肽选自，1-脱氧-D-木酮糖-5-磷酸合酶(DXS；EC 2.2.1.7)，1-脱氧-D-木酮糖-5-磷酸还原异构酶(DXR；EC 1.1.1.267)，2-C-甲基-D-赤藓醇4-磷酸胞苷酰转移酶(MCT；EC 2.7.7.60)，4-(胞苷5'-二磷酸)-2-C-甲基-D-赤藓醇激酶(CMK；EC 2.7.1.148)，2-C-甲基-D-赤藓醇2,4-环二磷酸合酶(MCS；EC 4.6.1.12)，4-羟基-3-甲基-2-(E)-丁烯基二磷酸合酶(IspG；EC 1.17.7.1)，以及其任何组合。

14.权利要求12的细胞，其中，所述DXP途径的多肽相对于所述细胞而言是内源的或外源的。

15.权利要求4的细胞，其中，所述细胞表达或者不表达异戊二烯合酶(IspS；EC4.2.3.27)。

16.权利要求4的细胞，其中，所述细胞为原核细胞。

17.权利要求4的细胞，其中，所述细胞为大肠杆菌或芽孢杆菌或蓝藻。

18.一种组合物，其包含权利要求1的多肽、HMBPP、NADPH或NADH、电子传递体，以及电子传递体传递电子所需的酶。

19.权利要求18的组合物，所述酶为铁氧化还原蛋白还原酶。

20.权利要求18的组合物，其中，所述电子传递体为铁氧化还原蛋白。

21.权利要求18的组合物，其中，所述电子传递体传递电子所需的酶为铁氧化还原蛋白还原酶。

22.权利要求18的组合物，其中，所述组合物包含所述多肽、HMBPP、NADPH、铁氧化还原蛋白和铁氧化还原蛋白还原酶。

23.权利要求22的组合物，其中，所述铁氧化还原蛋白还原酶为铁氧化还原蛋白-NADP⁺还原酶。

24.一种组合物，其包含权利要求1的多肽、DMAPP、NADPH或NADH、电子传递体，以及电子传递体传递电子所需的酶，其中，所述多肽的氨基酸序列如SEQ ID NO:2所示。

25.权利要求24的组合物，其中，所述电子传递体为铁氧化还原蛋白。

26.权利要求24的组合物，其中，所述电子传递体传递电子所需的酶为铁氧化还原蛋白还原酶。

27.权利要求24的组合物，其中，所述组合物包含所述多肽、DMAPP、NADPH、铁氧化还原蛋白和铁氧化还原蛋白还原酶。

28.权利要求27的组合物，其中，所述铁氧化还原蛋白还原酶为铁氧化还原蛋白-NADP⁺还原酶。

29.一种生产异戊二烯的方法，其包括，使用权利要求1的多肽，将HMBPP转化为异戊二烯。

30.权利要求29的方法，其中，所述方法包括，(a)将所述多肽、HMBPP、NADPH或NADH、电子传递体和电子传递体传递电子所需的酶混合并温育；和，(b)收集步骤(a)产生的异戊二烯。

31.权利要求30的方法，其中，所述电子传递体为铁氧化还原蛋白。

32.权利要求30的方法，其中，所述电子传递体传递电子所需的酶为铁氧化还原蛋白还原酶。

33.权利要求32的方法，其中，所述铁氧化还原蛋白还原酶为铁氧化还原蛋白-NADP⁺还原酶。

34.权利要求30的方法，其中，将所述多肽、HMBPP、NADPH或NADH、电子传递体和电子传递体传递电子所需的酶混合并在20-40℃进行温育。

35.权利要求30的方法，其中，将所述多肽、HMBPP、NADPH或NADH、电子传递体和电子传递体传递电子所需的酶混合并在室温或37℃进行温育。

36.一种生产异戊二烯的方法，其包括，(a)培养细胞，所述细胞表达外源导入的权利要求1的多肽；和，(b)收集步骤(a)产生的异戊二烯。

37.权利要求36的方法，其中，所述细胞还表达电子传递体和/或电子传递体传递电子所需的酶。

38.权利要求37的方法，其中，所述电子传递体为铁氧化还原蛋白。

39.权利要求37的方法，其中，所述电子传递体传递电子所需的酶为铁氧化还原蛋白还原酶。

40.权利要求36的方法，其中，所述细胞还表达铁氧化还原蛋白和铁氧化还原蛋白还原酶。

41.权利要求37的方法，其中，所述电子传递体和/或电子传递体传递电子所需的酶相对于所述细胞而言是内源的或外源的。

42.权利要求40的方法，其中，所述铁氧化还原蛋白和/或铁氧化还原蛋白还原酶相对于所述细胞而言是内源的或外源的。

43.权利要求40的方法，其中，所述铁氧化还原蛋白还原酶为铁氧化还原蛋白-NADP⁺还原酶(EC 1.18.1.2)。

44.权利要求36-43任一项的方法，其中，所述细胞还表达DXP途径的多肽。

45.权利要求44的方法，其中，所述DXP途径的多肽选自，1-脱氧-D-木酮糖-5-磷酸合酶(DXS；EC 2.2.1.7)，1-脱氧-D-木酮糖-5-磷酸还原异构酶(DXR；EC 1.1.1.267)，2-C-甲基-D-赤藓醇4-磷酸胞苷酰转移酶(MCT；EC 2.7.7.60)，4-(胞苷5'-二磷酸)-2-C-甲基-D-赤藓醇激酶(CMK；EC 2.7.1.148)，2-C-甲基-D-赤藓醇2,4-环二磷酸合酶(MCS；EC 4.6.1.12)，4-羟基-3-甲基-2-(E)-丁烯基二磷酸合酶(IspG；EC 1.17.7.1)，以及其任何组合。

46.权利要求44的方法，其中，所述DXP途径的多肽相对于所述细胞而言是内源的或外源的。

47.权利要求36的方法，其中，所述细胞表达或者不表达异戊二烯合酶(IspS；EC4.2.3.27)。

48.权利要求36的方法，其中，所述细胞为原核细胞。

49.权利要求36的方法，其中，所述细胞为大肠杆菌或芽孢杆菌或蓝藻。

50.一种生产异戊烯的方法，其包括，使用权利要求1的多肽，将DMAPP转化为异戊烯；其中，所述多肽的氨基酸序列如SEQ ID NO:2所示。

51.权利要求50的方法，其中，所述方法包括，(a)将所述多肽、DMAPP、NADPH或NADH、电子传递体和电子传递体传递电子所需的酶混合并温育；和，(b)收集步骤(a)产生的异戊烯。

52.权利要求51的方法，其中，所述电子传递体为铁氧化还原蛋白。

53.权利要求51的方法，其中，所述电子传递体传递电子所需的酶为铁氧化还原蛋白还原酶。

54.权利要求53的方法，其中，所述铁氧化还原蛋白还原酶为铁氧化还原蛋白-NADP⁺还原酶。

55.权利要求51的方法，其中，将所述多肽、DMAPP、NADPH或NADH、电子传递体和电子传递体传递电子所需的酶混合并在20-40℃进温育。

56.权利要求51的方法，其中，将所述多肽、DMAPP、NADPH或NADH、电子传递体和电子传递体传递电子所需的酶混合并在室温或37℃进温育。

57.权利要求50的方法，其中，所述方法生产3-甲基-1-丁烯和/或2-甲基-2-丁烯。

58.一种生产异戊烯的方法，其包括，(a)培养细胞，所述细胞表达外源导入的权利要求1的多肽，其中，所述多肽的氨基酸序列如SEQ ID NO:2所示；和，(b)收集步骤(a)产生的异戊烯。

59.权利要求58的方法，其中，所述细胞还表达电子传递体和/或电子传递体传递电子所需的酶。

60.权利要求59的方法，其中，所述电子传递体为铁氧化还原蛋白。

61.权利要求59的方法，其中，所述电子传递体传递电子所需的酶为铁氧化还原蛋白还原酶。

62.权利要求59的方法，其中，所述细胞还表达铁氧化还原蛋白和铁氧化还原蛋白还原酶。

63.权利要求59的方法，其中，所述电子传递体和/或电子传递体传递电子所需的酶相对于所述细胞而言是内源的或外源的。

64.权利要求62的方法，其中，所述铁氧化还原蛋白和/或铁氧化还原蛋白还原酶相对于所述细胞而言是内源的或外源的。

65.权利要求62的方法，其中，所述铁氧化还原蛋白还原酶为铁氧化还原蛋白-NADP⁺还原酶(EC 1.18.1.2)。

66.权利要求58-65任一项的方法，其中，所述细胞还表达DXP途径的多肽。

67.权利要求66的方法，其中，所述DXP途径的多肽选自，1-脱氧-D-木酮糖-5-磷酸合酶(DXS；EC 2.2.1.7)，1-脱氧-D-木酮糖-5-磷酸还原异构酶(DXR；EC 1.1.1.267)，2-C-甲基-D-赤藓醇4-磷酸胞苷酰转移酶(MCT；EC 2.7.7.60)，4-(胞苷5'-二磷酸)-2-C-甲基-D-赤藓醇激酶(CMK；EC 2.7.1.148)，2-C-甲基-D-赤藓醇2,4-环二磷酸合酶(MCS；EC 4.6.1.12)，4-羟基-3-甲基-2-(E)-丁烯基二磷酸合酶(IspG；EC 1.17.7.1)，以及其任何组合。

68.权利要求66的方法，其中，所述DXP途径的多肽相对于所述细胞而言是内源的或外源的。

69.权利要求58-65任一项的方法，其中，所述细胞还表达异戊烯基二磷酸异构酶(IDI；EC 5.3.3.2)。

70.权利要求69的方法，其中，所述异戊烯基二磷酸异构酶相对于所述细胞而言是内源的或外源的。

71.权利要求58的方法，其中，所述细胞为原核细胞。

72.权利要求58的方法，其中，所述细胞为大肠杆菌或芽孢杆菌或蓝藻。

73.权利要求58的方法，其中，所述方法生产3-甲基-1-丁烯和/或2-甲基-2-丁烯。

74.一种制备权利要求1的多肽的方法，其包括，(a)培养宿主细胞，所述宿主细胞包含并表达编码所述多肽的核酸；和，(b)收集所述细胞表达的所述多肽。