WO2013129393A1 - 炭化水素合成酵素遺伝子及びその利用 - Google Patents

炭化水素合成酵素遺伝子及びその利用 Download PDF

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WO2013129393A1
WO2013129393A1 PCT/JP2013/054956 JP2013054956W WO2013129393A1 WO 2013129393 A1 WO2013129393 A1 WO 2013129393A1 JP 2013054956 W JP2013054956 W JP 2013054956W WO 2013129393 A1 WO2013129393 A1 WO 2013129393A1
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protein
hydrocarbon
aldehyde compound
seq
gene
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PCT/JP2013/054956
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村松　正善
伊藤　正和
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トヨタ自動車株式会社
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    • C—CHEMISTRY; METALLURGY
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    • C12P5/00—Preparation of hydrocarbons or halogenated hydrocarbons
    • C12P5/02—Preparation of hydrocarbons or halogenated hydrocarbons acyclic
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    • C12Y102/01—Oxidoreductases acting on the aldehyde or oxo group of donors (1.2) with NAD+ or NADP+ as acceptor (1.2.1)
    • C12Y102/01048—Long-chain-aldehyde dehydrogenase (1.2.1.48)
    • C—CHEMISTRY; METALLURGY
    • C12—BIOCHEMISTRY; BEER; SPIRITS; WINE; VINEGAR; MICROBIOLOGY; ENZYMOLOGY; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING
    • C12Y—ENZYMES
    • C12Y601/00—Ligases forming carbon-oxygen bonds (6.1)

Definitions

  • the present invention relates to a hydrocarbon synthase gene having novel characteristics and use of the gene.
  • Microorganisms that can synthesize hydrocarbons such as alkanes are known. By identifying and isolating genes involved in hydrocarbon synthesis from microorganisms capable of synthesizing hydrocarbons, development of recombinant microorganisms with excellent hydrocarbon synthesis ability, development of hydrocarbon synthesis systems using such recombinant microorganisms, etc. You can expect.
  • Patent Document 1 WO2006 / 109558
  • a novel microalgae Pseudochoricystis ellipsoidea, Pseudochoricystis genus or Choricystis genus having a hydrocarbon-producing ability is described.
  • a method for collecting hydrocarbons from a culture by culturing microalgae having the ability to produce hydrocarbons is disclosed.
  • Patent Document 2 Japanese Patent Application Laid-Open No. 2010-528627 discloses a recombinant yeast in which a gene for converting an aldehyde to an alkane is incorporated into yeast or the like, and a method for producing alkane using the recombinant yeast. Yes.
  • Patent Document 3 Japanese Patent Publication No. 2011-520455 discloses an alkane synthase gene and an aldehyde synthase gene derived from Synechococcus elongatus, and a method for producing alkane and aldehyde using these genes is disclosed. Has been.
  • Patent Document 4 Japanese Patent Laid-Open No.
  • 09-322780 discloses a gene encoding a protein involved in the activity of fatty aldehyde decarbonylase derived from Arabidopsis thaliana, and a modified epicuticular wax composition using this is disclosed. The transformed plants shown are disclosed.
  • Non-Patent Document 1 (Process Biochemistry, 41, (2006), pp. 1001-1014) describes hydrocarbon synthesis pathways in microorganisms.
  • Non-patent document 2 (Appl.lMicrobiol. Biotechnol., (2005), 66: p.486-496) describes the biosynthesis of hydrocarbons in Botryococcus braunii, a kind of algae, as in Patent Document 1.
  • Patent Document 3 Proc. Natl. Acad. Sci., (1994), Vol. 91, ⁇ p. 10000-10004 describes a fly-derived gene in which an aldehyde is a hydrocarbon ((Z) -9 A cytochrome P450 gene that converts to -trichosene) is disclosed.
  • Non-Patent Document 1 and the flies disclosed in Non-Patent Document 3 have low alkane production and are not expected to be applied to practical levels.
  • the alga disclosed in Non-Patent Document 2 and Patent Document 1 have a slow alkane production reaction and accumulate alkanes in cells. For this reason, even if the algae disclosed in Non-Patent Document 2 and Patent Document 1 are used, it takes a long time for alkane production, and a process for purifying alkane from the cell is necessary, so that alkane cannot be synthesized at low cost There is.
  • an object of the present invention is to provide a hydrocarbon synthase gene having a novel function excellent in hydrocarbon synthesizing ability such as alkane and the use thereof.
  • a gene encoding a protein comprising an amino acid sequence having the motif sequence shown in SEQ ID NO: 1 and having an activity of synthesizing a hydrocarbon having one fewer carbon atoms from an aldehyde compound.
  • A a protein comprising an amino acid sequence described in any one of even numbers among SEQ ID NOs: 3 to 32 and 65 to 170
  • the gene according to (1) which is derived from a microorganism belonging to the genus Klebsiella or derived from Escherichia coli.
  • the protein, the coenzyme, and the aldehyde compound are obtained by culturing a transformant into which the gene according to any one of (1) to (5) is introduced in a solution containing the aldehyde compound.
  • the present invention it is possible to provide a hydrocarbon synthase gene having an excellent activity of converting an aldehyde compound into a hydrocarbon having one fewer carbon atoms than a conventionally known aldehyde decarbonylase gene.
  • a hydrocarbon synthase gene according to the present invention it is possible to produce a hydrocarbon with high efficiency and low cost using an aldehyde compound as a substrate.
  • FIG. 6 is a characteristic diagram showing the results of measuring the “activity for synthesizing hydrocarbons having one less carbon number from an aldehyde compound” of transformants prepared for 10 types of genes derived from Klebsiella sp. It is a GC / MS analysis chart figure about a vector control strain and a gene02 introduction strain.
  • FIG. 6 is a characteristic diagram showing the results of measuring the “activity for synthesizing hydrocarbons having one less carbon number from an aldehyde compound” of transformants prepared for five types of genes of E. coli W3110 strain.
  • FIG. 1 Shown are the results of measuring the "activity of synthesizing hydrocarbons having one less carbon number from aldehyde compounds" using various aldehyde compounds as substrates using the supernatant of disrupted transformants introduced with gene02 derived from Klebsiella sp.
  • FIG. It is the GC / MS analysis chart figure which measured the alkane of carbon number 13 about the vector control strain and the gene02 introduction strain by using the aldehyde compound of carbon number 14 as a substrate. It is a photograph showing the results of SDS-PAGE of a disrupted solution of transformed Escherichia coli and a purified His-tag protein solution.
  • FIG. 6 is a GC / MS analysis chart showing the results of in-vitro alkane synthesis using purified His-tag protein. It is a characteristic view which shows the result of having compared the alkane synthesis ability when NADH or NADPH is used as a coenzyme. It is a GC / MS analysis chart figure about the transformed yeast which introduce
  • the hydrocarbon synthesis gene according to the present invention includes an amino acid sequence having the motif sequence shown in SEQ ID NO: 1, and “the activity of synthesizing a hydrocarbon having one less carbon number from an aldehyde compound (hereinafter, this activity is referred to as hydrocarbon”). It is a gene encoding a protein having "synthetic activity").
  • the hydrocarbon synthesis activity is an enzyme activity that can synthesize a hydrocarbon having one less carbon number from an aldehyde compound, and can be restated as an enzyme activity that removes a carbonyl group from an aldehyde compound.
  • the hydrocarbon synthesis activity may include a reaction that generates carbon monoxide, carbon dioxide, carbonic acid, formic acid, water, and the like as by-products.
  • the motif sequence shown in SEQ ID NO: 1 is a sequence called a glutamic acid active site of aldehyde dehydrogenase (Description: Aldehyde dehydrogenases glutamic acid active site).
  • the first Xaa is L, I, V, M, F, G, or A in one letter of amino acid.
  • the third Xaa is L, I, M, S, T, A, or C in the single letter code for amino acids.
  • the fourth Xaa is either G or S in the single letter code for amino acids.
  • the sixth Xaa is any one of K, N, L, and M in the amino acid one-letter code.
  • the seventh Xaa is one of S, A, D, or N in the one-letter code of amino acid.
  • the 8th Xaa is one of T, A, P, F, or V in the single letter code of amino acid.
  • the hydrocarbon synthesis gene according to the present invention comprises a protein having an amino acid sequence further having the motif sequence shown in SEQ ID NO: 2 on the C-terminal side than the motif sequence shown in SEQ ID NO: 1 and having hydrocarbon synthesis activity. It is preferably a gene that encodes.
  • the motif sequence shown in SEQ ID NO: 2 is a hydrocarbon synthesis gene according to the present invention, and when a plurality of proteins encoded by genes derived from Klebsiella microorganisms are subjected to multiple alignment analysis of their amino acid sequences. Corresponds to the amino acid sequence of a highly conserved region.
  • the first Xaa is P, A, or F in the single letter code of amino acid.
  • the second Xaa is one of F, H, or V in a single letter of amino acid.
  • the third Xaa is either G or A in the amino acid single letter code.
  • the fifth Xaa may be any amino acid.
  • the sixth Xaa is one of K, G, or R in the one-letter code of amino acid.
  • the seventh Xaa may be any amino acid.
  • the 10th Xaa may be any amino acid.
  • the 11th Xaa is either G or H in the single letter code for amino acids.
  • the twelfth Xaa is one of R, K, or G in the one-letter code of amino acid.
  • the 13th Xaa is one of F, D, P, or A in amino acid one-letter code.
  • the hydrocarbon synthesis gene according to the present invention may be any organism-derived gene.
  • the hydrocarbon synthesis gene according to the present invention is identified from gram-negative bacteria, gram-positive bacteria, fungi, plants, and animals.
  • examples of gram-negative bacteria include Escherichia coli (E. coli) and Pseudomonas putida.
  • examples of gram-positive bacteria include Bacillus subtilis (Bacillus subtilis), Corynebacterium glutamicum, and Lactobacillus reuteri.
  • Bacillus subtilis Bacillus subtilis
  • Lactobacillus reuteri examples of fungi include Saccharomyces cerevisiae, Candida tropicalis, Debaryomyces hansenii, Pichia pastoris, and Aspergillus oryzae.
  • examples of plants include Zeamays and Arabidopsis thaliana.
  • examples of the animal include Drosophila melanogaster, Rattus nornorgicus, and Homo sapiens.
  • the hydrocarbon synthesis gene according to the present invention can be isolated from these various organisms and used appropriately.
  • aldehyde dehydrogenase gene encoding the protein having the motif sequence shown in SEQ ID NO: 1 can be searched from a database storing gene information such as NCBI (National Center for Biotechnology Information).
  • NCBI National Center for Biotechnology Information
  • the searched genes can be identified by the ACCESSION number as follows.
  • BAE77705, BAA35791, BAA14869, BAA14992, BAA15032, BAA16524, BAE77705, BAA15538 and BAA15073 can be identified as genes derived from Escherichia coli K-12 W3110 as hydrocarbon synthesis genes according to the present invention.
  • NP_388129, NP_389813, NP_390984, NP_388203, NP_388616, NP_391658, NP_391762, NP_391865 and NP_391675 can be identified as genes derived from Bacillus subtilis strain 168 as the hydrocarbon synthesis genes according to the present invention.
  • NP_599351, NP_599725, NP_601988, NP_599302, NP_601867, and NP_601908 can be identified as the hydrocarbon synthesis genes according to the present invention as genes derived from Corynebacterium glutamineum ATCC13032.
  • YP_001270647 can be identified as a hydrocarbon synthesis gene according to the present invention.
  • NP_010996, NP_011904, NP_015264, NP_0113828, NP_009560, NP_015019, NP_013893, NP_013892 and NP_011902 can be identified as genes derived from Saccharomyces cerevisiae as hydrocarbon synthesis genes according to the present invention.
  • XP_002548035, XP_002545751, XP_002547036, XP_002547030, XP_002550712, XP_002547024, XP_002550173, XP_002546610 and XP_002550289 can be identified as the genes derived from Candida tropicalis MYA-3404 as the hydrocarbon synthesis genes according to the present invention.
  • XP_460395, XP_457244, XP_457404, XP_457750, XP_461954, XP_462433, XP_461708 and XP_462528 can be identified as the hydrocarbon synthesis genes according to the present invention.
  • XP_002489360 As a gene derived from Pichia pastoris GS115, XP_002489360, XP_002493450, XP_002491418, XP_002493229, XP_002490175, XP_002491360 and XP_002491779 can be identified as the hydrocarbon synthesis genes according to the present invention.
  • a gene derived from Schizosaccharomyces pombe As a gene derived from Schizosaccharomyces pombe, NP_593172, NP_593499, and NP_594582 can be identified as hydrocarbon synthesis genes according to the present invention.
  • NP_001150417 genes derived from Zeamays, NP_001150417, NP_001105047, NP_001147173, NP_001169123, NP_001105781, NP_001157807, NP_001157804, NP_001105891, NP_001105046, NP_001105576, NP_001105589, NP_001168661, NP_001149126 and NP_001148092 it can.
  • NP_564204, NP_001185399, NP_178062, NP_001189589, NP_566749, NP_190383, NP_187321, NP_190400, NP_001077676 and NP_175812 can be identified as the hydrocarbon synthesis genes according to the present invention.
  • NP_733183, NP_609285, NP_001014665, NP_649099, NP_001189159, NP_610285, and NP_610107 can be identified as genes derived from Drosophila melanogaster as hydrocarbon synthesis genes according to the present invention.
  • NP_001006999, XP_001067816, XP_001068348, XP_001068253, NP_113919, XP_001062926, NP_071609, NP_071852, NP_058968, NP_001011975, NP_115792, NP_001178017, NP_001178707, XP_0010348, XP_0010348, XP_0010348, XP_0010348 Can be identified as NP_036322, NP_001193826, NP_001029345, NP_000684, NP_000680, NP_000683, NP_000681, NP_001071, NP_000687, NP_001180409, NP_001173, NP_000682, NP_000373, NP_001154976, NP_000685 and NP_000686 and NP_000
  • the gene encoding the protein having the motif sequence shown in SEQ ID NO: 1 is identified based on the genome sequence information by clarifying the genome sequence of an organism whose genome sequence is not registered in a database such as NCBI and is unknown. be able to. More specifically, the genome sequence of Klebsiella sp. NBRC100048 strain is analyzed according to a standard method, and a gene encoding a protein having the motif sequence shown in SEQ ID NO: 1 can be identified based on this genome sequence information.
  • genes for hydrocarbon synthesis according to the present invention are named gene01 to gene10 for convenience.
  • the base sequences of the coding regions in these genes 01 to 10 and the amino acid sequences encoded thereby are summarized in Table 1 below.
  • examples of the hydrocarbon synthesis gene according to the present invention registered in the NCBI database described above include Corynebacterium glutamicum ATCC13032-derived, Lactobacillus reuteri DSM20016-derived, Saccharomyces cerevisiae-derived, Candida tropicalis MYA-3404-derived, Debaryomyces hansenii CBS767-derived, Pichia
  • the genes derived from pastoris GS115, Schizosaccharomyces pombe, Aspergillus oryzae RIB40, Zea mays, Arabidopsis thaliana, Drosophila melanogaster, Rattus norvegicus and Homo sapiens the nucleotide sequence of the coding region and the amino acid sequence encoded thereby Table 3 below summarizes.
  • the “gene name” column describes the gene ID in Kyoto Encyclopedia of Genes and Genomes (KEGG).
  • hydrocarbon synthesis gene according to the present invention is not limited to those specified by the above-described gene name, base sequence and amino acid sequence.
  • one or more amino acids are substituted, deleted, inserted or added in the amino acid sequence described in any one of the even numbers among SEQ ID NOS: 3-32 and 65-170. It may be a gene that consists of an amino acid sequence and encodes a protein having hydrocarbon synthesis activity.
  • the plurality of amino acids means, for example, 2 to 100, preferably 2 to 80, more preferably 2 to 50, still more preferably 2 to 15 amino acids.
  • the hydrocarbon synthesis gene according to the present invention is 70% or more, preferably 80% or more, more preferably, relative to the amino acid sequence of any one of SEQ ID NOs: 3 to 32 and 65 to 170. It may be a gene encoding a protein having an amino acid sequence having an identity of 85% or more, more preferably 90% or more, and most preferably 98% or more, and having a hydrocarbon synthesis activity.
  • the identity between sequences means a value (ratio) indicating the degree of coincidence between two amino acid sequences using sequence similarity search software such as BLAST, PSI-BLAST, and HMMER with default settings.
  • the hydrocarbon synthesis gene according to the present invention is stringent with respect to at least a part of a polynucleotide consisting of a complementary strand of the base sequence described in the odd number of any one of SEQ ID NOs: 3 to 32 and 65 to 170. It may be a protein encoded by a polynucleotide that hybridizes under various conditions and a gene encoding a protein having hydrocarbon synthesis activity.
  • stringent conditions as used herein means the conditions under which a so-called specific hybrid is formed and a non-specific hybrid is not formed, and is appropriately determined with reference to, for example, Molecular Cloning: A Laboratory Manual (Third Edition) can do.
  • the stringency can be set according to the temperature at the time of Southern hybridization and the salt concentration contained in the solution, and the temperature at the time of the washing step of Southern hybridization and the salt concentration contained in the solution. More specifically, as stringent conditions, for example, the sodium concentration is 25 to 500 mM, preferably 25 to 300 mM, and the temperature is 42 to 68 ° C., preferably 42 to 65 ° C. More specifically, it is 5 ⁇ SSC (83 mM NaCl, 83 mM sodium citrate), and the temperature is 42 ° C.
  • the term “at least a part of the polynucleotide” means to include both the entire polynucleotide composed of a complementary strand of a predetermined base sequence and the entire continuous portion of the polynucleotide composed of the complementary strand.
  • the introduction of a mutation into a predetermined amino acid sequence can be performed by modifying the base sequence of the above-mentioned hydrocarbon synthesis gene by a technique known in the art.
  • Mutation can be introduced into a nucleotide sequence by a known method such as Kunkel method or Gapped duplex method or a method according thereto, for example, a mutation introduction kit using site-directed mutagenesis (for example, Mutant- Mutations are introduced using K, Mutant-G (both trade names, manufactured by TAKARA Bio Inc.) or the like, or using LA PCR-in-vitro Mutagenesis series kits (trade name, manufactured by TAKARA Bio Inc.).
  • EMS ethyl methanesulfonic acid
  • 5-bromouracil 2-aminopurine
  • hydroxylamine N-methyl-N'-nitro-N nitrosoguanidine
  • other carcinogenic compounds are representative.
  • a method using a chemical mutagen such as that described above may be used, or a method using radiation treatment or ultraviolet treatment represented by X-rays, alpha rays, beta rays, gamma rays and ion beams may be used.
  • Whether a gene consisting of a predetermined base sequence encodes a protein having a hydrocarbon synthesis activity can be determined by preparing an expression vector in which the gene is inserted between an appropriate promoter and terminator and using this expression vector.
  • a suitable host may be transformed and the hydrocarbon synthesis activity of the expressed protein may be measured.
  • the transformant in order to measure the hydrocarbon synthesis activity, is cultured in a solution containing an aldehyde compound serving as a substrate, and hydrocarbons derived from the aldehyde compound (having one carbon atom more than the substrate aldehyde compound). The amount of hydrocarbons) may be measured by a gas chromatography / mass spectrometer.
  • the hydrocarbon synthesis gene according to the present invention described above is incorporated into an appropriate expression vector and introduced into a host.
  • the host is not particularly limited as long as it is an organism capable of expressing the hydrocarbon synthesis gene of the present invention.
  • hosts include Escherichia such as Escherichia ⁇ coli, Bacillus genus such as Bacillus subtilis, Pseudomonas ⁇ ⁇ putida such as Pseudomonas putida, and Rhizobium melil.
  • Bacteria belonging to the genus Rhizobium, and yeasts such as Saccharomyces cerevisiae, Schizosaccharomyces pombe, and fungi including filamentous fungi.
  • the expression vector is preferably composed of a promoter, a ribosome binding sequence, the above-described gene, and a transcription termination sequence as well as being capable of autonomous replication in the bacterium.
  • the expression vector may contain a gene that controls promoter activity.
  • Escherichia coli any conventionally known strain such as Escherichia coli BL21 (DE3) strain, K12 strain, DH1 strain, JM109 strain can be used.
  • Escherichia coli so-called K strains such as K12 strains and strains prepared from K12 strains can be used.
  • Bacillus subtilis include Bacillus subtilis 168 strain.
  • Any promoter may be used as long as it can be expressed in a host such as E. coli.
  • those derived from Escherichia coli such as trp promoter, lac promoter, PL promoter, PR promoter, and those derived from phage such as T7 promoter are used.
  • artificially designed and modified promoters such as the tac promoter may be used.
  • the method for introducing the expression vector is not particularly limited as long as it is a method for introducing DNA into bacteria.
  • a method using calcium ions [Cohen, S.N., et al .: Proc. Natl. Acad. Sci., USA, 69: 2110-2114 (1972)], electroporation method and the like can be mentioned.
  • the yeast that can be used as a host is not particularly limited, but is not limited to Candida genus yeast such as Candida Shehatae, Pichia genus yeast such as Pichia stipitis, Pachysolen genus yeast such as Pachysolen tannophilus, Saccharomyces genus yeast such as Saccharomyces cerevisiae And yeast belonging to the genus Schizosaccharomyces such as Schizosaccharomyces pombe, and Saccharomyces cerevisiae is particularly preferred.
  • Candida genus yeast such as Candida Shehatae
  • Pichia genus yeast such as Pichia stipitis
  • Pachysolen genus yeast such as Pachysolen tannophilus
  • Saccharomyces genus yeast such as Saccharomyces cerevisiae
  • yeast belonging to the genus Schizosaccharomyces such as Schizosaccharomyces pombe, and Saccharomyces cerevisiae
  • an appropriate promoter having high transcription activity is used.
  • a promoter is not particularly limited.
  • the promoter of glyceraldehyde 3-phosphate dehydrogenase gene (TDH3), the promoter of 3-phosphoglycerate kinase gene (PGK1), and the hyperosmotic response 7 gene (HOR7) Promoters can be used.
  • the pyruvate decarboxylase gene (PDC1) promoter is preferred because of its high ability to highly express a downstream target gene.
  • downstream genes can be strongly expressed by using gal1 promoter, gal10 promoter, heat shock protein promoter, MF ⁇ 1 promoter, PHO5 promoter, GAP promoter, ADH promoter, AOX1 promoter, and the like.
  • any conventionally known method known as a yeast transformation method can be applied. Specifically, for example, electroporation method “Meth. Enzym., 194, p182 (1990)”, spheroplast method “Proc. Natl. Acad. Sci. USA, 75 p1929 (1978)”, lithium acetate method “J. Bacteriology, 153, p163 (1983)”, Proc. Natl. Acad. Sci. USA, 75 p1929 (1978), Methods in yeast genetics, 2000 Edition: A Cold Spring Harbor Laboratory Course Manual Although it can be implemented, it is not limited to this.
  • hydrocarbon synthesis gene according to the present invention As described above, recombinant organisms into which the hydrocarbon synthesis gene according to the present invention has been introduced, for example, recombinant Escherichia coli, recombinant yeast, if the above-mentioned hydrocarbon synthesis gene is expressed and aldehyde compounds and coenzymes such as NADH are present, A hydrocarbon can be synthesized from the aldehyde compound.
  • the protein encoded by the hydrocarbon synthesis gene according to the present invention can use NADH as a coenzyme for hydrocarbon synthesis activity. Since NADH is abundant in cells, the amount of coenzyme does not become a rate-limiting factor in the hydrocarbon synthesis reaction.
  • a recombinant organism into which the hydrocarbon synthesis gene according to the present invention has been introduced such as recombinant Escherichia coli and recombinant yeast, can synthesize hydrocarbons with excellent reaction efficiency.
  • the protein encoded by the hydrocarbon synthesis gene according to the present invention can also be used as a coenzyme for the deviation of NADH and NADPH.
  • the synthesizable hydrocarbons are both a hydrocarbon having a chain structure (chain hydrocarbon) and a hydrocarbon having a ring structure (cyclic hydrocarbon).
  • the hydrocarbon having a chain structure may have a structure having one or more branches.
  • the branch include alkyl groups such as a methyl group, an ethyl group, a propyl group, and a butyl group (including a tert-butyl group), an alkynyl group, and an alkenyl group.
  • the branch includes a chloromethyl group, an acetyl group, a 2-pyridyl group, a hydroxyphenyl group, and an aminoacetyl group.
  • the hydrocarbon to be synthesized may be a saturated hydrocarbon (alkane) or an unsaturated hydrocarbon (alkene and alkyne).
  • the carbon number of the hydrocarbon to be synthesized is not particularly limited, but is preferably about 5 to 20 carbon atoms that are liquid at room temperature.
  • the hydrocarbons to be synthesized are preferably saturated hydrocarbons having 10 to 20 carbon atoms, more preferably saturated hydrocarbons having 12 to 14 carbon atoms, especially those having 13 carbon atoms in consideration of the use as diesel fuel. Saturated hydrocarbons are most preferred. More specifically, examples of the hydrocarbon to be synthesized include dodecane having 12 carbon atoms, tridecane having 13 carbon atoms, and tetradecane having 14 carbon atoms.
  • an aldehyde compound used as a substrate suitably, when synthesize
  • the hydrocarbon synthesis gene according to the present invention can also be used in a hydrocarbon production method in vitro.
  • a recombinant organism into which the hydrocarbon synthesis gene according to the present invention has been introduced for example, a disruption solution obtained by disrupting recombinant Escherichia coli or recombinant yeast, or a fraction containing a protein encoded by the hydrocarbon synthesis gene from the disruption solution
  • Hydrocarbons can be synthesized in vitro using the extracted liquid. That is, hydrocarbons can be synthesized in vitro by adding an aldehyde compound (a coenzyme such as NADH, if necessary) as a substrate to the disrupted solution or the extract.
  • an aldehyde compound a coenzyme such as NADH, if necessary
  • the crushing solution and the extract contain abundant coenzymes such as NADH, the addition of an aldehyde compound serving as a substrate to the crushing solution and the extract is sufficient. In many cases, it is not necessary to add an enzyme. In other words, when the hydrocarbon synthesis gene according to the present invention is used, it is possible to efficiently synthesize hydrocarbons without requiring expensive coenzymes such as NADPH.
  • the protein encoded by the hydrocarbon synthesis gene according to the present invention is roughly purified or purified according to a conventional method, and the roughly purified or purified protein is mixed with a substrate aldehyde compound and a coenzyme such as NADH, in Hydrocarbons can be synthesized in vitro.
  • the protein encoded by the hydrocarbon synthesis gene according to the present invention can use NADH as a coenzyme for hydrocarbon synthesis activity, and does not necessarily need to use expensive NADPH. Therefore, when using the protein encoded by the hydrocarbon synthesis gene according to the present invention, it is possible to achieve low cost when synthesizing hydrocarbons in vitro by using cheaper NADH as a coenzyme. it can.
  • the synthesized hydrocarbon can be isolated according to a conventional method.
  • the above-described recombinant yeast is cultured in a medium to produce hydrocarbons. Since the synthesized hydrocarbon is synthesized in the medium, it can be isolated from the supernatant fraction after separating the cells from the medium by means such as centrifugation.
  • an organic solvent such as ethyl acetate and methanol is added to the supernatant fraction and sufficiently stirred. It can isolate
  • Example 1 the genome sequence of Klebsiella sp. NBRC100048 strain, which is a microorganism capable of synthesizing alkane, was analyzed according to a standard method, and 10 types encoding proteins having the motif sequence shown in SEQ ID NO: 1 based on this genome sequence information. The genes were identified. The ten genes identified in this example were named genes01 to 10 and their functions were estimated. Table 4 summarizes information on functions and sequences estimated for these 10 genes.
  • a gene encoding a protein having the motif sequence shown in SEQ ID NO: 1 was identified from the genome information of the E. coli W3110 strain.
  • Nucleic acid fragments containing these 15 genes were each amplified by PCR using the genomic DNA of Klebsiella sp. NBRC100048 or the genomic DNA of E. coli W3110 as a template.
  • the primers used for PCR are shown in Table 6.
  • DNeasy Blood & Tissue Kit manufactured by QIAGEN was used for extraction of genomic DNA.
  • sequences for homologous recombination are added to these primers.
  • PfuUltra II-Fusion-HS DNA-Polymerase (Stratagene's) was used for PCR.
  • the nucleic acid residue amplified by PCR and the pUC118 plasmid treated with BamHI were mixed, and the nucleic acid residue amplified by homologous recombination was incorporated into the vector.
  • QIAquick PCR-Purification Kit QIAGEN
  • In-Fusion HD Cloning Kit was used for PCR product ligation.
  • E. coli JM109 was transformed with the obtained expression plasmid.
  • the transformed Escherichia coli was cultured overnight at 37 ° C. and 100 rpm in 1 ml ⁇ ⁇ LB medium (ampicillin 100 ⁇ g / ml).
  • This culture solution was inoculated into 3 ml LB medium (ampicillin 100 ⁇ g / ml, Triton X-100 0.1%, IPTG 0.5 mM, and tetradecanal 1 mM) and cultured at 30 ° C and 100 rpm for 24 hours.
  • the culture is collected (room temperature, 6000 x g, 5 min), 1 ml of the supernatant is placed in a glass vial (Agilent Technologies), subjected to GC / MS analysis, and tridecane synthesized from tetradecanal is collected. Detected.
  • HP7694 manufactured by Hewlett-Packard
  • Table 7 shows the headspace sampler analysis conditions
  • Table 8 shows the GC / MS analysis conditions.
  • FIG. 1 shows the results of analysis using 10 types of genes derived from Klebsiella sp. Identified in this example. As shown in FIG. 1, it was revealed that all 10 types of genes derived from Klebsiella sp. Identified in this example are genes having hydrocarbon synthesis activity. It was also revealed that the proteins encoded by gene02 and gene05 have particularly excellent hydrocarbon synthesis activity. An analysis chart of GC / MS analysis is illustratively shown in FIG. 2 for the vector control strain and the gene02 introduced strain.
  • FIG. 3 shows the analysis results when using the five types of genes of the E. coli W3110 strain identified in this example. As shown in FIG. 3, it was clarified that all five kinds of genes of E. coli W3110 strain specified in this example are genes having hydrocarbon synthesis activity. In addition, the proteins encoded by BAA14992 and BAA14869 were found to have particularly excellent hydrocarbon synthesis activity.
  • Example 2 In this example, in vitro alkane synthesis was attempted using gene02, which was characterized in Example 1 as a gene encoding a protein excellent in hydrocarbon synthesis activity.
  • the recombinant Escherichia coli introduced with gene02 prepared in Example 1 was cultured overnight at 37 ° C. and 100 rpm in 1 ml LB medium (ampicillin 100 ⁇ g / ml). Thereafter, this culture solution was inoculated into 1 ml LB medium (ampicillin 100 ⁇ g / ml, IPTG 0.5 mM) and cultured at 30 ° C. and 120 rpm for 6 hours. Next, this culture solution is collected (4 ° C, 6000 xg, 3 minutes), and the cells are suspended in 500 ⁇ l of phosphate buffer (pH 7.2), and then the cells are disrupted using an ultrasonic disrupter. (4 ° C, 10 minutes). Next, the obtained crushed liquid was centrifuged (4 ° C., 10000 ⁇ g, 5 minutes), and the supernatant was collected. The collected solution was used for enzyme assay.
  • the enzyme reaction was performed overnight at 30 ° C. with the reaction composition shown in Table 9.
  • eight types of 11 to 18 carbon atoms were used as aldehyde compounds.
  • the synthesized alkane has one less carbon number than the carbon number of the aldehyde compound.
  • FIG. 5 exemplarily shows an analysis chart of GC / MS analysis in which a vector control strain and a gene02 introduced strain were measured for an alkane having 13 carbon atoms using an aldehyde compound having 14 carbon atoms as a substrate.
  • Example 3 the protein encoded by gene04 identified in Example 1 was purified, and in vitro alkane synthesis was attempted using the purified protein.
  • PCR was performed using as a template.
  • the PCR product was ligated to the BamHI site of pRSFduet-1 plasmid (Novagen).
  • the same PCR amplification kit, PCR product purification kit and PCR product ligation kit as in Example 1 were used.
  • E. coli BL21 (DE3) was transformed with the obtained expression vector.
  • This Escherichia coli was cultured overnight at 37 ° C. and 120 rpm in 2 ml LB medium (kanamycin 20 ⁇ g / ml). Thereafter, the culture solution was inoculated into 10 ml LB medium (kanamycin 20 ⁇ g / ml, IPTG 0.5 mM) at a volume of 1% and cultured at 37 ° C for 5 hours. The culture is collected (4 ° C, 6000 xg, 3 minutes), and the cells are suspended in 1 ml of phosphate buffer (pH 7.2), and then the cells are disrupted using an ultrasonic disrupter (4 (C, 10 minutes).
  • phosphate buffer pH 7.2
  • the His-tag protein was purified from the obtained disrupted solution using TALON® CellThru® Resin (Clontech).
  • TALON® CellThru® Resin (Clontech).
  • SDS- The results of PAGE are shown in FIG.
  • lane 1 is a disrupted solution of E. coli transformed with pRSFduet-1 plasmid not linked to gene04
  • lane 2 is a disrupted solution of E.
  • Lane 3 is a solution containing purified His-tag protein. As shown in FIG. 6, it was revealed that the His-tag protein could be purified at the position of the molecular weight of 56.6 kDa predicted from the base sequence of gene04.
  • in vitro alkane synthesis reaction was performed using a solution containing His-tag protein.
  • the enzyme reaction was performed overnight at 30 ° C. with the reaction composition shown in Table 10.
  • tetradecanal was used as the aldehyde compound.
  • the alkane to be synthesized is tridecane.
  • FIG. 7 An analysis chart of GC / MS analysis is shown in FIG. 7 (a) is an analysis chart of GC / MS analysis when the above reaction solution composition is used, and (b) is a GC / MS when no His-tag protein eluate is added in the above reaction solution composition. It is an analysis chart of MS analysis, and (c) is an analysis chart of GC / MS analysis when no coenzyme is added in the reaction solution composition.
  • FIG. 7 according to this example, it was revealed that the protein encoded by gene04 exhibits hydrocarbon synthesis activity in the purified protein state, not in the cell extract state.
  • the hydrocarbon synthesis activity when NADPH was used as a coenzyme was also examined. That is, except that NADPH was used as a coenzyme, an enzymatic reaction was performed in the same manner as in the above-described example, and the synthesized alkane was measured by GC / MS. The result is shown in FIG. As can be seen from FIG. 8, it was revealed that the protein encoded by gene04 can use either NADPH or NADH as a coenzyme. It was also shown that the protein encoded by gene04 is superior in hydrocarbon synthesis activity when NADH is used as a coenzyme rather than NADPH.
  • Example 4 gene02 characterized as a gene encoding a protein excellent in hydrocarbon synthesis activity in Example 1 was expressed in yeast, and alkane synthesis was attempted.
  • the nucleic acid fragment amplified by PCR was ligated to the BamHI site of the pESCpgkgap-HIS vector (see International Publication No. WO 2012/098662) using In-Fusion HD HD Cloning Kit (Clontech). Saccharomyces cerevisiae YPH499 strain was transformed with the obtained expression plasmid. Yeast transformation was performed according to the protocol attached to Frozen-EZ Yeast Transformation II Kit (Zymo Research).
  • the obtained transformed yeast colonies were inoculated into 1 ml of SD-His liquid medium and cultured overnight at 30 ° C. (IFM type, 130 rpm, manufactured by Oriental Giken Kogyo).
  • -His medium (tetradecanal 1 mM added) was inoculated at 1% volume and cultured at 30 ° C. and 100 rpm for 2 days.
  • Example 1 After completion of the culture, it was subjected to GC / MS analysis by the method described in Example 1. The analysis results are shown in FIG. As shown in FIG. 9, it was found that the gene02 gene derived from the Klebsiella sp. NBRC100048 strain functions as a gene encoding a protein exhibiting excellent hydrocarbon synthesis activity even when yeast is used as a host. .
  • Example 5 alkane synthesizing ability was evaluated for alkane synthase genes derived from various species.
  • Corynebacterium glutamicum ATCC13032 (NCgl0098, NCgl0463, NCgl2698, NCgl0049, NCgl2578 and NCgl2619), Lactobacillus reuteri DSM20016 (Lreu_0034) and Saccharomyces cerevisiae (YHR037W, YHR073W,
  • YMR169C YMR170C
  • YOR374W YBR006W
  • YMR110C YPL061W
  • Candida tropicalis MYA-3404-derived (CTRG_04587, CTRG_01342 and CTRG_00532), Debaryomyces hansenii CBS767-derived (DEHA2G03740g, DEHA2G22572g and DEHA2B10384g), Pichia paschrs_115_PA1_SrPA_115_SPA1_S_PA2 -1_0853 and PAS_chr4_0043), derived from Schizosaccharomyces pombe (SPAC139.05, SPAC1002.12c and SPAC9E9.09c), derived from Aspergillus oryzae RIB40 (AOR_1_1204144 and AOR_1_1330014) and amino acids from Zeamaymay (SEQ2840KE) The artificially synthesized gene based on this was used as a template.
  • Arabidopsis thaliana derived genes (AT1G23800, AT1G74920, AT1G79440, AT2G24270, AT3G24503, AT3G48000 and AT1G54100) were purchased from ATCC (American Type Culture Collection): ATCC77500 was used as a mold.
  • ATCC77500 was used as a mold.
  • Drosophila melanogaster-derived genes (Dmel_CG3752, Dmel_CG7145, Dmel_CG8665, Dmel_CG11140, Dmel_CG31075, Dmel_CG4685 and Dmel_CG9629) were purchased from ATCC (American Type Culture Library)- : ATCC87285 was used as a mold.
  • Rattus norvegicus-derived genes (24188 and 641316) were obtained by using a cDNA library ATCC77403 purchased from ATCC (American Type Culture Collection) as a template.
  • Homoapisapiens-derived genes (216, 219, 223, 224, 501 and 64577) are cDNA libraries purchased from ATCC (American Type Culture Collection): ATCC77402 was used as a mold.
  • the PCR conditions, the transformant culture conditions, and the alkane analysis method are the same as in Example 1.
  • the results of alkane analysis are shown in FIGS. 10-1 and 10-2.
  • FIGS. 10-1 and 10-2 it was revealed that the 53 types of genes described above are all genes having hydrocarbon synthesis activity.
  • NCgl0098 (Study No. 1), NCgl0049 (Study No. 4), NCgl2619 (Study No. 6), YER073W (Study No. 8), YOR374W (Study No. 13), YBR006W (Study No.

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Abstract

　アルカン等の炭化水素合成能に優れた新規な機能を有するタンパク質をコードする炭化水素合成酵素遺伝子を提供する　配列番号１に示したモチーフ配列を有するアミノ酸配列を含み、アルデヒド化合物から炭素数が１つ少ない炭化水素を合成する活性を有するタンパク質をコードする。

Description

炭化水素合成酵素遺伝子及びその利用
　本発明は、新規な特徴を有する炭化水素合成酵素遺伝子及び当該遺伝子の利用に関する。
　アルカン等の炭化水素を合成できる微生物が知られている。この炭化水素合成能を有する微生物より炭化水素合成に関与する遺伝子を同定・単離することで、炭化水素合成能に優れた組み換え微生物の開発、当該組み換え微生物を利用した炭化水素合成系の開発など期待することができる。例えば、特許文献１（WO2006/109558）には、炭化水素生産能を有する新規微細藻類シュードコリシスチス・エリプソイディア（Pseudochoricystis ellipsoidea）や、シュードコリシスチス（Pseudochoricystis）属或いはコリシスチス（Choricystis）属に属する炭化水素生産能を有する微細藻類を培養することで、培養物から炭化水素を採取する方法が開示されている。
　また、特許文献２（特開2010-528627号公報）には、アルデヒドをアルカンに転換する遺伝子を酵母等に組み込んだ組換え酵母、及び当該組換え酵母を用いたアルカンの製造方法が開示されている。さらに、特許文献３（特表2011-520455号公報）には、Synechococcus elongatus由来のアルカン合成酵素遺伝子やアルデヒド合成酵素遺伝子が開示されており、これらを利用してアルカンやアルデヒドを製造する方法が開示されている。さらにまた、特許文献４（特開平09-322780号公報）には、アラビドプシス・サリアナ由来の脂肪アルデヒドデカルボニラーゼ活性に関与するタンパク質をコードする遺伝子が開示され、これを利用した改変エピクチクラ蝋組成を示す形質転換植物が開示されている。
　さらに、非特許文献１（Process Biochemistry, 41, (2006), p.1001-1014）には、微生物における炭化水素合成パスウェイについて記載されている。また、非特許文献２（Appl. Microbiol. Biotechnol., (2005), 66: p.486-496）には、特許文献１と同様に、藻類の一種であるBotryococcus brauniiにおける炭化水素の生合成について記載されている。さらに、特許文献３（Proc. Natl. Acad. Sci., (1994), Vol. 91, p.10000-10004）には、ハエ由来の遺伝子であって、アルデヒドを炭化水素（(Z)-9-トリコセン）に変換するシトクロムP450遺伝子が開示されている。
　しかしながら、非特許文献１に開示された微生物や、非特許文献３に開示されたハエではアルカン生産量が低く、実用レベルへの応用が期待できるものではない。また、非特許文献２や特許文献１に開示された藻類はアルカン生成反応の速度が遅く、また細胞内にアルカンを蓄積する。このため、非特許文献２や特許文献１に開示された藻類を利用しても、アルカン生産に長時間を要するとともに細胞内からアルカンを精製する工程が必要となり低コストにアルカンを合成できないといった問題がある。さらに、特許文献４に開示された遺伝子を利用した組換え体を作製してもアルカンを合成できた実例はなく、未知の遺伝子といった他の因子が必要となるため実用的ではない。また、植物由来の遺伝子を微生物に利用しても十分に機能しない可能性が高いといった問題もある。また、特許文献３に開示されてシアノバクテリア由来のアルカン合成酵素遺伝子を利用しても、アルカン合成の生産性が低く、実用性は非常に低い。
WO2006/109558 特開2010-528627号公報 特表2011-520455号公報 特開平09-322780号公報
Process Biochemistry, 41, (2006), p.1001-1014 Appl. Microbiol. Biotechnol., (2005), 66: p.486-496 Proc. Natl. Acad. Sci., (1994), Vol. 91, p.10000-10004
　そこで、本発明は、上述した実情に鑑み、アルカン等の炭化水素合成能に優れた新規な機能を有する炭化水素合成酵素遺伝子及びその利用を提供することを目的とする。
　上記目的を達成するため、本発明者らが鋭意検討した結果、所定のモチーフ配列を有する一群のタンパク質がアルデヒド化合物から炭素数が１つ少ない炭化水素を合成する活性に優れることを見いだし、当該タンパク質をコードする遺伝子を炭化水素合成に利用できることを見いだし本発明を完成するに至った。
（１）配列番号１に示したモチーフ配列を有するアミノ酸配列を含み、アルデヒド化合物から炭素数が１つ少ない炭化水素を合成する活性を有するタンパク質をコードする遺伝子。
（２）上記タンパク質は、上記配列番号１に示したモチーフ配列よりもＣ末端側に配列番号２に示したモチーフ配列を更に有することを特徴とする（１）記載の遺伝子。
（３）上記タンパク質は、下記（ａ）～（ｄ）のいずれかであることを特徴とする（１）記載の遺伝子。
　　（ａ）配列番号３～３２及び６５～１７０のうちいずれか１つの偶数番号に記載のアミノ酸配列からなるタンパク質
　　（ｂ）配列番号３～３２及び６５～１７０のうちいずれか１つの偶数番号に記載のアミノ酸配列において１又は複数のアミノ酸が置換、欠失、挿入又は付加したアミノ酸配列からなり、アルデヒド化合物から炭素数が１つ少ない炭化水素を合成する活性を有するタンパク質
　　（ｃ）配列番号３～３２及び６５～１７０のうちいずれか１つの偶数番号に記載のアミノ酸配列に対して７０％以上の同一性を有するアミノ酸配列からなり、アルデヒド化合物から炭素数が１つ少ない炭化水素を合成する活性を有するタンパク質
　　（ｄ）配列番号３～３２及び６５～１７０のうちいずれか１つの奇数番号に記載の塩基配列の相補鎖からなるポリヌクレオチドの少なくとも一部に対してストリンジェントな条件下でハイブリダイズするポリヌクレオチドによりコードされるタンパク質であって、アルデヒド化合物から炭素数が１つ少ない炭化水素を合成する活性を有するタンパク質
（４）上記配列番号３～３２のうちいずれか１つの偶数番号は配列番号６又は１２であり、上記配列番号３～３２のうちいずれか１つの奇数番号は配列番号５又は１１であることを特徴とする（３）記載の遺伝子。
（５）Klebsiella属の微生物由来又は大腸菌由来であることを特徴とする（１）記載の遺伝子。
（６）上記（１）～（５）いずれかに記載の遺伝子を有する発現ベクター。
（７）上記（１）～（５）いずれかに記載の遺伝子を導入してなる形質転換体。
（８）大腸菌又は酵母を宿主とすることを特徴とする（７）記載の形質転換体。
（９）上記（１）～（５）いずれかに記載の遺伝子によりコードされたタンパク質。
（１０）上記（１）～（５）いずれかに記載の遺伝子によりコードされるタンパク質と、上記タンパク質におけるアルデヒド化合物から炭素数が１つ少ない炭化水素を合成する活性に関与する補酵素と、上記タンパク質における上記活性の基質となるアルデヒド化合物とを共存させ、当該アルデヒド化合物から炭素数が１つ少ない炭化水素を合成する、炭化水素の製造方法。
（１１）上記（１）～（５）いずれかに記載の遺伝子を導入してなる形質転換体を、上記アルデヒド化合物を含む溶液にて培養することで、上記タンパク質と上記補酵素と上記アルデヒド化合物とを共存させることを特徴とする（１０）記載の炭化水素の製造方法。
（１２）上記（１）～（５）いずれかに記載の遺伝子を導入してなる形質転換体より抽出した酵素液を、上記アルデヒド化合物を含む溶液と混合することで、上記タンパク質と上記補酵素と上記アルデヒド化合物とを共存させることを特徴とする（１０）記載の炭化水素の製造方法。
（１３）上記（１）～（５）いずれかに記載の遺伝子を導入してなる形質転換体から単離した上記タンパク質を、上記アルデヒド化合物及び上記補酵素を含む溶液に混合することで、上記タンパク質と上記補酵素と上記アルデヒド化合物とを共存させることを特徴とする（１０）記載の炭化水素の製造方法。
（１４）上記アルデヒド化合物は、炭素数１１～２１のアルデヒド化合物であることを特徴とする（１０）記載の炭化水素の製造方法。
（１５）上記補酵素は、還元型ニコチンアミドアデニンジヌクレオチド（NADH）であることを特徴とする（１０）記載の炭化水素の製造方法。
　本明細書は本願の優先権の基礎である日本国特許出願2012-040141号の明細書および／または図面に記載される内容を包含する。
　本発明によれば、従来公知のアルデヒドデカルボニラーゼ遺伝子と比較して、アルデヒド化合物を炭素数が１つ少ない炭化水素に変換する活性に優れた炭化水素合成酵素遺伝子を提供することができる。本発明に係る炭化水素合成酵素遺伝子を利用することで、アルデヒド化合物を基質として高効率且つ低コストに炭化水素を製造することができる。
Klebsiella sp.由来の１０種類の遺伝子について作製した形質転換体の「アルデヒド化合物から炭素数が１つ少ない炭化水素を合成する活性」を測定した結果を示す特性図である。 ベクターコントロール株とgene02導入株についてのGC/MS分析チャート図である。 E.coli W3110株の５種類の遺伝子について作製した形質転換体の「アルデヒド化合物から炭素数が１つ少ない炭化水素を合成する活性」を測定した結果を示す特性図である。 Klebsiella sp.由来のgene02を導入した形質転換体の破砕液上清を用いて各種アルデヒド化合物を基質とした「アルデヒド化合物から炭素数が１つ少ない炭化水素を合成する活性」を測定した結果を示す特性図である。 ベクターコントロール株とgene02導入株について、炭素数１４のアルデヒド化合物を基質として炭素数１３のアルカンを測定したGC/MS分析チャート図である。 形質転換大腸菌の破砕液、精製したHis-tagタンパク質溶液のSDS-PAGEの結果を示す写真である。 精製したHis-tagタンパク質を用いたin vitroにおけるアルカン合成の結果を示すGC/MS分析チャート図である。 補酵素としてNADH又はNADPHを使用したときのアルカン合成能を比較した結果を示す特性図である。 gene02遺伝子を導入した形質転換酵母についてのGC/MS分析チャート図である。 種々の生物種由来の５３種類の遺伝子について作製した形質転換体の「アルデヒド化合物から炭素数が１つ少ない炭化水素を合成する活性」を測定した結果を示す特性図である。 種々の生物種由来の５３種類の遺伝子について作製した形質転換体の「アルデヒド化合物から炭素数が１つ少ない炭化水素を合成する活性」を測定した結果を示す特性図である。
　以下、本発明を図面及び実施例を用いてより詳細に説明する。
　本発明に係る炭化水素合成遺伝子とは、配列番号１に示したモチーフ配列を有するアミノ酸配列を含み、「アルデヒド化合物から炭素数が１つ少ない炭化水素を合成する活性（以下、本活性を炭化水素合成活性と称す）」を有するタンパク質をコードする遺伝子である。炭化水素合成活性とは、アルデヒド化合物から炭素数が１つ少ない炭化水素を合成できる酵素活性であって、アルデヒド化合物からカルボニル基を取り除く酵素活性と言い換えることができる。このとき、炭化水素合成活性には、副生成物として一酸化炭素、二酸化炭素、炭酸、ギ酸及び水等を生成する反応が含まれていても良い。
　ここで、配列番号１に示したモチーフ配列は、アルデヒドデヒドロゲナーゼのグルタミン酸活性部位（Description：Aldehyde dehydrogenases glutamic acid active site）と呼称される配列である。配列番号１に示すアミノ酸配列において、１番目のXaaは、アミノ酸の一文字表記でL、I、V、M、F、G又はAのいずれかである。また、配列番号１に示すアミノ酸配列において、３番目のXaaは、アミノ酸の一文字表記でL、I、M、S、T、A又はCのいずれかである。さらに、配列番号１に示すアミノ酸配列において、４番目のXaaは、アミノ酸の一文字表記でG又はSのいずれかである。さらにまた、配列番号１に示すアミノ酸配列において、６番目のXaaは、アミノ酸の一文字表記でK、N、L又はMのいずれかである。さらにまた、配列番号１に示すアミノ酸配列において、７番目のXaaは、アミノ酸の一文字表記でS、A、D又はNのいずれかである。さらにまた、配列番号１に示すアミノ酸配列において、８番目のXaaは、アミノ酸の一文字表記でT、A、P、F又はVのいずれかである。
　特に、本発明に係る炭化水素合成遺伝子は、配列番号１に示したモチーフ配列よりもC末端側に配列番号２に示したモチーフ配列を更に有するアミノ酸配列を含み、炭化水素合成活性を有するタンパク質をコードする遺伝子であることが好ましい。ここで、配列番号２に示したモチーフ配列は、本発明に係る炭化水素合成遺伝子であってクレブシエラ属微生物由来の遺伝子によりコードされる複数のタンパク質について、それらのアミノ酸配列をマルチプルアライメント解析したときに高度に保存されている領域のアミノ酸配列に対応している。配列番号２に示すアミノ酸配列において、１番目のXaaは、アミノ酸の一文字表記でP、A又はFのいずれかである。また、配列番号２に示すアミノ酸配列において、２番目のXaaは、アミノ酸の一文字表記でF、H又はVのいずれかである。さらに、配列番号２に示すアミノ酸配列において、３番目のXaaは、アミノ酸の一文字表記でG又はAのいずれかである。配列番号２に示すアミノ酸配列において、５番目のXaaは、如何なるアミノ酸でもよい。さらにまた、配列番号２に示すアミノ酸配列において、６番目のXaaは、アミノ酸の一文字表記でK、G又はRのいずれかである。さらにまた、配列番号２に示すアミノ酸配列において、７番目のXaaは、如何なるアミノ酸でもよい。さらにまた、配列番号２に示すアミノ酸配列において、１０番目のXaaは、如何なるアミノ酸でもよい。さらにまた、配列番号２に示すアミノ酸配列において、１１番目のXaaは、アミノ酸の一文字表記でG又はHのいずれかである。さらにまた、配列番号２に示すアミノ酸配列において、１２番目のXaaは、アミノ酸の一文字表記でR、K又はGのいずれかである。さらにまた、配列番号２に示すアミノ酸配列において、１３番目のXaaは、アミノ酸の一文字表記でF、D、P又はAのいずれかである。
　さらに、本発明に係る炭化水素合成遺伝子としては、如何なる生物由来の遺伝子であっても良く、例えば、グラム陰性細菌、グラム陽性細菌、真菌、植物、動物から本発明に係る炭化水素合成遺伝子を同定・単離することができる。例えば、グラム陰性細菌としては、Escherichia coli（大腸菌）やPseudomonas putidaを挙げることができる。グラム陽性細菌としては、Bacillus subtilis（枯草菌）やCorynebacterium glutamicum、Lactobacillus reuteriを挙げることができる。また、真菌としては、Saccharomyces cerevisiaeやCandida tropicalis、Debaryomyces hansenii、Pichia pastoris、Aspergillus oryzaeを挙げることができる。さらに、植物としては、Zea maysやArabidopsis thalianaを挙げることができる。さらにまた、動物としては、Drosophila melanogasterやRattus norvegicus、Homo sapiensを挙げることができる。これら各種生物から本発明に係る炭化水素合成遺伝子を単離して適宜使用することができる。
　より具体的に、上述した配列番号１に示したモチーフ配列を有するタンパク質をコードするアルデヒドデヒドロゲナーゼ遺伝子は、NCBI（National Center for Biotechnology Information）といった遺伝子情報を格納したデータベースから検索することができる。検索した遺伝子はACCESSION番号により以下のように特定できる。
　すなわち、Escherichia coli K-12 W3110由来の遺伝子としてBAE77705、BAA35791、BAA14869、BAA14992、BAA15032、BAA16524、BAE77705、BAA15538及びBAA15073を本発明に係る炭化水素合成遺伝子として同定することができる。また、Pseudomonas putida_F1由来の遺伝子としてYP_001268218、YP_001265586、YP_001267408、YP_001267629、YP_001266090、YP_001270490、YP_001268439、YP_001267367、YP_001267724、YP_001269548、YP_001268395、YP_001265936、YP_001270470、YP_001266779及びYP_001270298を本発明に係る炭化水素合成遺伝子として同定することができる。
　また、Bacillus subtilis 168株由来の遺伝子としてNP_388129、NP_389813、NP_390984、NP_388203、NP_388616、NP_391658、NP_391762、NP_391865及びNP_391675を本発明に係る炭化水素合成遺伝子として同定することができる。Corynebacterium glutamicum ATCC13032由来の遺伝子としてNP_599351、NP_599725、NP_601988、NP_599302、NP_601867及びNP_601908を本発明に係る炭化水素合成遺伝子として同定することができる。Lactobacillus reuteri DSM20016由来の遺伝子としてYP_001270647を本発明に係る炭化水素合成遺伝子として同定することができる。
　さらに、Saccharomyces cerevisiae由来の遺伝子としてNP_010996、NP_011904、NP_015264、NP_013828、NP_009560、NP_015019、NP_013893、NP_013892及びNP_011902を本発明に係る炭化水素合成遺伝子として同定することができる。Candida tropicalis MYA-3404由来の遺伝子としてXP_002548035、XP_002545751、XP_002547036、XP_002547030、XP_002550712、XP_002547024、XP_002550173、XP_002546610及びXP_002550289を本発明に係る炭化水素合成遺伝子として同定することができる。Debaryomyces hansenii CBS767由来の遺伝子としてXP_460395、XP_457244、XP_457404、XP_457750、XP_461954、XP_462433、XP_461708及びXP_462528を本発明に係る炭化水素合成遺伝子として同定することができる。Pichia pastoris GS115由来の遺伝子としてXP_002489360、XP_002493450、XP_002491418、XP_002493229、XP_002490175、XP_002491360及びXP_002491779を本発明に係る炭化水素合成遺伝子として同定することができる。Schizosaccharomyces pombe由来の遺伝子としてNP_593172、NP_593499、NP_594582を本発明に係る炭化水素合成遺伝子として同定することができる。Aspergillus oryzae RIB40由来の遺伝子としてXP_001822148、XP_001821214、XP_001826612、XP_001817160、XP_001817372、XP_001727192、XP_001826641、XP_001827501、XP_001825957、XP_001822309、XP_001727308、XP_001818713、XP_001819060、XP_001823047、XP_001817717及びXP_001821011を本発明に係る炭化水素合成遺伝子として同定することができる。
　さらにまた、Zea mays由来の遺伝子としてNP_001150417、NP_001105047、NP_001147173、NP_001169123、NP_001105781、NP_001157807、NP_001157804、NP_001105891、NP_001105046、NP_001105576、NP_001105589、NP_001168661、NP_001149126及びNP_001148092を本発明に係る炭化水素合成遺伝子として同定することができる。Arabidopsis thaliana由来の遺伝子としてNP_564204、NP_001185399、NP_178062、NP_001189589、NP_566749、NP_190383、NP_187321、NP_190400、NP_001077676及びNP_175812を本発明に係る炭化水素合成遺伝子として同定することができる。
　さらにまた、Drosophila melanogaster由来の遺伝子としてNP_733183、NP_609285、NP_001014665、NP_649099、NP_001189159、NP_610285及びNP_610107を本発明に係る炭化水素合成遺伝子として同定することができる。Rattus norvegicus由来の遺伝子としてNP_001006999、XP_001067816、XP_001068348、XP_001068253、NP_113919、XP_001062926、NP_071609、NP_071852、NP_058968、NP_001011975、NP_115792、NP_001178017、NP_001178707、NP_446348、NP_071992、XP_001059375、XP_001061872及びNP_001128170を本発明に係る炭化水素合成遺伝子として同定することができる。Homo sapiens由来の遺伝子としてNP_036322、NP_001193826、NP_001029345、NP_000684、NP_000680、NP_000683、NP_000681、NP_001071、NP_000687、NP_001180409、NP_001173、NP_000682、NP_000373、NP_001154976、NP_000685及びNP_000686を本発明に係る炭化水素合成遺伝子として同定することができる。
　一方、上述した配列番号１に示したモチーフ配列を有するタンパク質をコードする遺伝子は、NCBIといったデータベースに登録されていないゲノム配列が未知な生物のゲノム配列を明らかにし、ゲノム配列情報に基づいて特定することができる。より具体的に、Klebsiella sp. NBRC100048株のゲノム配列を定法に従って解析し、このゲノム配列情報に基づいて配列番号１に示したモチーフ配列を有するタンパク質をコードする遺伝子を特定することができる。
　本発明に係る炭化水素合成遺伝子であって、Klebsiella sp.由来の遺伝子としては１０種類の遺伝子を特定することができる。これら１０種類の遺伝子を便宜的にgene01～gene10と命名する。これらgene01～10におけるコーディング領域の塩基配列及びこれによりコードされるアミノ酸配列を下記表１にまとめる。
Figure JPOXMLDOC01-appb-T000001
　なお、表１に挙げたKlebsiella sp.由来の遺伝子は、上述した配列番号２に示したモチーフ配列を有するタンパク質をコードしている。
　また、上述したNCBIデータベースに登録されている遺伝子の例として、Escherichia coli K-12 W3110由来の遺伝子であるBAA14869、BAA14992、BAA16524、BAE77705及びBAA15538の５種類について、コーディング領域の塩基配列及びこれによりコードされるアミノ酸配列を下記表２にまとめる。
Figure JPOXMLDOC01-appb-T000002
　さらに、上述したNCBIデータベースに登録されている本発明に係る炭化水素合成遺伝子の例として、Corynebacterium glutamicum ATCC13032由来、Lactobacillus reuteri DSM20016由来、Saccharomyces cerevisiae由来、Candida tropicalis MYA-3404由来、Debaryomyces hansenii CBS767由来、Pichia pastoris GS115由来、Schizosaccharomyces pombe由来、Aspergillus oryzae RIB40由来、Zea mays由来、Arabidopsis thaliana由来、Drosophila melanogaster由来、Rattus norvegicus由来及びHomo sapiens由来の遺伝子について、コーディング領域の塩基配列及びこれによりコードされるアミノ酸配列を下記表３にまとめる。なお、表３において「遺伝子名」の欄にはKyoto Encyclopedia of Genes and Genomes（KEGG）におけるgene IDが記載されている。
Figure JPOXMLDOC01-appb-T000003
Figure JPOXMLDOC01-appb-I000004
　ただし、本発明に係る炭化水素合成遺伝子は、上述した遺伝子名、塩基配列及びアミノ酸配列にて特定されるものに限定されるものではない。
　本発明に係る炭化水素合成遺伝子は、上述した配列番号３～３２及び６５～１７０のうちいずれか１つの偶数番号に記載のアミノ酸配列において１又は複数のアミノ酸が置換、欠失、挿入又は付加したアミノ酸配列からなり、炭化水素合成活性を有するタンパク質をコードする遺伝子であってもよい。ここで、複数のアミノ酸とは、例えば２～１００個、好ましくは２～８０個、より好ましくは２～５０個、更に好ましくは２～１５個のアミノ酸を意味する。
　また、本発明に係る炭化水素合成遺伝子は、配列番号３～３２及び６５～１７０のうちいずれか１つの偶数番号に記載のアミノ酸配列に対して７０％以上、好ましくは８０％以上、更に好ましくは８５％以上、より好ましくは９０％以上、最も好ましくは９８％以上の同一性を有するアミノ酸配列からなり、炭化水素合成活性を有するタンパク質をコードする遺伝子であってもよい。配列間の同一性とは、BLAST、PSI-BLAST、HMMERといった配列類似性検索ソフトウェアをデフォルトの設定で使用して２つのアミノ酸配列間の一致度を示す値（割合）を意味する。
　さらに、本発明に係る炭化水素合成遺伝子は、配列番号３～３２及び６５～１７０のうちいずれか１つの奇数番号に記載の塩基配列の相補鎖からなるポリヌクレオチドの少なくとも一部に対してストリンジェントな条件下でハイブリダイズするポリヌクレオチドによりコードされるタンパク質であって、炭化水素合成活性を有するタンパク質をコードする遺伝子であってもよい。ここでいう「ストリンジェントな条件」とはいわゆる特異的なハイブリッドが形成され、非特異的なハイブリッドが形成されない条件を意味し、例えばMolecular Cloning: A Laboratory Manual(Third Edition)を参照して適宜決定することができる。具体的には、サザンハイブリダイゼーションの際の温度や溶液に含まれる塩濃度、及びサザンハイブリダイゼーションの洗浄工程の際の温度や溶液に含まれる塩濃度によりストリンジェンシーを設定することができる。より詳細には、ストリンジェントな条件としては、例えば、ナトリウム濃度が25～500mM、好ましくは25～300mMであり、温度が42～68℃、好ましくは42～65℃である。より具体的には、5×SSC(83mM NaCl、83mMクエン酸ナトリウム)、温度42℃である。また、ポリヌクレオチドの少なくとも一部とは、所定の塩基配列の相補鎖からなるポリヌクレオチドの全部、当該相補鎖からなるポリヌクレオチドの全部の連続する部分の両者を含む意味である。
　なお、所定のアミノ酸配列に対する変異の導入は、上記炭化水素合成遺伝子の塩基配列を、当該技術分野で公知の手法によって改変することによって行うことができる。塩基配列に変異を導入するには、Kunkel法またはGapped duplex法等の公知手法又はこれに準ずる方法により行うことができ、例えば部位特異的突然変異誘発法を利用した変異導入用キット（例えばMutant-KやMutant-G（何れも商品名、TAKARA Bio社製））等を用いて、あるいはLA PCR in vitro Mutagenesisシリーズキット（商品名、TAKARA Bio社製）を用いて変異が導入される。また、変異導入方法としては、EMS（エチルメタンスルホン酸）、5-ブロモウラシル、2-アミノプリン、ヒドロキシルアミン、N-メチル-N’-ニトロ-Nニトロソグアニジン、その他の発ガン性化合物に代表されるような化学的変異剤を使用する方法でも良いし、X線、アルファ線、ベータ線、ガンマ線、イオンビームに代表されるような放射線処理や紫外線処理による方法でも良い。
　所定の塩基配列からなる遺伝子が、炭化水素合成活性を有するタンパク質をコードしているかは、該遺伝子を適当なプロモーターとターミネーター等の間に組み込んだ発現ベクターを作製し、この発現ベクターを用いて適当な宿主を形質転換し、発現するタンパク質の炭化水素合成活性を測定すればよい。ここで炭化水素合成活性を測定するには、基質となるアルデヒド化合物を含む溶液にて上記形質転換体を培養し、上記アルデヒド化合物に由来する炭化水素（基質のアルデヒド化合物よりも炭素数が１つ少ない炭化水素）をガスクロマトグラフィー/質量分析装置により測定すればよい。なお、炭化水素合成活性を定量的に測定する場合には、生成した炭化水素をガスクロマトグラフィー/質量分析装置によって定量すればよい。アルデヒド化合物としては、詳細を後述するが、例えばテトラデカナール等を利用することができる。
　以上で説明した本発明に係る炭化水素合成遺伝子は、適当な発現ベクターに組み込まれ、宿主に導入される。ここで、宿主としては、本発明の炭化水素合成遺伝子を発現できる生物であれば特に限定されるものではない。宿主としては、例えば、エッシェリヒア・コリ(Escherichia coli）などのエッシェリヒア属、バチルス・ズブチリス(Bacillus subtilis)などのバチルス属、シュードモナス・プチダ(Pseudomonas putida)などのシュードモナス属、リゾビウム・メリロティ(Rhizobium meliloti)などのリゾビウム属に属する細菌が挙げられ、サッカロマイセス・セレビシエ(Saccharomyces cerevisiae)、シゾサッカロマイセス・ポンベ(Schizosaccharomyces pombe)、ピキア・パストリス(Pichia pastoris)などの酵母、糸状菌などを含む真菌が挙げられる。
　大腸菌などの細菌を宿主とする場合、発現ベクターは、該細菌中で自律複製可能であると同時に、プロモーター、リボゾーム結合配列、上述した遺伝子、転写終結配列により構成されていることが好ましい。また、発現ベクターには、プロモーター活性を制御する遺伝子が含まれていてもよい。
　大腸菌としては、例えばエッシェリヒア・コリBL21(DE3)株、K12株、DH1株、JM109株など従来公知の如何なる菌株を使用することができる。大腸菌としては、特にK12株及びK12株から作製された株などの所謂K株を使用することができる。また、枯草菌としては、例えばバチルス・ズブチリス168株などが挙げられる。
　プロモーターとしては、大腸菌などの宿主中で発現できるものであればいずれを用いてもよい。例えばtrpプロモーター、lacプロモーター、PLプロモーター、PRプロモーターなどの大腸菌由来のものやT7プロモーターなどのファージ由来のものが用いられる。さらに、tacプロモーターなどのように人為的に設計改変されたプロモーターを用いてもよい。
　発現ベクターの導入方法としては、細菌にDNAを導入する方法であれば特に限定されるものではない。例えばカルシウムイオンを用いる方法[Cohen, S.N.,et al.:Proc. Natl. Acad. Sci., USA, 69:2110-2114 (1972)]、エレクトロポレーション法などが挙げられる。
　また、宿主として用いることができる酵母としては、特に限定するものではないがCandida Shehatae等のCandida属酵母、Pichia stipitis等のPichia属酵母、Pachysolen tannophilus等のPachysolen属酵母、Saccharomyces cerevisiae等のSaccharomyces属酵母及びSchizosaccharomyces pombe等のSchizosaccharomyces属酵母が挙げられ、特にSaccharomyces cerevisiaeが好ましい。
　また、本発明に係る炭化水素合成遺伝子の発現を強化する際には、転写活性の高い適当なプロモーターを使用する。このようなプロモーターとしては、特に限定されないが、例えばグリセルアルデヒド3リン酸デヒドロゲナーゼ遺伝子（TDH3）のプロモーター、3-ホスホグリセレートキナーゼ遺伝子（PGK1）のプロモーター、高浸透圧応答７遺伝子（HOR7）のプロモーターなどが利用可能である。なかでもピルビン酸脱炭酸酵素遺伝子（PDC1）のプロモーターが下流の目的遺伝子を高発現させる能力が高いために好ましい。その他にも、gal1プロモーター、gal10プロモーター、ヒートショックタンパク質プロモーター、MFα1プロモーター、PHO5プロモーター、GAPプロモーター、ADHプロモーター、AOX1プロモーターなどを使用することで、下流の遺伝子を強発現させることができる。
　また、上述した遺伝子を導入する方法としては、酵母の形質転換方法として知られている従来公知のいかなる手法をも適用することができる。具体的には、例えば、エレクトロポレーション法“Meth. Enzym., 194, p182 (1990)”、スフェロプラスト法“Proc. Natl. Acad. Sci. USA, 75 p1929(1978)”、酢酸リチウム法“J.Bacteriology, 153, p163(1983)”、Proc. Natl. Acad. Sci. USA, 75 p1929 (1978)、Methods in yeast genetics, 2000 Edition : A Cold Spring Harbor Laboratory Course Manualなどに記載の方法で実施可能であるが、これに限定されない。
　以上のように、本発明に係る炭化水素合成遺伝子を導入した組み換え生物、例えば組み換え大腸菌、組み換え酵母は、上記炭化水素合成遺伝子が発現することによってアルデヒド化合物及びNADH等の補酵素が存在すれば、当該アルデヒド化合物から炭化水素を合成することができる。このとき、ここで、本発明に係る炭化水素合成遺伝子がコードするタンパク質は、炭化水素合成活性に補酵素としてNADHを利用することができる。NADHは細胞内に豊富に存在するため、補酵素の量が炭化水素合成反応の律速要因となることがない。したがって、本発明に係る炭化水素合成遺伝子を導入した組み換え生物、例えば組み換え大腸菌、組み換え酵母は、優れた反応効率で炭化水素を合成することができる。なお、本発明に係る炭化水素合成遺伝子がコードするタンパク質は、NADH及びNADPHのずれも補酵素として使用することができる。
　ここで、合成可能な炭化水素は、鎖状構造からなる炭化水素（鎖式炭化水素）及び環構造からなる炭化水素（環式炭化水素）の両方である。なお、鎖状構造からなる炭化水素は、１以上の分岐を有する構造であってもよい。分岐としては、メチル基、エチル基、プロピル基及びブチル基（tert-ブチル基を含む）等のアルキル基、アルキニル基、アルケニル基等を挙げることができる。また、分岐としては、クロロメチル基、アセチル基、2-ピリジル基、ヒドロキシフェニル基、アミノアセチル基。メトキシ基、フェノキシ基、メチルチオ基、フェニルチオ基等を挙げることができる。さらに、合成対象の炭化水素は飽和炭化水素（アルカン）でもよいし、不飽和炭化水素（アルケン及びアルキン）でもよい。
　一方、合成対象の炭化水素の炭素数としては、特に限定されないが、常温で液体である炭素数５～２０程度であることが好ましい。また、合成対象の炭化水素としては、ディーゼル燃料としての用途を考慮して炭素数１０～２０の飽和炭化水素が好ましく、特に炭素数１２～１４の飽和炭化水素がより好ましく、特に炭素数１３の飽和炭化水素が最も好ましい。より具体的に、合成対象の炭化水素としは、炭素数１２のドデカン、炭素数１３のトリデカン及び炭素数１４のテトラデカンを挙げることができる。
　なお、上記で列挙したような特定の炭化水素を合成する場合、基質となるアルデヒド化合物を適宜選択すればよい。すなわち、炭化水素合成活性によりアルデヒド化合物を基質として炭化水素が合成されるため、目的とする炭化水素の構造に応じて適宜アルデヒド化合物を選択すればよい。
　一方、本発明に係る炭化水素合成遺伝子は、in vitroにおける炭化水素の製造方法に利用することもできる。一例として、本発明に係る炭化水素合成遺伝子を導入した組み換え生物、例えば組み換え大腸菌や組み換え酵母を破砕して得られる破砕溶液、或いは、破砕溶液から当該炭化水素合成遺伝子がコードするタンパク質を含む画分を抽出した抽出液を用いて、in vitroにて炭化水素を合成できる。すなわち、上記破砕溶液や上記抽出液に対して基質となるアルデヒド化合物（必要であればNADH等の補酵素）を添加することで、in vitroにて炭化水素を合成できる。特に、上記破砕溶液や上記抽出液にはNADH等の補酵素が豊富に含まれているため、上記破砕溶液や上記抽出液に対しては基質となるアルデヒド化合物を添加するのみでNADH等の補酵素を添加しないでよい場合が多い。換言すれば、本発明に係る炭化水素合成遺伝子を利用する場合、高価なNADPH等の補酵素を必要とせず、効率良く炭化水素を合成することができる。
　或いは、本発明に係る炭化水素合成遺伝子がコードするタンパク質を定法に従って粗精製若しくは精製し、粗精製若しくは精製されたタンパク質と基質となるアルデヒド化合物とNADH等の補酵素とを混合することで、in vitroにて炭化水素を合成できる。ここで、本発明に係る炭化水素合成遺伝子がコードするタンパク質は、炭化水素合成活性に補酵素としてはNADHを利用することができ、必ずしも高価なNADPHを利用する必要はない。よって、本発明に係る炭化水素合成遺伝子がコードするタンパク質を利用した場合、補酵素としてより安価なNADHを使用することでin vitroにて炭化水素を合成する際に低コスト化を達成することができる。
　なお、合成した炭化水素は定法にしたがって単離することができる。例えば、上述した組み換え酵母を培地にて培養し、炭化水素を生産させる。合成された炭化水素は培地中に合成されるため、遠心分離等の手段によって培地から菌体を分離した後の上清画分から単離できる。上清画分から炭化水素を単離するには、例えば、上清画分に酢酸エチル及びメタノール等の有機溶媒を添加し、十分に撹拌する。水層と溶媒層とに分離し、溶媒層から炭化水素を抽出することができる。
　以下、実施例により本発明を更に詳細に説明するが、本発明の技術的範囲は以下の実施例に限定されるものではない。
〔実施例１〕
　本実施例では、アルカン合成能を有する微生物であるKlebsiella sp. NBRC100048株のゲノム配列を定法に従って解析し、このゲノム配列情報に基づいて配列番号１に示したモチーフ配列を有するタンパク質をコードする１０種類の遺伝子を特定した。本実施例で特定した１０種類の遺伝子についてgene01～10と命名し、その機能を推定した。これら１０種類の遺伝子について推定した機能及び配列に関する情報を表４にまとめた。
Figure JPOXMLDOC01-appb-T000005
　本実施例では、これら１０種類の遺伝子に加えて、E.coli W3110株のゲノム情報から配列番号１に示したモチーフ配列を有するタンパク質をコードする遺伝子を特定した。特に本実施例では、特定した遺伝子のうち表５に示す以下の５種類の遺伝子に着目した。
Figure JPOXMLDOC01-appb-T000006
　これら１５種類の遺伝子を含む核酸断片を、それぞれKlebsiella sp. NBRC100048株のゲノムDNA又はE.coli W3110株のゲノムDNAを鋳型としたPCRによって増幅した。PCRに使用したプライマーを表６に示した。なお、ゲノムDNAの抽出にはDNeasy Blood & Tissue Kit（QIAGEN社製）を使用した。
Figure JPOXMLDOC01-appb-T000007
　なお、これらプライマーには、相同組換えのための配列（ベクターとの相同領域）が付加されている。また、PCRにはPfuUltra II Fusion HS DNA Polymerase（Stratagene's社製）を使用した。PCRによって増幅した核酸残片、BamHI処理したpUC118プラスミドを混合し、相同組換えによって増幅した核酸残片をベクターに組み込んだ。なお、PCR産物の精製にはQIAquick PCR Purification Kit（QIAGEN社製）を使用し、PCR産物の連結にはIn-Fusion HD Cloning Kit（Clontech社製）を使用した。
　得られた発現プラスミドでE.coli JM109を形質転換した。形質転換した大腸菌を1ml LB培地（アンピシリン 100μg/ml）で37℃、100rpmで一晩培養した。この培養液を、3ml LB培地（アンピシリン 100μg/ml、Triton X-100 0.1%、IPTG 0.5mM及びテトラデカナール 1mM）に10％容量接種し、30℃で100rpmで24時間培養した。
　この培養液を集菌（室温，6000×g，5min）し、上清1mlをガラス製バイアルビン（Agilent Technologies社製）に入れ、GC/MS分析に供し、テトラデカナールから合成されたトリデカンを検出した。なお、GC/MS分析においてヘッドスペースサンプラーとしてHP7694（Hewlett-Packard社製）を使用し、ヘッドスペースサンプラー分析条件を表７に、GC/MS分析条件を表８に示した。
Figure JPOXMLDOC01-appb-T000008
Figure JPOXMLDOC01-appb-T000009
　本実施例で特定したKlebsiella sp.由来の１０種類の遺伝子を用いたときの分析結果を図１に示す。図１に示すように、本実施例で特定したKlebsiella sp.由来の１０種類の遺伝子は全て炭化水素合成活性を有する遺伝子であることが明らかとなった。また、gene02及びgene05によりコードされるタンパク質は、特に優れた炭化水素合成活性を有することが明らかとなった。なお、GC/MS分析の分析チャートをベクターコントロール株とgene02導入株について例示的に図２に示した。
　同様に、本実施例で特定したE.coli W3110株の５種類の遺伝子を用いたときの分析結果を図３に示す。図３に示すように、本実施例で特定したE.coli W3110株の５種類の遺伝子は全て炭化水素合成活性を有する遺伝子であることが明らかとなった。また、BAA14992及びBAA14869によりコードされるタンパク質は、特に優れた炭化水素合成活性を有することが明らかとなった。
〔実施例２〕
　本実施例では、実施例１で炭化水素合成活性に優れたタンパク質をコードする遺伝子として特徴づけられたgene02を用いてin vitroにおけるアルカン合成を試みた。
　具体的には、実施例１で作製した、gene02を導入した組み換え大腸菌を1ml LB培地（アンピシリン 100μg/ml）で37℃、100rpmで一晩培養した。その後、この培養液を1ml LB培地（アンピシリン 100μg/ml，IPTG 0.5mM）に1％容量接種し、30℃、120rpmで6時間培養した。次に、この培養液を集菌（4℃、6000×g、3分）し、菌体を500μlのリン酸Buffer（pH 7.2）で懸濁した後、超音波破砕機を用いて細胞を破砕（4℃、10分）した。次に、得られた破砕液を遠心分離（4℃、10000×g、5分）し、上清を採取した。採取した溶液を酵素アッセイに用いた。
　酵素反応は表９に示す反応組成にて30℃で一晩行った。なお、本実施例では、アルデヒド化合物として炭素数１１～１８の８種類をそれぞれ使用した。なお、合成されるアルカンはアルデヒド化合物の炭素数より１つ少ない炭素数となる。
Figure JPOXMLDOC01-appb-T000010
　合成された炭素数１０～１７のアルカン生成量を図４に示した。図４から判るように、gene02によりコードされるタンパク質は、特に炭素数１２～１４のアルカンを合成する能力に優れることが明らかとなった。なお、ベクターコントロール株とgene02導入株について、炭素数１４のアルデヒド化合物を基質として炭素数１３のアルカンを測定したGC/MS分析の分析チャートを例示的に図５に示した。
〔実施例３〕
　本実施例では、実施例１で特定されたgene04によりコードされるタンパク質を精製し、精製したタンパク質を用いてin vitroにおけるアルカン合成を試みた。
　具体的には、実施例１と同様にして調整したKlebsiella sp. NBRC100048株のゲノムDNAを鋳型とし、一対のプライマー（フォワードプライマー：accacagccaggatccGCGTTATGCACACCCTGGCCAGCCCGGCGCCCTG（配列番号６３）及びリバースプライマー：gctcgaattcggatccTCAGAACAGGCCCAGCGGCGCGGTGCCGTAGCT（配列番号６４））を用いてPCRを行った。PCR産物をpRSFduet-1プラスミド(Novagen社製)のBamHIサイトに連結した。なお、PCR増幅キット、PCR産物の精製キット、PCR産物の連結キットは実施例１と同じ物を使用した。
　次に、得られた発現ベクターで、E.coli BL21（DE3）を形質転換した。この大腸菌を2ml LB培地（カナマイシン 20μg/ml）で37℃、120rpmで一晩培養した。その後、この培養液を10ml LB培地（カナマイシン 20μg/ml，IPTG 0.5mM）に１％容量接種し、37℃で5時間培養した。この培養液を集菌（4℃、6000×g、3分）し、菌体を1mlのリン酸Buffer（pH7.2）で懸濁した後、超音波破砕機を用いて細胞を破砕（4℃、10分）した。
　次に、得られた破砕液より、TALON CellThru Resin（Clontech社製）を用いてHis-tagタンパク質の精製を行った。gene04を連結したpRSFduet-1プラスミドで形質転換した大腸菌の破砕液、gene04を連結していないpRSFduet-1プラスミドで形質転換した大腸菌の破砕液、及び精製したHis-tagタンパク質を含む溶液について、SDS-PAGEの結果を図６に示す。図６中、レーン１はgene04を連結していないpRSFduet-1プラスミドで形質転換した大腸菌の破砕液であり、レーン２はgene04を連結したpRSFduet-1プラスミドで形質転換した大腸菌の破砕液であり、レーン３は精製したHis-tagタンパク質を含む溶液である。図６に示すように、gene04の塩基配列から予測されるタンパク質の分子量56.6kDaの位置にHis-tagタンパク質が精製できていることが明らかとなった。
　次に、His-tagタンパク質を含む溶液を用いてin vitroにおけるアルカン合成反応を行った。酵素反応は表１０に示す反応組成にて30℃で一晩行った。また、本実施例では、アルデヒド化合物としてテトラデカナールを使用した。なお、合成されるアルカンはトリデカンとなる。
Figure JPOXMLDOC01-appb-T000011
　酵素反応の終了後、実施例１や２と同様に、合成されたアルカンをGC/MSによって測定した。GC/MS分析の分析チャートを図７に示した。図７中、(a)は上記反応液組成を使用したときのGC/MS分析の分析チャートであり、(b)は上記反応液組成においてHis-tagタンパク質溶出液を加えなかったときのGC/MS分析の分析チャートであり、(c)は上記反応液組成において補酵素を加えなかったときのGC/MS分析の分析チャートである。図７に示すように、本実施例によれば、gene04によりコードされるタンパク質は、細胞抽出液の状態ではなく精製されたタンパク質の状態で炭化水素合成活性を示すことが明らかとなった。
　また、本実施例では、補酵素としてNADPHを使用した場合の炭化水素合成活性についても検討した。すなわち、補酵素としてNADPHを使用した以外は、上述した例と同様にした酵素反応を行い、合成されたアルカンをGC/MSによって測定した。その結果を図８に示す。図８から判るように、gene04によりコードされるタンパク質は、補酵素としてNADPH及びNADHのいずれも使用できることが明らかとなった。また、gene04によりコードされるタンパク質は、補酵素としてNADPHよりもNADHを使用したときの方が炭化水素合成活性に優れることも示された。
〔実施例４〕
　本実施例では、実施例１で炭化水素合成活性に優れたタンパク質をコードする遺伝子として特徴づけられたgene02を酵母で発現させ、アルカン合成を試みた。
　具体的には、実施例１と同様にして調整したKlebsiella sp. NBRC100048株のゲノムDNAを鋳型とし、一対のプライマー（フォワードプライマー：aacaaacaaaggatccaaaaaaATGCGTTATGCACACCCTGGCCAGC（配列番号１７１）及びリバースプライマー：gtcgtattacggatccttaTCAGAACAGGCCCAGCGGCGCGGTG（配列番号１７２））を用いてPCRを行った。PCRには、PfuUltra II Fusion HS DNA Polymerase（Stratagene's社製）を使用した。
　PCRによって増幅した核酸断片をIn-Fusion HD Cloning Kit（Clontech社製）を使用してpESCpgkgap-HISベクター（国際公開公報 WO 2012/098662号参照）のBamHIサイトに連結した。得られた発現プラスミドでSaccharomyces cerevisiae YPH499株を形質転換した。酵母の形質転換は、Frozen-EZ Yeast Transformation II Kit（ザイモリサーチ社製）付属のプロトコルに沿って行った。
　次に、得られた形質転換酵母のコロニーを1mlのSD-His液体培地に植菌し、30℃で一晩培養（オリエンタル技研工業製IFM型，130rpm）後、この前培養液を3mlのSD-His培地（テトラデカナール 1mM添加）に1％容量接種し、30℃、100rpmで2日間培養した。
　培養終了後、実施例１に記載した方法によりGC/MS分析に供した。分析結果を図９に示した。図９に示すように、Klebsiella sp. NBRC100048株由来のgene02遺伝子は、宿主として酵母を利用した場合であっても、優れた炭化水素合成活性を示すタンパク質をコードする遺伝子として機能することが判った。
〔実施例５〕
　本実施例では、様々な生物種由来のアルカン合成酵素遺伝子についてアルカン合成能を評価した。
　具体的には、上述した表３に示した、Corynebacterium glutamicum ATCC13032由来、Lactobacillus reuteri DSM20016由来、Saccharomyces cerevisiae由来、Candida tropicalis MYA-3404由来、Debaryomyces hansenii CBS767由来、Pichia pastoris GS115由来、Schizosaccharomyces pombe由来、Aspergillus oryzae RIB40由来、Zea mays由来、Arabidopsis thaliana由来、Drosophila melanogaster由来、Rattus norvegicus由来及びHomo sapiens由来の５３種類の遺伝子について、実施例１と同様にアルカン合成能を評価した。なお、本実施例では、宿主として大腸菌JM109株を使用した。
　これら５３種類の遺伝子の増幅には、下記表１１に示した一対のプライマーを使用した。
Figure JPOXMLDOC01-appb-T000012
Figure JPOXMLDOC01-appb-I000013
Figure JPOXMLDOC01-appb-I000014
　なお、表１１に示した５３種類の遺伝子のうち、Corynebacterium glutamicum ATCC13032由来（NCgl0098、NCgl0463、NCgl2698、NCgl0049、NCgl2578及びNCgl2619）、Lactobacillus reuteri DSM20016由来（Lreu_0034）及びSaccharomyces cerevisiae由来（YER073W、YHR037W、YHR039C、YMR169C、YMR170C、YOR374W、YBR006W、YMR110C及びYPL061W）の遺伝子については、各菌株から抽出したゲノムDNAを鋳型とした。また、表１１に示した５３種類の遺伝子のうち、Candida tropicalis MYA-3404由来（CTRG_04587、CTRG_01342及びCTRG_00532）、Debaryomyces hansenii CBS767由来（DEHA2G03740g、DEHA2G22572g及びDEHA2B10384g）、Pichia pastoris GS115由来（PAS_chr1-3_0024、PAS_chr2-1_0853及びPAS_chr4_0043）、Schizosaccharomyces pombe由来（SPAC139.05、SPAC1002.12c及びSPAC9E9.09c）、Aspergillus oryzae RIB40由来（AOR_1_1204144及びAOR_1_1330014）及びZea mays由来（100284047）の遺伝子については、KEGG上のアミノ酸配列に基づいて化学合成した人工遺伝子を鋳型とした。さらに、表１１に示した５３種類の遺伝子のうちArabidopsis thaliana由来の遺伝子（AT1G23800、AT1G74920、AT1G79440、AT2G24270、AT3G24503、AT3G48000及びAT1G54100）については、ATCC（American Type Culture Collection）から購入したcDNAライブラリー：ATCC77500を鋳型とした。さらにまた、表１１に示した５３種類の遺伝子のうちDrosophila melanogaster由来の遺伝子（Dmel_CG3752、Dmel_CG7145、Dmel_CG8665、Dmel_CG11140、Dmel_CG31075、Dmel_CG4685及びDmel_CG9629）については、ATCC（American Type Culture Collection）から購入したcDNAライブラリー：ATCC87285を鋳型とした。さらにまた、表１１に示した５３種類の遺伝子のうちRattus norvegicus由来の遺伝子（24188及び641316）については、ATCC（American Type Culture Collection）から購入したcDNAライブラリー：ATCC77403を鋳型とした。さらにまた、表１１に示した５３種類の遺伝子のうちHomo sapiens由来の遺伝子（216、219、223、224、501及び64577）については、ATCC（American Type Culture Collection）から購入したcDNAライブラリー：ATCC77402を鋳型とした。
　なお、PCRの条件、形質転換体の培養条件及びアルカンの分析法は、実施例１と同様である。アルカン分析の結果を図１０－１及び図１０－２に示した。図１０－１及び図１０－２に示すように、上述した５３種類の遺伝子は全て炭化水素合成活性を有する遺伝子であることが明らかとなった。特に、NCgl0098（試験No.1）、NCgl0049（試験No.4）、NCgl2619（試験No.6）、YER073W（試験No.8）、YOR374W（試験No.13）、YBR006W（試験No.14）、YMR110C（試験No.15）、CTRG_04587（試験No.17）、PAS_chr2-1_0853（試験No.24）、SPAC139.05（試験No.26）、AOR_1_1204144（試験No.29）及びDmel_CG7145（試験No.40）については、特に優れた炭化水素合成活性を有する遺伝子であることが明らかとなった。
　本明細書で引用した全ての刊行物、特許および特許出願をそのまま参考として本明細書にとり入れるものとする。

Claims (15)

  1. 配列番号１に示したモチーフ配列を有するアミノ酸配列を含み、アルデヒド化合物から炭素数が１つ少ない炭化水素を合成する活性を有するタンパク質をコードする遺伝子。
  2. 上記タンパク質は、上記配列番号１に示したモチーフ配列よりもＣ末端側に配列番号２に示したモチーフ配列を更に有することを特徴とする請求項１記載の遺伝子。
  3. 上記タンパク質は、下記（ａ）～（ｄ）のいずれかであることを特徴とする請求項１記載の遺伝子。
    　　（ａ）配列番号３～３２及び６５～１７０のうちいずれか１つの偶数番号に記載のアミノ酸配列からなるタンパク質
    　　（ｂ）配列番号３～３２及び６５～１７０のうちいずれか１つの偶数番号に記載のアミノ酸配列において１又は複数のアミノ酸が置換、欠失、挿入又は付加したアミノ酸配列からなり、アルデヒド化合物から炭素数が１つ少ない炭化水素を合成する活性を有するタンパク質
    　　（ｃ）配列番号３～３２及び６５～１７０のうちいずれか１つの偶数番号に記載のアミノ酸配列に対して７０％以上の同一性を有するアミノ酸配列からなり、アルデヒド化合物から炭素数が１つ少ない炭化水素を合成する活性を有するタンパク質
    　　（ｄ）配列番号３～３２及び６５～１７０のうちいずれか１つの奇数番号に記載の塩基配列の相補鎖からなるポリヌクレオチドの少なくとも一部に対してストリンジェントな条件下でハイブリダイズするポリヌクレオチドによりコードされるタンパク質であって、アルデヒド化合物から炭素数が１つ少ない炭化水素を合成する活性を有するタンパク質
  4. 上記配列番号３～３２及び６５～１７０のうちいずれか１つの偶数番号は配列番号６又は１２であり、上記配列番号３～３２及び６５～１７０のうちいずれか１つの奇数番号は配列番号５又は１１であることを特徴とする請求項３記載の遺伝子。
  5. Klebsiella属の微生物由来又は大腸菌由来であることを特徴とする請求項１記載の遺伝子。
  6. 請求項１～５いずれか一項記載の遺伝子を有する発現ベクター。
  7. 請求項１～５いずれか一項記載の遺伝子を導入してなる形質転換体。
  8. 大腸菌又は酵母を宿主とすることを特徴とする請求項７記載の形質転換体。
  9. 請求項１～５いずれか一項記載の遺伝子によりコードされたタンパク質。
  10. 請求項１～５いずれか一項記載の遺伝子によりコードされるタンパク質と、上記タンパク質におけるアルデヒド化合物から炭素数が１つ少ない炭化水素を合成する活性に関与する補酵素と、上記タンパク質における上記活性の基質となるアルデヒド化合物とを共存させ、当該アルデヒド化合物から炭素数が１つ少ない炭化水素を合成する、炭化水素の製造方法。
  11. 請求項１～５いずれか一項記載の遺伝子を導入してなる形質転換体を、上記アルデヒド化合物を含む溶液にて培養することで、上記タンパク質と上記補酵素と上記アルデヒド化合物とを共存させることを特徴とする請求項１０記載の炭化水素の製造方法。
  12. 請求項１～５いずれか一項記載の遺伝子を導入してなる形質転換体より抽出した酵素液を、上記アルデヒド化合物を含む溶液と混合することで、上記タンパク質と上記補酵素と上記アルデヒド化合物とを共存させることを特徴とする請求項１０記載の炭化水素の製造方法。
  13. 請求項１～５いずれか一項記載の遺伝子を導入してなる形質転換体から単離した上記タンパク質を、上記アルデヒド化合物及び上記補酵素を含む溶液に混合することで、上記タンパク質と上記補酵素と上記アルデヒド化合物とを共存させることを特徴とする請求項１０記載の炭化水素の製造方法。
  14. 上記アルデヒド化合物は、炭素数１１～２１のアルデヒド化合物であることを特徴とする請求項１０記載の炭化水素の製造方法。
  15. 上記補酵素は、還元型ニコチンアミドアデニンジヌクレオチド（NADH）であることを特徴とする請求項１０記載の炭化水素の製造方法。
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