CN112390855B - Pretide-146a在制备缓解或治疗自身免疫性疾病的药物中的应用 - Google Patents

Abstract

本发明提供了Pretide‑146a在制备缓解或治疗自身免疫性疾病的药物中的应用。本发明揭示了一种全新的功能性小肽，称为Pretide‑146a。所述的Pretide‑146a能够抑制I型干扰素通路异常活化，其可应用于缓解或治疗自身免疫性疾病，如系统性红斑狼疮及其并发症等。所述Pretide‑146a肽还具有易于合成、毒性小、效应持久、作用稳定等优势。

Description

Pretide-146a在制备缓解或治疗自身免疫性疾病的药物中的 应用

技术领域

本发明属于生物技术领域，更具体地，本发明涉及Pretide-146a在制备缓解或治疗自身免疫性疾病的药物中的应用。

背景技术

自身免疫性疾病是机体对自身抗原发生免疫应答而导致自身组织损害所引起的疾病。自身免疫性疾病可分为器官特异性和全身性自身免疫性疾病。而后者全身性自身免疫性疾病，又称系统性自身免疫疾病。患者的病变可见于多种器官和组织，系统性红斑狼疮(SLE)是典型的全身性自身免疫性疾病。自身抗体和自身反应性T淋巴细胞介导的对自身成分发生的获得性免疫应答是自身免疫性疾病发生的原因。因为I型干扰素在先天免疫和适应免疫中发挥着重要的功能和作用，所以它往往在一些自身免疫性疾病，如系统红斑狼疮，多发性硬化，干燥症，胰岛素依赖型糖尿病等中扮演着重要的角色。

I型干扰素(type I interferon，type I IFN)是一类具有抗病毒、抗细菌感染和免疫调节功能的细胞因子，在先天免疫和适应免疫发挥着重要作用。I型干扰素主要包括IFN-α和IFN-β两种形式，依靠受体下游酪氨酸蛋白激酶传递信号，是典型的JAK-STAT信号通路。I型干扰素可以由很多细胞分泌，包括浆细胞样树突状细胞(pDC)，淋巴细胞(NK细胞，B细胞，T细胞)，巨噬细胞等。随着研究的深入，人们发现I型干扰素是一类具有多重免疫调节效应的细胞因子，它既可激发也可以抑制机体免疫，对先天免疫和后天免疫的重要细胞及功能都有调节作用，例如I型干扰素作用于巨噬细胞能够增强其细胞内部的杀菌作用；I型干扰素能够促进B细胞的抗体型别转换。同时，IFN通路的异常活化也与许多人类疾病的发生发展相关，包括系统性红斑狼疮(SLE)、系统性硬化症、阿尔茨海默症、艾氏综合症(AGS)和抗磷脂综合症(APS)、类风湿性关节炎、银屑病、溃疡性结肠炎、克罗恩病、骨髓纤维化、真性红细胞增多症、原发性血小板增多症、急性骨髓细胞性白血病(AML)、急性淋巴细胞性白血病(ALL)、乳腺导管癌及非小细胞肺癌(NSCLC)、强直脊柱炎等类风湿性关节炎、银屑病、溃疡性结肠炎、克罗恩病、骨髓纤维化、真性红细胞增多症、原发性血小板增多症、急性骨髓细胞性白血病(AML)、急性淋巴细胞性白血病(ALL)、乳腺导管癌及非小细胞肺癌(NSCLC)等。

作为一种I型干扰素通路异常活化导致的典型自身免疫性疾病，系统性红斑狼疮(Systemic Lupus Erythematosus，SLE)是一种慢性系统性自身免疫疾病，其特征在于对自身抗原的免疫耐受性的破坏，导致炎症并累积全身多器官组织，从皮肤与关节受累，到更为严重甚至致命的狼疮肾炎(Lupus Nephritis，LN)和神经精神性狼疮(Neuropsychiatricmanifestations of SLE，NP-SLE)。NP-SLE是SLE最常见且最严重的并发症之一。然而，由于SLE确切的发病机制至今仍未得到完全阐明，尤其是重要脏器受累(脑和肾脏等)的机制未明，缺乏预警指标和特异性的诊断指标，缺乏特异性治疗手段。

近来研究发现，在系统性红斑狼疮(SLE)等免疫性疾病中，I型干扰素通路是异常活化的，活化的I型干扰素通路可以激活自身反应的T细胞、DC细胞和B细胞等，从而促进自身免疫反应，加重患者的病情。

本领域技术人员尽管对自身免疫性疾病的发病机制等已有一定的了解，但是目前一些自身免疫性疾病的治疗仍然是本领域的难题，难以根治。因此，本领域还需要在这一方面进行更为深入的探索和研究，以期开发出在临床上更为有效的药物。

发明内容

本发明的目的在于提供Pretide-146a在制备缓解或治疗自身免疫性疾病的药物中的应用。

在本发明的第一方面，提供一种分离的肽，该肽选自：(a)具有SEQ ID NO:1所示氨基酸序列的肽；或(b)将(a)所限定的肽的氨基酸序列经过一个或多个(如1-3个；较佳地1～2个)氨基酸残基的取代、缺失或添加而形成的，且具有(a)所限定的肽的功能的肽；或(c)与SEQ ID NO:2所示的氨基酸序列有至少62.5％(较佳地至少75％；更佳地至少87.5％)相同性，且具有(a)所限定的肽的功能的肽。

在一个优选例心中，(b)或(c)中，所述的肽是对应于SEQ ID NO:1所示氨基酸序列但其第2、7或第8位发生变异的肽；较佳地，所述第2、7或第8位的氨基酸变异为亲水性氨基酸；更佳地，所述的亲水性氨基酸包括选自下组的氨基酸：Ala，Asp，Gln，Asn，His，Glu，Thr，Lys，Pro，Ser，Hyp，Arg，羟脯氨酸，焦谷氨酸；更佳地选自：Ala，Asp，Gln；更佳地，(b)或(c)中所述的肽为具有SEQ ID NO:4、SEQ ID NO:5或SEQ ID NO:6所示氨基酸序列的肽。

在另一优选例中，所述的肽由pre-miR-146a(miR-146a前体)编码。

在本发明的另一方面，提供一种分离的多核苷酸，其编码前面任一所述的肽。

在另一优选例中，所述的多核苷酸不是天然存在于人体或动物体的。

在本发明的另一方面，提供一种表达载体，包括病毒载体或非病毒载体，其含有所述的多核苷酸。

在本发明的另一方面，提供一种重组细胞，其中含有所述的表达载体或其基因组中含有所述的多核苷酸。

在本发明的另一方面，提供所述的肽或编码其的多核苷酸在制备缓解或治疗自身免疫性疾病药物中的应用。

在一个优选例中，所述的自身免疫性疾病是I型干扰素通路异常活化相关疾病；较佳地，所述药物藉由抑制I型干扰素通路异常活化发挥缓解或治疗作用。

在另一优选例中，所述的自身免疫性疾病包括但不限于：系统性红斑狼疮及其并发症，系统性硬化症，阿尔茨海默症，艾氏综合症(AGS)，抗磷脂综合症(APS)，类风湿性关节炎、银屑病、溃疡性结肠炎、克罗恩病、骨髓纤维化、真性红细胞增多症、原发性血小板增多症、急性骨髓细胞性白血病(AML)、急性淋巴细胞性白血病(ALL)、乳腺导管癌及非小细胞肺癌(NSCLC)、强直脊柱炎；较佳地，所述的系统性红斑狼疮并发症包括(但不限于)：过敏与感染、神经精神性狼疮(NPSLE)，狼疮肾炎、狼疮性心脏病、狼疮肺炎、成人呼吸窘迫综合征(ARDS)、狼疮性腹膜炎、狼疮性血管炎、狼疮性肝炎、狼疮眼部病变、关节痛、雷诺现象、消化道损害。

在另一优选例中，所述的肽或编码其的多核苷酸：抑制体内蛋白尿水平；下调抗核糖体P蛋白抗体(ribosomal P antibody,anti-P)抗体水平；缓解焦虑情绪；缓解抑郁情绪；缓解社交异常或提高记忆能力。

在本发明的另一方面，提供一种制备所述的肽的方法，所述方法包括：培养所述的重组细胞，从而重组表达所述的肽。

在本发明的另一方面，提供一种制备所述的肽的方法，所述方法包括：通过体外人工合成的方法制备所述的肽。

在本发明的另一方面，提供一种肽复合体，包括偶联物，辍合物，融合蛋白，所述的肽复合体包括：前面所述的肽；以及与之连接的功能性分子；所述的功能性分子包括：穿膜肽，携带所述肽到达病灶区域的靶向性分子，可检测标志物(如荧光标记物或显色标记物)，生物标签如biotin，flag，miRNA。

在本发明的另一方面，提供一种用于缓解或治疗自身免疫性疾病的药物组合物，所述的药物组合物包括药学上或生理学上可接受的载体；以及前面任一所述的肽或编码其的多核苷酸；或所述的表达载体；所述的重组细胞；或所述的辍合物。

在本发明的另一方面，提供一种用于缓解或治疗自身免疫性疾病的药盒，所述药盒中包括：前面任一所述的肽或编码其的多核苷酸；所述的表达载体；所述的重组细胞；所述的辍合物；或所述的药物组合物。

本发明的其它方面由于本文的公开内容，对本领域的技术人员而言是显而易见的。

附图说明

图1、IFN-α诱导激活的ISRE反应元件在Pretide-146a加入后活性被抑制。HEK293T细胞中共同转入报告质粒ISRE-Firefly(100ng)和参比质粒Renilla(10ng)，24小时后，加入IFN-α以激活ISRE反应元件活性，6小时后加入Pretide-146a，处理24小时后检测双荧光活性。图中纵轴相对荧光活性是指虫荧光(Firefly)与海肾荧光(Renilla)的比值。数据采集自3次独立重复实验，数值是mean±SEM。*表示P<0.05，**表示P<0.01，***表示P<0.001，采用two-way ANOVA检验。

图2、Pretide-146a抑制HEK293T细胞与PBMCs中异常激活的IFN-α通路下游基因MX1，OAS1及IFIT3的表达。HEK293T细胞与PBMCs中分别加入Pretide-146a处理18小时后，加入1000U/ml IFN-α以激活IFN通路，6小时后收集细胞，提取RNA，通过Taqman法检测miR-146a表达水平(a)，通过SYBR Green法检测下游基因MX1(b)，OAS1(c)及IFIT3(d)的表达。数据采集自3次独立重复实验，数值是mean±SEM。*表示P<0.05，**表示P<0.01，***表示P<0.001，采用two-way ANOVA检验。

图3、Pretide-146a抑制L929细胞中异常激活的IFN-α通路下游基因MX1，OAS1及IFIT3的表达。人源L929细胞中加入Pretide-146a处理18小时后，加入IFN-α以激活IFN通路，6小时后收集细胞，提取RNA，通过Taqman法检测miR-146a表达水平(a)，通过SYBR Green法检测下游基因MX1(b)，OAS1(c)及IFIT3(d)的表达。数据采集自三次独立重复实验，数值是mean±SEM。*表示P<0.05，**表示P<0.01，***表示P<0.001，采用two-way ANOVA检验。

图4、Pretide-146a对IFN-α通路下游基因的抑制作用依赖于miR-146a。分离培养C57BL/6与miR-146a敲除小鼠(每组5只，6-8周大)来源的脾脏细胞，将阴性对照以及Pretide-146a转入，18小时后，用IFN-α刺激6小时，检测IFN诱导基因MX1(a)，OAS1(b)，IFIT3(c)的mRNA表达水平。数据采集自3次独立重复实验，数值是mean±SEM。*表示P<0.05，**表示P<0.01，***表示P<0.001，采用two-way ANOVA检验。

图5、Pretide-146a在体内早期干预治疗IFN-α加速肾炎研究示意图。IFN-αadv处理C57BL/6小鼠3天后，尾静脉连续3天注射Pretide-146a或ctrl-pep。

图6、Pretide-146a在体内抑制IFN-α对下游基因的激活。IFN-αadv处理C57BL/6小鼠3天后，尾静脉注射Pretide-146a或ctrl-pep进行干预治疗。小鼠处死后取出心、肝、脾、肺和肾脏，抽提组织总RNA，Real time PCR检测干扰素下游基因MX1、OAS1和IFIT3的表达，使用GAPDH基因作为内参。其中Adv-ctrl(n＝5)作为没有IFN刺激的情况下MX1、OAS1和IFIT3本底表达的对照组；ctrl-pep(n＝5)代表注射对照ctrl-pep和IFN-α的对照组；Pretide-146a(n＝5)代表注射Pretide-146a和IFN-α的处理组。*表示P<0.05，**表示P<0.01，***表示P<0.001，采用two-way ANOVA检验。

图7、IFN-α加速的NZB/NZW F1小鼠肾炎模型示意图。IFN-αadv处理NZB/NZW F1小鼠30天后，开始每隔一周尾静脉注射小肽Pretide-146a进行干预治疗并收集24小时蛋白尿，连续4次后处死小鼠。

图8、Pretide-146a在体内抑制IFN下游基因的激活。Q-PCR检测NZB/NZW F1小鼠脾脏内IFN下游基因MX1、OAS1和IFIT3的表达，使用GAPDH基因作为内参。每组小鼠10只，*表示P<0.05，**表示P<0.01，***表示P<0.001，采用two-way ANOVA检验。

图9、LN发病晚期体内过表达Pretide-146a能够有效的降低IFN-adv诱导的蛋白尿与自身抗体。(a)接取小鼠24小时尿液，BCA法检测其蛋白含量。ELISA检测血清中ANA(b)以及抗dsDNA自身抗体(c)。每组小鼠10只，*表示P<0.05，**表示P<0.01，***表示P<0.001，****表示p＜0.0005。

图10、LN发病晚期在体内过表达Pretide-146a能够有效的减轻肾脏病变症状。(a)肾脏组织HE染色和PAS染色，检测肾小球的中性粒细胞浸润，毛细血管袢增厚，系膜细胞增生与新月体压迫等病理症状；免疫荧光检测自身免疫复合物IgG和补体C3在肾脏中的沉积；(b)根据PAS染色结果，对肾脏损伤进行综合分析评分。每组小鼠10只，*表示P<0.05，**表示P<0.01，***表示P<0.001，采用two-way ANOVA检验。

图11、Pretide-146a对IFN-α加速NZB/NZW F1小鼠中抗核糖体P蛋白自身抗体(anti-P)的影响。利用Elisa法检测分析IFN-α加速的NZB/NZW F1小鼠神经精神性狼疮发生过程中血清中的标记物anti-P自身抗体水平。每组小鼠10只，*P<0.05，**P<0.01，***P<0.005，采用two-way ANOVA检验。

图12、高架十字实验检测Pretide-146a对IFN-α加速NZB/NZW F1小鼠焦虑情绪的影响。(a)各组小鼠分别在高架十字迷宫中的运动轨迹；(b)各组小鼠分别在高架十字迷宫中运动的总距离；(c)各组小鼠分别在高架十字迷宫的开臂中运动的距离占总距离的百分比；(d)各组小鼠分别进入高架十字迷宫各个臂中的次数；(e)各组小鼠分别进入高架十字迷宫的开臂中的次数占总次数的百分比；(f)各组小鼠每次进入高架十字迷宫开臂中的平均时间。每组小鼠10只，*P<0.05，**P<0.01，***P<0.005，采用two-way ANOVA检验。

图13、新环境进食抑制实验检测Pretide-146a对IFN-α加速NZB/NZW F1小鼠焦虑情绪的影响。(a)各组小鼠在新环境进食抑制实验中由放入测试箱到小鼠前肢首次抱起鼠粮进食的时间；(b)各组小鼠在新环境进食抑制实验中的总摄食量。每组小鼠10只，*P<0.05，**P<0.01，***P<0.005，采用two-way ANOVA检验。

图14、旷场实验检测Pretide-146a对IFN-α加速NZB/NZW F1小鼠焦虑情绪的影响。(a)各组小鼠在旷场中的运动轨迹；(b)各组小鼠分别在旷场中运动的总距离；(c)各组小鼠分别进入旷场中心区域的次数；(d)各组小鼠分别在旷场中心区域停留的时间；(e)各组小鼠分别在旷场边缘区域运动的距离。每组小鼠10只，*P<0.05，**P<0.01，***P<0.005，采用two-way ANOVA检验。

图15、悬尾实验检测Pretide-146a对IFN-α加速NZB/NZW F1小鼠抑郁情绪的影响。(a)悬尾实验中小鼠保持静止不动的时间；(b)悬尾实验中最初开始静止不动的时间。每组小鼠10只，*P<0.05，**P<0.01，***P<0.005，采用two-way ANOVA检验。

图16、管型社会支配实验检测Pretide-146a对IFN-α加速NZB/NZW F1小鼠社交行为的影响。各组小鼠在管型社会支配实验中获胜的几率。每组小鼠10只，*P<0.05，**P<0.01，***P<0.005，采用two-way ANOVA检验。

图17、三厢社交实验检测Pretide-146a对IFN-α加速NZB/NZW F1小鼠社交行为的影响。(a)各组小鼠分别在三厢迷宫中的运动轨迹；(b)各组小鼠在三厢迷宫中运动的总距离；各组小鼠分别在三厢迷宫的两小室中运动的时间(c)和距离(d)；各组小鼠分别围绕两小室中铁丝笼运动的时间(e)和距离(f)。每组小鼠10只，*P<0.05，**P<0.01，***P<0.005，采用two-way ANOVA检验。

图18、步下回避实验检测Pretide-146a对IFN-α加速NZB/NZW F1小鼠痛觉记忆的影响。(a)各组小鼠分别在经过痛觉训练2小时和24小时后的测试中走下跳台的时间；(b，c)各组小鼠分别在经过痛觉训练2小时和24小时后的测试成功率。每组小鼠10只，*P<0.05，**P<0.01，***P<0.005，采用two-way ANOVA检验。

图19、Y迷宫实验检测Pretide-146a对IFN-α加速NZB/NZW F1小鼠空间识别能力的影响。(a)各组小鼠分别在Y迷宫中的运动轨迹；(b)各组小鼠分别在Y迷宫中运动的总距离；(c)各组小鼠每次进入各个臂的平均运动时间；(d)各组小鼠分别进入各个臂的次数；(e)各组小鼠每次进入各个臂的平均运动距离。每组小鼠10只，*P<0.05，**P<0.01，***P<0.005，采用two-way ANOVA检验。

图20、在Pretide-146a序列基础上进行优化改造。将突变后的Pretide-146a分别加入HEK293T细胞中处理24小时后，提取RNA，分别检测各突变小肽对miR-146a的富集作用。

具体实施方式

本发明人经过深入的研究，揭示了一种全新的功能性小肽，称为Pretide-146a。所述的Pretide-146a能够抑制I型干扰素通路异常活化，其可应用于缓解或治疗自身免疫性疾病，如系统性红斑狼疮及其并发症等。所述Pretide-146a肽还具有易于合成、毒性小、效应持久、作用稳定等优势。

如本文所用，所述的“保守性变异肽”是指Pretide-146a肽的片段、衍生物和类似物。一般地，该“保守性变异肽”是与SEQ ID NO:1所示的氨基酸序列相比，有至多5个，较佳地至多4个，更佳地至多3、2或1个氨基酸被性质相似或相近的氨基酸所替换而形成肽。

如本文所用，“药学上可接受的”的成分是适用于人和/或哺乳动物而无过度不良副反应(如毒性)的，即具有合理的效益/风险比的物质。术语“药学上可接受的载体”指用于治疗剂给药的载体，包括各种赋形剂和稀释剂。该术语指这样一些药剂载体：它们本身并不是必要的活性成分，且施用后没有过分的毒性。

如本文所用，“有效量”指治疗剂治疗、缓解或预防目标疾病或状况的量，或是表现出可检测的治疗或预防效果的量。

Pretide-146a肽

本发明人发现pre-miR-146a(miR-146a前体)的核苷酸序列中，存在部分序列能够编码产生一段肽，命名为Pretide-146a。所述的pre-miR-146a的长度约99bp，而其中部分序列所编码的Pretide-146a的长度为8aa。

本发明的Pretide-146a肽可以是重组肽、合成肽。其可以是化学合成的产物，或使用重组技术从原核或真核宿主(例如，细菌、酵母、高等植物、昆虫和哺乳动物细胞)中产生。化学合成的方法对于本领域技术人员而言是熟悉的，例如固相肽合成方法。

本发明的Pretide-146a肽的序列可以是：MCILSFEN(SEQ ID NO:1)或其变体，如MAILSFEN(SEQ ID NO:4)，MCILSFDN(SEQ ID NO:5)，MCILSFEQ(SEQ ID NO:6)所示的肽。

本发明还包括Pretide-146a肽的保守性变异肽，其可以是片段、衍生物和类似物。如本文所用，术语“片段”、“衍生物”和“类似物”是指基本上保持本发明的Pretide-146a肽相同的生物学功能或活性的肽。本发明的肽片段、衍生物或类似物可以是：

(i)有一个或多个(如1-5个、1-3个或1-2个)保守或非保守性氨基酸残基(优选保守性氨基酸残基)被取代的肽，而这样的取代的氨基酸残基可以是也可以不是由遗传密码编码的，或

(ii)在一个或多个氨基酸残基中具有取代基团的肽，或

(iii)成熟肽与另一个化合物(比如延长肽半衰期的化合物，例如聚乙二醇)融合所形成的肽，或

(iv)附加的氨基酸序列融合、连接或附着到此肽序列而形成的肽(如前导序列或分泌序列或用来纯化此肽的序列或蛋白原序列，或融合蛋白)。根据本文的定义这些片段、衍生物和类似物属于本领域熟练技术人员公知的范围。

在本发明中，Pretide-146a肽可以指具有SEQ ID NO:1所示序列的肽。该术语还包括具有与Pretide-146a肽相同功能的、SEQ ID NO:1序列的变异形式(保守性变异肽)。这些变异形式包括(但并不限于)：若干个(如1-5个、1-3个或1-2个)氨基酸的缺失、插入和/或取代，以及在C末端和/或N末端添加一个或数个(例如为300个以内，较佳地200个以内，更佳地100个以内，更佳地50个以内，例如40、30、20、15、10、5、3、2、1)氨基酸。例如，在本领域中，用性能相近或相似的氨基酸进行取代时，通常不会改变蛋白质的功能。又比如，在C末端和/或N末端添加一个或数个氨基酸通常也不会改变蛋白质的功能。该术语还包括Pretide-146a肽的活性片段和活性衍生物。

本发明中，也包括为了增加肽的稳定性、半衰期、促进功效而对一个或几个氨基酸加以修饰后构成的修饰形式的肽(通常不改变一级结构)，包括：体内或体外的肽的化学衍生形式如乙酰化或羧基化。修饰还包括糖基化。修饰形式还包括具有磷酸化氨基酸残基(如磷酸酪氨酸，磷酸丝氨酸，磷酸苏氨酸)的序列。还包括被修饰从而提高了抗水解性能或优化了溶解性能的肽。

作为本发明的优选方式，本发明包括一种生物利用度或溶解性提高的SEQ ID NO:1所示序列肽的保守性变异肽。所述的肽对应于SEQ ID NO:1所示氨基酸序列，其第2、7或第8位发生变异；较佳地，所述第2、7或第8位的氨基酸变异为亲水性氨基酸；更佳地，所述的亲水性氨基酸包括选自下组的氨基酸：Ala，Asp，Gln，Asn，His，Glu，Thr，Lys，Pro，Ser，Hyp，Arg，羟脯氨酸，焦谷氨酸；更佳地选自：Ala，Asp，Gln，例如MAILSFEN(SEQ ID NO:4)，MCILSFDN(SEQ ID NO:5)，MCILSFEQ(SEQ ID NO:6)所示的肽。

本发明还提供了Pretide-146a肽与其它功能性分子融合、偶联、交联或附着后所形成的复合体。所述的功能性分子选自但不限于：穿膜肽，携带所述肽到达病灶区域的靶向性分子，可检测标志物(如荧光标记物或显色标记物)，标签分子如biotin，flag，miRNA。

例如，所述的Pretide-146a肽可以与一些荧光标记(如FITC，GFP或EGFP)连接，从而便于观察到Pretide-146a肽在细胞内的存在情况。为了检测和/或分析和/或诊断目的用于标记抗体的标记依赖于使用的特定检测/分析/诊断技术和/或方法例如免疫组织化学染色(组织)样品、流式细胞计量术等。对于本领域已知的检测/分析/诊断技术和/或方法合适的标记为本领域技术人员所熟知。

又例如，所述的Pretide-146a肽可以与穿膜肽连接，所述的穿膜肽是引导所述的小肽进入到细胞内的肽，穿膜肽可以采用本领域已知的可引导肽或其编码基因进入到细胞内的任何分子，或采用提高肽穿透细胞能力的任何分子。一些具有穿膜功能的肽包括：①蛋白衍生肽(protein derived CPPs)，如penetratin、TAT和pVEC等；②模型肽(modelpeptides)如MAP和(Arg)7等；③设计肽(designed CPPs)如MPG和Transportan等。从其两亲性性质也可将其分为3类：①两亲性CPPs(PaCPPs)，如MPG、transportan、TP10、Pep-1；②中等两亲性CPPs(SaCPPs)，如penetratin，RL16；③非两亲性CPPs(NaCPPs)，如R9。所述的穿膜肽可以与Pretide-146a肽直接连接，或者可以通过连接肽连接。

所述的Pretide-146a肽可以与一些具有穿膜功能的肽融合，以提高其穿透细胞，进入到细胞内的能力。一些具有穿膜功能的肽包括：①蛋白衍生肽(protein derivedCPPs)，如penetratin、TAT和pVEC等；②模型肽(model peptides)如MAP和(Arg)7等；③设计肽(designed CPPs)如MPG和Transportan等。从其两亲性性质也可将其分为3类：①两亲性CPPs(PaCPPs)，如MPG、transportan、TP10、Pep-1；②中等两亲性CPPs(SaCPPs)，如penetratin，RL16；③非两亲性CPPs(NaCPPs)，如R9。

本发明还提供了编码本发明Pretide-146a肽、其保守性变异肽或所述肽复合体的多核苷酸序列。本发明的多核苷酸可以是DNA形式或RNA形式。DNA可以是编码链或非编码链。也即，“编码肽的多核苷酸”可以是包括编码此肽的多核苷酸，也可以是还包括附加编码和/或非编码序列的多核苷酸。

其中，编码该肽(MCILSFEN)或其变异肽(MAILSFEN，MCILSFDN，MCILSFEQ)的序列可以是来源于pre-miR-146a的ORF(ATGTGTATCCTCAGCTTTGAGAACTGA)，或是能够编码同义氨基酸序列的碱基序列。由于密码子的简并性，排列组合后的碱基序列可以达到上万条，因此在此处针对小肽序列中氨基酸进行逐一分析。对于M，碱基序列为ATG；对于C，碱基序列可以为TGT，TGC；对于I，碱基序列可以为ATT，ATC，ATA；对于L，碱基序列可以为CTT，CTC，CTA，CTG，TTA，TTG；对于S，碱基序列可以为TCT，TCA，TCC，TCG，AGT，AGC；对于F，碱基序列可以为TTT，TTC；对于E，碱基序列可以为GAA，GAG；对于N，碱基序列可以为AAU，AAC；对于终止密码子，碱基序列可以为TAA，TAG，TGA。因此能够编码Pretide-146a的编码框可以有5184种。对于其变异肽MAILSFEN，编码A的碱基序列可以为GCT，GC，GCA，GCG，因此其可能的编码框有7793种。对于其变异肽MCILSFDN，编码D的碱基序列可以为GAT，GAC，因此其可能的编码框有5184种。对于其变异肽MCILSFEQ，编码Q的碱基序列可以为CAA，CAG，因此其可能的编码框有5184种。

本发明也涉及包含本发明的多核苷酸的载体，以及用本发明的载体或Pretide-146a肽的编码序列经基因工程产生的宿主细胞(重组细胞)，以及经重组技术产生本发明所述肽的方法。

术语“表达载体”指本领域熟知的细菌质粒、噬菌体、酵母质粒、植物细胞病毒、哺乳动物细胞病毒或其他载体。总之，只要能在宿主体内复制和稳定，任何质粒和载体都可以用。表达载体的一个重要特征是通常含有复制起点、启动子、标记基因和翻译控制元件。

包含上述的适当多核苷酸序列以及适当启动子或者控制序列的载体，可以用于转化适当的宿主细胞，以使其能够表达肽。宿主细胞可以是原核细胞，如细菌细胞；或是低等真核细胞，如酵母细胞；或是高等真核细胞，如植物细胞。代表性例子有：大肠杆菌，链霉菌属、农杆菌；真菌细胞如酵母；植物细胞等。

Pretide-146a肽的应用

本发明还提供了所述的Pretide-146a肽的应用，用于制备缓解或治疗自身免疫性疾病的药物；或用于制备I型干扰素通路异常活化相关疾病的药物，所述药物藉由抑制I型干扰素通路异常活化发挥缓解或治疗作用。

IFN信号通路参与了多种免疫过程，其过度活化也与许多人类疾病密切相关。因此，对IFN通路的有效抑制将对疾病的诊治具有重要意义。而本发明的Pretide-146a肽可有效地抑制IFN信号通路。

本发明中，所述的自身免疫性疾病包括(但不限于)：系统性红斑狼疮及其并发症，系统性硬化症，阿尔茨海默症，艾氏综合症(AGS)，抗磷脂综合症(APS)，类风湿性关节炎、银屑病、溃疡性结肠炎、克罗恩病、骨髓纤维化、真性红细胞增多症、原发性血小板增多症、急性骨髓细胞性白血病(AML)、急性淋巴细胞性白血病(ALL)、乳腺导管癌及非小细胞肺癌(NSCLC)、强直脊柱炎等。此外，本发明的小肽对其它一些与I型干扰素通路异常活化相关的疾病或症状也具有潜在的预防或治疗作用。目前，已经明确与I型干扰素通路异常活化相关的疾病或症状包括：系统性红斑狼疮及其并发症，过敏与感染、神经精神性狼疮(NPSLE)，狼疮肾炎、狼疮性心脏病、狼疮肺炎、成人呼吸窘迫综合征(ARDS)、狼疮性腹膜炎、狼疮性血管炎、狼疮性肝炎、狼疮眼部病变、关节痛、雷诺现象、消化道损害等。

在本发明的具体实施例中，以SLE为例进行了研究。SLE作为一种典型的系统性自身免疫性疾病，其发病机制已被证实与IFN通路的异常活化密切相关。

在本发明的具体实施例中，利用Pretide-146a靶向miR-146a进行干预治疗后，有效缓解了IFN-α加速模型动物模型中肾炎的相应症状如蛋白尿的发生、自身抗体ANA与dsDNA的异常升高、肾小球结构的病变及免疫复合物的沉积，同时有效降低了IFN-α诱导产生的异常高水平anti-P抗体，并缓解甚至逆转了神经精神性狼疮相关的行为学异常。

在得知了所述的Pretide-146a的用途后，可以采用本领域熟知的多种方法来筛选调控I型干扰素通路的物质。

在本发明的一种优选方式中，提供一种筛选方法，所述的方法包括：将候选物质与含有Pretide-146a的体系接触；观察候选物质对于Pretide-146a的表达的影响；若所述候选物质可提高(优选显著提高，如提高20％或更低；更优选提高40％或更高)Pretide-146a的表达或活性，则表明该候选物质是抑制I型干扰素通路的潜在物质；反之，则该候选物质是促进I型干扰素通路的潜在物质。

更优选的，可通过设置对照组来观察候选物质对于Pretide-146a的表达的影响状况；所述对照组是不添加所述候选物质的含有Pretide-146a的体系。

一些可上调细胞中Pretide-146a表达的方法例如但不限于：提高细胞内pre-miR-146a(miR-146a前体)的含量，或提高形成该pre-miR-146a的pri-miR-146a的量。提高上述分子的量的方法是本领域技术人员已知的，例如利用表达质粒来转化细胞，使细胞内或细胞核内pre-miR-146a或pri-miR-146a的量提高。

药物组合物及药盒

本发明还提供一种用于缓解或治疗自身免疫性疾病的药物组合物，所述的药物组合物包括：本发明所述的Pretide-146a肽或编码其的多核苷酸，含有该多核苷酸的表达载体或表达该Pretide-146a肽的重组细胞，或含有该Pretide-146a肽的肽复合体或编码该复合体的核酸；以及药学上或生理学上可接受的载体。

合适的药学上可接受的载体是本领域普通技术人员所熟知的。在Remington’sPharmaceutical Sciences中可找到关于药学上可接受的载体的充分说明。在组合物中药学上可接受的载体可含有液体，如水、磷酸盐缓冲液、ringer溶液、生理盐水、平衡盐溶液、甘油或山梨醇等。另外，这些载体中还可能存在辅助性的物质，如润滑剂、助流剂、润湿剂或乳化剂、pH缓冲物质和稳定剂，如白蛋白等。

在使用时，是将安全有效量的本发明所述的本发明所述的Pretide-146a肽或编码其的多核苷酸，或含有该多核苷酸的表达载体或表达该Pretide-146a肽的重组细胞施用于哺乳动物(如人)。具体剂量还应考虑给药途径、病人健康状况等因素，这些都是熟练医师技能范围之内的。

对于某一对象的精确有效量取决于该对象的体型和健康状况、病症的性质和程度、以及选择给予的治疗剂和/或治疗剂的组合。对于某给定的状况而言，可以用常规实验来确定该有效量，临床医师是能够判断出来的。

本发明还提供了一种药盒或试剂盒，其中包括：本发明所述的Pretide-146a肽或编码其的多核苷酸，或含有该多核苷酸的表达载体或表达该Pretide-146a肽的重组细胞；或所述的药物组合物。

为了便于临床应用，本发明的药物组合物可以包含在注射用给药器(如注射用针)中，所述的注射用给药器中，可以包含一次给药量的所述的药物组合物。所述的注射用给药器可以被包含在药盒中，以方便储存、使用。

本发明所述的药盒或试剂盒中，还可包括使用说明书，以利于本领域技术人员按照正确的方式使用。

下面结合具体实施例，进一步阐述本发明。应理解，这些实施例仅用于说明本发明而不用于限制本发明的范围。下列实施例中未注明具体条件的实验方法，通常按照常规条件如J.萨姆布鲁克等编著，分子克隆实验指南，第三版，科学出版社，2002中所述的条件，或按照制造厂商所建议的条件。

实施例1、Pretide-146a的确定

本发明人致力于动物细胞的miRNA及其上下游机制的研究，意外地发现动物细胞胞浆中的pre-miRNA具有编码调节性小肽的功能。在动物miRNA成熟过程中，核内转录形成的pri-miRNA经过剪切后形成pre-miRNA，被运输到胞浆中经过进一步剪切加工形成miRNA的成熟体，而mRNA也同样在核内经过转录形成后，进入胞浆以结合核糖体进一步翻译形成蛋白。因此，本发明人推测miRNA的茎环结构前体pre-miRNA中存在着未被发现的功能性sORF(即同时有起始密码子ATG与终止密码子的开放阅读框，且编码小于35aa长度的小肽)。

miR-146a作为已知的miRNA分子，参与一系列炎症反应，其激活与抑制往往和免疫性疾病密切相关，对其功能与表达的调节研究将有助于疾病治疗。针对miR-146a，本发明人找到了与其相互作用的Pretide-146a。

pri-miR-146a序列(人源)(SEQ ID NO:2)(2301nt)：

CGCTCTTCCTTTCCTGGATGGCACCAGCAGGGCCGATTGGAGTGGTAAACCCTGGGCCGGAAGGCATGCCAAAGGGTGGACAGGATGGACAGGAGACAGTAGCACAACGAGGAGGGGGAGAACAGCGGCTGAATTGGAAATGATAAAATAAAATGAAATTTTAGGAGCTCGCTGGCTGGGACAGGCCTGGACTGCAAGGAGGGGTCTTTGCACCATCTCTGAAAAGCCGATGTGTATCCTCAGCTTTGAGAACTGAATTCCATGGGTTGTGTCAGTGTCAGACCTCTGAAATTCAGTTCT TCAGCTGGGATATCTCTGTCATCGTGGGCTTGAGGACCTGGAGAGAGTAGATCCTGAAGAACTTTTTCAGTCTGCTGAAGAGCTTGGAAGACTGGAGACAGAAGGCAGAGTCTCAGGCTCTGAAGGTATAAGGAGTGTGAGTTCCTGTGAGAAACACTCATTTGATTGTGAAAAGACTTGAATTCTATGCTAAGCAGGGTTCCAAGTAGCTAAATGAATGATCTCAGCAAGTCTCTCTTGCTGCTGCTGCTACTCGTTTACATTTATTGATTACTTACGATGATTCAGGTACTGTTGTAAGTGCTTTACATGCTGTTATACGAGACTCTTGGGAGAAATCACTTTAATGAAGCTTGAGACACATGGCATTGCCATGCAATGATTTTTCCCCCCTCTTCACGGGATCAGAGGGAACTAATAGAATGTGACAATGATTCTTTAGCAGGGACTGCTGAGGCTTCTGGTTCCTTTTTAAGATCTGCAGTGAAAGAAGATGAGAAACATGGATATGCCCTTCTTTTGGTCCCCCTCTTCCTTTATTTGATCTCTACTTCCTTCTATAAATATATTAGGGCTACATTGTCCCTTTGTATTTCAAACAAGGCAAAAAGAGGTTGTAATTACACTTTACTGCAATCCTCAGTTTCTCCAGGGAACAGGAATGCAAAGGCTTTGAAGGCCTCTCTATTTGCTGACATGGTCAGCTGGGTGCCATGGGCCAAGTCCTTCTGTTGCCCTCCTCTGTCACCAAGTAAGCTAGGTCCTTTCTGAGGCTCAGGTTTGCTGTGATGATGATCACTTTTAGGCAGAAGGTTAGAGGCCTCATGAGTGCTATATGGACTTTATTAGGCTTTAGATTTGATGGGGAATAAGGGATGTGATTTGTCTTTTGGGAACTCATCTTTGATTCATCATTGTCTCTTGGTATCTTGGAATTTCCATGTCATTACAGTCTACAGAATGAAAGAGTAACCTGTCCCAGAGGAGAGGCAGGTGAAAGACTCCACAGCATGCTCATTCTCATTCTGTCTTCTCAGTGACACCGAGGTTTACTGAGTGCCCACTATGTGCCAAGCACTGTGCTCAGGGCTTTCTTTGTATGCATGATCTCAGTGAATCTCACCAAGCCTCATCTGGAAAACGGGGACAAATTAACAACAGGATGGCAAATTGAAAAACACGTAACCATGTTCTACAGATGGAAAGGGGTGCTTGGTTATTATGAAGGCCCCCTCGCAAGCGTGTGGGACATGGGTGTGTTCTCTGGGTTGTACTGATCAGATCAAGGACCTCCCCCACCCTTCTCACACTCTGCCCACTTCCGCCCTTTGCTTATCAGACCCTTAGCCAGTGACTCATTCCAGAACCAGAACCTTGGTGAAATCTCAACCGACACCAGAGATCGGTGTCTTCAGTCCTAGACTGATGGAGAAAATCCAGAATATATACTAGAAGCTCCAAATGCTCTGGGTTTCAGCTCCTCTGTGCTGTGGACACTGACTTTGGCTCAGAACTCCGATTTAGTACAAAAGGCTCATTTTTATTTCAGGGGCACTCTTCCTAAAGCAAACCTAATAAATGAAATATGGAATTCACAGATACACACACACATTAAAAAATTAACCTAGTGTATCTGTGAGGAGTAGGCAGAAATTCACTGTATAAAAGAATGCTTCATTTCATAGAGAATTTGTGTTAAGATTCCATTAGATAGTACATTTCTCAAAGATTTTTGAGGTTGTATTTGCTTTACCAAAACTTGGTTTATGTAAGTGGAAAAAGCATGTTGCAAAATAACTTGGTGTCTATGATTCAGTTTATGTAAAATAATAAATGTATGTAGGAATACGTGTGTTGAAAGATGTACATCAATTTGCTAACAATGGTTATCTCTGACGTGGTGGGATTTGAGATGTGTTTTTCTTTTTGGTTGTATTTTTCTCTATTGTTTGACTTAACACAGAACATGTTTGGTTACAACAATAAAGTTATTGAAGACAA

pre-miR-146a序列(人源)(SEQ ID NO:3)：

CCG

TGAATTCCATGGGTTGTGTCAGTGTCAGACCTCTGAAATTCAGTTCTTCAGCTGGGATATCTCTGTCATCGT

Pretide-146a氨基酸序列(人源)(SEQ ID NO:1)(8aa)：

MCILSFEN

实施例2、细胞实验验证Pretide-146a对IFN通路的抑制作用

根据实施例1中的序列，本发明人合成了Pretide-146a。

1、Pretide-146a抑制IFN诱导的ISRE活性

由于I型IFN可与细胞膜表面的IFN受体相结合进而磷酸化下游的信号转导与转录激活分子1(singnal transducer and activator of transcription 1，STAT1)和STAT2，从而使这两个分子被活化，并结合IFN诱导基因启动子区的ISRE，诱导IFN通路下游基因的转录表达。因此本发明人通过在HEK293T细胞中测定干扰素诱导反应元件(InterferonStimulated Response Element，ISRE)介导转录的荧光素酶(ISRE-Luc)活性来检测Pretide-146a对I型IFN通路下游信号是否有直接的调控作用。在HEK293T细胞中瞬转ISRE报告基因质粒(购自Clonetech，pISRE-TA-Luc)，之后加入Pretide-146a处理，用1000U/mLIFN-α刺激6小时。

结果发现，Pretide-146a能够明显抑制IFN诱导的ISRE活性(图1)。

2、Pretide-146a抑制干扰素诱导基因的表达

随后，本发明人以代表性的IFN诱导基因的表达作为反映IFN通路下游活化的检测指标，以研究Pretide-146a对IFN通路下游的直接调节作用。首先分别在HEK293T细胞与人外周血单核细胞PBMCs中加入Pretide-146a处理18小时后，加入Ⅰ型干扰素(IFN-α)刺激6小时，通过q-PCR检测。

结果发现，IFN-α刺激后异常激活的干扰素通路下游基因MX1、OAS1及IFIT3表达水平均显著下降，说明Pretide-146a能够显著抑制干扰素诱导基因的表达(图2)。由于miRNA具有高度保守性，miR-146a成熟体序列在人鼠间是完全保守的。本发明人用Pretide-146a处理了小鼠来源的L929细胞，证实了Pretide-146a对miR-146a及IFN通路的影响同样是人鼠保守的(图3)。

3、Pretide-146a对IFN通路的调节作用依赖于miR-146a

因为Pretide-146a通过上调miR-146a的水平调节IFN通路，那么Pretide-146a发挥功能是否依赖于miR-146a？由于miRNA具有高度保守性，miR-146a是人鼠保守的。本发明人分别用Pretide-146a处理C57BL/6小鼠与miR-146a敲除小鼠来源的脾脏细胞，检测其在小鼠体内的功能。

结果发现，在野生型小鼠来源的脾脏细胞中，Pretide-146a同样也特异性地促进了小鼠的mmu-miR-146a的表达，并抑制了异常激活的IFN通路，而在miR-146a敲除小鼠来源的脾脏细胞中则没有效果(图4)。

上述结果表明，Pretide-146a对IFN通路的调节作用是依赖于miR-146a的。

实施例3、Pretide-146a可以有效缓解IFN-α依赖的狼疮模型小鼠肾炎的发生

根据上述，在人类及小鼠来源的细胞中，Pretide-146a均能够通过增强miR-146a在胞内的稳定性而促进其表达水平，并抑制IFN-α通路。由于type I IFN在SLE的发生发展过程中起了重要作用，Pretide-146a对IFN-α信号的抑制就使之具有潜在的治疗价值，Pretide-146a很有可能成为在SLE患者体内抑制IFN-α信号的小分子药物。基于上述想法，本发明人决定验证Pretide-146a的体内抑制活性。

1、Pretide-146a在体内抑制IFN-α信号

本发明人使用C57BL/6小鼠构建早期干预IFN加速模型验证Pretide-146a是否具有体内抑制IFN-α信号的活性。首先，通过尾静脉给小鼠注射IFN-αadv(表达IFN-α的腺病毒载体，购自Vigene)，三天后再通过尾静脉注射Pretide-146a慢病毒作为治疗，经过连续三天的干预治疗后，将小鼠处死，取出心、肝、脾、肺和肾脏用于检测IFN下游基因的表达(图5)。

本发明人发现，Pretide-146a在不同的器官中，对MX1、OAS和IFIT3这三个IFN诱导基因的抑制水平是有差异的(图6)—心脏，脾脏和肺脏中三个诱导基因都受到了明显抑制；肝脏主要是OAS1受到明显抑制，MX1和IFIT3效应略弱；肾脏主要是OAS1和MX1受到抑制，IFIT3效应略弱。

基于这些结果，本发明人认为：虽然在不同的器官，对于不同的IFN诱导基因，Pretide-146a的抑制效应不完全相同，但可以肯定的是Pretide-146a具有在体内抑制IFN-α信号的作用。

2、Pretide-146a在体内抑制IFN诱导基因且降低蛋白尿水平

NZB/NZW F1(F1)小鼠模型(购自美国Jackson lab，货号stain 100008)是一个经典的自发狼疮小鼠模型。由于遗传背景的原因，F1小鼠在4到5个月的时候开始出现自身抗体，蛋白尿也随之出现。8到9个月时，F1小鼠出现严重的狼疮肾炎。于是本发明人构建了IFN-αadv加速的NZB/NZW F1小鼠肾炎模型来验证小肽Pretide-146a是否具有抑制病理状态下IFN-α通路和减轻或是治疗肾炎的作用。

本发明人选取12～13周龄大的雌性NZB/NZW F1狼疮自发小鼠(以下简称为F1小鼠)，分为四组：Ctrl-adv注射组，IFN-adv注射组，IFN-adv+Pretide-146a慢病毒注射组，IFN-adv+CTX(Cyclophosphamide，环磷酰胺)注射组，每组10只小鼠。在注射Ctrl-adv和IFN-adv 30天后，收集24小时蛋白尿。对于IFN-adv+Pretide-146a慢病毒组和IFN-adv+CTX组，在尾静脉注射IFN-adv后，于第30天开始每隔一周进行尾静脉注射治疗并分别在注射后的第7天收集蛋白尿，具体时间流程图见图7。所有小鼠在注射腺病毒50天后眼眶取血，离心后获取血清，并采集脾脏与肾脏组织，对脾脏组织提取RNA，检测IFN-α通路的活化程度；对肾脏组织制备切片后通过HE染色、PAS染色及免疫荧光进行病理学分析，检测肾脏中肾小球的结构变化与免疫复合物沉积等多项指标。

结果表明，Pretide-146a在NZB/NZW F1小鼠脾脏中对MX1、OAS和IFIT3这三个IFN诱导基因均有显著的抑制作用(图8)。同时，在F1小鼠注射Adv-IFN-α30天后已出现蛋白尿，处于LN发病的晚期。与IFN-α处理组相比，在干预治疗7天后，Pretide-146a能够显著降低蛋白尿的水平，效果优于阳性对照药CTX，在干预治疗第16天、24天时，仍然保持此趋势(图9a)。与此结果一致，小肽干预治疗组中小鼠的抗核抗体(antinuclear antibody，ANA)和anti-dsDNA(double-stranded DNA)自身抗体也显著低于对照组的小鼠(图9b，9c)。

3、Pretide-146a能够有效缓解狼疮肾炎

本发明人通过肾脏切片病理学分析，并对小鼠的肾脏损伤进行相应的评分，发现在IFN-αadv处理组中，未进行干预治疗的小鼠肾脏结构病变坏死严重，注射阳性对照药物CTX的小鼠有着轻微病变的肾小球结构，而小肽Pretide-146a干预治疗组具有较正常的肾小球结构。随后，本发明人通过免疫荧光检测了肾脏中自身免疫复合物IgG以及补体C3的沉积情况，发现与Ctrl-adv处理组相比，IFN-αadv处理组的小鼠肾脏有着显著的自身抗体IgG以及补体C3的沉积。而通过Pretide-146a干预治疗能够有效降低自身免疫复合物及补体的沉积，其效果等同甚至优于阳性对照药CTX(图10a-b)。

以上结果显示，Pretide-146a能够有效地缓解Adv-IFN-α诱导的狼疮肾炎。

同时，通过对小鼠的观测，本发明人发现Pretide-146a在体内的有效作用时间长约可持续25天，稳定性好，且未观测到不良副作用的产生。

实施例4、Pretide-146a有效缓解IFN-α依赖的狼疮动物的神经精神性狼疮的发生发展本发明人发现，miR-146a的表达缺失参与介导了神经精神性狼疮的发生发展，而Pretide-146a可特异性促进miR-146a的表达并增强其功能。同时，IFN-α通路的异常活化也被认为与神经精神性狼疮的发生发展密切相关。因此本发明人推测利用Pretide-146a靶向促进IFN-α加速的NZB/NZW F1模型小鼠中miR-146a的表达，从而干预过度活化的IFN-α通路，可起到缓解亦或是治疗神经精神性狼疮的作用。

1、Pretide-146a有效下调anti-P抗体水平

神经精神性狼疮的一个特异性标志抗体是抗核糖体P蛋白抗体(ribosomal Pantibody，anti-P)，约60％神经精神性狼疮患者的anti-P抗体呈阳性，表明精神异常与抗P蛋白抗体相关。因此，本发明人在IFN-α加速的NZB/NZW F1小鼠模型中验证Pretide-146a是否具有抑制病理状态下IFN-α通路和减轻或是治疗神经精神性狼疮的作用。

本发明人观察到，与对照小鼠相比，IFN-α处理的小鼠表现出更高水平的抗anti-P抗体，而在Pretide-146a干预治疗组中，anti-P抗体水平明显下降，与control组(对照腺病毒处理组)无明显差异(图11)。

2、Pretide-146a有效缓解动物焦虑情绪

焦虑是神经精神性狼疮表现的主要精神障碍之一。为了评估Pretide-146a干预治疗对小鼠焦虑情绪的缓释作用，本发明人进行了高架十字实验，新环境进食抑制实验和旷场实验以评估焦虑相关的行为表型。

在高架十字实验中，与对照小鼠相比，IFN-α处理后的小鼠在开放臂上的停留时间明显更少，在开放臂中运动的距离更短，进入开放臂的次数也大大降低(图12a，f，c，e)。但经过Pretide-146a干预治疗后，小鼠在开放臂中的停留时间、运动距离与进入次数均明显上升，效果优于阳性对照CTX组(图12f，c，e)。同时，各组小鼠在开放和闭合臂中行进的总距离(图12b)和每个臂中进入的总次数(图12d)没有显著差异。

这些结果表明，IFN-α处理后的小鼠对开放臂的探索性下降，但Pretide-146a干预治疗可逆转该现象。

在新环境进食抑制实验中，如图13a所示，IFN-α处理后，小鼠的摄食潜伏期明显增加，而经过Pretide-146a干预治疗后，小鼠的摄食潜伏期明显下降，其效果优于阳性对照CTX组。此外，在各组之间没有观察到食物消耗的差异，排除了小鼠间食欲差异对结果的影响(图13b)。

在旷场实验中(图14a)，各组之间的总运动距离没有统计学差异(图14b)，说明IFN-α处理对小鼠的运动能力没有影响。同时，与对照小鼠相比，IFN-α处理后的小鼠进入中心区域的次数(图14c)和停留时间(图14d)更少，在边缘区域中的运动距离明显增加(图14e)。而经过Pretide-146a干预治疗后，小鼠进入中心区域的次数(图14c)和停留时间(图14d)明显上升，在边缘区域中的运动距离显著减少(图14e)，效果优于阳性对照CTX组。

上述结果说明，Pretide-146a的运用可有效地逆转动物的焦虑情绪。

3、Pretide-146a有效缓解动物抑郁情绪

为了进一步评估Pretide-146a干预治疗对神经精神性狼疮中抑郁情绪的缓解作用，本发明人进行了悬尾实验以考察NZB/NZW F1小鼠的抑郁样行为。在用IFN-α处理后，与对照小鼠相比，小鼠静止不动的时间明显延长，首次开始静止不动的潜伏期也明显提前；而经过Pretide-146a干预治疗后，小鼠静止不动的时间明显缩短，首次开始静止不动的潜伏期也明显推迟，其效果优于阳性对照CTX组(图15a-b)。

这些结果提示，Pretide-146a干预治疗可明显逆转小鼠的抑郁样行为。

4、Pretide-146a有效缓解动物的社交异常

由于社交行为的异常也是NP-SLE的常见症状，本发明人采用管型社交支配实验和三厢社交实验来评价IFN-α处理后的NZB/NZW F1小鼠的社交行为。

本发明人首先进行了管型社交支配实验来评估小鼠的攻击性和支配地位。结果表明，IFN-α处理后的小鼠获胜的可能性要小得多，而经过Pretide-146a干预治疗后，小鼠的获胜率明显回升，其效果类似于阳性对照CTX组，逆转了小鼠的攻击性和社会等级的下降(图16)。

三厢社交测试(图17a)中，各组小鼠在三个小室中运动的总距离间没有观察到显著差异(图17b)，但是它们偏好的小室明显不同。对照小鼠会优先留在含有陌生小鼠的小室，表现为更长的停留时间与运动距离，而IFN-α处理后的小鼠则未对两个小室表现出偏好(图17c，d)。

为了进一步考察小鼠直接的社交行为，本发明人分析了小鼠围绕笼子的嗅探时间和旋转距离并发现，对照小鼠更倾向于在含有陌生小鼠周围绕行和嗅探(图17e，f)，但IFN-α处理后的小鼠没有表现出类似的趋势。经过Pretide-146a干预治疗后，小鼠明显表现出类似于对照小鼠的社交行为，其效果类似于阳性对照CTX组，逆转了小鼠社交活动性的下降(图17c-f)。

上述结果表明，Pretide-146a干预治疗可有效逆转该表型。

5、Pretide-146a有效提高动物记忆能力

最后，本发明人通过步下回避实验和Y迷宫实验评估NZB/NZW F1小鼠的认知功能。

在步下回避实验中，如图18a所示，本发明人观察到短期记忆(2小时)和长期记忆(24小时)测试中，IFN-α处理组小鼠的步下小跳台的潜伏期明显短于对照组，而经过Pretide-146a干预治疗后，潜伏期明显延长，其效果类似于阳性对照CTX组。至于小鼠达到记忆测试标准的百分比(图18b，18c)，也表现出了类似的规律。

在Y迷宫实验中，本发明人通过分析Y迷宫中小鼠的自发交替行为来考察Pretide-146a干预治疗短期空间工作记忆的影响(图19a)。本发明人发现，各组在Y迷宫中运动的总距离(图19b)和进入各个臂的次数(图19d)之间没有差异，但在新异臂与熟悉臂中的相对运动距离与时间有着明显差异：IFN-α处理后的小鼠在新异臂中的运动距离和时间与熟悉臂没有明显差异，而Pretide-146a干预治疗组则表现出明显差异，其效果优于阳性对照CTX组，表现为对IFN-α影响下错乱的空间识别能力的逆转(图19c，e)。

这些研究结果表明，IFN-α处理强烈干扰了小鼠的长期记忆和空间识别工作记忆，但Pretide-146a干预治疗可有效逆转该现象。

综上，本发明人在IFN-α加速的自发狼疮模型NZB/NZW F1小鼠中发现，利用Pretide-146a靶向miR-146a进行干预治疗后，有效降低了IFN-α诱导产生的异常高水平抗P蛋白抗体，并缓解甚至逆转了神经精神性狼疮相关的行为学异常，提示了一种基于miR-146a为靶点的新的小肽干预手段。

实施例5、在Pretide-146a基础上进行优化改造

在前期实验中，本发明人发现Pretide-146a能够特异性抑制IFN通路，在SLE小鼠自发模型中也能够有效缓解狼疮肾炎与神经精神性狼疮。但由于其本身氨基酸组成的疏水性较高，导致Pretide-146a水溶性较差，不利于在生物体内的运输。为增强其溶解性，改善生物利用度，增加吸收，本发明人在原序列的基础上，通过替换为性质类似的氨基酸进行点突变，突变位置如图20。

并通过下游的q-PCR对miR-146a表达水平检测评估Pretide-146a突变体的效应后发现，将人源Pretide-146a序列中第二位的C替换为A，或是将第七位的E替换为D，或是将最后一位的N替换为Q后，均可检测到与Pretide-146a类似的对miR-146a的促进效应，同时水溶性也得到了显著的提高。所述的肽特别是MAILSFEN(SEQ ID NO:4)，MCILSFDN(SEQ IDNO:5)，MCILSFEQ(SEQ ID NO:6)。

在本发明提及的所有文献都在本申请中引用作为参考，就如同每一篇文献被单独引用作为参考那样。此外应理解，在阅读了本发明的上述讲授内容之后，本领域技术人员可以对本发明作各种改动或修改，这些等价形式同样落于本申请所附权利要求书所限定的范围。

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序列表

<110> 上海交通大学医学院附属仁济医院

<120> Pretide-146a在制备缓解或治疗自身免疫性疾病的药物中的应用

<130> 195169

<160> 6

<170> SIPOSequenceListing 1.0

<210> 1

<211> 8

<212> PRT

<213> 智人(Homo sapiens)

<400> 1

Met Cys Ile Leu Ser Phe Glu Asn

1 5

<210> 2

<211> 2301

<212> DNA

<213> 智人(Homo sapiens)

<400> 2

cgctcttcct ttcctggatg gcaccagcag ggccgattgg agtggtaaac cctgggccgg 60

aaggcatgcc aaagggtgga caggatggac aggagacagt agcacaacga ggagggggag 120

aacagcggct gaattggaaa tgataaaata aaatgaaatt ttaggagctc gctggctggg 180

acaggcctgg actgcaagga ggggtctttg caccatctct gaaaagccga tgtgtatcct 240

cagctttgag aactgaattc catgggttgt gtcagtgtca gacctctgaa attcagttct 300

tcagctggga tatctctgtc atcgtgggct tgaggacctg gagagagtag atcctgaaga 360

actttttcag tctgctgaag agcttggaag actggagaca gaaggcagag tctcaggctc 420

tgaaggtata aggagtgtga gttcctgtga gaaacactca tttgattgtg aaaagacttg 480

aattctatgc taagcagggt tccaagtagc taaatgaatg atctcagcaa gtctctcttg 540

ctgctgctgc tactcgttta catttattga ttacttacga tgattcaggt actgttgtaa 600

gtgctttaca tgctgttata cgagactctt gggagaaatc actttaatga agcttgagac 660

acatggcatt gccatgcaat gatttttccc ccctcttcac gggatcagag ggaactaata 720

gaatgtgaca atgattcttt agcagggact gctgaggctt ctggttcctt tttaagatct 780

gcagtgaaag aagatgagaa acatggatat gcccttcttt tggtccccct cttcctttat 840

ttgatctcta cttccttcta taaatatatt agggctacat tgtccctttg tatttcaaac 900

aaggcaaaaa gaggttgtaa ttacacttta ctgcaatcct cagtttctcc agggaacagg 960

aatgcaaagg ctttgaaggc ctctctattt gctgacatgg tcagctgggt gccatgggcc 1020

aagtccttct gttgccctcc tctgtcacca agtaagctag gtcctttctg aggctcaggt 1080

ttgctgtgat gatgatcact tttaggcaga aggttagagg cctcatgagt gctatatgga 1140

ctttattagg ctttagattt gatggggaat aagggatgtg atttgtcttt tgggaactca 1200

tctttgattc atcattgtct cttggtatct tggaatttcc atgtcattac agtctacaga 1260

atgaaagagt aacctgtccc agaggagagg caggtgaaag actccacagc atgctcattc 1320

tcattctgtc ttctcagtga caccgaggtt tactgagtgc ccactatgtg ccaagcactg 1380

tgctcagggc tttctttgta tgcatgatct cagtgaatct caccaagcct catctggaaa 1440

acggggacaa attaacaaca ggatggcaaa ttgaaaaaca cgtaaccatg ttctacagat 1500

ggaaaggggt gcttggttat tatgaaggcc ccctcgcaag cgtgtgggac atgggtgtgt 1560

tctctgggtt gtactgatca gatcaaggac ctcccccacc cttctcacac tctgcccact 1620

tccgcccttt gcttatcaga cccttagcca gtgactcatt ccagaaccag aaccttggtg 1680

aaatctcaac cgacaccaga gatcggtgtc ttcagtccta gactgatgga gaaaatccag 1740

aatatatact agaagctcca aatgctctgg gtttcagctc ctctgtgctg tggacactga 1800

ctttggctca gaactccgat ttagtacaaa aggctcattt ttatttcagg ggcactcttc 1860

ctaaagcaaa cctaataaat gaaatatgga attcacagat acacacacac attaaaaaat 1920

taacctagtg tatctgtgag gagtaggcag aaattcactg tataaaagaa tgcttcattt 1980

catagagaat ttgtgttaag attccattag atagtacatt tctcaaagat ttttgaggtt 2040

gtatttgctt taccaaaact tggtttatgt aagtggaaaa agcatgttgc aaaataactt 2100

ggtgtctatg attcagttta tgtaaaataa taaatgtatg taggaatacg tgtgttgaaa 2160

gatgtacatc aatttgctaa caatggttat ctctgacgtg gtgggatttg agatgtgttt 2220

ttctttttgg ttgtattttt ctctattgtt tgacttaaca cagaacatgt ttggttacaa 2280

caataaagtt attgaagaca a 2301

<210> 3

<211> 99

<212> DNA

<213> 智人(Homo sapiens)

<400> 3

ccgatgtgta tcctcagctt tgagaactga attccatggg ttgtgtcagt gtcagacctc 60

tgaaattcag ttcttcagct gggatatctc tgtcatcgt 99

<210> 4

<211> 8

<212> PRT

<213> 人工序列(Artificial Sequence)

<220>

<221> VARIANT

<222> (1)..(8)

<223> 突变体

<400> 4

Met Ala Ile Leu Ser Phe Glu Asn

1 5

<210> 5

<211> 8

<212> PRT

<213> 人工序列(Artificial Sequence)

<220>

<221> VARIANT

<222> (1)..(8)

<223> 突变体

<400> 5

Met Cys Ile Leu Ser Phe Asp Asn

1 5

<210> 6

<211> 8

<212> PRT

<213> 人工序列(Artificial Sequence)

<220>

<221> VARIANT

<222> (1)..(8)

<223> 突变体

<400> 6

Met Cys Ile Leu Ser Phe Glu Gln

1 5

Claims (14)

1.一种分离的肽，其特征在于，该肽选自：

(a) 氨基酸序列如SEQ ID NO: 1所示的肽；或

(b) 将(a)所限定的肽的氨基酸序列经过一个或多个氨基酸残基的取代而形成的，且具有 (a) 所限定的肽的功能的肽，所述的肽为氨基酸序列如SEQ ID NO: 4、SEQ ID NO: 5或SEQ ID NO: 6所示的肽。

2.如权利要求1所述的肽，其特征在于，所述的肽由pre-miR-146a编码。

3.一种分离的多核苷酸，其编码权利要求1～2任一所述的肽。

4.一种表达载体，其含有权利要求3所述的多核苷酸。

5.一种重组细胞，其中含有权利要求4所述的表达载体或其基因组中含有权利要求3所述的多核苷酸。

6.权利要求1～2任一所述的肽或编码其的多核苷酸在制备缓解或治疗自身免疫性疾病药物中的应用；所述自身免疫性疾病为系统性红斑狼疮。

7.如权利要求6所述的应用，其特征在于，所述的系统性红斑狼疮中，I型干扰素通路异常活化。

8.如权利要求7所述的应用，其特征在于，所述药物藉由抑制I型干扰素通路异常活化发挥缓解或治疗作用。

9.如权利要求6所述的应用，其特征在于，所述的系统性红斑狼疮为：神经精神性狼疮或狼疮肾炎。

10.如权利要求6～9任一所述的应用，其特征在于，所述的肽或编码其的多核苷酸：

抑制体内蛋白尿水平；

下调抗核糖体P蛋白抗体水平；

缓解焦虑情绪；

缓解抑郁情绪；

缓解社交异常；

提高记忆能力。

11.一种制备权利要求1～2任一所述的肽的方法，其特征在于，所述方法包括：培养权利要求5所述的重组细胞，从而重组表达权利要求1～2任一所述的肽；或

所述方法包括：通过体外人工合成的方法制备权利要求1～2任一所述的肽。

12.一种肽复合体，其特征在于，所述的肽复合体包括：

权利要求1～2任一所述的肽；以及

与之连接的功能性分子；所述的功能性分子包括：穿膜肽，携带所述肽到达病灶区域的靶向性分子，可检测标志物，标签分子。

13.一种用于缓解或治疗自身免疫性疾病的药物组合物，其特征在于，所述的药物组合物包括药学上或生理学上可接受的载体以及：

权利要求1～2任一所述的肽或编码其的多核苷酸；或

权利要求4所述的表达载体；

权利要求5所述的重组细胞；或

权利要求12所述的肽复合体。

14.一种用于缓解或治疗自身免疫性疾病的药盒，其特征在于，所述药盒中包括：

权利要求1～2任一所述的肽或编码其的多核苷酸；或

权利要求4所述的表达载体；

权利要求5所述的重组细胞；

权利要求12所述的肽复合体；或

权利要求13所述的药物组合物。

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