CN111868234A - 工程化免疫细胞作为疾病的诊断探针 - Google Patents

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Abstract

本文描述了经过基因工程化的免疫细胞的实施例，其基于免疫细胞迁移到病理部位的能力提供了可用于超灵敏疾病检测的一种新的基于细胞的体内传感器。所述基于细胞的传感器提供了用于早期癌症检测的方法并且允许使用工程化免疫细胞来监测包含但不限于癌症的多种疾病状态。

Description

工程化免疫细胞作为疾病的诊断探针
相关申请的交叉引用
本申请要求于2018年2月27日提交的题为“工程化免疫细胞作为疾病的诊断探针(Engineered immune cells as diagnostic probes of disease)”的美国临时申请第62/635,664号以及于2019年1月18日提交的题为“工程化免疫细胞作为疾病的诊断探针(Engineered immune cells as diagnostic probes of disease)”的美国临时申请第62/794,011号的优先权，所述美国临时申请的全部内容通过引用并入本文。
关于联邦政府资助的研究或开发的声明
本发明是在政府支持下根据美国国立综合医学科学研究所(NationalInstitutes ofGeneral Medical Sciences)授予的合同GM007365进行的。政府享有本发明中的某些权利。
序列表
本申请含有作为ASCII.txt文件创建于2019年2月13日、以电子形式提交的题为“2219072430_ST25”的序列表。序列表的内容以其整体并入本文。
技术领域
本公开总体上涉及包括基因工程化免疫细胞的肿瘤或其它疾病的特异性探针。本公开总体上还涉及制造和使用该探针的方法。
背景技术
原发性疾病和复发的早期检测是显著降低全球癌症负担的有前景的途径。迄今为止，大多数早期检测工作均依赖于疾病状态特征的内源性生物标志物的检测。在癌症中，例如，包含蛋白质、循环肿瘤细胞(CTC)、无细胞循环肿瘤DNA(ctDNA)、癌症衍生的外来体、肿瘤教育的血小板和microRNA的生物标志物已经成为许多研究的主题。内源性生物标志物仍然处于早期疾病检测工作的最前沿，但是许多内源性生物标志物缺乏影响疾病管理所必需的敏感性和特异性。
发明内容
本公开涵盖最初可能或可能不是从患者中分离的新颖的工程化(经过基因修饰的)巨噬细胞的实施例。基因修饰是将编码可检测多肽或核酸(如miRNA)的基因表达盒引入到细胞中，并且处于由肿瘤或疾病特异性代谢因子诱导的基因启动子/增强子的表达控制下。
因此，本公开的一个方面涵盖经过基因修饰的免疫细胞的实施例，所述经过基因修饰的免疫细胞包括异源核酸，所述异源核酸被配置成响应于由接受所述经过基因修饰的免疫细胞的动物或人类受试者的病理状况引起的代谢或分子表达变化来表达可检测药剂。
在本公开的此方面的一些实施例中，所述经过基因修饰的免疫细胞可以是单核细胞、巨噬细胞、T细胞、B细胞、自然杀伤(NK)细胞、骨髓细胞、干细胞或树突状细胞。
在本公开的此方面的一些实施例中，所述异源核酸可以包括至少一个基因表达盒，所述至少一个基因表达盒包括可操作地连接到编码可检测药剂的核酸序列的基因表达调控区，并且其中所述基因表达调控区可以响应于所述经过基因修饰的免疫细胞中的病理学特异性代谢变化以诱导所述可检测药剂的表达。
在本公开的此方面的一些实施例中，所述异源核酸可以是核酸载体。
在本公开的此方面的一些实施例中，所述异源核酸可以是质粒。
在本公开的此方面的一些实施例中，所述基因表达调控区可以包括基因启动子区。
在本公开的此方面的一些实施例中，所述基因表达调控区可以进一步包括基因特异性增强子。
在本公开的此方面的一些实施例中，所述基因启动子可以是ARG1启动子、AKT1启动子、多功能蛋白聚糖(versican)启动子、MIF启动子、Ym1启动子、CD206启动子、FIZZ1启动子、DC-SIGN启动子、CD209启动子、MGL-1启动子、Dectin-1启动子、CD23启动子、半乳凝素-3启动子、Mer酪氨酸激酶启动子、AXL受体蛋白启动子、GAS-6启动子、NOS-2启动子、CD68启动子、CD86启动子、CCL18启动子、CD163启动子、MMR/CD206启动子、CD200R启动子、TGM2启动子、DecoyR启动子、IL-1R II启动子、IL-10启动子、TGF-β启动子、IL-Ira启动子、CCL17启动子、CCL2启动子或CCL24启动子。
在本公开的此方面的一些实施例中，所述可检测药剂可以是可检测多肽或可分泌核酸。
在本公开的此方面的一些实施例中，所述可检测多肽可以是造影剂、与报告基因互补的结合剂、产生可检测分子的酶、光声报告因子、生物发光报告因子、自发荧光报告因子、化学发光报告因子、发光报告因子或比色报告因子、可以通过无创成像检测到的药剂或驱动可检测分子积累的转运体。
在本公开的此方面的一些实施例中，所述可检测药剂可以是可分泌核酸。
在本公开的此方面的一些实施例中，所述可分泌核酸可以是可通过RT-QPCR、QPCR、杂交、测序或质谱法检测的结构化RNA或合成miRNA。
在本公开的此方面的一些实施例中，所述可检测多肽可以是高斯荧光素酶(Gaussia luciferase)(Gluc)。
在本公开的此方面的一些实施例中，所述可检测多肽可以是铁蛋白。
在本公开的此方面的一些实施例中，所述可检测多肽可以是HSV1-胸苷激酶(HSV1-tk)。
在本公开的此方面的一些实施例中，所述可检测多肽可以是多巴胺D2受体的D80RA突变体。
在本公开的此方面的一些实施例中，所述可检测多肽可以是人钠碘同向转运体(hNIS)。
在本公开的此方面的一些实施例中，所述异源核酸可以与如SEQ ID NO：1所示的核苷酸序列具有至少80％的同一性。
在本公开的此方面的一些实施例中，所述基因表达调控区可以响应于所述经过基因修饰的免疫细胞中的肿瘤特异性代谢变化以诱导所述可检测药剂的表达。
在本公开的此方面的一些实施例中，所述经过基因修饰的免疫细胞中的所述肿瘤特异性代谢变化由选自由以下组成的组的癌症引起：膀胱癌、乳腺癌、结直肠癌、子宫内膜癌、头颈癌、肺癌、黑素瘤、非小细胞肺癌、卵巢癌、前列腺癌、睾丸癌、子宫癌、宫颈癌、甲状腺癌、胃癌、脑干胶质瘤、小脑星形细胞瘤、脑星形细胞瘤、胶质母细胞瘤、室管膜瘤、尤文氏肉瘤家族肿瘤(Ewing′s sarcoma family of tumors)、生殖细胞瘤、颅外癌症(extracranial cancer)、霍奇金病白血病(Hodgkin′s disease leukemia)、肝癌、成神经管细胞瘤、神经母细胞瘤、脑瘤、骨肉瘤、骨恶性纤维组织细胞瘤、视网膜母细胞瘤、横纹肌肉瘤、肉瘤、幕上原始神经外胚层肿瘤、松果体肿瘤、视觉通路和下丘脑胶质瘤(visualpathway and hypothalamic glioma)、维尔姆斯瘤(Wilms′tumor)、食管癌、毛细胞白血病、肾癌、口腔癌、胰腺癌、皮肤癌和小细胞肺癌。
在本公开的一些实施例中，所述经过基因修饰的免疫细胞中的病理学特异性代谢变化可以来自炎症。
在一些实施例中，所述异源核酸可以包括多个不同的基因表达调控区，其中每个调控区可操作地连接到编码多种类型的可检测药剂的多个核酸序列，并且其中所述基因表达调控区响应于病理学特异性代谢变化以诱导所述可检测药剂的表达，其中每个可检测药剂的水平指示所述受试者的不同病状。
本公开的另一个方面涵盖一种产生经过基因修饰的免疫细胞的方法，所述方法包括以下步骤：
(a)从受试者中分离出病理学应答性免疫细胞群体；以及
(b)用异源核酸转化(a)中分离出经过分离的所述病理学应答性免疫细胞群体的病理学应答性免疫细胞以产生所述经过基因修饰的免疫细胞，其中所述异源核酸编码可检测药剂，并且其中所述经过基因修饰的免疫细胞被配置成响应于由接受所述经过基因修饰的免疫细胞的动物或人类受试者的病理状况引起的代谢变化来表达所述可检测药剂。
在本公开的此方面的一些实施例中，所述病理学可以是肿瘤。
在本公开的此方面的一些实施例中，所述肿瘤应答性免疫细胞是巨噬细胞。
本公开的又另一个方面涵盖一种检测动物或人类受试者的病理状况的方法的实施例，所述方法包括以下步骤：向动物或人类受试者施用药学上可接受的组合物，所述药学上可接受的组合物包括根据本公开的经过基因修饰的免疫细胞群体；从所述动物或人类受试者中获得生物流体样品；确定所述生物流体样品是否包括由所述经过基因修饰的免疫细胞表达的可分泌可检测药剂，所述经过基因修饰的免疫细胞与所述动物或人类患者的病理状况接触或靠近。
在本公开的此方面的一些实施例中，所述生物流体可以是血液。
在本公开的此方面的一些实施例中，所述可分泌可检测药剂的存在指示所述动物或人类具有引起与所述病理状况接触的所述经过基因修饰的免疫细胞中的表型变化的病理状况。
在一些实施例中，所述经过基因修饰的应答性免疫细胞是肿瘤应答性巨噬细胞。
在本公开的此方面的一些实施例中，所述病理状况可以是癌症。
在一些实施例中，所述病理状况是肿瘤。
在本公开的此方面的一些实施例中，所述方法可以进一步包括以下步骤：在邻近于或依附于所述病理状况的病理学应答性免疫细胞中检测来自所述可检测药剂的信号；产生相对于所述受试者的所述可检测信号的图像；以及确定局部信号在所述受试者中的位置。
在本公开的此方面的一些实施例中，所述生物流体是血液。
在一些实施例中，当邻近于或依附于所述动物或人类患者的病理状况的所述经过基因修饰的免疫细胞未分泌一定量的所述可检测药剂时执行所述方法。
本公开的仍另一个方面涵盖试剂盒的实施例，所述试剂盒包括设备，所述设备用于骨髓源性巨噬细胞(BMDM)分离；以及无内毒素质粒制剂，所述无内毒素质粒制剂编码可操作地连接到ARG-1启动子的可检测药剂。
本公开的另一个方面涵盖用于鉴别受试者的病理状况的方法的实施例，所述方法包括：(a)向所述受试者施用包括异源核酸的经过基因修饰的免疫细胞，所述异源核酸具有编码可检测药剂的核酸序列，其中所述经过基因修饰的免疫细胞响应于由所述受试者的病理状况引起的代谢变化来表达所述可检测药剂；以及(b)检测所述受试者中的所述可检测药剂以鉴别所述病理状况。
在本公开的此方面的一些实施例中，当响应于所述经过基因修饰的免疫细胞中的肿瘤特异性代谢变化时，所述基因表达调控区可以诱导所述可检测药剂的表达。
在本公开的此方面的实施例中，所述经过基因修饰的免疫细胞中的所述肿瘤特异性代谢变化可以由选自由以下组成的组的癌症引起：膀胱癌、乳腺癌、结直肠癌、子宫内膜癌、头颈癌、肺癌、黑素瘤、非小细胞肺癌、卵巢癌、前列腺癌、睾丸癌、子宫癌、宫颈癌、甲状腺癌、胃癌、脑干胶质瘤、小脑星形细胞瘤、脑星形细胞瘤、胶质母细胞瘤、室管膜瘤、尤文氏肉瘤家族肿瘤、生殖细胞瘤、颅外癌症、霍奇金病白血病、肝癌、成神经管细胞瘤、神经母细胞瘤、脑瘤、骨肉瘤、骨恶性纤维组织细胞瘤、视网膜母细胞瘤、横纹肌肉瘤、肉瘤、幕上原始神经外胚层肿瘤、松果体肿瘤、视觉通路和下丘脑胶质瘤、维尔姆斯瘤、食管癌、毛细胞白血病、肾癌、口腔癌、胰腺癌、皮肤癌和小细胞肺癌。
在本公开的此方面的一些实施例中，所述经过基因修饰的免疫细胞中的所述病理学特异性代谢变化来自炎症。
在所述经过基因修饰的免疫细胞的一些实施例中，所述异源核酸包括多个不同的基因表达调控区，其中每个调控区可操作地连接到编码多种类型的可检测药剂的多个核酸序列，并且其中所述基因表达调控区响应于病理学特异性代谢变化以诱导所述可检测药剂的表达，其中每个可检测药剂的水平指示所述受试者的不同状況。
附图说明
当结合附图阅读下文所描述的其各个实施例的详细描述时，将更容易理解本公开的其它方面。
图1示意性地展示了诊断性过继细胞转移。在采用“肿瘤相关联”代谢图谱时，则对巨噬细胞进行基因工程化以分泌合成的生物标志物。工程化巨噬细胞被静脉内注射到同基因宿主中并且被允许在现有的病理位点归巢。然后，血液测试(或其它生物流体的测试)可以用于监测来自指示疾病存在的工程化巨噬细胞的生物标志物的分泌。此系统还可以通过使用可成像的合成生物标志物来提供免疫细胞活化的空间信息。术语“Macs”表示巨噬细胞。
图2A-2F展示了(a)M2巨噬细胞在一系列人类癌症中具有高度代表性；以及(b)精氨酸酶-1在癌症的体外和体内小鼠模型中识别M2巨噬细胞。
图2A展示了描绘了一系列人类癌症中的各种免疫细胞的相对分数的热图。
图2B展示了一系列条形图，其示出了鼠类BMDM响应于如用qPCR测量的IL-4、IL-13和肿瘤条件培养基展现出ARG1表达的浓度依赖性增加。
图2C展示了一系列条形图，其示出了RAW264.7鼠类巨噬细胞响应于如用qPCR测量的IL-4、IL-13和肿瘤条件培养基展现出ARG1表达的浓度依赖性增加。
图2D展示了一系列条形图，其示出了精氨酸酶活性测定在用IL-4、IL-13和肿瘤条件培养基(TCM)刺激时显示出ARG1水平升高。
图2E展示了FACS图和条形图，其示出了从皮下荷瘤小鼠的肿瘤和脾脏中分离出内源性巨噬细胞和静脉内注射的过继转移(ACT)RAW264.7巨噬细胞(左)并且与其脾脏对应物相比通过qPCR对在肿瘤浸润性巨噬细胞中发现的ARG1表达倍数升高进行定量(右)。还大量测量了肿瘤中非巨噬细胞(AO，所有其它)的ARG1水平并且相对于脾脏巨噬细胞进行定量。*指示p＜0.05时的统计显著性，并且***指示p＜0.001时的统计显著性。误差条描绘了至少三次生物复制的平均值的标准误差(s.e.m)。BMDM，骨髓源性巨噬细胞；TCM，肿瘤条件培养基；ACT，过继细胞转移。
图2F展示了通过流式细胞术从皮下荷瘤小鼠或健康小鼠的肿瘤、脾脏、肺和肝脏中分离出内源性巨噬细胞和过继转移(ACT)RAW264.7巨噬细胞(左上左)并且示出了相对于肝脏驻留(对于内源性)或肝脏归巢(对于ACT)巨噬细胞的不同组织中M2基因表达的倍数升高(右上)。*指示p＜0.05时的统计显著性，**指示p＜0.01时的统计显著性，并且***指示p＜0.001时的统计显著性。误差条描绘了平均值的标准误差(s.e.m)。BMDM，骨髓源性巨噬细胞；TCM，肿瘤条件培养基。
图3A-3G展示了巨噬细胞在体外和体内朝着肿瘤迁移。
图3A展示了用肿瘤条件培养基执行的transwell测定(顶部图示)，如化学引诱物通过光学显微镜所显示的，RAW264.7巨噬细胞迁移的浓度依赖性增加(右)，其中每10倍视野的迁移细胞的定量显示迁移增加了四倍以上(底部)。巨噬细胞被示出为红色伪彩色。比例尺长度为400μm。
图3B和3C展示了肿瘤和巨噬细胞信号在随颈背到右肩的距离变化的辐射线迹线上强烈共定位。
图3B是具有叠加伪彩色的一系列数码照片，其示出了VivoTrack 680标记的巨噬细胞在静脉内注射之后的第1到5天在皮下Fluc表达的肿瘤中的时间依赖性积累，如通过体内荧光显微镜可视的。比例尺长度为1cm。左辐射比例和右辐射比例分别适用于肿瘤和巨噬细胞信号。
图3C是示出了对应于图3B的辐射对距离的右肩辐射线迹线的图，其示出了肿瘤和巨噬细胞信号在随颈背到右肩的距离变化的辐射线迹线上强烈共定位。
图3D示出了收集的肿瘤和脾脏的流式细胞术(FACS图)结果，其显示在第五天之后，每个位点中19-25％的驻留巨噬细胞来自过继转移(VivoTrack680阳性)，从而表明随时间推移的肿瘤定殖和巨噬细胞传感器的持久性。图3E是饼图，其示出了在第五天之后，每个位点中19-25％的驻留巨噬细胞来自过继转移，从而表明随时间推移的肿瘤定殖和巨噬细胞传感器的持久性。
图3F和3G展示了中和剂量的抗CCL2抗体(n＝4，p＝0.0077)和抗CSF1抗体(n＝3，p＝0.0049)比其相应的同种型对照抗体更能干扰巨噬细胞向皮下肿瘤的迁移。
图3F展示了具有叠加伪彩色的数码照片，其示出了中和剂量的抗CCL2抗体(n＝4，p＝0.0077)和抗CSF1抗体(n＝3，p＝0.0049)比其相应的同种型对照抗体更能干扰巨噬细胞向皮下肿瘤的迁移。
图3G展示了条形图，其示出了减去背景的辐射值。*指示p＜0.05时的统计显著性，**指示p＜0.01时的统计显著性，并且***指示p＜0.001时的统计显著性。误差条描绘了至少三次生物复制的s.e.m。TCM，肿瘤条件培养基；Ab，抗体；AH，亚美尼亚仓鼠。
图4A-4I展示了巨噬细胞传感器使体内检测和小肿瘤可视化成为可能。
图4A展示了一对条形图，其示出了被工程化成表达pARG1-Gluc报告因子的RAW264.7巨噬细胞在用如从培养基中测定的肿瘤条件培养基(左)和IL-4/IL-13(右)刺激时展现出时间和浓度依赖性Gluc分泌。
图4B是示出了从4T1荷瘤小鼠血浆中测定的RLU值在局部肺微肿瘤中未示出高于健康对照(n＝7，AUC＝0.657，95％CI 0.335-0.979，p＝0.372)的升高但在播散性疾病(n＝11，AUC＝1.00，p＝0.0018)中却显著升高的散点图。RLU值被减去背景以消除来自健康血液的非特异性信号。
图4C是示出了活化巨噬细胞和肿瘤播散的生物发光成像(BLI)的一系列数码照片，从而揭示巨噬细胞传感器激活与疾病部位的明显共定位。
图4D是示出了在局部皮下CT26模型中的来自活化巨噬细胞传感器的减去背景的血浆Gluc可以可靠地检测＞50mm3的AUC＝1.00的肿瘤(n＝6，p＝0.0009)和25-50mm3的AUC＝0.849的肿瘤(n＝6，95％CI 0.620-1.00，p＝0.021)的散点图。
图4E是示出了活化巨噬细胞(白色圆圈)与右肩肿瘤的可见空间重叠的一系列BLI成像的数码照片。比例尺长度1cm。
图4F是示出了右肩辐射线迹线的图，所述右肩辐射线迹线示出了活化巨噬细胞(白色圆圈)与右肩肿瘤的可见空间重叠。比例尺长度为1cm。图4C和4E中的左辐射比例和右辐射比例分别适用于活化巨噬细胞和肿瘤信号。*指示p＜0.05时的统计显著性，**指示p＜0.01时的统计显著性，并且***指示p＜0.001时的统计显著性。误差条描绘了至少三次生物复制的s.e.m。TCM，肿瘤条件培养基；RLU，相对发光单位；AUC，曲线下面积。
图4G展示了荧光活化细胞分选(FACS)迹线，所述FACS迹线示出了在M-CSF中培养的骨髓源性细胞展现出单核细胞/巨噬细胞成熟标志物F4/80的水平增加，其中在培养的第5天出现单核细胞表型。
图4H是示出了用如从培养基中测定的肿瘤条件培养基展现出Gluc的时间依赖性分泌的用pARG1-Gluc报告因子电穿孔的BMDM的图。
图4I展示了散点图，其显示，当局部皮下CT26肿瘤的体积达到60-75mm3(AUC＝0.813，95％CI 0.555-1.00，p＝0.0894)时，来自活化的BMDM传感器的减去背景的血浆Gluc示出了显著升高(n＝4，p＝0.0342)。比例尺长度为1cm。(C)和(E)中的左辐射比例和右辐射比例分别适用于活化巨噬细胞和肿瘤信号。*指示p＜0.05时的统计显著性，**指示p＜0.01时的统计显著性，并且***指示p＜0.001时的统计显著性。误差条描绘了s.e.m。TCM，肿瘤条件培养基；RLU，相对发光单位；AUC，曲线下面积。
图5A-5I展示了巨噬细胞传感器反映炎症和伤口愈合模型中的免疫学时间框架。
图5A展示了条形图，其显示，当暴露于如通过qPCR进行定量的经典促炎细胞因子IFNγ和TNFα时，BMDM和RAW264.7巨噬细胞展现出如通过qPCR进行定量的ARG1 mRNA的最低升高。BMDMARG1水平同样不受LPS影响。
图5B是示出了工程化的表达pARG1-Gluc的巨噬细胞传感器在用相同的促炎细胞因子刺激时不会显著增加培养基中的Gluc水平的条形图。
图5C是一系列数码照片，其显示，肌内注射松节油后0-10天的后腿肌肉的H&E染色展现出典型的急性炎症时间线，其中伴有原发性嗜中性(深色箭头)应答，然后在炎症消退的后期阶段出现巨噬细胞浸润(浅色箭头)。比例尺长度为50μm。
图5D是散点图，其显示，在炎症的第1天(n＝6)或第7天(n＝8)(左)的静脉内巨噬细胞传感器注射后24小时减去背景的血浆Gluc水平在急性炎症阶段(第1天)显示出无升高，但在消退阶段(第7天)显示出显著升高和巨噬细胞活化。这也由以下反映：在急性炎症期间不加区别的AUC＝0.643(95％CI 0.332-0.953，p＝0.371)，但在伤口愈合阶段稳健的AUC＝0.929(95％CI 0.783-1.00，p＝0.006)。
图5E是来自活化巨噬细胞的细胞内Gluc的一系列数字生物发光成像(BLI)图像，其显示，来自背景、注射有传感器的未发炎小鼠(对照)和注射有传感器的急性发炎小鼠(急性感染)的比较信号。这与在第7天消退阶段期间注射巨噬细胞传感器时的BLI图像形成对比，其中在伤口愈合位点(黑色圆圈)处的巨噬细胞的局部活化清晰可见。比例尺长度为1cm。*指示p＜0.05时的统计显著性，并且***指示p＜0.001时的统计显著性。误差条描绘了至少三次生物复制的s.e.m。RLU，相对发光单位；AUC，曲线下面积。
图5F是一系列数码照片，其显示，鼻内接种LPS之后肺部H&E染色的显微照片展现出类似的急性炎症时间线，其中随着伤口愈合过程的进行，在第7小时处呈现出中性粒细胞浸润(绿色箭头)，然后逐渐被巨噬细胞(黄色箭头)代替。LPS接种后48小时伤口愈合达到峰值并且到72小时处，健康的肺部架构存在某种程度的恢复。比例尺长度为50μm。
图5G是散点图，其显示，注射有BMDM传感器的小鼠的血浆Gluc测量反映了急性炎症和伤口愈合动力学在48小时处达到峰值，其中AUC＝0.975(95％CI 0.900-1.00，n＝5，p＝0.0054)。
图5H和5I展示了散点图(图5H)和一系列数字BLI图像(图5I)，其显示，BMDM传感器可以在存在(AUC＝0.975，95％CI 0.900-1.00，n＝5，p＝0.0054)和不存在(AUC＝1.00，95％CI 1.00-1.00，n＝4，p＝0.0066)LPS诱导的急性炎症的情况下通过血浆Gluc测量(图5H)以及通过活化巨噬细胞的BLI(图5I)稳健地区分转移性4T1肿瘤。*指示p＜0.05时的统计显著性，**指示p＜0.01时的统计显著性，并且***指示p＜0.001时的统计显著性。误差条描绘了s.e.m。LPS，脂多糖；RLU，相对发光单位；AUC，曲线下面积。
图6A-6F展示了巨噬细胞传感器优于临床使用的癌症复发的生物标志物。
图6A是示出了皮下植入的LS174T肿瘤在nu/nu小鼠(n＝12)中展现出指数增长的图。
图6B是示出了通过酶联免疫吸附测定(ELISA)检测到的血浆CEA水平增加的图。
图6C是散点图，其显示，在血浆采样的第一天，来自巨噬细胞传感器的减去背景的血浆Gluc测量(左)相比于CEA测量(右)能够更好地区分荷瘤小鼠(n＝7)和健康小鼠(n＝5)。
图6D是示出了巨噬细胞传感器(0.914，95％CI 0.738-1.00，p＝0.019)相比于内源性生物标志物(0.829，95％CI 0.590-1，p＝0.062)反映在接受者操作曲线上的提高的AUC值中的敏感性和特异性提高的图。*指示p＜0.05时的统计显著性。AUC表示曲线下面积。
图6E是混合散点图/箱形图，其显示，cfDNA的血浆浓度不会显著增加到健康水平以上，直到皮下CT26肿瘤体积达到1500-2000mm3。
图6F展示了肯定图/否定图，其显示，通过qPCR在小鼠血浆cfDNA(n＝23，左；n＝28，右)中未检测到测定突变，直到肿瘤体积大于约1300mm3。向下的条指示荷瘤小鼠，其中在血浆cfDNA中未检测到突变并且竖直的条指示检测到突变。
图7A-7C展示了骨髓源性巨噬细胞纯度和电穿孔效率。
图7A是FACS图，其显示，用10ng/mL鼠类刺激因子(M-CSF)活化5天后，收集的BMDM通过F4/80染色展现出97.4％的纯度。
图7B是FACS图，其显示，用pARG1-Gluc报告因子质粒对BMDM进行电穿孔，其中效率大约为40％，如通过流式细胞术进行定量的。
图7C是FACS图，其显示，用pARG1-Gluc报告因子质粒对BMDM进行电穿孔，其中效率为＞80％并且活力为约60％，如通过流式细胞术进行定量的。
图8展示了pARG1-Gluc报告因子质粒图。pARG1-Gluc构建体紧靠3780个碱基对ARG1增强子/启动子序列的下游含有高斯硬脑膜荧光素酶(Gaussia Dura Luciferase)。构建体还含有组成型CMV启动子控制下的增强型绿色荧光蛋白(eGFP)以进行细胞分选并且确定转染或电穿孔效率。
图9是示出了RAW264.7巨噬细胞的VivoTrack 680标记的FACS图。用未染色的巨噬细胞(红色)上方的4-5个数量级荧光观察到巨噬细胞的均匀标记(蓝色)。
图10A和10B展示了使用瞬时转染的骨髓源性巨噬细胞对转移性乳腺癌的检测。
图10A是散点图，其显示，当静脉内注射BMDM传感器时，来自携带转移性乳腺癌的小鼠(n＝5)血浆中的RLU值显著高于(AUC＝0.920，95％CI 0.739-1.00，p＝0.028)健康对照(n＝5)。
图10B是一系列数码照片，其显示活化BMDM(白色圆圈)和转移性结节的BLI显示出后肢中的共定位。左辐射比例和右辐射比例分别适用于活化巨噬细胞和肿瘤信号。RLU，相对发光单位；AUC，曲线下面积。
图11展示了转移性乳腺癌模型中的肺微肿瘤。静脉内注射4T1细胞一周后，如通过BLI可视化的，疾病负担仍然定位于肺(左)。肺的离体检查还显示肺胸膜衬壁的微肿瘤未升高(右)。比例尺长度为1cm。
图12A-12C展示了结直肠癌的皮下局部模型中的巨噬细胞传感器优化。
图12A是展示了通过数显卡尺测量的肿瘤体积与通过BLI(r2＝0.918)估计的肿瘤体积呈正相关的图。虚线示出了线性回归的95％置信区间。
图12B是展示了工程化巨噬细胞传感器无法检测体积大于1500mm3的可见坏死肿瘤的图，这可能是由于传感器对无血管肿瘤核心的浸润性差。
图12C是散点图，其显示，与健康对照相比，巨噬细胞传感器注射后24小时检测到50-200mm3的局部皮下肿瘤，血浆Gluc明显升高，但在随后几天中，健康小鼠和荷瘤小鼠两者中的信号均下降。
图13示出了一对箱形图，其显示，乳酸诱导巨噬细胞中ARG1的表达；100mM乳酸在刺激后24小时诱导骨髓源性(左)和RAW264.7(右)巨噬细胞两者中的FIZZ1和ARG1 mRNA的表达。*指示p＜0.05时的统计显著性，**指示p＜0.01时的统计显著性。误差条描绘了平均值的标准误差。BMDM，骨髓源性巨噬细胞。
图14A和14B示出了用于巨噬细胞分选的流式细胞术门控策略。
图14A展示了一系列FACS图，其示出了用于肿瘤、脾脏、肺和肝中的过继转移(VT680+)和幼稚(VT680-)巨噬细胞的流式细胞术门控策略。CD11b+F4/80+细胞的群体在两个组织中均良好分离，并且基于荧光减一对照对过继转移的巨噬细胞进行门控。FMO，荧光减一。
图14B展示了一系列饼图，其示出了过继转移后五天存在于各种组织中的所施用(VT680+)对内源性(VT680-)巨噬细胞的平均分数组成。
图15展示了相对于CT26肿瘤中的缺氧的巨噬细胞定位的免疫荧光；来自注射有荧光标记的骨髓源性单核细胞(底部)的小鼠的CT26肿瘤的免疫荧光显微照片显示巨噬细胞与缺氧区共定位。来自未注射有哌莫硝唑和注射有非荧光标记的骨髓源性单核细胞(顶部)的小鼠的CT26肿瘤的免疫荧光在绿色或红色通道中均未示出证实特异性的任何信号。图像以10倍的放大率示出，并且比例尺长度为250μm。CB640，CellBrite 640；BMDM，骨髓源性单核细胞。
图16展示了静脉内注射巨噬细胞传感器对肿瘤进展的作用；在图中显示，在皮下荷瘤小鼠(n＝4)中静脉内注射BMDM传感器导致相对于媒剂注射小鼠(n＝3)的肿瘤体积的初始回归(第4天，p＝0.058)，然后恢复指数增长。左图示出了个别肿瘤的生长并且右图示出了平均肿瘤体积。在任何尺寸的肿瘤超过15mm时处死小鼠，并且仅针对一组中所有小鼠仍存活的时间点在右图中示出平均肿瘤体积。误差条描绘了平均值的标准误差。BMDM，骨髓源性巨噬细胞。
图17是展示了用锁核酸探针进行的检测的缺失突变极限的一对图。CT26和野生型Balb/c基因组DNA的实时qPCR扩增图显示，在等位基因频率分别为0.1％和1％时，可以检测到7号染色体(左)和19号染色体(右)缺失。每个病状一式三份地示出。RFU，相对荧光单位；AF，等位基因频率。
图18A-18D示出了核酸序列SEQ ID NO 1。
具体实施方式
在更详细地描述本公开之前，应理解，本公开不限于所描述的特定实施例并且因此当然可以改变。还应理解，本文中使用的术语仅出于描述特定实施方案的目的，而无意于限制本发明，因为本公开内容的范围仅由所附权利要求书限制。。
在本文中提供了值范围的情况下，应理解，每个中间值、到下限的第十个单位(除非上下文另外明确指明)、在所述范围的上限与下限之间以及在所陈述的范围内的任何其它所陈述的值或中间值均涵盖在本公开内。这些较小范围的上限和下限可以独立地包含在更小的范围中，并且也涵盖在本公开内，这受制于所陈述的范围中的任何明确排除的限值。在所陈述的范围包含限值中的一个或两个限值的情况下，排除被包含在内的限值中的任一个或两个限值的范围也包含在本公开内。
除非另外定义，否则本文所使用的所有技术和科学术语具有与本公开所属领域的普通技术人员通常所理解的含义相同的含义。尽管与本文所描述的方法和材料类似或等同的任何方法和材料也可以用于本公开的实践或测试中，但是现在描述优选的方法和材料。
本文中所引用的申请和专利中的每一个以及这些申请和专利中的每一个所引用的每个文件或参考文献(包含在每个已发布专利的诉讼期间；“申请引用的文件”)以及与这些申请和专利中的任一个相对应和/或要求优先权的PCT和外国申请或专利中的每一个以及在申请引用的文件中的每一个中所引用或所参考的文献中的每一个均通过引用明确地并入本文。进一步地，本文、权利要求之前的参考文献列表或本文自身所引用的文件或参考文献；以及这些文件或参考文献(“本文中所引用的参考文献”)中的每一个以及本文中所引用的参考文献(包含任何制造商的说明书、说明等)中的每一个中所引用的每个文件或参考文献均通过引用明确地并入本文。
如对于本领域技术人员将显而易见的是，在阅读本公开时，本文所描述和展示的单独实施例中的每一个均具有离散的组成部分和特征，所述组成部分和特征可以在不偏离本公开的范围或精神的情况下易于与其它若干个实施例中的任何实施例的特征分离或组合。任何叙述的方法可以以所叙述事件的顺序或以逻辑上可能的任何其它顺序进行。
除非另有指示，否则本公开的实施例将采用在本领域技术范围内的医学、有机化学、生物化学、分子生物学、药理学等技术。此类技术在文献中有充分解释。
应注意，除非上下文另有清楚地指明，否则如在本说明书和所附权利要求中所使用的单数形式“一个/一种(a/an)”和“所述(the)”包含复数指代物。因此，例如，对“支撑物”的引用包含多种支撑物。在本说明书和以下的权利要求中，除非有明显的相反意图，否则将引用大量术语，这些术语将被定义成具有以下含义。
如本文所使用的，除非另有说明，否则以下术语具有赋予其的含义。在本公开中，“包括(comprises/comprising)”、“含有(containing)”和“具有(having)”等可以具有美国专利法赋予其的含义并且可以意指“包含(includes/including)”等；“基本上由........组成(consisting essentially of/consists essentially)”等，当应用于本公开所涵盖的方法和组合物时是指类似于本文所公开的组合物的组合物，但是可以含有另外的结构基团、组合物组分或方法步骤(或如上文所讨论的类似物或其衍生物)。然而，与本文所公开的对应组合物或方法的另外的结构基团、组合物组分或方法步骤相比，此类另外的结构基团、组合物组分或方法步骤等不会实质性地影响组合物或方法的一个或多个基本和新颖特性。当应用于本公开所涵盖的方法和组合物时，“基本上由........组成(consistingessentially of/consists essentially)”等具有美国专利法赋予的含义并且术语是开放式的，从而允许超出所叙述的存在，只要所叙述的基本或新颖特性不会因所存在的超过所列举的内容而改变，但是排除现有技术实施例。
通过端点在本文中叙述的数值范围包含归入所述范围内的所有数字和分数(例如，1到5包含1、1、5、2、2.75、3、3.90、4和5)。还应理解，假定所有数字和其分数均被术语“约”修饰。术语“约”意指所参考数字的正负0.1到50％、5-50％或10-40％，优选地10-20％，更优选地10％或15％。
在描述各个实施例之前，除非另有指示，否则提供以下定义并且应当使用以下定义。
缩写
SEAP，分泌型胚胎碱性磷酸酶；MRI，磁共振成像；BLI，生物发光成像；ROI，感兴趣的区；AUC，曲线下面积；RG，报告基因；TS，肿瘤特异性；Gluc，高斯荧光素酶；CTC，循环肿瘤细胞；ctDNA，循环肿瘤DNA；HSV1-tk，HSV1-胸苷激酶；hNIS，人钠碘同向转运体；ACT，过继细胞转移；RLU，相对发光单位；BMDM，骨髓源性巨噬细胞。
定义
如本文所使用的，术语“过继细胞转移(ACT)”是指细胞向患者的转移。所述细胞可能源自患者或源自另一个个体。在自体癌症免疫疗法中，T细胞从患者中提取、进行基因修饰和体外培养并且返回到同一患者。
如本文所使用的，术语“自体”是指从个体动物或人类中分离或源自所述个体动物或人类并且然后返回到同一个体的细胞或细胞群体。所述细胞在返回到个体之前可能已经经过基因修饰或培养。
如本文所使用的，术语“生物流体”是指生物流体样品涵盖从个体获得的各种流体样品类型并且可以用于诊断或监测测定中。所述定义涵盖血液总量或血清)、脑脊髓液(CSF)、唾液、眼泪、痰、呼吸、尿液和其它生物学来源的液体样品。所述定义还包含在取得之后以任何方式操纵的样品，如用试剂处理、增溶或针对如蛋白质或多核苷酸等某些组分加以富集。
如本文所使用的，术语“血液样品”是来自血液、优选地外周(或循环)血的生物样品。血液样品可以是，例如全血、血浆、血清或此类流体的增溶制剂，其中细胞组分已经被裂解以将细胞内内容物释放到缓冲液或其它液体介质中。
如本文所使用的，术语“生物发光”是指化学发光的一种类型，其通过生物分子(具体地是蛋白质)发光。生物发光的基本条件是在加氧酶的存在下结合或游离的分子氧、作用于底物的萤光素酶、在分子氧的存在下的萤光素并且将底物转化成激发态，其在返回到较低的能级时以光的形式释放能量。
如本文所使用的，术语“生物标志物”是指抗原，如但不限于可以在细胞表面发现的肽、多肽、蛋白质(单体或多聚体)；细胞的细胞内组分或生物流体的组分或成分，如血清样品中的可溶性蛋白；并且所述抗原是作为肿瘤或肿瘤细胞的指示物进行客观测量和评估的特性。从受试者人类或动物中分离的生物流体或生物样品中存在这种生物标志物可以指示受试者是病理学(例如癌症)的携带者。这种生物标志物表达的变化可能与疾病或进展的风险增加或与疾病对给定治疗的应答预测有关。
如本文所使用的，术语“癌症”应当作为针对其中异常细胞不受控制地分裂的疾病的通用术语被给予其普通含义。具体地，癌症是指血管生成相关的癌症。癌症细胞可以侵入附近组织并且可以通过血流和淋巴系统扩散到身体的其它部分。
存在若干种主要癌症类型，例如，癌是始于皮肤或标示或覆盖内部器官的组织的癌症。肉瘤是始于骨、软骨、脂肪、肌肉、血管或其它结缔组织或支持性组织的癌症。白血病是始于如骨髓等血液形成组织并且引起大量异常血液细胞生成并且进入血流的癌症。淋巴瘤是始于免疫系统的细胞的癌症。
当正常细胞丧失其表现为指定、控制和协调单元的能力时，就会形成肿瘤。通常，实体瘤是通常不含有囊肿或液体区域的异常组织块(一些脑肿瘤确实具有囊肿和充满液体的中央坏死区域)。通过出错的不同过程，单个肿瘤甚至可能在其内具有不同类型的细胞。实体瘤可能是良性的(例如非癌性)或恶性的(例如癌性)。不同类型的实体瘤是以形成其的细胞类型命名的。实体瘤的实例为肉瘤、癌和淋巴瘤。白血病(血液癌症)通常不会形成实体瘤。
代表性癌症包含但不限于膀胱癌、乳腺癌、结直肠癌、子宫内膜癌、头颈癌、白血病、肺癌、淋巴瘤、黑素瘤、非小细胞肺癌、卵巢癌、前列腺癌、睾丸癌、子宫癌、宫颈癌、甲状腺癌、胃癌、脑干胶质瘤、小脑星形细胞瘤、脑星形细胞瘤、胶质母细胞瘤、室管膜瘤、尤文氏肉瘤家族肿瘤、生殖细胞瘤、颅外癌症、霍奇金病白血病、急性淋巴细胞白血病(acutelymphoblastic leukemia)、急性髓性白血病、肝癌、成神经管细胞瘤、神经母细胞瘤、一般脑瘤、非霍奇金淋巴瘤(non-Hodgkin′s lymphoma)、骨肉瘤、骨恶性纤维组织细胞瘤、视网膜母细胞瘤、横纹肌肉瘤、一般软组织肉瘤、幕上原始神经外胚层和松果体肿瘤、视觉通路和下丘脑胶质瘤、维尔姆斯瘤、急性淋巴细胞性白血病(acute lymphocytic leukemia)、成人急性髓性白血病、成人非霍奇金淋巴瘤、慢性淋巴细胞性白血病、慢性髓性白血病、食管癌、毛细胞白血病、肾癌、多发性骨髓瘤、口腔癌、胰腺癌、原发性中枢神经系统淋巴瘤、皮肤癌、小细胞肺癌等。
肿瘤可以分为恶性的或良性的。在两种情况下，均存在异常的细胞聚集和增殖。在恶性肿瘤的情况下，这些细胞表现得更具侵袭性，从而获得如增加的侵入性等特性。最终，肿瘤细胞可能甚至获得以下能力：脱离其起源的微观环境、扩散到身体的另一个区域(具有迥然不同的环境，通常不利于其生长)并且在此新位置中继续快速生长并分裂。这被称为转移。一旦恶性细胞已经转移，则要实现治愈就更加困难。
良性肿瘤的侵入倾向较小并且转移的可能性较小。脑肿瘤在脑内广泛扩散，但是通常不会转移到大脑外部。胶质瘤在大脑内部(甚至跨越大脑半球)具有很强的侵入性。尽管其确实以不受控制的方式分裂。取决于其位置，胶质瘤可能像恶性病变一样危及生命。这方面的实例是脑部良性肿瘤，其可以生长并占据颅骨内的空间，从而导致脑部压力增加。
如本文所使用的，术语“细胞或细胞群体”是指从组织中切除或通过组织培养技术在体外生长的经过分离的细胞或多个细胞。最具体地，细胞群体是指动物或人类的组织中的体内细胞。
如本文所使用的，术语“编码序列”和“编码所选多肽”是指例如当核酸存在于活细胞(体内)并且置于适当的调控序列(或“控制元件”)的控制下时被转录(在DNA的情况下)和翻译(在mRNA的情况下)成多肽的核酸分子。
如本文所使用的，术语“控制元件”是指但不限于转录启动子、转录增强子元件、转录终止信号、聚腺苷酸化序列(位于翻译终止密码子的3′)、用于优化翻译起始的序列(位于编码序列的5′)以及翻译终止序列。
术语“细胞因子”是由一个细胞群体释放的蛋白质的通用术语，所述蛋白质作为细胞间介体作用于另一个细胞群体。此类细胞因子的实例为淋巴因子、单核因子和传统的多肽激素。细胞因子中包含生长激素，如人生长激素、N-甲硫氨酰基人生长激素和牛生长激素；甲状旁腺激素；甲状腺素；胰岛素；胰岛素原；松弛肽(relaxin)；松弛素(prorelaxin)；糖蛋白激素，如促卵泡激素(FSH)、促甲状腺激素(TSH)和黄体化激素(LH)；肝细胞生长因子；纤维母细胞生长因子；催乳素；胎盘催乳素；肿瘤坏死因子α和肿瘤坏死因子β；副中肾管抑制物质；小鼠促性腺激素关连肽；抑制素；活化素；血管内皮生长因子；整联蛋白；血小板生成素(TPO)；神经生长因子，如NGF-α；血小板生长因子；胎盘生长因子、转化生长因子(TGF)，如TGF-α和TGF-β；胰岛素样生长因子-1和胰岛素样生长因子-11；促红细胞生成素(EPO)；骨诱导因子；干扰素，如干扰素-α、干扰素-β和干扰素-γ；集落刺激因子(CSF)，如巨噬细胞-CSF(M-CSF)、粒细胞巨噬细胞-CSF(GM-CSF)和粒细胞-CSF(G-CSF)；白介素(IL)，如IL-1、IL-2、IL-3、IL-4、IL-5、IL-6、IL-7、IL-8、IL-9、IL-10、IL-11、IL-12、IL-13、IL-15、IL-18、IL-21、IL-22、IL-23和IL-33；肿瘤坏死因子，如TNF-α或TNF-β；以及包含LIF和kit配体(KL)的其它多肽因子。如本文所使用的，术语细胞因子包含来自天然来源或来自重组细胞培养物的蛋白质以及天然序列细胞因子的生物活性等同物。
如本文所使用的，术语“递送到细胞”是指通过全身靶向递送进行体内施用或通过将一个或多个细胞与所述效应子一起进行离体或体外温育来用小分子化合物、核酸、肽或多肽或能够表达抑制性核酸或多肽的核酸直接靶向细胞。
术语“可检测药剂”是指可通过被设计成特异性检测这种试剂的相对或绝对浓度的任何测定检测的分子(例如小分子、肽、蛋白质RNA、DNA)。在一些实施例中，可检测药剂是对其引入的免疫细胞而言外源性的多肽。可检测药剂可以通过无创成像方法而可检测，如MRI成像、PET成像、SPECT成像和发光成像，包含但不旨在限于光声报告因子、生物发光报告因子、自发荧光报告因子、化学发光报告因子、发光报告因子或比色报告因子。适合的MRI报告基因包含例如编码肌酸激酶的基因；酪氨酸酶；转铁蛋白受体；铁蛋白；Mag A。PET成像报告基因包含但不限于如单纯性疱疹病毒1胸苷激酶(HSV1-tk)；次黄嘌呤磷酸核糖基转移酶；L-氨基酸脱羧酶；多巴胺2受体(D2R，包含突变体D2RA80)；生长抑素受体；雌激素受体(hERL)；多巴胺转运体；钠碘同向转运体；儿茶酚胺转运体；β-半乳糖苷酶。PET/SPECT成像报告基因包含但不限于单纯性疱疹病毒1型胸苷激酶和多个优化的突变体，如HSV1-sr39tk；多巴胺2型受体；钠碘同向转运体；生长抑素2型受体；人类去甲肾上腺素转运体；人类雌激素受体α；人类脱氧胞苷激酶的突变体；和重组癌胚抗原。生物发光报告基因包含但不限于萤火虫荧光素酶(fl)；高斯荧光素酶(Gluc)；合成海肾荧光素酶(hrl)；增强型绿色荧光蛋白(egfp)；红色荧光蛋白(rfp)；单体红色荧光蛋白(mrfp1)等。适合于并入到本公开中的遗传构建体中的报告基因进一步可能提供多模态成像方法。
如本文所使用的，术语“表达盒”是指能够指导任何RNA转录物表达的任何核酸构建体，所述RNA转录物包含感兴趣的基因/编码序列以及非翻译RNA，如shRNA、微RNA、siRNA、反义RNA等。此类盒可以被构建成“载体”、“载体构建体”、“表达载体”或“基因转移载体”以将表达盒转移到靶细胞中。因此，所述术语包含克隆和表达载体以及质粒和病毒载体。
如本文所使用的，术语“表达载体”是指可用于表达编码本文所使用的蛋白质的DNA并且用于产生蛋白质的核酸。只要表达载体在各种原核和/或真核宿主细胞中表达编码蛋白质的基因并且产生此蛋白质，所述表达载体就不受限制。当酵母、动物细胞或昆虫细胞用作宿主时，表达载体优选地至少包括启动子、起始密码子、编码蛋白质的DNA和终止密码子。其还可以包括编码信号肽的DNA、增强子序列、编码蛋白质的基因的5′非翻译区和3′非翻译区、剪接点、聚腺苷酸化位点、选择性标志物区和复制子。如果需要的话，表达载体还可以含有通常使用的用于基因扩增的基因(标志物)。
在细菌中表达蛋白质的启动子/操纵子区包括启动子、操纵子和夏因-达尔加诺(Shine-Dalgarno)(SD)序列(例如，AAGG)。例如，当宿主是大肠杆菌时，其优选地包括Trp启动子、lac启动子、recA启动子，λ.PL启动子、b 1pp启动子、tac启动子等。当宿主是如哺乳动物细胞等真核细胞时，其实例为SV40衍生的启动子、逆转录病毒启动子、热休克启动子等。当然，启动子不限于上述实例。另外，使用增强子对于表达而言是有效的。优选的起始密码子是，例如甲硫氨酸密码子(ATG)。常用的终止密码子(例如，TAG、TAA和TGA)被例示为终止密码子。通常，所使用的天然或合成终止子用作终止子区。也可以使用本领域通常使用的如衍生自SV40的增强子序列、聚腺苷酸化位点和剪接点。可以根据通常方法来使用通常采用的选择性标志物。其实例是如四环素、氨苄青霉素或卡那霉素等抗生素的抗性基因。
本文所使用的，表达载体可以通过将至少上文提及的启动子、起始密码子、编码蛋白质的DNA、终止密码子和终止子区连续地且循环地连接到适当的复制子来制备。如果期望的话，可以通过如用限制酶消化或与T4 DNA连接酶连接等方法来使用适当的DNA片段(例如，连接子、限制位点等)。可以通过将上文提及的表达载体导入宿主细胞来制备转化体。
如本文所使用的，术语“异源序列”或“异源核酸”是指源自非特定宿主细胞所原有的来源(或如果来自同一来源，则从其原始形式进行修饰)的核酸。因此，细胞中的异源表达盒是例如通过连接到来自表达载体而不是染色体DNA的核苷酸序列、连接到异源启动子、连接到报告基因等而对于特定宿主细胞而言非内源的表达盒。
如本文所使用的，术语“炎症”是指其中体内平衡被异常或失调的炎症应答破坏的急性和慢性病症。这些病状由多种炎症因子引发和介导，包含氧化应激；趋化因子；细胞因子；血液/组织屏障的破坏；与诱导过量的pro-细胞损伤、促炎/破坏体内平衡介体的白细胞、单核细胞/巨噬细胞或实质细胞结合的自身免疫性疾病或其它病状。这些疾病发生在广泛的组织和器官中并且目前正在通过如皮质类固醇、非甾体类抗炎药、TNF调节剂、COX-2抑制剂等抗炎药进行治疗。
如本文所使用的，术语“体内成像”是指其中可以在无需牺牲生命的情况下可检查生物的结构状态、功能状态或生理状态的方法或过程。
如本文所使用的，术语“萤光素酶”是指催化发光反应的加氧酶。例如，细菌荧光素酶催化黄素单核苷酸和脂族醛的氧化，因此反应产生光。在海洋节肢动物中发现的另一类萤光素酶催化海萤荧光素的氧化，并且另一类萤光素酶催化鞘翅目萤光素的氧化。因此，“荧光素酶”是指催化生物发光反应的酶或光蛋白。萤光素酶(如萤火虫萤光素酶和海肾萤光素酶)是起催化作用并且在生物发光产生反应期间未改变的酶。萤光素酶光蛋白(如与萤光素非共价结合的aequorin光蛋白和obelin光蛋白)在生物发光产生反应期间通过萤光素的释放而改变。萤光素酶是在生物或其变体或突变体(如通过诱变产生的变体)中天然存在的蛋白质，所述萤光素酶具有与天然存在的蛋白质不同的一种或多种性质，如热稳定性或pH稳定性。萤光素酶和其经过修饰的突变体或变体形式是众所周知的。例如，提及“海肾荧光素酶”意指从海肾属成员中分离的酶或从任何其它来源(如从另一种珊瑚虫纲)获得的或已经合成制备的等效分子。提及“高斯荧光素酶”意指从高斯属成员中分离的酶。
“生物发光蛋白质”是指能够作用于生物发光引发剂分子底物以产生或发出生物发光的蛋白质。
“生物发光引发剂分子”是可以与生物发光供体蛋白质反应以产生生物发光的分子。生物发光引发剂分子包含但不限于腔肠素、其类似物和其功能衍生物。腔肠素的衍生物包含但不限于腔肠素400a、腔肠素cp、腔肠素f、腔肠素fcp、腔肠素h、腔肠素hcp；腔肠素ip、腔肠素n、腔肠素O、腔肠素c、腔肠素c、腔肠素i、腔肠素icp、腔肠素2-甲基、苄基-腔肠素双脱氧腔肠素和深蓝色腔肠素(DBC)(更详细地描述于美国专利第6,020,192号；第5,968,750号和第5,874,304号)。
如本文所使用的，术语“巨噬细胞”是指经典活化巨噬细胞(M1巨噬细胞)和替代活化巨噬细胞(M2巨噬细胞)。Martinez等人，《免疫学年度评论(Annu.Rev.Immunol.)》27：451-483(2009)。通常，M1巨噬细胞展现出强有力的抗微生物性质，令人联想到1型辅助性T淋巴细胞(Th1)应答。相反，M2巨噬细胞促进2型辅助性T淋巴细胞(Th2)样应答、分泌较少的促炎细胞因子并且通过营养因子合成和吞噬作用帮助炎症消退。Mosser等人，《自然综述(Nature Rev.)》8：958-969(2008)。M2巨噬细胞可以进一步分成由特定细胞因子谱限定的三个不同亚类，即，M2a、M2b和M2c。Mantovani等人，《免疫学趋势(Trends Immunol.)》25：677-686(2004)。尽管M2巨噬细胞通常以促炎细胞因子(如IL-12)的低产量和抗炎细胞因子(如IL-10)的高产量为特征，但是M2b巨噬细胞保留高水平的炎性细胞因子(如TNF-α和IL-6)产量(Mosser，《白细胞生物学杂志(J.Leukocyte Biol.)》73：209-212(2003))。
巨噬细胞可以通过其微环境极化以假设与炎症和愈合的不同阶段相关联的不同表型。Stout等人，《免疫学杂志(J.Immunol.)》175：342-349(2005)。某些巨噬细胞对于伤口愈合而言是必不可少的。其参与细胞募集和组织防御的早期阶段以及组织体内平衡和修复的后期阶段。(Pollard，《自然综述》9：259-270(2009))。衍生自外周血液单核细胞的巨噬细胞已经用于治疗难治性溃疡。Danon等人，《实验老年学(Exp.Gerontol.)》32：633-641(1997)；Zuloff-Shani等人，《输血和清血科学(Transfus.Apher.Sci.)》0：163-167(2004)，所述文献中的每一个均通过引用并入本文，如同以其整体予以阐述。
如本文所使用的，术语“修饰基因表达的水平”是指产生变化，即基因的转录或翻译产物的量的减少或增加。基因的转录产物在本文中旨在指基因的信使RNA(mRNA)转录的产物并且可以是剪接前或剪接后的mRNA。可替代地，术语“修饰基因表达的水平”可以指由于siRNA与细胞内容物相互作用而由细胞产生的蛋白质、多肽或肽的量的变化。例如但不限于，如果对应的mRNA物种由于与引入到细胞中的siRNA相关联而经受降解，则可以降低衍生自基因的多肽的量。
术语“调节”是指影响(例如，促进或阻碍)细胞功能的方面的组合物活性，所述细胞功能包含但不限于细胞生长、增殖、凋亡等。
术语“核酸”、“核酸序列”或“寡核苷酸”也涵盖多核苷酸。“多核苷酸”是指在一个核苷的3′羟基与第二核苷的5′羟基之间通过磷酸二酯键连接进而通过其3′羟基连接到第三核苷的5′羟基等以形成包含通过磷酸二酯主链连接的核苷的聚合物的核苷酸直链。“经过修饰的多核苷酸”是指其中天然核苷酸已经被经过修饰的核苷酸部分代替的多核苷酸。
如本文所使用的，术语“可操作地连接”是指其中如此描述的组件被配置成执行其通常功能的元件布置。因此，当存在适当的酶时，可操作地连接到编码序列的给定启动子(例如，报告因子表达盒)能够影响编码序列的表达。启动子或其它控制元件不必与编码序列毗连，只要其起到指导其表达的作用。例如，中间的未翻译但仍被转录的序列可以存在于启动子序列与编码序列之间，并且仍然可以认为启动子序列“可操作地连接”到编码序列。
如本文所使用的，术语“引物”是指与待扩增或待复制的DNA区段互补的寡核苷酸。通常地，引物用于PCR。引物与模板DNA杂交(或“退火”)并且被聚合酶用作复制/扩增过程的起点。“互补”意指引物序列可以与模板形成稳定的氢键复合物。
术语“启动子”是指导多核苷酸转录的DNA序列。通常地，启动子可以位于待转录的多核苷酸的5′区中，靠近这种多核苷酸的转录起始位点。更通常地，启动子被限定为第一外显子的上游区；更通常地，被限定为多个转录起始位点中的第一转录起始位点的上游区。通常，启动子能够指导位于启动子的3′的互补DNA链的每一个上的基因的转录。换句话说，许多启动子展现出双向性并且当以任一朝向(即相对于基因的编码区为5′到3′或3′到5′)存在时可以指导下游基因的转录。另外，启动子还可包含至少一个控制元件，如上游元件。此类元件包含影响多核苷酸的转录的上游活化剂区(UAR)和任选地其它DNA序列，如合成上游元件等。有利于在本公开的实施例中使用的启动子包含但不限于AKT1启动子、多功能蛋白聚糖启动子、MIF启动子、Ym1启动子、CD206启动子、FIZZ1启动子、DC-SIGN启动子、CD209启动子、MGL-1启动子、Dectin-1启动子、CD23启动子、半乳凝素-3启动子、Mer酪氨酸激酶启动子、AXL受体蛋白启动子、GAS-6启动子、NOS-2启动子、CD68启动子、CD86启动子、CCL18启动子、CD163启动子、MMR/CD206启动子、CD200R启动子、TGM2启动子、DecoyR启动子、IL-1R II启动子、IL-10启动子、TGF-β启动子、IL-1ra启动子、CCL17启动子、CCL2启动子或CCL24启动子。
如本文所使用的，术语“多肽”是指氨基酸的任何聚合链。术语“肽”和“蛋白质”可与术语多肽互换使用并且也指氨基酸的聚合链。术语“多肽”涵盖天然或人工蛋白质、蛋白质片段和蛋白质序列的多肽类似物。多肽可以是单体的或聚合的。
术语“qPCR”是指实时聚合酶链反应，也被称为定量实时聚合酶链反应(Q-PCR/qPCR/qrt-PCR)，其用于扩增并且同时检测靶向DNA分子的数量。可以将数量表示为拷贝数或标准化到输入DNA的相对量。与标准PCR不同，检测是随着反应的进展实时进行的，其中在其终点处检测到反应的产物。用于检测实时PCR中的产物的两种常用方法是：(1)插入任何双链DNA的非特异性荧光染料；以及(2)用荧光报告因子标记并且在与其互补DNA靶标杂交之后允许检测的序列特异性寡核苷酸。
术语“转化”是指外源DNA进入宿主细胞的任何过程。转化可以使用本领域熟知的各种方法在天然或人工条件下发生。转化可以依赖于用于将外来核酸序列插入到原核或真核宿主细胞中的任何已知方法。所述方法基于被转化的宿主细胞来选择，并且可以包含但不限于病毒性感染、电穿孔、脂质转染和粒子轰击。此类“经过转化的”细胞包含稳定转化的细胞，其中插入的DNA能够作为自主复制质粒或作为宿主染色体的一部分进行复制。其还包含在有限的时间段内瞬时表达插入的DNA或RNA的细胞。
标准技术可以用于重组DNA、寡核苷酸合成以及组织培养和转化(例如，电穿孔、脂质转染)。酶促反应和纯化技术可以根据制造商的说明书或如本领域通常实现的或如本文所描述的来执行。前述技术和程序通常可以根据在本说明书通篇引用和讨论的各种一般和更具体的参考文献中所描述的常规方法执行。参见例如，Sambrook等人，(1989)《分子克隆：实验室手册(Molecular Cloning，A Laboratory Manual)》(第2版，纽约州冷泉港的冷泉港实验室出版社(Cold Spring Harbor Laboratory Press，Cold Spring Harbor，N.Y.))。
术语“载体”旨在指能够转运已经与其连接的另一个核酸的核酸分子。一种类型的载体是“质粒”，所述质粒是指可以将另外的DNA区段连接到其中的环状双链DNA环。另一种类型的载体是病毒载体，其中另外的DNA区段可以连接到病毒基因组中。某些载体能够在其被引入到其中的宿主细胞中进行自主复制(例如，具有细菌复制起点的细菌载体以及附加型哺乳动物载体)。其它载体(例如，非附加型哺乳动物载体)在引入宿主细胞中时可以被整合到宿主细胞的基因组中，并且由此与宿主基因组一起复制。此外，某些载体能够指导与其操作性地连接的基因的表达。此类载体在本文中被称为“重组表达载体”(或简单地，“表达载体”)。一般而言，可用于重组DNA技术的表达载体通常呈质粒形式。在本说明书中，“质粒”和“载体”可以互换使用，因为质粒是最常用的载体形式。然而，另外的实施例包含提供同等功能的此类其它形式的表达载体，如病毒载体(例如，复制缺陷型逆转录病毒、腺病毒和腺相关联病毒)。
讨论
当前基于内源性生物标志物的癌症测试缺乏在其最早恶性或恶变前阶段可靠地检测疾病所需的敏感性和特异性，至少部分由于血液中生物标志物的快速清除、健康组织中的高背景信号或混杂的疾病状态以及相对低浓度的外周循环。
传统上依赖检测和疾病检测的内源性生物标志物的定量的替代性诊断策略是全身递送可以在疾病存在下被选择性活化并且随后产生可通过体液的成像或采样检测到的信号的外源性探针。由于其不受，例如恰好与疾病相关联的内源性生物标志物的免疫学检测能力限制，因此与使用内源性生物标志物的方法相比，使用这些可活化的外源性探针以检测疾病的方法可能具有更高的敏感性和信噪比。迄今为止，合成生物标志物策略已经受到以下限制：(i)探针的生物相容性；(ii)探针对疾病的不同位点的高效递送；(iii)探针测定生化复杂疾病环境的多个特征的能力；或(iv)提供空间位置信息以及来自患者样本的肯定/否定回答两者的能力。
本公开涵盖提供用于疾病的超灵敏检测的新的基于细胞的体内传感器平台的基因工程化免疫细胞的实施例。在采用“肿瘤相关联”代谢图谱时，对同基因巨噬细胞的过继转移进行工程化以产生合成的生物标志物。在一些情况下，此平台允许检测小到25-50mm3的肿瘤、有效追踪炎症模型中的免疫学应答并且比临床使用的肿瘤复发生物标志物更敏感。此技术为早期癌症检测建立了高度生物相容且可临床翻译的方法并且提供了用于使用工程化免疫细胞监测包含但不限于癌症的许多疾病状态的概念框架。
由于内源性生物标志物仍无法在疾病的早期阶段检测疾病或可靠地定位起源位点，因此疾病可活化探针仍然是早期疾病检测、定位和监测的有前景的方法。本公开提供了用于使用工程化免疫细胞作为诊断传感器来进行早期疾病检测的新颖平台技术。通过利用巨噬细胞中的疾病特异性代谢变化，已经显示，免疫细胞传感器可以检测直径至少小到4mm的肿瘤并且展现出比临床使用的肿瘤复发/发生生物标志物更高的敏感性。25-50mm3的肿瘤体积和通过本公开的工程化巨噬细胞可检测的直径低于当前临床PET分子成像的检测极限(分别为大约200mm3和7mm)，从而指示巨噬细胞可以在早期肿瘤发生过程中迁移并改变其代谢状态并且有利于作为用于小肿瘤的诊断传感器。通过炎症模型进一步显示，这种传感器既可以潜在地实现高特异性，又可以有用地应用于监测除了癌症之外的疾病状态。
因此，本公开涵盖最初可能或可能不从患者中分离的工程化(例如经过基因修饰的)巨噬细胞的实施例。在一些情况下，在可由肿瘤特异性代谢因子诱导的基因启动子/增强子的表达控制下，基因修饰通过将基因表达载体引入到细胞中来实现，所述基因表达载体编码可检测药剂(例如可检测多肽或合成RNA)。可由肿瘤特异性代谢因子诱导的基因启动子/增强子可以包括ARG1的调控序列，当在巨噬细胞存在于肿瘤中时，所述调控序列在M2巨噬细胞中被诱导。细胞因子和如酸度增加等其它肿瘤介导的因子可能诱导ARG1的启动子活性。
因此，已经发现，例如，当工程化巨噬细胞与肿瘤接触或极为靠近时，将编码可检测药剂的核酸置于ARG1的表达控制下会导致可检测药剂的表达。已经进一步发现选择可以从巨噬细胞分泌到血流中的可检测药剂允许检测血液样品中的药剂，从而指示肿瘤可能存在于患者中。尽管检测血液样品中的药剂有利地允许用于确定肿瘤是否存在于患者中的快速且经济的方法，但是一定百分比的表达产物也保留在与肿瘤接触的巨噬细胞内。这可以进一步允许对患者体内的肿瘤进行空间检测。
在本公开的一个实施例中，可检测药剂可以是高斯荧光素酶(Gluc)，并且已经发现，与其它检测方法相比，可能会显著增加肿瘤检测的敏感性。然而，可由本公开的构建体表达的其它替代性可检测药剂也是可能的。因此，例如，在本公开的一些实施例中，可检测药剂可以是人类绒毛膜促性腺激素(HCG)或其衍生物、可分泌碱性磷酸酶(SEAP)或甚至可以使用如人工分泌的microRNA等非蛋白质生物标志物。作为可检测药剂，SEAP具有许多理想特性。其是仅在胚胎发生期间表达的人工的、C端截短的、可分泌形式的人类胎盘碱性磷酸酶(PLAP)；因此，其是通常在血液中找不到的独特报告因子并且应当具有接近零的背景(Berger等人，(1988)《基因(Gene)》66：1-10)。与PLAP相比，SEAP具有异乎寻常的热稳定性；因此，将样品加热到65℃允许对SEAP进行特异性测定(Bronstein等人，(1994)《生物技术(BioTechniques)》17：172-174，76-177)。商业SEAP检测测定在至少4个对数阶浓度范围内极为敏感，其中检测极限处于皮克/毫升范围内。SEAP也是一种用于临床翻译的有利的基于蛋白质的报告因子，因为：(1)其已经示出了对小鼠和大型动物中的非病毒基因转移的有效纵向监测(Brown等人，(2008)《分子生物学方法(Methods Mol.Biol.)》423：215-224)；(2)其人类起源意味着其在患者中的免疫原性潜力可能降低或为零，这类似于免疫活性小鼠中的鼠类SEAP(muSEAP)所示出的(Wang等人，(2001)《基因》279：99-108)；以及(3)SEAP已经用于临床监测施用HPV16/18AS04佐剂疫苗之后的抗体水平(Kemp等人，(2008)《疫苗(Vaccine)》26：3608-3616)。
本文所描述的本公开的工程化免疫细胞平台克服了竞争方法所面临的许多临床翻译障碍。例如，基于纳米粒子的传感器和工程化细菌传感器已经用于体内监测包含癌症、纤维化、血栓形成和炎症的疾病过程，取得了相当大的成功。尽管如此，其临床翻译已经受到不利的药代动力学(PK)、到疾病部位的不可靠递送以及传感器固有的免疫原性的阻碍。
相反，目前所公开的工程化巨噬细胞平台展现出对病理部位的自然生化介导应答并且可以使用受试者自身的(例如自体的)细胞来克服生物相容性问题。此外，在临床成像之前产生分泌的肿瘤或疾病诱导的生物标志物并且使用相关联血液测试的能力比需要对每个受试者进行昂贵且费时的临床成像的筛查测试更经济并且可以更高效地施用。另外，目前描述的或临床上使用的大多数人工传感器受限于监测病理学的单个特征(例如蛋白酶的过表达或18FDG PET情况下的沃伯格(Warburg)效应)。相反，本文所描述的工程化免疫细胞平台的细胞可以能够整合构成疾病环境(如TME)以改变代谢基因表达的多个复杂的物理和生化诱因。以此方式，基于细胞的传感器可以利用自然的复杂遗传和/或生化途径来提供电路系统以在没有广泛工程化的情况下提高检测敏感性和特异性。
本公开的组合物和方法具有另外的优点：适应疾病状态、免疫细胞亚型和报告因子构建体的选择。尽管概念验证使用巨噬细胞的典型实例并且相关联的M2表型可以充当癌症的诊断代替物，但是包含T细胞、B细胞、自然杀伤细胞和树突状细胞的其它免疫亚型已经全部被示出为在存在肿瘤微环境(TME)和其它疾病状态的情况下调节关键的代谢基因。因此，还可以根据本公开的方法对可以迁移到患者的病理部位的此类免疫细胞进行工程化以充当肿瘤或疾病特异性细胞传感器。从翻译角度看，T细胞具体地具有吸引力，因为可以将诊断构建体与嵌合抗原受体(CAR)一起引入已经经受CAR T细胞疗法的患者。这将允许在疗法期间对T细胞代谢进行动态评估以检测残留的疾病负担或甚至监测临床可行的表型，如T细胞衰竭。进一步地，尽管Gluc最初用作合成生物标志物，因为可获得针对其的简单且敏感的检测方法(例如萤光素酶测定)，但是可以使用其它低免疫原性合成生物标志物(例如分泌的胎盘碱性磷酸酶(SEAP)或分泌的合成RNA/microRNA)。
如通过研究中来自活化巨噬细胞的BLI信号与病理部位的共定位所证明的，本文所描述的由工程化巨噬细胞平台提供的空间信息可以用于临床决策。已经报告了使用PET追踪含有HSV1-tk报告基因的过继转移的CAR T细胞。因此，本文所描述的工程化免疫细胞平台的实施例可以通过以下来适应：用HSV1-tk代替Gluc、执行PET以可视化M2极化区以及观察BLI信号的空间分布以评估患者的疾病状态。用于此类成像程序的临床先例已经存在。例如，涉及对患者的中性粒细胞进行放射性标记并且用SPECT对其进行体内追踪的铟111白细胞扫描用于确定潜在的感染区域。可替代地，氧化铁纳米粒子已经用于用磁共振成像(MRI)对实体瘤中的肿瘤相关联的巨噬细胞进行成像。
尽管本文所描述的系统可能涉及免疫细胞探针的个性化发展，但是仍存在用于改善此系统的总体适用性的若干种选择。如将基因体内递送到感兴趣的免疫亚群等技术可以使能够在没有细胞分离和工程化的情况下原位生成诊断传感器。
工程化细胞
已经建立了针对原代体细胞的瞬时和稳定转染两者的如本文所利用的技术等多种技术。瞬时技术包含通过例如以下递送核酸(例如携带如同本文所描述的合成生物标志物构建体的合成基因元件的DNA质粒或DNA微环)：脂质转染、聚乙烯亚胺(PEI)介导的转染以及磷酸钙介导的转染、电穿孔或核转染。稳定转染包含病毒和非病毒技术两者。病毒技术包含基于慢病毒的、基于腺病毒的或基于腺相关联病毒的转导，其中对复制缺陷病毒体进行工程化以包含合成基因元件(例如本文所描述的合成生物标志物构建体)。非病毒技术包含携带附加型维持元件(例如含有质粒或CELiD载体的S/MAR)的DNA载体的转染、环状或线状合成DNA分子的转染和随机整合以及使用环状或线状合成DNA分子的CRISPR定向切割和同源定向修复。
精氨酸酶-1表达来鉴别与肿瘤相关联的巨噬细胞
对于广泛应用的诊断传感器，可以选择广泛存在于一系列人类癌症中的免疫细胞亚群。根据基因组图谱(iPRECOG)数据集对临床结果的免疫预测，对5,782个肿瘤标本中的肿瘤浸润性白细胞的部分患病率的分析显示，M2巨噬细胞是存在于大多数实体瘤中的主要免疫细胞群体，其部分丰度高达0.43(脑膜瘤)(图2A)，从而指示其在本文所描述的所述平台中作为泛癌诊断传感器的有用性。
在小鼠中，与肿瘤相关联的M2极化以涉及促进免疫抑制微环境的基因产物(例如ARG1)的上调为特征。因此，研究了ARG1表达是否可以用作遭遇肿瘤微环境(TME)的巨噬细胞的诊断代替物。TME是以酸中毒、缺氧、T-辅助-2(Th2)细胞因子(包含IL-4和IL-13)的浓度升高以及肿瘤衍生的细胞因子和代谢产物为特征的复杂生态位。在用IL-4和IL-13刺激时，BMDM和RAW264.7巨噬细胞系两者在ARG1特异性mRNA表达和活性方面均展现出类似的浓度依赖性增加，如定量PCR(qPCR)(图2B和2C)和精氨酸酶活性测定(图2D)分别所测量的。在暴露于来自CT26鼠类结肠癌细胞系的肿瘤条件培养基(TCM)时，也复制了此剂量依赖性作用，其中BMDM在ARG1表达上展现出600±65倍的增加(图2B和2C和2D)。此作用由肿瘤衍生的细胞因子以及TCM的酸度两者介导。所述作用似乎由肿瘤来源的细胞因子和包含乳酸在内的代谢中间体来介导(图13)。
为了评估过继转移的巨噬细胞是否可以在荷瘤小鼠中呈现出肿瘤相关联的表型，将RAW264.7细胞用VivoTrack 680(VT680)膜染料标记，然后静脉内注射到具有同基因25-50mm3皮下结直肠肿瘤的BALB/c小鼠中。通过流式细胞术证实了巨噬细胞的统一标记(图9)。注射经过标记的巨噬细胞五天后，收获肿瘤和脾脏，并且通过流式细胞术分离出内源性(CD11b+、F4/80+、VT680-)巨噬细胞和过继转移的(CD11b+、F4/80+、VT680+)巨噬细胞(图2E)。与体外数据一致，分别与肝脏归巢和驻留巨噬细胞相比，内源性和过继转移的肿瘤浸润性巨噬细胞两者均展现出升高(通过qPCR增加大约200倍)的ARG1水平，从而证实过继转移的巨噬细胞可以响应于存在于宿主中的病理学改变其代谢状态。25-50mm3的肿瘤体积还指示巨噬细胞存在于肿瘤发生的早期并且是早期癌症检测的有前景的候选物。
过继转移的巨噬细胞迁移到肿瘤微环境并且在所述肿瘤微环境中积累
基于探针的诊断的翻译的一个障碍是无法有效递送到疾病部位。由于免疫细胞募集是包含癌症在内的许多疾病状态的共同特征，因此认为巨噬细胞传感器将自然迁移到恶性肿瘤位点。与对肿瘤衍生的细胞因子(如CSF-1)的巨噬细胞趋化性的报告一致，在24小时transwell测定中，巨噬细胞向TCM的浓度依赖性迁移比向无条件培养基的浓度依赖性迁移大高达4倍(图3A)。在体内，如通过近红外染料的荧光成像可视化的，VT680标记的过继转移的巨噬细胞在五天的过程内迁移到25-50mm3皮下结直肠肿瘤(图3B-3C)。切除的肿瘤的免疫荧光显示巨噬细胞与缺氧区的共定位(图15)。荧光信号与Fluc转染的CT26肿瘤的生物发光信号强烈共定位，如沿右肩的辐射线迹线所证明的(图3D)。脾脏巨噬细胞和肿瘤巨噬细胞两者的流式细胞术分析显示，存在于每个位点中的20-25％的巨噬细胞来自过继转移(CD11b+、F4/80+、VT680+)，从而表明传感器在健康器官和疾病部位两者中的显著定殖(图2D和3E)。
为了研究募集机制，分析了被描述为在迁移中起作用的如CSF1、CCL2和CCL5等趋化因子受体的表面表达。相对于脾脏巨噬细胞，内源性和过继转移的肿瘤浸润性巨噬细胞两者均展现出同源受体CSF1R、CCR2和CCR5的表达增加(图3D)。为了描述趋化因子在介导肿瘤募集或维持中的作用，施用中和剂量的抗CCL2和CSF1的抗体并且再次监测VT680+巨噬细胞的迁移。任一趋化因子的中和作用显著减弱了所比较的迁移并且证实了募集机制(图3D)。
分泌的生物标志物使能够对巨噬细胞活化进行非侵入性监测
为了非侵入性地测定体内巨噬细胞极化的变化，巨噬细胞被工程化，使得ARG1的活化与分泌的生物标志物的产生耦合，所述分泌的生物标志物可以在活体受试者的血液或外周血液样品中进行测定。Gluc是主要分泌(95％)的合成生物标志物(相对于萤火虫和海肾荧光素酶展现出高敏感性)，在血清中具有稳定性，具有20分钟的半衰期，使能够对活化过程进行动态监测，并且还提供了通过细胞内捕获的Gluc的BLI对巨噬细胞ARG1表达进行空间追踪的潜力。因此，分泌的Gluc上游的大约3.8kb ARG1启动子和增强子区被克隆并工程化成具有pARG1-Gluc报告构建体的稳定表达的RAW264.7细胞系以用于M2极化的非侵入性监测。
在用TCM、IL-4和IL-13进行的离体活化时程实验中，培养基采样显示，在24小时内，对于IL-4/IL-13，Gluc发光信号的浓度和时间依赖性增加高达2倍，并且对于“高”TCM增加60倍(图4A)。
工程化巨噬细胞传感器可以检测50mm3以下的肿瘤
为了确定工程化巨噬细胞平台是否可以在体内检测肿瘤，如上文所描述的含有基于ARG-1的传感器的巨噬细胞被静脉内引入到荷瘤小鼠中，并且随后测定小鼠的血浆中的Gluc以监测活化。采用转移性乳腺癌的同基因模型，其中静脉内注射的4T1细胞首先在肺部形成局部微肿瘤，然后出现影响大脑、肝脏和骨骼的转移性疾病。传感器在注射后24小时内以100％敏感性和特异性(曲线下面积(AUC)＝1.00，n＝11，p＝0.0018)将健康对照与转移性疾病区分开来(图4B)。用瞬时转染的BMDM实现了类似的结果，从而证明所述方法即使用原代巨噬细胞也具有可行性(图10A)。此时间尺度与体内迁移和体外巨噬细胞活化的动力学一致。此外，尽管Gluc是主要分泌的生物标志物，但是保留细胞内浓度的约5％可以用BLI可视化以在空间上追踪活化巨噬细胞。活化巨噬细胞(Gluc)和转移瘤(Fluc)两者在单独的天数的成像均显示活化巨噬细胞和转移位点(包含脑内)的标记共定位(图4C、图10B)，从而指示巨噬细胞传感器可以有效地运输到疾病部位并且经受高度限制的活化模式。值得注意的是，当在4T1注射之后提早将肿瘤负荷定位于不可触及的肺微肿瘤时(图4B、图11)，传感器未检测到疾病，这可能是由于高氧肺中TME发育不良。
为了确定可通过传感器检测到的肿瘤体积的大小，将上文所描述的巨噬细胞传感器应用于体积为0-250mm3的CT26结直肠癌的皮下模型。临床PET可以可靠地检测直径大约为7mm并且体积大约为200mm3的肿瘤结节。在传感器注射当天用卡尺(图12A和12B)测量肿瘤大小并且在随后的几天测定血浆。卡尺测量与通过BLI测量的肿瘤大小相关(r2＝0.918，图12A)。在传感器注射后24小时，可以以100％敏感性和特异性(AUC＝1.00，n＝6，p＝0.0009)来检测体积大于50mm3(例如50-250mm3，平均为117.19+/-74.87mm3)的肿瘤(图3D)。值得注意的是，还用AUC＝0.849(95％CI 0.620-1.00，n＝6，p＝0.021)将体积为25-50mm3(平均为39.43+/-7.90)的肿瘤与健康对照区分开来，这表明与目前所用的临床PET相比，本文所描述的可活化免疫传感器可实现更低的检测极限。
未可靠地检测到小于25mm3的肿瘤体积。用传感器也未检测到体积大于约1500mm3的可见坏死或溃疡性肿瘤(图12B)，这可能是由于即使存在TME的情况下，免疫浸润到血管化程度较差的坏死核心中的能力仍然有限。尽管Gluc成像产生了来自CTZ底物代谢的非特异性肝脏信号，但是通过BLI观察到了活化巨噬细胞与肿瘤位点的共定位(图4E)并且通过右肩的辐射线迹线得到证实(图4F)。
此局部疾病模型还允许询问活化特征，否则其将很难在涉及癌症播散的新增变量的转移模型中进行研究。例如，在传感器注射后长达四天的血浆中Gluc的测定显示，健康小鼠和荷瘤小鼠两者在24小时后信号均持续下降(图12C)，这可能是由于合成生物标志物在第一天后的免疫原性和加速清除。在局部疾病控制模型中的这些早期优化支持早期血浆采样并且在未来研究中为进一步的细胞数量剂量优化提供了框架。
作为所述方法的可翻译性的进一步的证据，还证实了可用原代BMDM进行肿瘤检测。单核细胞产生自骨髓并且通过测定成熟标记物F4/80的中间表达来证实表型(图4G)。以大于80％的效率通过电穿孔引入pARG1-Gluc构建体(图7B)，并且通过“低”和“高”TCM两者将所产生的传感器活化大约10倍(图4H)。BMDM传感器还检测到低至60-75mm3的体内CT26肿瘤体积(n＝4，p＝0.0342)，其中AUC为0.813(95％CI 0.555-1.00，n＝4，p＝0.0894)(图4I)。来自注射有BMDM的小鼠的肿瘤展现出初步的消退(第4天，p＝0.058)，但此后并未展现出改变的生长动力学(图16)，从而表明传感器M2极化似乎未加速肿瘤进展。
炎症和伤口愈合模型中的巨噬细胞传感器
对于癌症诊断而言，炎症是重大混杂疾病状态。因此，对暴露于体外促炎细胞因子以及体内炎症模型时假阳性传感器活化的程度进行了研究。尽管免疫浸润是许多病理学的标志，但是使用代谢标记物作为诊断代替物的一个优势是其在不同疾病状态下受到严格控制和独特的转录调控。与促炎性M1巨噬细胞的充分表征图谱一致，用如IFNγ/LPS和TNFα等炎性细胞因子刺激时，RAW264.7巨噬细胞通过qPCR展现出相对最小的升高(小于3倍)或抑制ARG1表达(图5A)。RAW264.7ARG1表达同样不受TNFα的影响，但由IFNγ/LPS诱导。由于高剂量的IFNγ或TNFα不会显著影响ARG1表达，因此此诱导很大程度上由LPS介导。用这些相同的炎症介体刺激pARG1-Gluc工程化的BMDM和RAW264.7巨噬细胞导致Gluc分泌的增加最小化(图5B)。
也在松节油诱导的后腿炎症模型中评估了传感器特异性。肌内注射松节油后一到十天之间的后腿肌肉组织学显示了炎症和伤口愈合的定型时间线：第1-3天反映了以深入的中性粒细胞浸润为特征的急性炎症阶段，而第7-10天反映了更大的碎屑清除的巨噬细胞浸润和炎症消退(图5C)。在第1天(急性炎症期间和使用松节油的同一天)静脉内施用本公开的巨噬细胞传感器在24小时后未产生显著升高的血浆Gluc，从而证实了免疫传感器的特异性(图5D)。
进一步地，由于M2巨噬细胞也涉及伤口愈合和炎症消退，因此在消退阶段期间的第7天测试传感器的注射以确定在注射位点是否存在传感器活化。与伤口愈合过程期间所描述的M2活化和ARG1诱导的生物学一致，当在此阶段期间注射传感器时，血浆Gluc显著升高(AUC＝0.929，95％CI 0.783-1.00，n＝8，p＝0.006)。活化中的这些时间趋势在传感器注射后24小时采用Gluc的BLI中也很明显(图5E)。
在LPS诱导的肺部炎症模型中，使用BMDM传感器观察到类似的趋势。组织学证实了此模型的动力学，从而显示在7小时处的急性炎症和中性粒细胞的涌入、在48小时处的伤口愈合和巨噬细胞的涌入达到峰值以及在72小时处健康肺泡形态的逐渐恢复(图5F)。血浆采样前7、24、48或72小时鼻内施用LPS概括了这些动力学。在7小时时间点处急性炎症期间的血浆Gluc并未升高，从而为传感器特异性提供了进一步的证据。如所预期的，血浆Gluc在伤口愈合期间在24小时(AUC＝0.771，95％CI 0.501-1.00，n＝6，p＝0.093)时展现出逐渐升高并且最终在48小时(AUC＝0.975，95％CI 0.900-1.00，n＝5，p＝0.0054)时达到峰值(图5G)。随着正常肺部架构的恢复，在72小时(AUC＝0.792，95％CI 0.540-1.00，n＝6，p＝0.071)时水平开始朝着基线下降。
还研究了共发炎症影响传感器检测体内肿瘤能力的能力。采用转移性4T1模型，在不存在(AUC＝0.975，95％CI 0.900-1.00，n＝5，p＝0.0054)或存在(AUC＝1.00，95％CI1.00-1.00，n＝4，p＝0.0066)LPS诱导的急性肺部炎症的情况下，当使用BMDM传感器时，观察到血浆Gluc无显著差异(图5H)。活化BMDM传感器的BLI同样不受影响(图5I)。
尽管急性炎症期间巨噬细胞的成像未显示任何活化或区域偏置，但是在消退阶段容易观察到右后腿的巨噬细胞极化。数据表明，尽管本文所描述的免疫传感器可以规避癌症中最令人困惑的疾病状态(急性炎症)，但是针对早期癌症检测用途存在禁忌的病理学群组(例如伤口愈合)。可替代地，巨噬细胞表型移位的稳健性支持在肿瘤检测之外扩大的免疫传感器的用途，包含在监测伤口愈合中的应用。具体应用还将影响启动子的选择，其中除了pARG1之外的启动子的选择可能允许早期癌症检测甚至具有更高的特异性。
巨噬细胞传感器优于临床使用的肿瘤复发的生物标志物
最后，作为免疫细胞传感器的临床相关性的证据，评估巨噬细胞传感器比临床使用的复发/发生生物标志物更早检测到肿瘤存在的能力。将传感器敏感性与癌胚抗原(CEA)进行比较，所述癌胚抗原是用于疗法监测和检测结直肠癌的疾病复发的临床生物标志物，因为免疫传感器可能首先会针对这些适应症进行临床翻译。发展BALB/c NU/NU小鼠(n＝7))的皮下定位中使用分泌CEA的人类细胞系LS174T(使CEA脱落)的结直肠腺癌的皮下模型以对明显缺乏分泌CEA的天然鼠类细胞系作出解释。一旦肿瘤达到大于25mm3的平均体积，则通过卡尺测量肿瘤大小并且收集血浆以通过酶联免疫吸附测定(ELISA)检查是否可检测到CEA。在这天之前的24小时注射巨噬细胞传感器并且还根据同一血浆样品测量Gluc水平。然后此后每隔三天针对CEA监测血浆。
当肿瘤的平均体积为136.62+/-110.71mm3时，肿瘤生长遵循指数动力学，其中在不早于血浆采样(第4天)的第二天可检测到CEA(图6A和6B)。在第一血浆采样期间，使用CEA无法检测到平均体积为44.82+/-40.12mm3(比第4天小67％)的具有统计显著性的肿瘤，但在来自巨噬细胞传感器的Gluc测量的基础上进行区分(图6C)。这也反映在用巨噬细胞传感器使CEA的AUC从0.829(95％CI 0.590-1，p＝0.062)提高到0.914(95％CI 0.738-1.00，p＝0.019)(图6D)。考虑到所述模型的固有局限性，传感器优于临床使用的生物标志物的能力是特别有前景的。例如，NU/NU模型缺乏将以另外的方式有助于介导巨噬细胞向肿瘤迁移并且形成TME的内源性免疫细胞诱因。另外，LS174T是如由ATCC表征的第二最高表达CEA的细胞系，并且巨噬细胞传感器在早期检测中获得的收益可能会在较不积极地释放生物标志物的肿瘤模型中更加明显。
然后将本文所描述的工程化免疫细胞传感器的敏感性与第二种诊断方式——无细胞DNA(cfDNA)的敏感性进行比较。由于本文所描述的传感器可以检测25-50mm3的CT26肿瘤(图4D)，因此确定了可以通过血浆中的cfDNA浓度定量或突变检测而检测到的大小最小的肿瘤。使用CT26细胞系中的突变数据库，对两个缺失进行鉴别并且qPCR测定被设计有分别为0.1％和1％的等位基因频率检测极限，这类似于现有测序方法的敏感性(图17)。
cfDNA浓度无法将健康小鼠与荷瘤小鼠区分开来，直到肿瘤体积达到1500-2000mm3(图6E)。类似地，血浆中未检测到缺失突变，直到肿瘤的最小体积达到1300mm3(图6F)。尽管模型的通用性受到如肿瘤血管形成、细胞死亡速率和肿瘤DNA释放动力学等变量的限制，但是数据指示，本文所描述的巨噬细胞传感器可以潜在地检测到比cfDNA可能小一个数量级的肿瘤(即使给定突变的先验知识)。
试剂盒
本公开还设想了包括本公开的化合物中的一种或多种化合物的试剂盒。在本公开的各方面中，本公开的试剂盒包括容器。在特定方面，本公开的试剂盒包括容器和包括缓冲液的第二容器。试剂盒可以另外包含从商业和用户角度看期望的其它材料，包含但不限于缓冲液、稀释剂、过滤器、针头、注射器以及具有用于执行本文所公开的任何方法(例如，用于治疗本文所公开的疾病的方法)的包装说明书。本公开的试剂盒中的药物或调配物可以包括本文所公开的调配物或组合物中的任一种。
本公开的一个方面涵盖经过基因修饰的免疫细胞的实施例，所述经过基因修饰的免疫细胞包括异源核酸，所述异源核酸响应于由接受所述经过基因修饰的免疫细胞的动物或人类受试者的病理状况引起的代谢变化来表达可检测药剂。
在本公开的此方面的一些实施例中，所述免疫细胞可以是单核细胞、巨噬细胞、T细胞、B细胞、自然杀伤细胞或树突状细胞。
在本公开的此方面的一些实施例中，所述异源核酸可以包括至少一个基因表达盒，所述至少一个基因表达盒包括可操作地连接到编码可检测药剂的核酸序列的基因表达调控区，并且其中所述基因表达调控区可以响应于所述经过基因修饰的免疫细胞中的代谢变化以诱导所述可检测药剂的表达。
在本公开的此方面的一些实施例中，所述异源核酸可以是核酸载体。
在本公开的此方面的一些实施例中，所述异源核酸可以是质粒。
在本公开的此方面的一些实施例中，所述基因表达调控区可以包括基因启动子区。
在本公开的此方面的一些实施例中，所述基因表达调控区可以进一步包括基因特异性增强子。
在本公开的此方面的一些实施例中，所述基因启动子可以是ARG1启动子、CD163启动子、MMR/CD206启动子、CD200R启动子、TGM2启动子、DecoyR启动子、IL-1R II启动子、IL-10启动子、TGF-β启动子、IL-1ra启动子、CCL17启动子、CCL2启动子或CCL24启动子。
在本公开的此方面的一些实施例中，所述可检测药剂可以是多肽或可分泌核酸。
在本公开的此方面的一些实施例中，所述可检测多肽可以是高斯荧光素酶(Gluc)。
在本公开的此方面的一些实施例中，所述可检测多肽可以是铁蛋白。
在本公开的此方面的一些实施例中，所述可检测多肽可以是HSV-1胸苷激酶(HSV1-tk)。
在本公开的此方面的一些实施例中，所述可检测多肽可以是多巴胺D2受体的D80RA突变体。
在本公开的此方面的一些实施例中，所述可检测多肽可以是人钠碘同向转运体(hNIS)。
在本公开的此方面的一些实施例中，所述可检测多肽可以是造影剂、与报告基因互补的结合剂、产生可检测分子的酶或驱动可检测分子积累的转运体。
在本公开的此方面的一些实施例中，所述可检测药剂可以是可分泌核酸。
在本公开的此方面的一些实施例中，所述异源核酸可以具有如SEQ ID NO：1所示的核苷酸序列。
在本公开的此方面的一些实施例中，所述基因表达调控区可以响应于所述经过基因修饰的免疫细胞中的肿瘤特异性代谢变化以诱导所述可检测药剂的表达。
在本公开的此方面的一些实施例中，所述经过基因修饰的免疫细胞中的所述肿瘤特异性代谢变化由选自由以下组成的组的癌症引起：膀胱癌、乳腺癌、结直肠癌、子宫内膜癌、头颈癌、肺癌、黑素瘤、非小细胞肺癌、卵巢癌、前列腺癌、睾丸癌、子宫癌、宫颈癌、甲状腺癌、胃癌、脑干胶质瘤、小脑星形细胞瘤、脑星形细胞瘤、胶质母细胞瘤、室管膜瘤、尤文氏肉瘤家族肿瘤、生殖细胞瘤、颅外癌症、霍奇金病白血病、肝癌、成神经管细胞瘤、神经母细胞瘤、脑瘤、骨肉瘤、骨恶性纤维组织细胞瘤、视网膜母细胞瘤、横纹肌肉瘤、肉瘤、幕上原始神经外胚层肿瘤、松果体肿瘤、视觉通路和下丘脑胶质瘤、维尔姆斯瘤、食管癌、毛细胞白血病、肾癌、口腔癌、胰腺癌、皮肤癌和小细胞肺癌。
在本公开的此方面的一些实施例中，所述经过基因修饰的免疫细胞中的所述病理学特异性代谢变化可以来自炎症。
本公开的另一个方面涵盖一种产生经过基因修饰的免疫细胞的方法，所述方法包括以下步骤：从人类或动物受试者中分离出病理学应答性免疫细胞群体；以及用异源核酸转化经过分离的病理学应答性免疫细胞群体，所述异源核酸响应于由接受所述经过基因修饰的免疫细胞的动物或人类受试者的病理状况引起的代谢变化来表达可检测药剂。
在本公开的此方面的一些实施例中，所述病理学可以是肿瘤。
在本公开的此方面的一些实施例中，所述肿瘤应答性免疫细胞是巨噬细胞。
本公开的又另一个方面涵盖一种检测动物或人类受试者的病理状况的方法的实施例，所述方法包括以下步骤：向动物或人类受试者施用药学上可接受的组合物，所述药学上可接受的组合物包括根据本公开的经过基因修饰的免疫细胞群体；从所述动物或人类受试者中获得生物流体样品；在所述生物流体样品中检测所述可分泌可检测药剂的存在，所述可分泌可检测药剂由与所述动物或人类患者的病理状况接触或靠近的所述经过基因修饰的免疫细胞表达，其中所述存在指示所述动物或人类具有引起代谢变化的病理状况。
在本公开的此方面的一些实施例中，所述生物流体可以是血液。
在本公开的此方面的一些实施例中，所述经过基因修饰的免疫细胞可以是肿瘤应答性巨噬细胞。
在本公开的此方面的一些实施例中，所述病理状况可以是癌症。
在本公开的此方面的一些实施例中，所述病理状况可以是肿瘤。
在本公开的此方面的一些实施例中，所述方法进一步包括以下步骤：在邻近于或依附于所述病理状况的免疫细胞内检测来自所述可检测药剂的信号；产生相对于所述动物或人类的所述可检测信号的图像；以及确定局部信号在所述动物或人类中的位置。
在一些实施例中，所述方法可以包括检测分泌物的不存在以及使用这种不存在来指定所述动物或人类受试者的病理学的不存在。
本公开的仍另一个方面涵盖试剂盒的实施例，所述试剂盒包括设备，所述设备用于骨髓源性巨噬细胞(BMDM)分离；以及无内毒素质粒制剂，所述无内毒素质粒制剂编码可操作地连接到ARG-1启动子的可检测药剂。
本公开的另一个方面涵盖用于鉴别受试者的病理状况的方法的实施例，所述方法包括：(a)向所述受试者施用包括异源核酸的经过基因修饰的免疫细胞，所述异源核酸具有编码可检测药剂的核酸序列，其中所述经过基因修饰的免疫细胞响应于由所述受试者的病理状况引起的代谢变化来表达所述可检测药剂；以及(b)检测所述受试者中的所述可检测药剂以鉴别所述病理状况。
在本公开的此方面的一些实施例中，当响应于所述经过基因修饰的免疫细胞中的肿瘤特异性代谢变化时，所述基因表达调控区可以诱导所述可检测药剂的表达。
在本公开的此方面的实施例中，所述经过基因修饰的免疫细胞中的所述肿瘤特异性代谢变化可以由选自由以下组成的组的癌症引起：膀胱癌、乳腺癌、结直肠癌、子宫内膜癌、头颈癌、肺癌、黑素瘤、非小细胞肺癌、卵巢癌、前列腺癌、睾丸癌、子宫癌、宫颈癌、甲状腺癌、胃癌、脑干胶质瘤、小脑星形细胞瘤、脑星形细胞瘤、胶质母细胞瘤、室管膜瘤、尤文氏肉瘤家族肿瘤、生殖细胞瘤、颅外癌症、霍奇金病白血病、肝癌、成神经管细胞瘤、神经母细胞瘤、脑瘤、骨肉瘤、骨恶性纤维组织细胞瘤、视网膜母细胞瘤、横纹肌肉瘤、肉瘤、幕上原始神经外胚层肿瘤、松果体肿瘤、视觉通路和下丘脑胶质瘤、维尔姆斯瘤、食管癌、毛细胞白血病、肾癌、口腔癌、胰腺癌、皮肤癌和小细胞肺癌。
在本公开的此方面的一些实施例中，所述经过基因修饰的免疫细胞中的所述病理学特异性代谢变化来自炎症。
在所述经过基因修饰的免疫细胞的一些实施例中，所述异源核酸包括多个不同的基因表达调控区，其中每个调控区可操作地连接到编码多种类型的可检测药剂的多个核酸序列，并且其中所述基因表达调控区响应于病理学特异性代谢变化以诱导所述可检测药剂的表达，其中每个可检测药剂的水平指示所述受试者的不同病状。
尽管结合实例和对应文本和图描述了本公开的实施例，但是不旨在使本公开受限于这些描述中的实施例。相反，旨在覆盖包含在本公开的实施例的精神和范围内的所有替代方案、修改和等同物。
实例
实例1
肿瘤浸润性白细胞分析：从斯坦福大学iPRECOG数据库获得来自各种癌症的转录组分析的部分免疫细胞组成。由于在每种癌症类型下列出了多个群组的肿瘤样品，因此基于每个群组中分析的肿瘤样品数量计算每种癌症的免疫细胞分数的加权平均值。
实例2
骨髓源性巨噬细胞(BMDM)制备和电穿孔：从6-8周龄的雌性BALB/c小鼠中分离股骨和胫骨并且用5mL冷PBS冲洗骨髓。骨髓通过重复移液而重悬于均质溶液中并且穿过40μm过滤器以清除碎屑。以300×g离心5分钟之后，将骨髓重悬于冰上ACK裂解缓冲液(马萨诸塞州沃尔瑟姆的英杰公司(Invitrogen，Waltham，MA))中5分钟。将ACK在PBS中稀释10倍，并且将溶液再次以300×g离心5分钟。将细胞以4×106个细胞/10cm培养皿的密度铺板在10mL的IMDM(马萨诸塞州沃尔瑟姆的赛默飞世尔(ThermoFisher，Waltham，MA))中，所述IMDM补充有10％热灭活胎牛血清(FBS)、1％抗菌/抗真菌(A/A)溶液(赛默飞世尔)和10ng/mL鼠类集落刺激因子(M-CSF，新泽西州洛基山的派普泰克公司(Peprotech，Rocky Hill，NJ))并且在用细胞铲收获以供下游使用之前在37℃下、在湿润的5％CO2培养箱中保持5天。
为了使BMD单核细胞用于所有体内研究，将细胞以6×106个细胞/孔的密度铺板在补充有20ng/mL M-CSF的6mL培养基中的6孔.RTM Costar.RTM超低附着板(纽约州康宁的康宁公司(Corning，Corning，NY))中。5天之后，丢弃贴壁细胞(巨噬细胞)并且收集未贴壁细胞。与同种型对照相比，通过F4/80(加利福尼亚州圣地亚哥的Biolegend公司)染色由流式细胞术确定纯度大于96％(图7A)。
使用用于小鼠巨噬细胞的核转染试剂盒(瑞士巴塞尔的龙沙集团(Lonza Basel，Switzerland))和相关联的核转染2b装置上的方案Y-001来通过电穿孔执行瞬时转染。每个反应含有2×106个BMDM和12μg质粒DNA并且达到平均大约为40％的效率(图7B)。
实例3
细胞系：RAW264.7鼠类巨噬细胞、CT26鼠类结肠癌、4T1鼠类乳腺癌和LS174T人类结直肠腺癌获自ATCC(弗吉尼亚州马纳萨斯(Manassas，VA))并且在补充有10％FBS和1％抗菌/抗真菌溶液(赛默飞世尔)的DMEM(RAW264.7，LS174T)或RPMI(CT26，4T1)中培养并且在37℃下、在湿润的5％CO2培养箱中保持。通过慢病毒转导，然后针对最高2.5％的eGFP表达子进行三轮分选来产生CT26 eGFP-萤火虫荧光素酶(Fluc)和4T1 eGFP-Fluc细胞系。通过用脂质体3000(赛默飞世尔)进行转染并且针对最高2.5％的eGFP表达子进行三轮分选来产生驱动高斯荧光素酶(pARG1-Gluc)细胞系的RAW264.7精氨酸酶-1启动子。
实例4
体外巨噬细胞活化：将巨噬细胞(RAW264.7或BMDM)以1×106个细胞/孔的密度铺板在2.5mL培养基中的6孔板中。24小时之后，培养基用肿瘤条件培养基(TCM)代替或补充有IL-4、IL-13、肿瘤坏死因子α(TNFα)或干扰素γ(IFNγ)。通过在6孔板中的每孔2.5mL培养基中分别培养2×106个或3×106个CT26细胞24小时来产生“高”和“低”TCM。使用之前，将条件培养基以300×g离心10分钟以清除碎屑。24小时之后，根据制造商的说明，使用BioLux高斯荧光素酶测定试剂盒(马萨诸塞州伊普斯维奇的新英格兰生物实验室(New England，BioLabs Ipswich，MA))收获巨噬细胞用于RNA分离或收集20μL培养基以测定Gluc。在TD20/20发光计(加利福尼亚州圣何塞的特纳仪器公司(Turner Designs，San Jose，CA))上执行发光测量，其中以相对光单位(RLU)表示的整合和发光为10秒。
实例5
精氨酸酶(ARG-1)基因表达测定：按照制造商的说明，使用RNeasy迷你试剂盒(德国希尔登的凯杰公司(Qiagen，Hilden，Germany))从巨噬细胞中提取总RNA。通过孔内直接裂解从细胞培养物中的巨噬细胞中提取RNA，而在流式细胞术期间通过直接分选到RNeasy裂解缓冲液中来执行从肿瘤和脾脏浸润性巨噬细胞中的提取。按照制造商的说明，cDNA合成使用iScript cDNA合成试剂盒(加利福尼亚州赫拉克勒斯的伯乐公司(Bio-rad，Hercules，CA))。定量PCR(qPCR)反应在20μL体积中进行，其中含有1倍SsoAdvanced通用探针Supermix(伯乐公司)、1μL的基因特异性水解探针、2μL的cDNA和不含核酸酶的水(伯乐公司)。商购获得用于ARG1和GAPDH的FAM荧光团缀合的水解探针(伯乐公司)。用于cDNA合成和qPCR两者的热循环使用CFX96实时系统C1000触摸热循环仪(伯乐公司)，使用以下方案：25℃进行5分钟、46℃进行20分钟、95℃进行1分钟(cDNA合成)以及95℃进行3分钟，然后进行以下60个循环：95℃进行15秒以及59℃进行30秒(qPCR)。用于所有样品的技术复制一式两份执行。用不含核酸酶的水代替cDNA执行阴性对照。循环阈值是自动确定的单个阈值(使用CFX管理器软件版本3.1)，其中所有Cq值均落入测定的线性可量化范围内。
实例6
精氨酸酶(ARG-1)活性测定：巨噬细胞用PBS洗涤一次、收获并且在含有1倍停止蛋白酶抑制剂鸡尾酒(Halt Protease Inhibitor Cocktail)(赛默飞世尔)的100μL皮尔斯IP裂解缓冲液(Pierce IP Lysis Buffer)(赛默飞世尔)中在冰上裂解10分钟。按照制造商的说明，将裂解液在4℃下以14,000×g离心10分钟并且使用比色QuantiChrom精氨酸酶测定试剂盒(加利福尼亚州海沃德的生物测定系统公司(BioAssay Systems，Hayward，CA))测量上清液精氨酸酶活性。在Synergy 4酶标仪(佛蒙特州威努斯基的伯腾公司(BioTekWinooski，VT))上测量430nm处的光密度。
实例7
体外迁移测定：使用具有孔径为8.0μM的聚酯膜(纽约州康宁的康宁公司)的6.5mmTranswell组织培养处理的插入物执行体外迁移测定。将1×105个RAW264.7巨噬细胞接种到膜室顶部上的100μL DMEM中并且允许在将所述室浸入含有“高”肿瘤条件或无条件培养基的孔中之前粘附10分钟。24小时之后，去除插入物，用棉签去除膜顶部上的未迁移细胞，并且将插入物固定在600μL的70％乙醇中10分钟。膜被允许干燥15分钟并且然后浸入600μL的0.2％结晶紫(CV)溶液中10分钟以进行细胞染色。最后，将膜用PBS洗涤5次以去除过量的CV，从插入物中去除，并且在EVOS成像系统(赛默飞世尔)上的10个随机10倍视场中的明视野中对迁移的细胞数量进行计数。
实例8
体内迁移测定：在6-8周龄的雌性BALB/c小鼠(马萨诸塞州威明顿市的查尔斯河(Charles River，Wilmington，MA))的右肩上、在100μL PBS中皮下植入1×106个CT26eGFP-Fluc细胞。七天后，在腹腔内注射100μL PBS中的30mg/kg D-萤光素之后，通过在IVIS光谱(马萨诸塞州沃尔瑟姆的珀金埃尔默公司(PerkinElmer，Waltham，MA))装置上的生物发光成像(BLI)对肿瘤进行成像以证实肿瘤摄入。肿瘤植入后十天，用近红外荧光膜染料(珀金埃尔默公司的VivoTrack 680)标记1×107个同基因RAW264.7巨噬细胞并且静脉内注射到100μL PBS中。在注射巨噬细胞后第一天、第三天和第五天，使用IVIS光谱用640nm激发滤波器和700nm发射滤波器组执行体内荧光成像以可视化到肿瘤的迁移。使用活体图像4.5.2软件绘制感兴趣的区(ROI)和线迹线以基于光子·s-1·cm-2.球面度-1中的平均辐射率分别对巨噬细胞迁移的程度和与肿瘤共定位的程度进行定量。
实例9
巨噬细胞染色和细胞分选：切除的肿瘤用剪刀机械分解并且在含有10μg/mLDNase I(密苏里州圣路易斯的西格玛奥德里奇公司(Sigma-Aldrich St.Louis，MO))和25μg/mL释放酶(瑞士巴塞尔的罗氏公司(Roche Basel，Switzerland))的5mL Hank′s平衡盐溶液(HBSS)中在37℃下消化45分钟。然后将溶液用冷PBS稀释，通过70μm过滤器过滤，并且在重悬于FACS缓冲液(PBS+2％FBS+1％A/A)中之前以300×g离心5分钟。使用1mL注射器柱塞的背面将收集的脾脏压过40μm过滤器并且通过PBS洗涤。以300×g旋转5分钟之后，将脾细胞重悬于5mL的ACK裂解缓冲液中并且置于冰上5分钟。然后将不含红细胞的馏分离心并且重悬于FACS缓冲液中。
对于巨噬细胞分选实验，将来自肿瘤和脾脏的单细胞悬浮液在含有0.2μg的每种抗F4/80和CD11b(Biolegend)的抗体以及活/死染色剂(碘化丙啶)的100μL HBSS中染色并且在FACSAria II台式细胞分选仪(新泽西州富兰克林湖的贝迪医疗公司(BectonDickinson，Franklin Lakes，NJ))上分选，其中使用UltraComp eBeads(赛默飞世尔)或VivoTrack 680的单染色细胞执行补偿。使用荧光减一对照对阳性细胞和阴性细胞进行门控。
实例10
报告因子质粒构建：使用基于标准PCR的克隆技术构建质粒并且通过Sequetech(加利福尼亚州山景城)进行测序。通过克隆先前所描述的高斯硬脑膜荧光素酶(马里兰州罗克维尔市的Genecopoeia公司)的序列上游的-31/-3810ARG1启动子/增强子(马萨诸塞州剑桥市的Addgene公司)序列形成pARG1-Gluc报告因子质粒(图8)。核苷酸序列在SEQ IDNO：1(如图18所示)中给出。
实例11
小鼠肿瘤模型和血液收集：通过将150μL PBS中的2.5×1054T1 eGFP-Fluc细胞静脉内注射到雌性BALB/c小鼠中来建立转移性乳腺癌的同基因模型。在局部疾病模型中，当如通过BLI可视化的疾病仍可能局限于肺时，在七天之后注射巨噬细胞传感器(3×106个细胞RAW264.7或1×106个BMDM)。在转移性模型中，一旦肿瘤负荷已经扩散到肺外，则在14天之后注射传感器。在传感器注射24小时之后，从小鼠的下颌下静脉放血，将血液收集在K3-EDTA试管(德国巴登-符腾堡的葛来娜公司(Greiner，Baden-Württemberg，Germany))并且然后以1,000×g在4℃下离心10分钟。如先前所描述的，从20μL血浆中测定Gluc。在巨噬细胞注射48小时之后，通过静脉内注射稀释于150μL的PBS中的35μg腔肠素(CTZ)底物(威斯康辛州麦迪逊市的普洛麦格公司(Promega，Madison，WI))来由BLI对活化巨噬细胞(细胞内Gluc)进行成像。
如迁移研究中所描述的建立同基因皮下结直肠癌模型，其中在工程化巨噬细胞注射之前，允许肿瘤生长到0-25mm3、25-50mm3或50-200mm3。通过等式V＝0.5×L×W2来估计肿瘤体积，其中L和W表示肿瘤球体的较长和较短的直接垂直直径。用数显卡尺测量尺寸。传感器注射之后，以24小时为间隔从小鼠的下颌下静脉放血(50μL)多达四天，其中注射后48小时对活化巨噬细胞执行BLI成像。
实例12
小鼠炎症模型：在肌肉炎症模型中，向6-8周龄的BALB/c雌性小鼠的右后肢肌内注射30μL松节油(西格玛奥德里奇公司)。在注射后第一天、第三天、第七天和第十天收集注射有PBS的健康对侧肌肉和被处死小鼠的发炎肌肉并且在10％福尔马林中固定48小时，包埋在石蜡中，并且按照标准方案(加利福尼亚州海沃德市希思托泰克实验室(Histo-TecLaboratory，Hayward，CA))进行苏木精和曙红(H&E)染色处理。在松节油注射后第一天或第七天将RAW264.7巨噬细胞传感器(3×106个细胞)静脉内注射到100μL PBS中，其中在细胞注射后24小时进行50μL血液收集、血浆Gluc测量以及活化巨噬细胞的BLI。
在LPS诱导的急性肺部炎症模型中，向6-8周龄的雌性BALB/c小鼠鼻内接种重悬于20μL PBS中的50μg LPS。对照小鼠未接受媒剂，因为鼻内施用盐水可能会诱导肺部炎症。如先前所描述的，将健康的肺或LPS施用后7、24、48、72小时的肺固定并且进行H&E染色处理。在监测伤口愈合情况时，将BMDM传感器(3×106个活的、转染的细胞)静脉内注射到100μLPBS中并且在注射后0、24、48或65小时施用LPS。由于来自所述BMDM传感器的血浆Gluc在注射后72小时进行测定，因此此时间表允许分别在炎症的72、48、24、或7小时询问传感器活性。
在共发的肿瘤和急性炎症模型中，向携带转移性4T1肿瘤的Balb/c小鼠注射BMDM传感器并且在65小时后(在测定血浆Gluc之前7小时)鼻内接种LPS。血液收集之后立即执行活化BMDM传感器的BLI。
实例13
癌胚抗原释放模型：将LS174T细胞(50μL PBS中的2×106个)皮下植入雌性免疫缺陷的BALB/c NU/NU小鼠(查尔斯河)的右肩。通过卡尺测量估计肿瘤体积并且从植入后第十天开始每三天一次收集血液(50μL)。在第1天(植入后10天)注射RAW264.7巨噬细胞传感器(100μL PBS中的3×106个细胞)，其中收集50μL血液24小时后进行Gluc和CEA检测。用商业ELISA试剂盒(赛默飞世尔)测量血浆CEA浓度，其中检测极限为200pg/mL。
实例14
统计分析：使用参数未配对t测试和韦尔奇(Welch)校正执行统计分析。所有统计分析均在GraphPad Prism版本7.03中执行。
实例15
免疫荧光：根据制造商的说明，向携带10天大的CT26肿瘤的6-8周龄的雌性BALB/c小鼠静脉内注射用CellBriteTM Fix 640染料(加利福尼亚州弗里蒙特的Biotium公司)标记的1×107个BMDM。四天后，在腹腔内注射60mg/kg盐酸哌莫硝唑(马萨诸塞州柏林顿的Hypoxyprobe公司)后90分钟收获肿瘤以进行缺氧检测。切除之后立即将肿瘤冷冻在最佳切割温度化合物(加利福尼亚州托伦斯的Sakura Finetek公司)中，使用切片机将其切成10μm厚的切片，并且封固到磨砂显微镜载玻片上。然后在4℃下用1∶50(1.2μg/mL)FITC抗-哌莫硝唑(Hypoxyprobe公司)染色过夜之前用免疫荧光封闭缓冲液(马萨诸塞州丹弗斯的细胞信号传导技术公司(Cell Signaling Technology，Danvers，MA))将组织载玻片封闭30分钟。载玻片用PBS洗涤三次并且在用透明指甲油密封之前使用具有DAPI(赛默飞世尔)的ProLong.RTM金色防褪色试剂封固盖玻片。使用NanoZoomer 2.0-RS整体幻灯片成像仪(日本滨松市的滨松集团(Hamamatsu，Hamamatsu City，Japan))获取图像。
实例16
无细胞DNA模型：皮下CT26肿瘤生长到介于0-2000mm3之间的体积并且最终从小鼠的下颌下静脉放血。使用NextPrep-MagTM cfDNA分离试剂盒(德克萨斯州奥斯汀的柏尔生物科技公司(Bioo Scientific，Austin，TX))从血浆中提取无细胞DNA(cfDNA)并且使用Quant-iTTM高敏感性dsDNA测定试剂盒(塞默飞世尔)进行定量。使用安捷伦(Agilent)2100生物分析仪(加利福尼亚州圣克拉拉的安捷伦公司(Agilent，Santa Clara，CA))，证实cfDNA展现出主要单核小体大小范围(140-180个碱基对)并且排除了受大片段基因组DNA污染的样品。引物和锁核酸(LNA)探针获自IDT(加利福尼亚州圣何塞)，其中序列如表1所示。
表1.用于无细胞DNA突变检测测定的参数
Figure BDA0002681535040000541
探针序列中碱基后的‘+’指示所述碱基是锁定的核酸碱基。LNA，锁定的核酸。
用于qPCR的热循环使用CFX96实时系统C1000触摸热循环仪(伯乐公司)执行，使用以下方案：95进行℃下进行3分钟，然后进行以下50个循环：95℃下进行15秒以及69.4℃(chr7_13872039_del)或67.9℃(chr19_39237841_del)下进行15秒。用从CT26细胞中分离的基因组DNA使用用健康Balb/c基因组DNA(西格玛奥德里奇)稀释的PureLinkTM基因组DNA迷你试剂盒(赛默飞世尔)来执行检测实验的等位基因频率极限以基于先前所报告的100％(chr7_13872039_del)和9％(chr19_39237841_del)的初始等位基因频率获得5％、1％和0.1％的等位基因频率。反应含有5ng的cfDNA、500nM的正向和反向引物浓度、200nM的探针浓度，总体积为20μL。
当考虑到内源性生物标志物所面临的生物学和数学局限性时，本公开的疾病可活化探针是有利的。例如，在cfDNA中，突变等位基因频率随疾病负担而减小，从而导致10mL抽血中不存在突变的单个拷贝的可能性增加。已经估计肿瘤必须达到大于1,000mm3的体积(对应于0.01％的等位基因频率)才能在4mL的血浆中存在甚至一个基因组当量的肿瘤DNA。然而，与可能的cfDNA突变检测相比，本公开的巨噬细胞传感器能够检测体积小多达50倍的肿瘤。使用本公开的巨噬细胞传感器进行生物标志物检测的方法不需要知道要寻找哪些DNA突变。
本文所描述的方法在疾病、免疫细胞和报告因子的选择上具有模块化的优势。除了癌症之外的具有免疫组分的其它疾病包含但不限于自身免疫性疾病，如桥本氏甲状腺炎(Hashimoto′s thyroiditis)、类风湿性关节炎、1型糖尿病和全身性红斑狼疮；或炎症性疾病，包含但不限于动脉粥样硬化、糖尿病、胰腺炎、COPD、慢性肾病、急性肾损伤、溃疡性结肠炎(UC)和克罗恩病(Crohn disease)、非酒精性脂肪性肝病、癫痫、阿尔茨海默氏病(Alzheimer′s)和帕金森氏病(Parkinson′s disease)。除了巨噬细胞之外的其它免疫亚型(例如T细胞、B细胞和自然杀伤细胞)均调节肿瘤中的代谢基因，并且因此可以使用本公开的工程化免疫细胞和方法有利地进行检测。进一步地，尽管高斯荧光素酶(Gluc)可用作报告因子，但是可以使用其它非免疫原性合成生物标志物，如分泌的胎盘碱性磷酸酶(SEAP)、人类绒毛膜促性腺激素(HCG)、合成RNA或合成miRNa模板、分裂的报告分子的一半。
尽管本文中已经示出并且描述了本发明的优选实施例，但是对于本领域的技术人员而言将显而易见的是，这些实施例仅作为示例提供。在不背离本发明的情况下，本领域技术人员现在将想到许多变化、改变和替代。应当理解的是，本文所描述的本发明的实施例的不同替代方案可以用于实践本发明。意图是，以下权利要求限定本发明的范围并且由此覆盖处于这些权利要求和其等效物的范围内的方法和结构。
序列表
<110> 小利兰·斯坦福大学董事会（The Board of Trustees of the LelandStanford junior University）
<120> 工程化免疫细胞作为疾病的诊断探针
<130> 221907-2430
<150> US 62/635,664
<151> 2018-02-27
<150> US 62/794,011
<151> 2019-01-18
<160> 8
<170> PatentIn版本3.5
<210> 1
<211> 9615
<212> DNA
<213> 人工序列（Artificial sequence）
<220>
<223> 质粒ARG1/Gluc报告因子质粒
<400> 1
aagcttggta ccgagctcgg atccagccac catgggagtc aaagttctgt ttgccctgat 60
ctgcatcgct gtggccgagg ccaagcccac cgagaacaac gaagacttca acatcgtggc 120
cgtggccagc aacttcgcga ccacggatct cgatgctgac cgcgggaagt tgcccggcaa 180
gaagctgccg ctggaggtgc tcaaagagct ggaagccaat gcccggaaag ctggctgcac 240
caggggctgt ctgatctgcc tgtcccacat caagtgcacg cccaagatga agaagttcat 300
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ggcgatcgtc gacattcctg agattcctgg gttcaaggac ttggagcccc tggagcagtt 420
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cgtgcagtgt tctgacctgc tcaagaagtg gctgccgcaa cgctgtgcga cctttgccag 540
caagatccag ggccaggtgg acaagatcaa gggggccggt ggtgactaag cggccgcttc 600
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gcaataaaca agttaacaac aacaattgca ttcattttat gtttcaggtt cagggggagg 780
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ttaatagtaa tcaattacgg ggtcattagt tcatagccca tatatggagt tccgcgttac 900
ataacttacg gtaaatggcc cgcctggctg accgcccaac gacccccgcc cattgacgtc 960
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ggagtattta cggtaaactg cccacttggc agtacatcaa gtgtatcata tgccaagtac 1080
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caagctgccc gtgccctggc ccaccctcgt gaccaccctg acctacggcg tgcagtgctt 1680
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ggaggacggc aacatcctgg ggcacaagct ggagtacaac tacaacagcc acaacgtcta 1920
tatcatggcc gacaagcaga agaacggcat caaggtgaac ttcaagatcc gccacaacat 1980
cgaggacggc agcgtgcagc tcgccgacca ctaccagcag aacaccccca tcggcgacgg 2040
ccccgtgctg ctgcccgaca accactacct gagcacccag tccgccctga gcaaagaccc 2100
caacgagaag cgcgatcaca tggtcctgct ggagttcgtg accgccgccg ggatcactct 2160
cggcatggac gagctgtaca agtaggttta aacactagaa ataattctta ctgtcatgcc 2220
aagtaagatg cttttctgtg ctgcaatagc aggcatgctg gggatgcggt gggctctatg 2280
gcttctgagg cggaaagaac tagacccagc tttcttgtac aaagttggca ttataagaaa 2340
gcattgctta tcaatttgtt gcaacgaaca ggtcactatc agtcaaaata aaatcattat 2400
ttgccatcca ggtcgagtgt ggaatgtgtg tcagttaggg tgtggaaagt ccccaggctc 2460
cccagcaggc agaagtatgc aaagcatgca tctcaattag tcagcaacca ggtgtggaaa 2520
gtccccaggc tccccagcag gcagaagtat gcaaagcatg catctcaatt agtcagcaac 2580
catagtcccg cccctaactc cgcccatccc gcccctaact ccgcccagtt ccgcccattc 2640
tccgccccat ggctgactaa ttttttttat ttatgcagag gccgaggccg cctctgcctc 2700
tgagctattc cagaagtagt gaggaggctt ttttggaggc ctaggctttt gcaaaaagct 2760
cccgggagct tgtatatcca ttttcggatc tgatcaaaga tccaccggag cttaccatga 2820
ccgagtacaa gcccacggtg cgcctcgcca cccgcgacga cgtccccagg gccgtacgca 2880
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acatcgagcg ggtcaccgag ctgcaagaac tcttcctcac gcgcgtcggg ctcgacatcg 3000
gcaaggtgtg ggtcgcggac gacggcgccg cggtggcggt ctggaccacg ccggagagcg 3060
tcgaagcggg ggcggtgttc gccgagatcg gcccgcgcat ggccgagttg agcggttccc 3120
ggctggccgc gcagcaacag atggaaggcc tcctggcgcc gcaccggccc aaggagcccg 3180
cgtggttcct ggccaccgtc ggcgtctcgc ccgaccacca gggcaagggt ctgggcagcg 3240
ccgtcgtgct ccccggagtg gaggcggccg agcgcgccgg ggtgcccgcc ttcctggaga 3300
cctccgcgcc ccgcaacctc cccttctacg agcggctcgg cttcaccgtc accgccgacg 3360
tcgaggtgcc cgaaggaccg cgcacctggt gcatgacccg caagcccggt gcctgacgcc 3420
cgccccacga cccgcagcgc ccgaccgaaa ggagcgcacg accccatgca tcggtaccta 3480
gagtcggggc ggccggccgc ttcgagcaga catgataaga tacattgatg agtttggaca 3540
aaccacaact agaatgcagt gaaaaaaatg ctttatttgt gaaatttgtg atgctattgc 3600
tttatttgta accattataa gctgcaataa acaagttaac aacaacaatt gcattcattt 3660
tatgtttcag gttcaggggg aggtgtggga ggttttttaa agcaagtaaa acctctacaa 3720
atgtggtaaa atcgctgcag ctctggcccg tgtctcaaaa tctctgatgt tacattgcac 3780
aagataaaaa tatatcatca tgaacaataa aactgtctgc ttacataaac agtaatacaa 3840
ggggtgttat gagccatatt caacgggaaa cgtcgaggcc gcgattaaat tccaacatgg 3900
atgctgattt atatgggtat aaatgggctc gcgataatgt cgggcaatca ggtgcgacaa 3960
tctatcgctt gtatgggaag cccgatgcgc cagagttgtt tctgaaacat ggcaaaggta 4020
gcgttgccaa tgatgttaca gatgagatgg tcagactaaa ctggctgacg gaatttatgc 4080
ctcttccgac catcaagcat tttatccgta ctcctgatga tgcatggtta ctcaccactg 4140
cgatccccgg aaaaacagca ttccaggtat tagaagaata tcctgattca ggtgaaaata 4200
ttgttgatgc gctggcagtg ttcctgcgcc ggttgcattc gattcctgtt tgtaattgtc 4260
cttttaacag cgatcgcgta tttcgtctcg ctcaggcgca atcacgaatg aataacggtt 4320
tggttgatgc gagtgatttt gatgacgagc gtaatggctg gcctgttgaa caagtctgga 4380
aagaaatgca taaacttttg ccattctcac cggattcagt cgtcactcat ggtgatttct 4440
cacttgataa ccttattttt gacgagggga aattaatagg ttgtattgat gttggacgag 4500
tcggaatcgc agaccgatac caggatcttg ccatcctatg gaactgcctc ggtgagtttt 4560
ctccttcatt acagaaacgg ctttttcaaa aatatggtat tgataatcct gatatgaata 4620
aattgcagtt tcatttgatg ctcgatgagt ttttctaatc agaattggtt aattggttgt 4680
aacattattc agattgggcc ccgttccact gagcgtcaga ccccgtagaa aagatcaaag 4740
gatcttcttg agatcctttt tttctgcgcg taatctgctg cttgcaaaca aaaaaaccac 4800
cgctaccagc ggtggtttgt ttgccggatc aagagctacc aactcttttt ccgaaggtaa 4860
ctggcttcag cagagcgcag ataccaaata ctgttcttct agtgtagccg tagttaggcc 4920
accacttcaa gaactctgta gcaccgccta catacctcgc tctgctaatc ctgttaccag 4980
tggctgctgc cagtggcgat aagtcgtgtc ttaccgggtt ggactcaaga cgatagttac 5040
cggataaggc gcagcggtcg ggctgaacgg ggggttcgtg cacacagccc agcttggagc 5100
gaacgaccta caccgaactg agatacctac agcgtgagct atgagaaagc gccacgcttc 5160
ccgaagggag aaaggcggac aggtatccgg taagcggcag ggtcggaaca ggagagcgca 5220
cgagggagct tccaggggga aacgcctggt atctttatag tcctgtcggg tttcgccacc 5280
tctgacttga gcgtcgattt ttgtgatgct cgtcaggggg gcggagccta tggaaaaacg 5340
ccagcaacgc ggccttttta cggttcctgg ccttttgctg gccttttgct cacatgttct 5400
ttcctgcgtt atcccctgat tctgtggata accgtattac cgctagcatg gatctcgggg 5460
acgtctaact actaagcgag agtagggaac tgccaggcat caaataaaac gaaaggctca 5520
gtcggaagac tgggcctttc gttttatctg ttgtttgtcg gtgaacgctc tcctgagtag 5580
gacaaatccg ccgggagcgg atttgaacgt tgtgaagcaa cggcccggag ggtggcgggc 5640
aggacgcccg ccataaactg ccaggcatca aactaagcag aaggccatcc tgacggatgg 5700
cctttttgcg tttctacaaa ctcttcctgt tagttagtta cttaagctcg ggccccaaat 5760
aatgatttta ttttgactga tagtgacctg ttcgttgcaa caaattgata agcaatgctt 5820
ttttataatg ccaactttgt acaaaaaagc aggcttcgaa ggagatagaa ccagatcttg 5880
gaattcagat tgccaggaat ataccagaca ctggagctag gtaaaggcct cctgtacacc 5940
catacaagga gcgcttctct gccttcaaat atcaacaagt tttaaatccc cagtgtgtag 6000
tacagagcag gctgggtgga tttgaggtct gtgttcttag gaattgaacc tttaaagcgc 6060
agtatacatt ctctacgcta aggaaagact tgggctggga aaagtgggct ctgccaagac 6120
tcaggccgat gacctcgtcc cctccagagc agtgggtctc aagcttccta actctccaac 6180
cttttaatac agttcttatg ttgcagtggc cccaatcatc aaattgtttt gttgttacag 6240
cataactata attttcctag ttataaagca tactgtaaac aactgtgttt tctgatggtt 6300
ttagggtaac cgctgtgaaa ggatctatca gccccaaaag gaattgggat ccacaggtta 6360
agaaccagtg ccttagatgt tctgaggcca cagctttgga gattgaaaag acagtccttt 6420
gtgaagacta gaatcttagg ccaaggtgct tgctgccaag cctgacaccc cagtctgact 6480
ctcagaaccc atacagcaag gagaacctcc tcagggccat ggtatgtgtt tcccaacacg 6540
gacacacaca caatcacaca gagtaaaggg ttttttaatt aagcaagaaa tacagtttac 6600
acatatgtct gcataaggtc acggagggtg gtagccgacg agagaccagc tcatcttcaa 6660
taaggaagtc agagagcaga aggctttgtc agcagggcaa gactatactt tgttaggaag 6720
tgaggcattg ttcagacttc cttatgcttt cttatgaaca ggctgtatta gccaacagtc 6780
ctgtctgtac gtgagttgtg ccactttggg ttgagggtgc tgggctaaca cagatcttag 6840
ttaagcattt ccttgtcctt tgattcctca atgacccaga acaggcaaac aatacgatac 6900
ttatgtttga tgaattagat gactgcatct acaactgaac ttgtgcactg agttctggat 6960
ggtcgcctga aggagaacgc agggaggcag gcgatacttt aataggactg actgtgaggg 7020
taaatcggtg tcatacatgg aaccgtcgtg tgtatggaga tacccagaac aataaagacc 7080
caagaaaaac agatagtcaa gaaatcatga gttttactta atcagggcgt tttgatcagt 7140
cagtccaatg atgccaatga tgaaaagtca ccctcaaact gcccgaggga agactttcag 7200
gaaaagccct ggtgataaag tttaacagca aatacctatg aatgaatgta taaagctagt 7260
aacggccgta gcactgtttt caaaacgtag tcaccggctc actctacatt tgcgagaccc 7320
cgacagaagt aaatgtaagg tcaagcgatt ttgaaaaaga ggagcaccag ttcctttcct 7380
gcagctctaa cgtcctacca atggggctgc atggactggt gcagccacag gtgatgagcc 7440
cagagcatag aggaaactgg aagatggagc agcgtatcgt ttataacagc aacttggcat 7500
ctgatggaga tagctcagtg gtaacgtggg gagtctgtcc atttggtgct ggtggggaaa 7560
ctgggagaga caaaggggaa atggaggatt taaacaaaat acaaaaaaaa aaaatggacg 7620
caacagtcag caatcactgt gaatagcaaa ttcttcatgc atccaagact taagcccagc 7680
atctttcagg caggaaaaca atctacccct gaatggcatt tttcttcttt tctttttacc 7740
tttggggcag gttctgtgtt gacctttgaa ctaaccctat aaccccagca ggtgttgaac 7800
ctataatccc cctgcctcat cctctcaaat agctggaatt tgtgggccag caccaagagg 7860
cccaaagaaa gagaaagttt aaattaaata gaagaaaatg tagaggtatt gataggtggt 7920
ggtatcacac acctttaatc ccagcactca ggaggcagtg acagattgct atctgtgagt 7980
tcaaggttag gctggtctat agggctagtt ctagggtagc cagagccaca caaagaaaac 8040
atgtctccaa aaagcaaaca aaaatgtaga ggtgcacatt tgggatctgg gagcaggtaa 8100
aacttaaatt cctagctagc ttcaaatata taggaaaatt ctatcttaca taaatcaatt 8160
ttttaaaaaa atctataacc gtatatcaga aaaacatagt aagatgaaaa atatatttga 8220
aaaggaggta ccaaaatggt cctgagggac tttggcttct tgatttattc attcaataaa 8280
tgcaatacat ttattcagtc aataagtcaa tgtttatttt gtattgaacg attctatgta 8340
ctgatggtag agggaacaga atctttcttg aggtattaaa attctgggtg ctttttgtcc 8400
tcacaaggtt aaagaaattt acttctgaca tgtgggtttt ctttttaaaa ttataatcat 8460
gtaactttgt aactgggaga atacttggtt gtgtttcttc taaattaata cttttaaaaa 8520
tatttcttta gtgttggggg tggctttaca cagggaccgg accacatcac ccacgtggag 8580
gtcagagatc aacttggagg agttgactct ttccttgcac caaatgggtt ctgcgggtca 8640
aactcgggtc atcgggcttg gtgttaccgg ctggcctctc tcatctgccc tagatctcag 8700
ggggccctgc tgacactctg ctggtgtgta gattagaatc gcggcagctc ggcgggtgca 8760
gaatgcccat tgctccgttt tgattcttct gcaacctgta tgtgactagc aacctcacca 8820
agctgcagtc tcttcctcgg caaaacagca taagaatgat tctcagtctg aagttagttt 8880
aaagaggaaa caggaaacga aagaacatta actagaatag cacttggcac acgacagaca 8940
actcatatta gctagtttgc tttccctatc ttgggatatc atgattccaa aaatgagatt 9000
ttcccggaga ctgtatttca aaaatagaac tgctttgggt tgtcagggaa ataaatgatg 9060
ccttcctgaa ataataataa taataacaac aacaacaaca acaacaatat aaaacaaaaa 9120
ccagccccat gctttcctag acagtgtaac ctggtgacac atgaaatgtg tctcactttc 9180
cccagaactt gaagccttga ctcaggatgc tcaacaggag ggaagtaaga gacaccaccc 9240
cccacccccg cttgctgttt tagcctcacc ttgcaagtcc ccagtggact taaatcttgg 9300
aaaaggtgag caccctgccc tgaggtgccc aggccggaag cctagcactt cacatgaggt 9360
tatgaaatca cacataattg tcaattgtct gaggagagat taatgtcatc cagctggctt 9420
tttcaaaagg gtgtgaactg gacggatgaa taatgctcag agggaagaat ggtagttcct 9480
ctgatgggga ggttctgttg actctgtcat tcttccattc ggtgggcgga gccagttgtt 9540
ggataaacag atccaacctg attataaggg gggaaaaaga tgtgccctct gtcttttagg 9600
gttacggccg gtgga 9615
<210> 2
<211> 20
<212> DNA
<213> 人工序列（Artificial sequence）
<220>
<223> 来自基因座chr7_13872039的缺失区
<400> 2
caggccagtt tcatcccttc 20
<210> 3
<211> 19
<212> DNA
<213> 人工序列（Artificial sequence）
<220>
<223> 用于来自 chr7_13872039的缺失的正向引物
<400> 3
attcccaaag cgtcgaact 19
<210> 4
<211> 22
<212> DNA
<213> 人工序列（Artificial sequence）
<220>
<223> 用于来自chr7_13872039的缺失的反向引物
<400> 4
ctaccattgg aaggacgatc ac 22
<210> 5
<211> 13
<212> DNA
<213> 人工序列（Artificial sequence）
<220>
<223> 用于来自chr7_13872039的缺失的LNA探针，其中在n = 3,4,6,8,9,11时具有锁核苷酸
<400> 5
taaggacatc cat 13
<210> 6
<211> 23
<212> DNA
<213> 人工序列（Artificial sequence）
<220>
<223> 用于来自chr19_39237841的缺失的正向引物
<400> 6
caattcttta ggtgtaccct gtg 23
<210> 7
<211> 22
<212> DNA
<213> 人工序列（Artificial sequence）
<220>
<223> 用于来自chr19_39237841的缺失的反向引物
<400> 7
aaacaatgga gcagatgaca tt 22
<210> 8
<211> 10
<212> DNA
<213> 人工序列（Artificial sequence）
<220>
<223> 用于来自chr19_39237841的缺失的LNA探针，其中在n = 2,3,4,6,8,9时具有锁核苷酸
<400> 8
ttctcgctgt 10

Claims (37)

1.一种经过基因修饰的免疫细胞，其包括异源核酸，其被配置为响应于由接受所述经过基因修饰的免疫细胞的动物或人类受试者的病理状况引起的代谢或分子表达变化来表达可检测药剂。
2.根据权利要求1所述的经过基因修饰的免疫细胞，其中所述经过基因修饰的免疫细胞是单核细胞、巨噬细胞、T细胞、B细胞、自然杀伤(NK)细胞、骨髓细胞、干细胞或树突状细胞。
3.根据权利要求1所述的经过基因修饰的免疫细胞，其中所述异源核酸包括基因表达调控区，其可操作地连接到编码可检测药剂的核酸序列，并且其中所述基因表达调控区响应于病理学特异性代谢变化以诱导所述可检测药剂的表达。
4.根据权利要求1所述的经过基因修饰的免疫细胞，其中所述异源核酸是核酸载体。
5.根据权利要求4所述的经过基因修饰的免疫细胞，其中所述异源核酸是质粒。
6.根据权利要求1所述的经过基因修饰的免疫细胞，其中所述基因表达调控区包括基因启动子区。
7.根据权利要求6所述的经过基因修饰的免疫细胞，其中所述基因表达调控区进一步包括基因特异性增强子。
8.根据权利要求6所述的经过基因修饰的免疫细胞，其中所述基因启动子是ARG1启动子、AKT1启动子、多功能蛋白聚糖(versican)启动子、MIF启动子、Ym1启动子、CD206启动子、FIZZ1启动子、DC-SIGN启动子、CD209启动子、MGL-1启动子、Dectin-1启动子、CD23启动子、半乳凝素-3启动子、Mer酪氨酸激酶启动子、AXL受体蛋白启动子、GAS-6启动子、NOS-2启动子、CD68启动子、CD86启动子、CCL18启动子、CD163启动子、MMR/CD206启动子、CD200R启动子、TGM2启动子、DecoyR启动子、IL-1RII启动子、IL-10启动子、TGF-β启动子、IL-1ra启动子、CCL17启动子、CCL2启动子或CCL24启动子。
9.根据权利要求1所述的经过基因修饰的免疫细胞，其中所述可检测药剂是可检测多肽或可分泌核酸。
10.根据权利要求9所述的经过基因修饰的免疫细胞，其中所述可检测多肽是造影剂、与报告基因互补的结合剂、产生可检测分子的酶、光声报告因子、生物发光报告因子、自发荧光报告因子、化学发光报告因子、发光报告因子或比色报告因子、能够通过无创成像检测到的药剂或驱动可检测分子的积累的转运体。
11.根据权利要求9所述的经过基因修饰的免疫细胞，其中所述可检测药剂是可分泌核酸，并且其中所述可分泌核酸是可通过RT-QPCR、QPCR、杂交、测序或质谱法检测的结构化RNA或合成miRNA。
12.根据权利要求10所述的经过基因修饰的免疫细胞，其中所述可检测多肽是铁蛋白。
13.根据权利要求10所述的经过基因修饰的免疫细胞，其中所述可检测多肽是高斯荧光素酶(Gaussia luciferase)(Gluc)。
14.根据权利要求10所述的经过基因修饰的免疫细胞，其中所述可检测多肽是HSV1-tk。
15.根据权利要求10所述的经过基因修饰的免疫细胞，其中所述可检测多肽是多巴胺D2受体的D80RA突变体。
16.根据权利要求10所述的经过基因修饰的免疫细胞，其中所述可检测多肽是人钠碘同向转运体(hNIS)。
17.根据权利要求1所述的经过基因修饰的免疫细胞，其中所述异源核酸与如SEQ IDNO：1所示的核苷酸序列具有至少80％的同一性。
18.根据权利要求1所述的经过基因修饰的免疫细胞，其中所述异源核酸编码所述可检测药剂。
19.根据权利要求3所述的经过基因修饰的免疫细胞，其中响应于所述经过基因修饰的免疫细胞中的肿瘤特异性代谢变化，所述基因表达调控区诱导所述可检测药剂的表达。
20.根据权利要求19所述的经过基因修饰的免疫细胞，其中所述经过基因修饰的免疫细胞中的所述肿瘤特异性代谢变化由选自由以下组成的组的癌症引起：膀胱癌、乳腺癌、结直肠癌、子宫内膜癌、头颈癌、肺癌、黑素瘤、非小细胞肺癌、卵巢癌、前列腺癌、睾丸癌、子宫癌、宫颈癌、甲状腺癌、胃癌、脑干胶质瘤、小脑星形细胞瘤、脑星形细胞瘤、胶质母细胞瘤、室管膜瘤、尤文氏肉瘤家族肿瘤(Ewing′s sarcoma family of tumors)、生殖细胞瘤、颅外癌症(extracranial cancer)、霍奇金病白血病(Hodgkin′s disease leukemia)、肝癌、成神经管细胞瘤、神经母细胞瘤、脑瘤、骨肉瘤、骨恶性纤维组织细胞瘤、视网膜母细胞瘤、横纹肌肉瘤、肉瘤、幕上原始神经外胚层肿瘤、松果体肿瘤、视觉通路和下丘脑胶质瘤(visualpathway and hypothalamic glioma)、维尔姆斯瘤(Wilms′tumor)、食管癌、毛细胞白血病、肾癌、口腔癌、胰腺癌、皮肤癌和小细胞肺癌。
21.根据权利要求3所述的经过基因修饰的免疫细胞，其中所述经过基因修饰的免疫细胞中的所述病理学特异性代谢变化来自炎症。
22.一种产生经过基因修饰的免疫细胞的方法，其包括以下步骤：
(a)从人类或动物受试者中分离出病理学应答性免疫细胞群体；以及
(b)用异源核酸转化(a)中分离出的经过分离的病理学应答性免疫细胞群体的病理学应答性免疫细胞以产生所述经过基因修饰的免疫细胞，其中所述异源核酸编码可检测药剂，并且其中所述经过基因修饰的免疫细胞被配置成响应于由接受所述经过基因修饰的免疫细胞的动物或人类受试者的病理状况引起的代谢变化来表达所述可检测药剂。
23.根据权利要求22所述的方法，其中所述病理学应答性免疫细胞是肿瘤应答性免疫细胞。
24.根据权利要求23所述的方法，其中所述肿瘤应答性免疫细胞是巨噬细胞。
25.一种检测动物或人类受试者的病理状况的方法，其包括以下步骤：
向受试者施用药学上可接受的组合物，所述药学上可接受的组合物包括根据权利要求1到21中任一项所述的经过基因修饰的免疫细胞群体；
从所述动物或人类受试者中获得生物流体样品；
在所述生物流体样品中检测可分泌可检测药剂的存在，其中所述存在指示所述动物或人类受试者具有引起与动物或人类患者的病理状况接触的所述经过基因修饰的免疫细胞中的表型变化的病理状况。
26.根据权利要求25所述的方法，其中所述经过基因修饰的免疫细胞是肿瘤应答性巨噬细胞。
27.根据权利要求25所述的方法，其中所述病理状况是癌症。
28.根据权利要求25所述的方法，其中所述病理状况是肿瘤。
29.根据权利要求25所述的方法，其中所述方法进一步包括以下步骤：
在邻近于或依附于所述病理状况的病理学应答性免疫细胞中检测来自所述可检测药剂的信号；
产生相对于所述受试者的所述可检测信号的图像；以及
确定局部信号在所述受试者中的位置。
30.根据权利要求25所述的方法，其中所述生物流体是血液。
31.根据权利要求28所述的方法，其包括当邻近于或依附于所述动物或人类患者的病理状况的所述经过基因修饰的免疫细胞未分泌一定量的所述可检测药剂时执行所述方法。
32.一种试剂盒，其包括：
设备，所述设备用于骨髓源性巨噬细胞(BMDM)分离；以及
无内毒素质粒制剂，其编码可操作地连接到精氨酸酶-1(Arg-1)启动子的可检测药剂。
33.一种用于鉴别受试者的病理状况的方法，其包括：
(a)向所述受试者施用包括异源核酸的经过基因修饰的免疫细胞，所述异源核酸具有编码可检测药剂的核酸序列，其中所述经过基因修饰的免疫细胞响应于由所述受试者的病理状况引起的代谢变化来表达所述可检测药剂；以及
(b)检测所述受试者中的所述可检测药剂以鉴别所述病理状况。
34.根据权利要求33所述的方法，其中当响应于所述经过基因修饰的免疫细胞中的肿瘤特异性代谢变化时，所述基因表达调控区诱导所述可检测药剂的表达。
35.根据权利要求33所述的方法，其中所述经过基因修饰的免疫细胞中的所述肿瘤特异性代谢变化由选自由以下组成的组的癌症引起：膀胱癌、乳腺癌、结直肠癌、子宫内膜癌、头颈癌、肺癌、黑素瘤、非小细胞肺癌、卵巢癌、前列腺癌、睾丸癌、子宫癌、宫颈癌、甲状腺癌、胃癌、脑干胶质瘤、小脑星形细胞瘤、脑星形细胞瘤、胶质母细胞瘤、室管膜瘤、尤文氏肉瘤家族肿瘤、生殖细胞瘤、颅外癌症、霍奇金病白血病、肝癌、成神经管细胞瘤、神经母细胞瘤、脑瘤、骨肉瘤、骨恶性纤维组织细胞瘤、视网膜母细胞瘤、横纹肌肉瘤、肉瘤、幕上原始神经外胚层肿瘤、松果体肿瘤、视觉通路和下丘脑胶质瘤、维尔姆斯瘤、食管癌、毛细胞白血病、肾癌、口腔癌、胰腺癌、皮肤癌和小细胞肺癌。
36.根据权利要求33所述的方法，其中所述经过基因修饰的免疫细胞中的所述病理学特异性代谢变化来自炎症。
37.根据权利要求1所述的经过基因修饰的免疫细胞，其中所述异源核酸包括多个不同的基因表达调控区，其中每个调控区可操作地连接到编码多种类型的可检测药剂的多个核酸序列，并且其中所述基因表达调控区响应于病理学特异性代谢变化以诱导所述可检测药剂的表达，其中每个可检测药剂的水平指示所述受试者的不同状況。
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