CN115920056A - Roquin2蛋白及其编码基因在抗血管发生治疗肿瘤中的应用 - Google Patents

Abstract

本发明公开了Roquin2蛋白及其编码基因在抗血管发生治疗肿瘤中的应用。本发明中的肿瘤血管发生抑制蛋白及其编码基因对控制肿瘤血管发生，抑制肿瘤转移及生长进程具有显著的理论和实际应用意义。

Description

Roquin2蛋白及其编码基因在抗血管发生治疗肿瘤中的应用

技术领域

本发明涉及肿瘤学、遗传学、分子生物学。具体的，本发明涉及一种肿瘤血管发生抑制蛋白Roquin2及其编码基因和应用。所述蛋白的氨基酸序列如SEQ ID NO.1所示，基因序列如SEQ ID NO.2所示。本发明中的肿瘤血管发生抑制蛋白及其编码基因对控制肿瘤血管发生，抑制肿瘤转移及生长进程具有显著的理论和实际应用意义。

背景技术

肿瘤血管发生是实体瘤进一步生长及向远端器官转移的一个关键(Teleanu RL,et al.2019)。遗憾的是，截止目前调节肿瘤血管发生的分子机制仍不清楚。肿瘤细胞通过分泌释放一些血管发生相关因子激活血管内皮细胞及周细胞，继而在肿瘤组织内构建形成丰富的血管网络(Lugano R,et al.2020)，这些新生的血管将促进肿瘤块的进一步生长及远端转移(Singh P,et al.2018)。因此，肿瘤细胞分泌的一系列血管发生因子成为肿瘤细胞—内皮细胞间相互交流的纽带(Kumar M,et al.2016)，它们控制着肿瘤血管发生的开启。通常情况下，肿瘤血管发生的开启通过或者增加促血管发生因子基因的表达，或者通过降低抗血管发生因子基因的表达，局部组织中血管发生相关因子的平衡与否将决定血管发生被诱导还是被抑制(Gacche RN,et al.2013)。虽然广泛的研究进展已经拓展了我们对于肿瘤诱导血管发生机制的理解，但是肿瘤细胞内转录后水平调控肿瘤血管发生因子基因表达的机制仍不清楚，尤其是RNA结合蛋白在控制肿瘤血管发生中发挥的作用及机制。

Roquin2是一种RNA结合蛋白，由Rc3h2基因编码，属于Roquin家族(由Roquin1和Roquin2组成)。Roquin1/2均在其N-末端含有一个RING功能区；一个保守的ROQ功能区；一个CCCH-型锌指蛋白功能区(Leppek K,et al.2013)。其中ROQ功能区能够结合mRNAs的3’UTR中的茎环结构(stem-loop motif)并促进其靶mRNAs降解(Vinuesa CG,et al.2005；Schlundt A,et al.2014；Tan D,et al.2014)。缺失Roquin2小鼠出生后几天内死亡(Bertossi A,et al.2011)。Roquin2可募集CCR4-CAF-NOT复合体，导致mRNA脱腺苷酸化并降解(Sgromo A,et al.2017)。晶体结构分析发现Roquin2的ROQ和HEPN功能区能够同时结合stem-loop和双链RNA(Zhang Q,et al.2015；Sakurai S,et al.2015)。Roquin2与Roquin1均能通过降解共刺激因子Icos和Ox40的mRNAs控制TfH(follicular helper T)细胞分化(Vogel KU,et al.2013)。Roquin2与Roquin1还能够差异性调节NKT细胞的分化(Drees C,et al.2017)。Roquin2通过促进泛素化介导的ASK1蛋白降解调节细胞的应急反应(Maruyama T,et al.2014)。最近报道，Roquin2能够与KLHL6相互作用，并作为后者的靶点被降解，进而参与B细胞癌—DLBCLs(Choi J,et al.2018)。另外，PTPN14可通过蛋白去磷酸化机制降解Roquin2蛋白参与调控DLBCL进展(Choi J,et al.2018)。研究证实Roquin2能够调控多种细胞因子的表达，包括TNF-α,ICOS,IFN-γ,IL17A等(Pratama A,et al.2013；Essig K,et al.2017)，这表明Roquin2很可能调节肿瘤细胞分泌的血管发生相关因子的表达。基于此，阐述Roquin2在肿瘤血管发生中的作用及其机制对于未来靶向肿瘤血管新生治疗癌症具有非常重要的临床应用前景。

发明内容

本发明的目的在于，提供了Roquin2蛋白以及Roquin2基因的一种新应用。更具体地，本发明涉及Roquin2蛋白以及Roquin2基因在抗血管发生治疗肿瘤中的新用途以及作为分子靶标在抗肿瘤药物研发中的新用途。

本发明首先保护Roquin2蛋白及基因在制备抗血管发生治疗肿瘤药物中的应用。

本发明还保护Roquin2基因或具有Roquin2基因的生物材料在制备肿瘤治疗药物中的应用。

本发明还保护可以上调生物体中Roquin2蛋白丰度的物质在制备肿瘤治疗药物中的应用。所述可以上调生物体中Roquin2蛋白丰度的物质可以为Roquin2蛋白本身，也可以是生物体中位于Roquin2蛋白上游的可以促进Roquin2蛋白表达的其他蛋白质，也可以是生物体中位于Roquin2蛋白下游的可以减少Roquin2蛋白降解的其他蛋白质，也可以是促进生物体中Roquin2蛋白水平增加的化合物或其他小分子。

本发明还保护可以上调生物体中Roquin2基因丰度的物质在制备肿瘤治疗药物中的应用。所述可以上调生物体中Roquin2基因丰度的物质可以为Roquin2基因本身，也可以是生物体中位于Roquin2基因上游的可以促进Roquin2基因表达的其他蛋白或核酸分子；也可以是生物体中位于Roquin2基因下游的可以减少Roquin2基因降解的其他蛋白或核酸分子；也可以是促进生物体中Roquin2基因表达的化合物或其他小分子。

本发明还保护Roquin2蛋白或Roquin2基因作为分子靶标物在抗肿瘤药物研发中的应用。Roquin2蛋白作为分子靶标物具体可以为Roquin2蛋白作为分子靶标物被上调。可以上调生物体中Roquin2蛋白的物质可以为Roquin2蛋白本身，也可以是生物体中位于Roquin2蛋白上游的可以促进Roquin2蛋白生成的其他蛋白质，也可以是生物体中位于Roquin2蛋白下游的可以减少Roquin2蛋白降解的其他蛋白质，也可以是促进生物体中Roquin2蛋白水平增加的化合物或其他小分子。Roquin2基因作为目标靶标物具体可为Roquin2基因作为靶标物被上调。可以上调生物体中Roquin2基因的物质可以为Roquin2基因本身，也可以是生物体中位于Roquin2基因上游的可以促进Roquin2基因表达的其他蛋白或核酸分子，也可以是生物体中位于Roquin2基因下游的可以减少Roquin2基因降解的其他蛋白或核酸分子，也可以是促进生物体中Roquin2基因表达的化合物或其他小分子。

本发明还保护一种Roquin2蛋白截短体，即Roquin2蛋白的ROQ功能区。

Roquin2蛋白的ROQ功能区为Roquin2蛋白第171-325位氨基酸残基。

编码所述Roquin2蛋白截短体的基因也属于本发明的保护范围。

本发明还保护Roquin2蛋白截短体在制备肿瘤治疗药物中的应用。

本发明还保护编码所述Roquin2蛋白截短体的基因或具有编码所述Roquin2蛋白截短体的基因的生物材料在制备肿瘤治疗药物中的应用。

本发明还保护Roquin2蛋白截短体或编码所述Roquin2蛋白截短体的基因作为靶标物在抗肿瘤药物研发中的应用。Roquin2蛋白截短体作为靶标物具体可为Roquin2蛋白截短体作为靶标物被上调。可以上调生物体中Roquin2蛋白截短体的物质可以为Roquin2蛋白截短体本身，也可以是促进生物体中Roquin2蛋白截短体水平增加的其他蛋白质、肽段、化合物或其他小分子。编码Roquin2蛋白截短体的基因作为靶标物具体可为编码Roquin2蛋白截短体的基因作为靶标物被上调。可以上调生物体中编码Roquin2蛋白截短体的基因的物质可以为编码Roquin2蛋白截短体的基因本身，也可以是促进编码Roquin2蛋白截短体的基因表达的其他蛋白、多肽、核酸分子、化合物或其他小分子。

以上任一所述药物的功能为如下(a1)和/或(a2)和/或(a3)和/或(a4)：(a1)治疗肿瘤；(a2)抑制肿瘤生长和/或转移；(a3)抑制肿瘤血管发生；(a4)阻止肿瘤细胞的生长。

示例性的，以上任一所述Roquin2蛋白可为人Roquin2蛋白。

以上任一所述Roquin2蛋白具体可为如下(b1)、(b2)、(b3)或(b4)：

(b1)序列表中序列1所示的蛋白质；

(b2)在(b1)的氨基末端或羧基末端连接标签得到的融合蛋白；

(b3)将(b1)经过一个或几个氨基酸残基的取代和/或缺失和/或添加得到的具有(a1)至(a4)中任一功能的蛋白质；

(b4)来源于人且与(b1)具有98％以上同一性且具有(a1)至(a4)中任一功能的蛋白质。

标签具体如表1所示。

表1标签的序列

所述Roquin2蛋白还可为其它物种中的具有(a1)至(a4)中任一功能的同源蛋白。所述其它物种包括但不限于小鼠、大鼠、兔子、狗、猴子、猩猩、猿类、牛、羊、猪、马、绵羊、山羊、猫等。

Roquin2基因即编码Roquin2蛋白的基因。

以上任一所述Roquin2基因具体可为如下(c1)或(c2)或(c3)：

(c1)编码区如序列表中序列2所示的DNA分子；

(c2)来源于人且与(c1)具有95％以上同一性且编码所述蛋白质的DNA分子；

(c3)在严格条件下与(c1)限定的核苷酸序列杂交且编码所述蛋白质的DNA分子。

所述Roquin2基因还可为其它物种中的同源基因。所述其它物种包括但不限于小鼠、大鼠、兔子、狗、猴子、猩猩、猿类、牛、羊、猪、马、绵羊、山羊、猫等。

Roquin2蛋白截短体具体可为如下(d1)、(d2)、(d3)或(d4)：

(d1)序列表的序列1中第174-326位氨基酸残基所示的蛋白质；

(d2)在(d1)的氨基末端或羧基末端连接标签得到的融合蛋白；

(d3)将(d1)经过一个或几个氨基酸残基的取代和/或缺失和/或添加得到的具有(a1)至(a4)中任一功能的蛋白质；

(d4)来源于人且与(d1)具有98％以上同一性且具有(a1)至(a4)中任一功能的蛋白质。

标签具体如表1所示。

所述Roquin2蛋白截短体还可为其它物种中的具有(a1)至(a4)中任一功能的同源蛋白。所述其它物种包括但不限于小鼠、大鼠、兔子、狗、猴子、猩猩、猿类、牛、羊、猪、马、绵羊、山羊、猫等。

以上任一所述编码Roquin2蛋白截短体的基因具体可为如下(e1)或(e2)或(e3)：

(e1)序列表中序列2所示的DNA分子中编码Roquin2蛋白截短体的DNA分子；

(e2)来源于人且与(e1)具有95％以上同一性且编码所述Roquin2蛋白截短体的DNA分子；

(e3)在严格条件下与(e1)限定的核苷酸序列杂交且编码所述Roquin2蛋白截短体的DNA分子。

所述编码Roquin2蛋白截短体的基因还可为其它物种中的同源基因。所述其它物种包括但不限于小鼠、大鼠、兔子、狗、猴子、猩猩、猿类、牛、羊、猪、马、绵羊、山羊、猫等。

以上任一所述具有Roquin2基因的生物材料可为具有Roquin2基因的表达载体。以上任一所述具有编码Roquin2蛋白截短体的基因的生物材料可为具有编码Roquin2蛋白截短体的基因的表达载体。所述表达载体能够携带核苷酸序列，并将这个序列整合到细胞基因组中，并能够在细胞中复制。“表达载体”包括质粒、黏端质粒、病毒(噬菌体、动物病毒、植物病毒等)以及人工染色体(比如YACs)。当前可能适用于临床基因治疗的作为表达载体的病毒(又称病毒载体)如下：腺病毒载体、逆转录病毒载体、腺相关病毒载体、慢病毒载体、疱疹病毒载体、嵌合病毒载体以及其它病毒载体。

以上任一所述肿瘤包括但不限于乳腺癌。

以上任一所述肿瘤细胞包括但不限于乳腺癌细胞。

本发明的发明者发现Roquin2蛋白具有显著的抗肿瘤血管发生功能，可抑制肿瘤细胞诱导的血管发生，其机制在于选择性抑制促血管发生因子的基因转录本的表达(包括PDGFC/D、ENG、EDN1等)。本发明的发明者发现在乳腺癌组织及细胞中Roquin2基因表达是被抑制的，这可能方便它们促进肿瘤血管发生。过表达Roquin2基因可阻滞乳腺癌细胞诱导的血管发生，然而，通过使用shRNA进一步抑制Roquin2基因表达可显著增强肿瘤血管发生。与这些体外观察相一致，在生物体内过表达Roquin2基因可显著抑制肿瘤血管发生、肿瘤生长及转移。通过分析人肿瘤样本数据库，发明者发现低表达水平的Roquin2与差的乳腺癌患者存活显著关联。并且，在癌症患者组织中Roquin2基因的表达水平与其促血管发生因子靶基因ENG、EDN1、Ang、Tie1的表达水平呈显著负相关。这些结果表明Roquin2是一个肿瘤抑制基因，参与调节肿瘤血管发生信号通路，通过抑制血管发生促进基因表达。基于此，利用该肿瘤抑制性蛋白Roquin2提高临床肿瘤治疗效果具有非常重要的应用前景。

本发明首次鉴定人Roquin2基因是一种肿瘤抑制基因，肿瘤细胞中过表达Roquin2基因可显著抑制肿瘤血管发生并抑制肿瘤转移。本发明对于肿瘤血管发生、肿瘤转移的机制研究提供了重要的理论支持。本发明对于抗血管生成治疗肿瘤具有十分重要的理论及实际意义。

附图说明

图1为Roquin2抑制肿瘤细胞诱导的血管发生并阻止肿瘤生长及转移。MDA-MB-468细胞中鉴定外源性Roquin2/GFP融合蛋白有效表达(图1A)；过表达Roquin2基因的不同乳腺肿瘤细胞上清液显著抑制内皮细胞迁移(图1B)和成管(图1C)；过表达Roquin2基因抑制肿瘤生长(图1D)；肿瘤组织内血管生成(图1E)及肺转移(图1F)。

图2为Roquin2靶向3’UTRs抑制促血管发生因子基因mRNAs表达。过表达Roquin2基因后，促血管发生因子基因mRNAs被下调，部分抗血管发生基因被上调(图2A、图2B、图2C)；Roquin2蛋白靶向结合促血管发生因子基因的mRNA(图2D)；Roquin2蛋白可靶向结合促血管发生因子基因的3’UTR降解它们的mRNAs(图2E)，但不能靶向抗血管发生因子基因的3’UTRs(图2F)。

图3为Roquin2的ROQ功能区负责降解促血管发生因子基因的mRNAs。对促血管发生因子基因mRNAs半衰期的检测发现(图3A、图3B、图3C和图3D)，过表达Roquin2基因显著降低它们的半衰期；Roquin2功能区示意图及不同突变体的制备策略(图3E)；免疫印迹法鉴定Roquin2不同突变体的表达(图3F)；过表达S1截短体基因或S3截短体基因后，促血管发生因子基因mRNAs被下调(图3G)；S1截短体或S3截短体可靶向结合促血管发生基因的3’UTR降解它们的mRNAs图3H)；过表达S1截短体基因或S3截短体基因抑制肿瘤细胞诱导的内皮管腔形成(图3I)。

图4为体内过表达Roquin2基因抑制肿瘤生长及转移。表达Roquin2基因的重组腺病毒可以抑制荷瘤裸鼠的肿瘤生长和转移(图4A、图4B和图4C)；表达Roquin2基因的重组腺病毒可以抑制肿瘤组织内的血管发生(图4D)。

具体实施方式

以下结合附图对本发明的原理和特征进行描述。以下的实施例便于更好地理解本发明，但并不限定本发明。下述实施例中的实验方法，如无特殊说明，均为常规方法。如无特殊说明，以下实施例中的定量试验，均设置3次以上重复实验，结果取平均值。

pEGFP-N1载体：Clontech公司；pEGFP-N1载体表达EGFP蛋白，EGFP蛋白又称为GFP蛋白。MDA-MB-468细胞(人乳腺癌细胞)：

HTB-132^TM。MDA-MB-231细胞(人乳腺癌细胞)：

HTB-26^TM；人脐静脉内皮细胞：HUVEC(Human Umbilical Vein EndothelialCells)。

实施例1、Roquin2阻止肿瘤血管发生新功能的鉴定

1、将Roquin2基因(Roquin2基因如序列表的序列2所示，插入序列去除了终止密码子)插入pEGFP-N1载体的EcoR I和AgeI酶切位点之间，得到重组质粒pEGFP-N1-Roquin2-GFP。重组质粒pEGFP-N1-Roquin2-GFP已进行测序验证。重组质粒pEGFP-N1-Roquin2-GFP中，插入的DNA分子与载体中的EGFP基因形成融合基因，表达Roquin2-EGFP融合蛋白(简称R2-GFP融合蛋白)。

2、将重组质粒pEGFP-N1-Roquin2-GFP导入MDA-MB-468细胞，得到重组细胞，命名为MDA-MB-468/R2-GFP细胞。

3、将pEGFP-N1载体导入MDA-MB-468细胞，得到重组细胞，命名为MDA-MB-468/GFP细胞。

4、将重组质粒pEGFP-N1-Roquin2-GFP导入MDA-MB-231细胞，得到重组细胞，命名为MDA-MB-231/R2-GFP细胞。

5、将pEGFP-N1载体导入MDA-MB-231细胞，得到重组细胞，命名为MDA-MB-231/GFP细胞。

6、取MDA-MB-468/R2-GFP细胞和MDA-MB-468/GFP细胞，分别进行如下步骤：在平行条件下进行培养，36小时后进行细胞裂解，然后收集裂解液进行免疫印迹。免疫印迹采用Roquin2抗体杂交的结果见图1A。

7、在平行条件下进行培养MDA-MB-468/GFP细胞和MDA-MB-468/R2-GFP细胞48h，分别收集它们的培养上清液(CM,Conditioned Medium)，1500rpm过滤，标注为Con CM,R2 CM。

8、取MDA-MB-468/GFP细胞和MDA-MB-468/R2-GFP细胞的CM，以及MDA-MB-231/GFP细胞和MDA-MB-231/R2-GFP细胞的CM，分别进行如下步骤：在平行条件下处理HUVEC，24h后拍照记录内皮细胞的迁移，以检测过表达Roquin2基因对内皮细胞迁移的影响。结果见图1B。

9、取MDA-MB-468/GFP细胞和MDA-MB-468/R2-GFP细胞的CM，以及MDA-MB-231/GFP细胞和MDA-MB-231/R2-GFP细胞的CM，分别进行如下步骤：在平行条件下处理HUVEC，12h后拍照记录内皮细胞的管腔形成能力，以检测过表达Roquin2基因对内皮细胞成管的影响。结果见图1C。

10、取MDA-MB-468/GFP细胞(在图中标注为Empty Vector)和MDA-MB-468/R2-GFP细胞(在图中标注为Roquin2-GFP)，分别进行如下步骤：背部皮下注射BALB/c裸鼠(每只小鼠注射：3×10⁸个细胞/100μL PBS缓冲液)，从注射开始计天数。第20天至第64天每天测量原位的肿瘤体积，原位肿瘤体积随时间的变化见图1D(6只小鼠的平均值)。第64天处死小鼠并进行解剖。肿瘤组织内新生血管通过免疫组化染色CD31确定，见图1E左图，CD31⁺血管数量的定量分析见图1E右图。除了原位肿瘤外，所有小鼠都发生了肺转移。取肺脏并拍照，见图1F的左图。统计肺脏中的白色结节数量，见图1F的右图(6只小鼠的平均值)。

图1的结果表明：MDA-MB-468/R2-GFP细胞有效表达R2-GFP融合蛋白(图1A)；过表达Roquin2基因显著抑制肿瘤血管发生(图1B、图1C、图1D和图1E)；过表达Roquin2基因抑制肿瘤转移(图1F)。

以上结果表明：过表达Roquin2基因从而提高Roquin2蛋白水平，可以抑制肿瘤细胞诱导的血管发生并阻止肿瘤细胞转移，即过表达Roquin2基因从而提高Roquin2蛋白水平具有治疗肿瘤的效果。Roquin2蛋白/Roquin2基因的上述功能是本发明的发明人首次发现的。

实施例2、Roquin2特异性降解促血管发生因子基因mRNAs

一、Roquin2特异性降解促血管发生基因mRNAs

为了进一步检测Roquin2蛋白抑制肿瘤血管发生、生长及转移进展的机制，对调节肿瘤血管发生相关基因进行检测。

1、取实施例1中的MDA-MB-468/R2-GFP细胞，培养36小时后提取总RNA并反转录为cDNA，然后进行PCRarray(QIAGEN公司)，结果见图2A。

2、取实施例1中的MDA-MB-468/R2-GFP细胞，进行如下步骤：不同培养时间(0h、12h、24h、48h)收集细胞，提取总RNA并反转录为cDNA，然后进行qPCR以检测目标基因的表达量。结果见图2B。

3、取实施例1中的MDA-MB-231/R2-GFP细胞，进行如下步骤：不同培养时间(0h、12h、24h、48h)收集细胞，提取总RNA并反转录为cDNA，然后进行qPCR以检测目标基因的表达量。结果见图2C。

4、取MDA-MB-468/R2-GFP细胞，进行如下步骤：在平行条件下进行培养，不同培养时间(24h、36h、72h)进行western blot，检测各个目标蛋白的丰度，结果见图2D中的各个时间点对应的泳道。

5、取MDA-MB-468/R2-GFP细胞，进行如下步骤：培养36小时后进行细胞裂解，然后收集裂解液；将GFP抗体(或同型IgG)与Protein A/G Beads(Santa Cruz公司)孵育2h，然后加入所述裂解液并继续孵育2h，然后4℃、2000rpm离心，充分洗涤Beads，然后用Trizol收集总RNA；取总RNA，进行RT-PCR以检测目的基因。GAPDH作为阴性对照，结果见图2E。

7、荧光素酶报告子试验

在HEK293细胞中共转染供试质粒和报告子载体，转染36小时后进行细胞裂解，然后收集裂解液，利用Dual-LuciferaseReporter Assay System(Promega)检测荧光素酶活性，结果见图2F和图2G。供试质粒分别为：重组质粒pEGFP-N1-Roquin2-GFP(在图中标注为Roquin2)或pEGFP-N1载体(在图中标注为Control)。报告子载体分别为：具有β-Actin基因3’UTR的报告子载体、具有PDGFC基因3’UTR的报告子载体、具有PDGFD基因3’UTR的报告子载体、具有ENG基因3’UTR的报告子载体或具有EDN1基因3’UTR的报告子载体。以及抗血管发生因子基因TIMP1、ANGPTL4、SERPINF1、TIMP3的3’UTR的报告子载体。

8、取MDA-MB-468/R2-GFP细胞(在图中标注为Roquin2-GFP)和MDA-MB-468/GFP细胞(在图中标注为Empty Vector)，分别进行如下步骤以检测促血管发生基因mRNAs的半衰期：用ActD和DRB处理细胞(ActD与DRB的工作浓度均为5μg/mL)，分别于0min、30min、60min和120min后取细胞，提取总RNA，然后进行qPCR检测目的基因。结果见图3A、图3B、图3C和图3D。

步骤一的结果表明：过表达Roquin2基因后，促血管发生因子基因mRNAs被下调，部分抗血管发生基因被上调(图2A、图2B、图2C、图2D)；Roquin2蛋白可靶向结合促血管发生因子基因的mRNAs(图2E)；Roquin2蛋白可靶向结合促血管发生基因的3’UTR降解它们的mRNAs(图2F)，但不结合抗血管发生因子基因的3’UTRs(图2G)；对促血管发生基因mRNAs半衰期的检测发现(图3A、图3B、图3C和图3D)，过表达Roquin2基因显著降低它们的半衰期，这进一步证实Roquin2蛋白特异性降解促血管发生因子基因的mRNAs。

以上结果表明：本发明的发明人首次发现了Roquin2蛋白的一个新功能，即可以特异性的降解促血管发生因子基因mRNAs，该新功能解释了过表达Roquin2基因可以阻止肿瘤血管发生及转移进展的本质原因。

二、Roquin2蛋白的ROQ功能区负责阻止肿瘤血管发生

Roquin2蛋白的结构域示意图见图3E。第14-54位氨基酸残基为RING结构域，第171-325位氨基酸残基为ROQ结构域，第410-438位氨基酸残基为ZF结构域，第576-704位氨基酸残基为PRD结构域。

1、制备若干重组质粒如下(各个重组质粒均已进行测序验证)：

将序列表的序列2中编码截短体1的DNA分子插入pEGFP-N1载体，得到重组质粒pEGFP-N1-S1-GFP；重组质粒pEGFP-N1-S1-GFP表达S1-EGFP融合蛋白。截短体1用S1表示，如序列表的序列1中第1-410位氨基酸残基所示。

将序列表的序列2中编码截短体2的DNA分子插入pEGFP-N1载体，得到重组质粒pEGFP-N1-S2-GFP；重组质粒pEGFP-N1-S2-GFP表达S2-EGFP融合蛋白。截短体2用S2表示，如序列表的序列1中第410-1191位氨基酸残基所示。

将序列表的序列2中编码截短体3的DNA分子插入pEGFP-N1载体，得到重组质粒pEGFP-N1-S3-GFP；重组质粒pEGFP-N1-S3-GFP表达S3-EGFP融合蛋白。截短体3用S3表示，如序列表的序列1中第171-325位氨基酸残基所示。

2、将重组质粒pEGFP-N1-S1-GFP导入MDA-MB-468细胞，得到重组细胞，命名为MDA-MB-468/S1-GFP细胞。将重组质粒pEGFP-N1-S2-GFP导入MDA-MB-468细胞，得到重组细胞，命名为MDA-MB-468/S2-GFP细胞。将重组质粒pEGFP-N1-S3-GFP导入MDA-MB-468细胞，得到重组细胞，命名为MDA-MB-468/S3-GFP细胞。

3、取实施例1中的MDA-MB-468/R2-GFP细胞(在图中标注为WT)，取步骤2制备的MDA-MB-468/S1-GFP细胞(在图中标注为1-410)、MDA-MB-468/S2-GFP细胞(在图中标注为410-1191)和MDA-MB-468/S3-GFP细胞(在图中标注为171-325)，分别进行如下步骤：在平行条件下进行培养，36小时后进行细胞裂解，然后收集裂解液采用GFP抗体进行免疫印迹。结果见图3F。

4、取实施例1中的MDA-MB-468/R2-GFP细胞(在图中标注为Roquin2-GFP)和MDA-MB-468/GFP细胞(在图中标注为Control Vector)，取步骤2制备的各个重组细胞(根据截短体，在图中分别标注为1-410、171-325、410-1191)，分别进行如下步骤：在平行条件下进行培养，36小时后取细胞，提取总RNA并反转录为cDNA，然后进行qPCR以检测促血管发生因子基因的表达量。结果见图3G。

5、荧光素酶报告子试验

在HEK293细胞中共转染供试质粒和报告子载体，转染36小时后进行细胞裂解，然后收集裂解液，利用Dual-LuciferaseReporter Assay System(Promega)检测荧光素酶活性，结果见图3H。供试质粒分别为：重组质粒pEGFP-N1-Roquin2-GFP(在图中标注为Roquin2-GFP)或pEGFP-N1载体(在图中标注为Control)或重组质粒pEGFP-N1-S1-GFP(在图中标注为1-410)或重组质粒pEGFP-N1-S2-GFP(在图中标注为410-1191)或重组质粒pEGFP-N1-S3-GFP(在图中标注为171-325)。报告子载体分别为：具有β-actin基因3’UTR的报告子载体、具有PDGFC基因3’UTR的报告子载体、具有PDGFD基因3’UTR的报告子载体、具有ENG基因3’UTR的报告子载体或具有EDN1基因3’UTR的报告子载体。

6、取MDA-MB-468/GFP细胞的CM(在图中标注为Con CM)、MDA-MB-468/R2-GFP细胞的CM(在图中标注为R2 CM)，以及步骤2制备的各个重组细胞的CM(在图中分别标注为：1-410CM；410-1191CM；171-325CM)，分别进行如下步骤：在平行条件下处理HUVEC，12h后拍照记录内皮细胞的管腔形成能力，以检测过表达Roquin2不同功能区对内皮细胞成管的影响。结果见图3I。

步骤二的结果表明：过表达S1截短体基因或S3截短体基因后，促血管发生因子基因mRNAs被下调(图3G)；S1截短体或S3截短体可靶向结合促血管发生因子基因的3’UTR降解它们的mRNAs(图3H)；过表达S1截短体基因或S3截短体基因抑制肿瘤血管发生(图3I)。

以上结果表明：Roquin2蛋白的ROQ功能区在特异性降解促血管发生因子基因中发挥重要作用。

实施例3、过表达Roquin2基因(提高Roquin2蛋白水平)抑制肿瘤血管发生、生长及转移

1、取MDA-MB-231细胞，背部皮下注射BALB/c裸鼠(每只小鼠注射：1×10⁸个细胞/100μL PBS缓冲液)。从注射MDA-MB-231细胞开始计天数。第40天时，各小鼠的原位肿瘤均直径>3mm。第40天开始每隔一天注射一次重组腺病毒(每次每只小鼠注射1×10¹⁰pfu)，共注射5次。设置两个处理组，分别给予表达Roquin2基因的重组腺病毒(Roquin2基因如序列表的序列2所示，表达Roquin2基因的重组腺病毒用Roquin2 Adenovirus或Ad-Roquin2表示)或对照腺病毒(用Control Adenovirus或Ad-Control表示，与表达Roquin2基因的重组腺病毒相比对照腺病毒的差异仅在于不具有所述Roquin2基因)。第30天至第62天每天测量原位的肿瘤体积，原位肿瘤体积随时间的变化见图4A(5只小鼠的平均值)和图4B。第62天，处死小鼠，取肺脏制作病理切片并进行HE染色，见图4C。根据HE染色的结果统计转移灶数量，结果见图4D(5只小鼠的平均值)。

结果发现Roquin2可在体内显著抑制肿瘤血管发生、肿瘤生长并抑制肿瘤细胞肺转移。综上实验结果表明，过表达Roquin2基因(提高Roquin2蛋白水平)可显著抑制肿瘤血管发生、肿瘤生长及肿瘤转移。

以上所述仅为本发明的较佳实施例，并不用以限制本发明，凡在本发明的精神和原则之内，所作的任何修改、等同替换、改进等，均应包含在本发明的保护范围之内。

Claims (9)

1.Roquin2蛋白及其编码基因在抗血管发生治疗肿瘤中的应用，其特征在于，包括其在抗肿瘤药物中的应用，所述药物包括至少一种如下功能：(a1)治疗肿瘤；(a2)抑制肿瘤生长和/或转移；(a3)抑制肿瘤血管发生；(a4)阻止肿瘤细胞生长。

2.Roquin2基因或具有Roquin2基因的生物材料在制备肿瘤治疗药物中的应用，其特征在于，所述药物包括至少一种如下功能：(a1)治疗肿瘤；(a2)抑制肿瘤生长和/或转移；(a3)抑制肿瘤血管发生；(a4)阻止肿瘤细胞生长。

3.可以上调生物体中Roquin2蛋白及其基因丰度的物质在制备肿瘤治疗药物中的应用，其特征在于，所述药物包括至少一种如下功能：(a1)治疗肿瘤；(a2)抑制肿瘤生长和/或转移；(a3)抑制肿瘤血管发生；(a4)阻止肿瘤细胞生长。

4.根据权利要求3所述的可以上调生物体中Roquin2蛋白及其基因丰度的物质在制备肿瘤治疗药物中的应用，所述可以上调生物体中Roquin2蛋白丰度的物质包括：Roquin2蛋白本身；生物体中位于Roquin2蛋白上游的可以促进Roquin2蛋白表达的蛋白质；生物体中位于Roquin2蛋白下游的可以减少Roquin2蛋白降解的蛋白质；促进生物体中Roquin2蛋白水平增加的化合物或其他小分子。

5.根据权利要求3所述的可以上调生物体中Roquin2蛋白及其基因丰度的物质在制备肿瘤治疗药物中的应用，所述可以上调生物体中Roquin2基因丰度的物质包括：Roquin2基因本身；生物体中位于Roquin2基因上游的可以促进Roquin2基因表达的其他蛋白或核酸分子；生物体中位于Roquin2基因下游的可以减少Roquin2基因降解的其他蛋白或核酸分子；促进生物体中Roquin2基因表达的化合物或其他小分子。

6.Roquin2蛋白或Roquin2基因作为分子靶标物在抗肿瘤药物研发中的应用。

7.一种Roquin2蛋白截短体，即Roquin2蛋白的ROQ功能区。

8.编码权利要求7所述的Roquin2蛋白截短体的基因。

9.Roquin2蛋白截短体的基因作为靶标物在抗肿瘤药物研发中的应用，其特征在于，所述药物包括至少一种如下功能：(a1)治疗肿瘤；(a2)抑制肿瘤生长和/或转移；

(a3)抑制肿瘤血管发生；(a4)阻止肿瘤细胞生长。

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