CN103080309B - REIC/Dkk-3蛋白的部分区域多肽 - Google Patents

Abstract

本发明的目的在于提供可强力诱导、活化树突状细胞样细胞并可通过免疫疗法进行癌症的治疗或预防的多肽；以及编码该多肽的DNA，所述多肽为下述(a)或(b)的由REIC/Dkk-3蛋白的部分区域构成的多肽：(a)一种由REIC/Dkk-3蛋白的部分区域构成的多肽，其由选自由序列编号3、序列编号5、序列编号7和序列编号9所示的氨基酸序列、以及由下述部分区域的片段构成的多肽的氨基酸序列组成的组中的氨基酸序列构成，所述部分区域由序列编号2所示的氨基酸序列的第135位的Ser至第350位的Ile构成，所述部分区域的片段含有由序列编号2所示的氨基酸序列的第205位的Gly至第288位的Phe构成的部分区域；(b)一种具有单核细胞分化成树突状细胞样细胞的分化诱导活性的多肽，其是由在选自由序列编号3、序列编号5、序列编号7和序列编号9所示的氨基酸序列、以及由下述部分区域的片段构成的多肽的氨基酸序列组成的组中的氨基酸序列中有一个或数个氨基酸发生了取代、缺失或者添加的氨基酸序列构成的多肽蛋白质，所述部分区域由序列编号2所示的氨基酸序列的第135位的Ser至第350位的Ile构成，所述部分区域的片段含有由序列编号2所示的氨基酸序列的第205位的Gly至第288位的Phe构成的部分区域。

Description

REIC/Dkk-3蛋白的部分区域多肽

技术领域

本发明涉及用于提高抗癌免疫活性、进行癌症的治疗或预防的药物组合物。

背景技术

作为与细胞的永生化有关的基因，已知有REIC/Dkk-3基因，有报告指出，在癌细胞中，该基因的表达受到抑制(参照专利文献1和非专利文献1至4)。

REIC/Dkk-3基因为Dkk家族成员，有文献暗示该基因藉由Wnt受体阻断Wnt信号传递(参照非专利文献5和6)。据报告，Wnt基因在细胞的成长、分化、癌变等重要的生物学状况中发挥出多样的作用(参照非专利文献7)。

有报告指出，对于REIC/Dkk-3来说，若将全长REIC/Dkk-3蛋白以10μg/ml的浓度添加到对外周血单核球细胞(单核细胞)进行培养的培养液中，则该细胞会分化为树突状细胞样细胞(参照专利文献2)。

一般来说，仅报道了数种确认到可诱导血液前体细胞分化为树突状细胞(样)的物质，其多数为已知的细胞因子。例如，有许多报告是关于GM-CSF和IL-4的合用的，通过将它们添加到培养液中来进行单核细胞到树突状细胞的分化诱导，其被认为是树突状细胞分化的金标准。此外，作为可通过单独使用或合用来诱导树突状细胞的分化的物质，据报告有TNF-α、IL-2、IL-3、IL-6、IL-7、IL-12、IL-13、IL-15、HGF(Hepatocytegrowthfactor，肝细胞生长因子)、CD40配体、M-CSF、Fit3配体、TGF-β等。这些蛋白质之中，作为如全长REIC/Dkk-3蛋白那样仅单用一种就可由其前体细胞诱导分化树突(样)细胞的物质，已知有IL-2、IL-15、HGF、CD40配体。并且，这些之中，确认到体内(invivo)抗癌效果的仅为IL-2。另外，作为GM-CSF未能发挥出功效的理由，据认为原因在于其不仅活化了抗癌免疫，而且还对骨髓来源免疫抑制性细胞(MDSC)和免疫调节性T细胞(Treg)所代表的免疫抑制系细胞进行分化诱导，活化了“负免疫体系”(参照非专利文献8)。

专利文献1：国际公开第WO01/038523号小册子

专利文献2：国际公开第WO09/119874号小册子

非专利文献1：Tsuji,T.etal.,BiochemBiophysResCommun268,20-4(2000)

非专利文献2：Tsuji,T.etal.,BiochemBiophysResCommun289,257-63(2001)

非专利文献3：Nozaki,I.etal.,IntJOncol19,117-21(2001)

非专利文献4：Kurose,K.etal.,JUrol171,1314-8(2004)

非专利文献5：Bafico,A.etal.,NatCellBiol3,683-6(2001)

非专利文献6：Hoang,B.H.etal.,CancerRes64,2734-9(2004)

非专利文献7：Moon,R.T.etal.,Science296,1644-6(2002)

非专利文献8：Parmiani,G.etal.,AnnalsofOncology18,226-32(2007)

发明内容

本发明的目的在于提供可强力诱导、活化树突状细胞样细胞并可通过免疫疗法进行癌症的治疗或预防的多肽；以及编码该多肽的DNA。

本发明人明确了全长REIC/Dkk-3蛋白在生物体内的免疫、炎症现象中的有用性、优越性及其在大范围的领域、疾病中的可利用性(国际公开第WO09/119874号小册子)。

本发明人进一步对REIC/Dkk-3蛋白的部分区域的活性进行了研究，结果发现，在特定的部分区域存在有很强的诱导单核细胞分化树突状细胞样的生理活性、该生理活性远强于全长REIC/Dkk-3蛋白。这显示出，REIC/Dkk-3蛋白的特定部分区域进行单核细胞向树突状细胞样细胞的分化诱导，可通过癌免疫活化用于癌症的治疗和预防。

作为这样的免疫学癌症治疗剂，据报告IL-2蛋白在肾细胞癌等特殊癌种中具有治疗效果。但是，临床上已知的事实是，具有该IL-2蛋白给药适应性的癌种及其效果也是有限的。REIC/Dkk-3蛋白被确认到在几乎所有癌种中的表达、分泌发生降低，该REIC/Dkk-3蛋白具有可作为在这些各种癌种中具有癌免疫活化作用的癌症治疗剂进行使用的可能性，并且其治疗效果也可能比IL-2具有优越性。

如上所述，本发明人发现，REIC/Dkk-3蛋白的特定部分区域具有强于全长REIC/Dkk-3蛋白的“诱导单核细胞分化为树突状细胞样的生理活性”，从而完成了本发明。

即，本发明如下。

[1]一种由REIC/Dkk-3蛋白的部分区域构成的多肽，其为下述(a)～(e)的任意一种：

(a)一种由REIC/Dkk-3蛋白的部分区域构成的多肽，其由选自由序列编号3、序列编号5、序列编号7和序列编号9所示的氨基酸序列、以及由下述部分区域的片段构成的多肽的氨基酸序列组成的组中的氨基酸序列构成，所述部分区域由序列编号2所示的氨基酸序列的第135位的Ser至第350位的Ile构成，所述部分区域的片段含有由序列编号2所示的氨基酸序列的第205位的Gly至第288位的Phe构成的部分区域；

(b)一种具有单核细胞分化成树突状细胞样细胞的分化诱导活性的多肽，其是由在选自由序列编号3、序列编号5、序列编号7和序列编号9所示的氨基酸序列、以及由下述部分区域的片段构成的多肽的氨基酸序列组成的组中的氨基酸序列中有一个或数个氨基酸发生了取代、缺失或者添加的氨基酸序列构成的多肽蛋白质，所述部分区域由序列编号2所示的氨基酸序列的第135位的Ser至第350位的Ile构成，所述部分区域的片段含有由序列编号2所示的氨基酸序列的第205位的Gly至第288位的Phe构成的部分区域；

(c)一种由REIC/Dkk-3蛋白的部分区域构成的多肽，其是由REIC/Dkk-3蛋白的部分区域构成的、能够与Tctex-1蛋白结合的多肽，其由序列编号17所表示的氨基酸序列构成；

(d)一种与Tctex-1蛋白具有结合活性的多肽，其是由在序列编号17所表示的氨基酸序列中有一个或数个氨基酸发生了取代、缺失或者添加的氨基酸序列构成的多肽；以及

(e)一种由REIC/Dkk-3蛋白的部分区域构成的、能够与Tctex-1蛋白结合的多肽，该多肽含有序列编号18所表示的共有序列，由7～22残基的氨基酸构成。

[2]一种编码由REIC/Dkk-3蛋白的部分区域构成的多肽的DNA，其为下述(f)～(l)的任意一种；

(f)一种DNA，其由选自由序列编号4、序列编号6、序列编号8和序列编号10所示的碱基序列、以及由下述的部分序列的片段构成的碱基序列组成的组中的碱基序列构成，该部分序列由序列编号1所示的碱基序列的第403位的t至第1050位的t构成，且所述部分序列的片段含有由序列编号1所示的碱基序列的第613位的g至第864位的c构成的部分序列；

(g)一种DNA，其与由下述碱基序列构成的DNA在严格条件下杂交、且编码具有单核细胞分化成树突状细胞样细胞的分化诱导活性的多肽，所述碱基序列与选自由序列编号4、序列编号6、序列编号8和序列编号10所示的碱基序列、以及由下述的部分序列的片段构成的碱基序列组成的组中的碱基序列互补，该部分序列由序列编号1所示的碱基序列的第403位的t至第1050位的t构成，且所述部分序列的片段含有由序列编号1所示的碱基序列的第613位的g至第864位的c构成的部分序列；

(h)一种DNA，其由在选自由序列编号4、序列编号6、序列编号8和序列编号10所示的碱基序列、以及由下述的部分序列的片段构成的碱基序列组成的组中的碱基序列中有一个或数个碱基发生了缺失、取代或添加的碱基序列构成，且编码具有单核细胞分化成树突状细胞样细胞的分化诱导活性的多肽，所述部分序列由序列编号1所示的碱基序列的第403位的t至第1050位的t构成，且所述部分序列的片段含有由序列编号1所示的碱基序列的第613位的g至第864位的c构成的部分序列；

(i)一种DNA，其由编码下述氨基酸序列的DNA序列构成且编码具有单核细胞分化成树突状细胞样细胞的分化诱导活性的多肽，所述氨基酸序列选自由序列编号3、序列编号5、序列编号7和序列编号9所示的氨基酸序列、以及由下述部分区域的片段构成的多肽的氨基酸序列组成的组，所述部分区域由序列编号2所示的氨基酸序列的第135位的Ser至第350位的Ile构成，所述部分区域的片段含有由序列编号2所示的氨基酸序列的第205位的Gly至第288位的Phe构成的部分区域；

(j)一种DNA，其编码由REIC/Dkk-3蛋白的部分区域构成的、能够与Tctex-1蛋白结合的多肽，该DNA由下述碱基序列构成，该碱基序列由序列编号8所表示的碱基序列的第4位的g至第69位的g构成；

(k)一种DNA，其与由下述碱基序列构成的DNA在严格条件下杂交、且编码与Tctex-1蛋白具有结合活性的多肽，所述碱基序列与由序列编号8所表示的碱基序列的第4位的g至第69位的g构成的碱基序列互补；以及

(l)一种DNA，其由编码序列编号17所表示的氨基酸序列的DNA序列构成、且编码与Tctex-1蛋白具有结合活性的多肽，所述氨基酸序列是由REIC/Dkk-3蛋白的部分区域构成的、能够与Tctex-1蛋白结合的多肽。

[3]一种载体，其含有[2]所述的DNA。

[4]如[3]所述的载体，其中，载体为腺病毒载体。

[5]一种单核细胞分化成树突状细胞样细胞的分化诱导剂，其含有[1]所述的由REIC/Dkk-3蛋白的部分区域构成的多肽作为有效成分。

[6]一种免疫活化细胞的分化诱导促进剂，所述免疫活化细胞选自由树突状细胞、辅助T细胞、CTL和NK细胞组成的组，所述分化诱导促进剂含有[1]所述的由REIC/Dkk-3蛋白的部分区域构成的多肽作为有效成分。

[7]一种免疫抑制功能系细胞的分化诱导抑制剂，所述免疫抑制功能系细胞为MDSC或Treg，所述分化诱导抑制剂含有[1]所述的由REIC/Dkk-3蛋白的部分区域构成的多肽作为有效成分。

[8]一种抗癌剂，其含有[1]所述的由REIC/Dkk-3蛋白的部分区域构成的多肽作为有效成分。

[9]一种单核细胞分化成树突状细胞样细胞的分化诱导剂，其含有[2]所述的编码由REIC/Dkk-3蛋白的部分区域构成的多肽的DNA或者[3]或[4]所述的载体作为有效成分。

[10]一种免疫活化细胞的分化诱导促进剂，所述免疫活化细胞选自由树突状细胞、辅助T细胞、CTL和NK细胞组成的组，所述分化诱导促进剂含有[2]所述的编码由REIC/Dkk-3蛋白的部分区域构成的多肽的DNA或者[3]或[4]所述的载体作为有效成分。

[11]一种免疫抑制系细胞的分化诱导抑制剂，所述免疫抑制系细胞为MDSC或Treg，所述分化诱导抑制剂含有[2]所述的编码由REIC/Dkk-3蛋白的部分区域构成的多肽的DNA或者[3]或[4]所述的载体作为有效成分。

[12]一种抗癌剂，其含有[2]所述的编码由REIC/Dkk-3蛋白的部分区域构成的多肽的DNA或者[3]或[4]所述的载体作为有效成分。

[13]一种诱导CD14阳性单核细胞分化成树突状细胞样细胞的方法，该方法包括在体外(invitro)、在[1]所述的由REIC/Dkk-3蛋白的部分区域构成的多肽的存在下对由动物采集的单核细胞进行培养的步骤。

[14]如[13]所述的方法，其中，单核细胞为外周血单核细胞。

本说明书中包含作为本申请优先权基础的日本专利申请2010-150935号和日本特愿2011-014319号的说明书和/或附图中记载的内容。

附图说明

图1为示出人REIC/Dkk-3蛋白的全长以及部分区域1[Arg121-329]和部分区域2[Gly184-Ile329]的制备方法的图。

图2为示出在单独(无添加)(图2A)对PBMC进行7天培养、在GM-CSF+IL-4(图2B)(分别为2ng/ml)、或者人REIC/Dkk-3蛋白的全长(图2C)、部分区域1[Arg121-Ile329](图2D)或部分区域2[Gly184-Ile329](图2E)(10μg/ml)的存在下对PBMC进行7天培养时PBMC相位差显微镜像的照片(低倍放大像)。

图3为示出在单独(无添加)(图3A)对PBMC进行7天培养、在GM-CSF+IL-4(图3B)(分别为2ng/ml)、或者部分区域2[Gly184-Ile329](10μg/ml)(图3C)的存在下对PBMC进行7天培养时PBMC相位差显微镜像的照片(高倍放大像)。

图4为示出通过单独(无添加)、添加GM-CSF+IL-4(分别为2ng/ml)、或者人REIC/Dkk-3蛋白的全长、部分区域1[Arg121-Ile329]或部分区域2[Gly184-Ile329](10μg/ml)所分化诱导出的树突状细胞样细胞的出现频率的图。

图5-1为示出REIC/Dkk-3蛋白的部分区域3[Ser114-Phe267]的制造法和精制法的方案的图。

图5-2为示出REIC/Dkk-3蛋白的部分区域3[Ser114-Phe267]的精制中第1次离子交换色谱精制的曲线图的图。

图5-3为适合粗REIC/Dkk-3蛋白的部分区域3[Ser114-Phe267]的精制中第2次离子交换色谱精制的曲线图的图。

图6为示出人组织来源培养细胞表达人REIC蛋白添加所致的诱导外周血单核细胞分化为树突状细胞样的照片，为通过单独(无添加)(图6A)、或者添加REIC/Dkk-3蛋白的部分区域1[Arg121-Ile329](10μg/ml)(图6B)或部分区域3[Ser114-Phe267](10μg/ml)(图6C)所分化诱导出的树突状细胞样细胞(第7天)的相位差显微镜照片(低倍放大)。

图7为示出人组织来源培养细胞表达人REIC蛋白添加所致的诱导外周血单核细胞分化为树突状细胞样的照片，为通过单独(无添加)(图7A)、或者添加REIC/Dkk-3蛋白的部分区域1[Arg121-Ile329](10μg/ml)(图7B)或部分区域3[Ser114-Phe267](10μg/ml)(图7C)所分化诱导出的树突状细胞样细胞(第7天)的相位差显微镜照片(高倍放大)。

图8为示出REIC/Dkk-3蛋白的部分区域3[Ser114-Phe267]的稳定性确认实验的结果的图。

图9为示出实施例3中所用的基因高表达质粒所包含的表达盒的结构的图。

图10为示出人全长REIC/Dkk-3蛋白以及部分区域3[Ser114-Phe267]的腹腔内给药实验方案的图。

图11A为示出人全长REIC/Dkk-3蛋白以及部分区域3[Ser114-Phe267]的腹腔内给药所带来的肿瘤增殖抑制效果(肿瘤体积的经时变化)的图。

图11B为示出人全长REIC/Dkk-3蛋白以及部分区域3[Ser114-Phe267]的腹腔内给药所带来的肿瘤增殖抑制效果(肿瘤重量)的图。

图11C为示出人全长REIC/Dkk-3蛋白以及部分区域3[Ser114-Phe267]的腹腔内给药所带来的肿瘤增殖抑制效果的肿瘤照片。图11C-a示出了给与PBS后的情况的结果；图11C-b示出了给与人全长REIC/Dkk-3蛋白后的情况的结果；图11C-c示出了给与部分区域3的情况的结果。

图12A为示出在REIC/Dkk-3蛋白(全长或部分区域3)治疗实验终止时(即将安乐死之前)或无处置组或PBS缓冲液给药组中各外周血中的骨髓来源免疫抑制性细胞的阳性率(%)的图表。

图12B为示出在REIC/Dkk-3蛋白(全长或部分区域3)治疗实验终止时(即将安乐死之前)或无处置组或PBS缓冲液给药组中各外周血中的树突状细胞细胞的阳性率(%)的图表。

图12C为示出在REIC/Dkk-3蛋白(全长或部分区域3)治疗实验终止时(即将安乐死之前)或无处置组或PBS缓冲液给药组中各外周血中的活化树突状细胞(CD11c+/CD80+)的阳性率(%)的图表。

图12D为示出在REIC/Dkk-3蛋白(全长或部分区域3)治疗实验终止时(即将安乐死之前)或无处置组或PBS缓冲液给药组中各外周血中的活化树突状细胞(CD11c+/CD86+)的阳性率(%)的图表。

图12E为示出在REIC/Dkk-3蛋白(全长或部分区域3)治疗实验终止时(即将安乐死之前)或无处置组或PBS缓冲液给药组中各外周血中的辅助T细胞的阳性率(%)的图表。

图12F为示出在REIC/Dkk-3蛋白(全长或部分区域3)治疗实验终止时(即将安乐死之前)或无处置组或PBS缓冲液给药组中各外周血中的免疫抑制性T细胞的阳性率(%)的图表。

图12G为示出在REIC/Dkk-3蛋白(全长或部分区域3)治疗实验终止时(即将安乐死之前)或无处置组或PBS缓冲液给药组中各外周血中的细胞毒性T细胞的阳性率(%)的图表。

图12H为示出在REIC/Dkk-3蛋白(全长或部分区域3)治疗实验终止时(即将安乐死之前)或无处置组或PBS缓冲液给药组中各外周血中的活性型细胞毒性T细胞的阳性率(%)的图表。

图12I为示出在REIC/Dkk-3蛋白(全长或部分区域3)治疗实验终止时(即将安乐死之前)或无处置组或PBS缓冲液给药组中各外周血中的NK细胞的阳性率(%)的图表。

图13为示出人全长REIC/Dkk-3蛋白在原位肾细胞癌、肺转移模型小鼠中的腹腔内给药实验方案的图。

图14A为人全长REIC/Dkk-3蛋白(10μg、100μg)在原位肾细胞癌、肺转移模型小鼠中的腹腔内给药实验中肾癌原发灶的肿瘤组织照片。

图14B为示出在全长REIC/Dkk-3蛋白(10μg、100μg)治疗实验终止时(即将安乐死之前)或PBS缓冲液给药组中肾癌原发灶的肿瘤重量(g)的平均值的图表。

图15A为在人全长REIC/Dkk-3蛋白(10μg、100μg)的原位肾细胞癌、肺转移模型小鼠中的腹腔内给药实验中肺转移灶的肿瘤组织照片。

图15B为示出在全长REIC/Dkk-3蛋白(10μg、100μg)的治疗实验终止时(即将安乐死之前)或PBS缓冲液给药组中肺转移灶的肿瘤重量(g)的平均值的图表。

图16A为示出对于从无处置小鼠中采集的骨髓细胞给与GM-CSF(20ng/ml)(16A-a)或REIC蛋白(10ug/ml)与GM-CSF(20ng/ml)的混合液(16A-c)时MDSC细胞的分化诱导的细胞图。16A-a为对照。

图16B为示出由图16A所示的细胞图推出的MDSC细胞的阳性率的图表。

图17A-1为示出使用流式细胞分析对由全长REIC/Dkk-3蛋白(10μg、100μg)的治疗实验终止时(即将安乐死之前)或PBS缓冲液给药组中采集的各外周血进行MDSC(Gr-1+,CD11b+)阳性率测定的结果(细胞图)的图。图17A-1a为使用PBS的情况下的结果；图17A-1b为使用全长REIC/Dkk-3蛋白(10μg)的情况下的结果；图17A-1c为使用全长REIC/Dkk-3蛋白(100μg)的情况下的结果。

图17A-2为示出使用流式细胞分析对由全长REIC/Dkk-3蛋白(10μg、100μg)的治疗实验终止时(即将安乐死之前)或PBS缓冲液给药组中采集的各外周血进行MDSC(Gr-1+,CD11b+)阳性率测定的结果(阳性率的图表)的图。

图17B-1为示出使用流式细胞分析对由全长REIC/Dkk-3蛋白(10μg、100μg)的治疗实验终止时(即将安乐死之前)或PBS缓冲液给药组中采集的各外周血进行树突状细胞(CD11c+,CD80+)阳性率测定的结果(细胞图)的图。图17B-1a为使用PBS的情况下的结果；图17B-1b为使用全长REIC/Dkk-3蛋白(10μg)的情况下的结果；图17B-1c为使用全长REIC/Dkk-3蛋白(100μg)的情况下的结果。

图17B-2为示出使用流式细胞分析对由全长REIC/Dkk-3蛋白(10μg、100μg)的治疗实验终止时(即将安乐死之前)或PBS缓冲液给药组中采集的各外周血进行树突状细胞(CD11c+,CD80+)阳性率测定的结果(阳性率的图表)的图。

图17C-1为示出使用流式细胞分析对由全长REIC/Dkk-3蛋白(10μg、100μg)的治疗实验终止时(即将安乐死之前)或PBS缓冲液给药组中采集的各外周血进行Treg(CD4+,Foxp3+)阳性率测定的结果(细胞图)的图。图17C-1a为使用PBS的情况下的结果；图17C-1b为使用全长REIC/Dkk-3蛋白(10μg)的情况下的结果；图17C-1c为使用全长REIC/Dkk-3蛋白(100μg)的情况下的结果。

图17C-2为示出使用流式细胞分析对由全长REIC/Dkk-3蛋白(10μg、100μg)的治疗实验终止时(即将安乐死之前)或PBS缓冲液给药组中采集的各外周血进行Treg(CD4+,Foxp3+)阳性率测定的结果(阳性率的图表)的图。

图17D-1为示出使用流式细胞分析对由全长REIC/Dkk-3蛋白(10μg、100μg)的治疗实验终止时(即将安乐死之前)或PBS缓冲液给药组中采集的各外周血进行活性型CTL(CD8+,CD69)阳性率测定的结果(细胞图)的图。图17D-1a为使用PBS的情况下的结果；图17D-1b为使用全长REIC/Dkk-3蛋白(10μg)的情况下的结果；图17D-1c为使用全长REIC/Dkk-3蛋白(100μg)的情况下的结果。

图17D-2为示出使用流式细胞分析对由全长REIC/Dkk-3蛋白(10μg、100μg)的治疗实验终止时(即将安乐死之前)或PBS缓冲液给药组中采集的各外周血进行活性型CTL(CD8+,CD69+)阳性率测定的结果(阳性率的图表)的图。

图17E-1为示出使用全流式细胞分析对由长REIC/Dkk-3蛋白(10μg、100μg)的治疗实验终止时(即将安乐死之前)或PBS缓冲液给药组中采集的各外周血进行NK细胞(CD3e+,NK1.1+)阳性率测定的结果(细胞图)的图。图17E-1a为使用PBS的情况下的结果、图17E-1b为使用全长REIC/Dkk-3蛋白(10μg)的情况下的结果、图17E-1c为使用全长REIC/Dkk-3蛋白(100μg)的情况下的结果。

图17E-2为示出使用流式细胞分析对由全长REIC/Dkk-3蛋白(10μg、100μg)的治疗实验终止时(即将安乐死之前)或PBS缓冲液给药组中采集的各外周血进行NK细胞(CD3e+,NK1.1+)阳性率测定的结果(阳性率的图表)的图。

图18A为示出表示REIC/Dkk-3蛋白与Tctex-1蛋白的相互作用的酵母双杂交分析结果的图。图中，蓝色菌落表示具有REIC/Dkk-3蛋白与Tctex-1蛋白的相互作用。

图18B为示出表示REIC/Dkk-3蛋白与Tctex-1蛋白的相互作用的免疫沉降分析与Western印迹分析结果的图。

图19A为示出表示全长REIC/Dkk-3蛋白与Tctex-1蛋白的相互作用的动物细胞双杂交分析结果的图。

图19B为示出表示人全长REIC/Dkk-3蛋白的部分区域与Tctex-1蛋白的相互作用的动物细胞双杂交分析结果的图。

图20A为示出REIC/Dkk-3蛋白与动力蛋白中间链(DIC)TcTex-1结合区域的氨基酸序列比对的图。

图20B为示出REIC/Dkk-3蛋白Tctex结合域与已知结合蛋白的氨基酸序列比对的图。

图21A为示出人全长REIC/Dkk-3蛋白与Tctex-1蛋白的细胞内定位的照片。图21A的照片为在人成纤维细胞OUMS24中进行人全长REIC/Dkk-3蛋白(A-b)与作为内质网标记物的刀豆球蛋白A(A-a)的双重荧光染色(A-c)的共聚焦显微镜照片。

图21B为示出人全长REIC/Dkk-3蛋白与Tctex-1蛋白的细胞内定位的照片。图21B的照片为在人成纤维细胞OUMS24中进行Tctex-1蛋白(B-b)与作为内质网标记物的刀豆球蛋白A(B-a)的双重荧光染色(B-c)的共聚焦显微镜照片。

图22A为利用荧光显微镜通过Hochest染色拍摄表示Ad-REIC的凋亡诱导能力由于Tctex-1表达减少而减弱、由于其表达增加而增强的情况的照片。上部照片为使用Ad-LacZ的情况，下部照片为使用Ad-REIC的情况，a、b和c分别表示给与GFP质粒、shRNA-Tctex-1、Tctex-1表达质粒的情况的结果。

图22B为利用凋亡诱导率图表表示Ad-REIC的凋亡诱导能力由于Tctex-1表达减少而减弱、由于其表达增加而增强的情况的图。

具体实施方式

以下详细说明本发明。

REIC/Dkk-3基因(REIC基因)的全长碱基序列和该基因所编码的蛋白质的氨基酸序列分别以序列编号1和序列编号2表示。序列编号2所表示的氨基酸序列中，由第1位至第21位氨基酸构成的序列被预测为信号序列。REIC/Dkk-3基因可基于序列编号1的序列信息由人细胞、人组织等得到。另外也可以按照国际公开第WO01/038523号小册子的记载来得到。

本发明的由REIC/Dkk-3蛋白(REIC蛋白)的部分区域构成的多肽包括下述多肽。

(1)由包含下述部分区域的209个氨基酸构成，该部分区域由REIC/Dkk-3蛋白中除去信号序列部分以外部分的第121位的Arg至第329位的Ile构成。该多肽由序列编号2所示的氨基酸序列的第142位的Arg至第350位的Ile构成。有时将本发明的多肽称为REIC/Dkk-3蛋白的部分区域[Arg121-Ile329]。本发明的REIC/Dkk-3蛋白的部分区域[Arg121-Ile329]的氨基酸序列示于序列编号5中，编码该氨基酸序列的碱基序列示于序列编号6中。

(2)由包含下述部分区域的146个氨基酸构成，该部分区域由REIC/Dkk-3蛋白中除去信号序列部分以外部分的第184位的Gly至第329位的Ile构成。该多肽由序列编号2所示的氨基酸序列的第205位的Gly至第350位的Ile构成。有时将本发明的多肽称为REIC/Dkk-3蛋白的部分区域[Gly184-Ile329]。本发明的REIC/Dkk-3蛋白的部分区域[Gly184-Ile329]的氨基酸序列示于序列编号3中，编码该氨基酸序列的碱基序列示于序列编号4中。

(3)由包含下述部分区域的154个氨基酸构成，该部分区域由REIC/Dkk-3蛋白中除去信号序列部分以外部分的第114位的Ser至第267位的Phe构成。该多肽由序列编号2所示的氨基酸序列的第135位的Ser至第288位的Phe构成。有时将本发明的多肽称为REIC/Dkk-3蛋白的部分区域[Ser114-Phe267]。本发明REIC/Dkk-3蛋白的部分区域[Ser114-Phe267]的氨基酸序列示于序列编号7中，编码该氨基酸序列的碱基序列示于序列编号8中。

(4)由包含下述部分区域的83个氨基酸构成，该部分区域由REIC/Dkk-3蛋白中除去信号序列部分以外部分的第184位的Gly至第267位的Phe构成。该多肽是由上述3种多肽的共有序列构成的多肽，据认为其是成为生理活性核心的多肽。该多肽由序列编号2所示的氨基酸序列的第205位的Gly至第288位的Phe构成。有时将本发明的多肽称为REIC/Dkk-3蛋白的部分区域[Gly184-Phe267]。本发明REIC/Dkk-3蛋白的部分区域[Gly184-Phe267]的氨基酸序列示于序列编号9中，编码该氨基酸序列的碱基序列示于序列编号10中。

(5)进一步地，本发明的由REIC/Dkk-3蛋白(REIC蛋白质)的部分区域构成的多肽包括由下述部分区域的片段构成的多肽，该部分区域由第114位的Ser至第329位的Ile构成，且该片段含有由REIC/Dkk-3蛋白中除去信号序列部分以外部分的第184位的Gly至第267位的Phe构成的部分区域。该多肽由由序列编号2所示的氨基酸序列的第135位的Ser至第350位的Ile所构成的部分区域的片段构成，且该片段含有由序列编号2所示的氨基酸序列的第205位的Gly至第288位的Phe构成的部分区域。另外，编码该多肽的碱基序列由由序列编号1所示的碱基序列的第403位的t至第1050位的t所构成的部分序列的片段构成，且所述部分序列的片段含有由序列编号1所示的碱基序列的第613位的g至第864位的c构成的部分序列。该多肽的氨基酸残基数目为83～216个。

进一步地，REIC/Dkk-3蛋白与Tctex-1(t-complextestisexpressed-1)蛋白相互作用(缔合)来发挥作用。Tctex-1蛋白为构成马达动力蛋白复合体的轻链蛋白(dyneinlightchain，动力蛋白轻链)，通过与Tctex-1结合蛋白缔合而作为马达动力蛋白与膜泡负载(小胞積荷)间的插入分子发挥出重要作用。

REIC/Dkk-3蛋白与Tctex-1蛋白均靠近内质网周边存在，Tctex-1蛋白促进REIC/Dkk-3蛋白的凋亡诱导能力。REIC/Dkk-3蛋白的由22个氨基酸构成的部分区域(该部分区域由序列编号2所示的氨基酸序列的第136位的Val至第157位的Met构成)与Tctex-1蛋白相互作用。该部分区域多肽相当于由REIC/Dkk-3蛋白中除去信号序列部分以外部分的第115位的Val至第136位的Met构成的部分区域。该部分区域的氨基酸序列示于序列编号17中。

该部分区域的氨基酸序列中，EXGRRXH(序列编号18；相当于由序列编号17的第4～10氨基酸构成的序列)(X为任意的天然氨基酸)是涉及与Tctex-1蛋白的结合的共有序列(共有基序)。

本发明包括REIC/Dkk-3蛋白与上述Tctex-1蛋白相互作用的部分区域肽和上述共有基序。

因而，本发明的由REIC/Dkk-3蛋白(REIC蛋白)的部分区域构成的多肽包含由REIC/Dkk-3蛋白的部分区域构成的、能够与Tctex-1蛋白结合的多肽，其是由序列编号17所表示的氨基酸序列构成的、由REIC/Dkk-3蛋白的部分区域构成的多肽。进一步包含下述多肽：该多肽含有上述EXGRRXH(序列编号18)所表示的共有基序的序列、由7～22残基的氨基酸构成。该多肽例如为由序列编号17所示的氨基酸序列中连续的7～22残基的氨基酸构成的多肽，其含有由第4位的Glu至第10位的His的7个氨基酸残基构成的氨基酸序列。这种情况下，第5位的Glu和第9位的Ser可被其它任意的天然氨基酸取代。

本发明的REIC/Dkk-3蛋白的部分区域多肽为具有上述的氨基酸序列或者与该氨基酸序列实质上相同的氨基酸序列、具有树突状细胞样细胞分化诱导活性的多肽，该上述的氨基酸序列即为序列编号3、序列编号5、序列编号7或序列编号9所示的氨基酸序列；或者由下述部分区域的片段构成的多肽的氨基酸序列，所述部分区域由REIC/Dkk-3蛋白中第114位的Ser至第329位的Ile构成，所述部分区域的片段含有由REIC/Dkk-3蛋白中除去信号序列部分以外部分的第184位的Gly至第267位的Phe构成。另外，本发明的REIC/Dkk-3蛋白的部分区域多肽为具有序列编号17表示的氨基酸序列或者与该氨基酸序列实质上相同的氨基酸序列、与Tctex-1蛋白具有结合活性的多肽。此处，作为实质上相同的氨基酸序列，可以举出：在该氨基酸序列中有一个或多个或者数个(1～10个、优选为1～5个、进一步优选为1个或者2个)氨基酸发生了取代、缺失和/或添加的氨基酸序列；或在使用BLAST(BasicLocalAlignmentSearchToolattheNationalCenterforBiologicalInformation(美国国家生物技术信息中心碱基局部对准检索工具))等(使用例如默认即初期设定参数)进行计算时，与该氨基酸序列具有至少85%以上、优选为90%以上、进一步优选为95%以上、特别优选为97%以上的同源性的氨基酸序列。

本发明的多肽具有诱导单核细胞分化为树突状细胞样细胞的活性，进一步具有分化诱导CTL细胞、NK细胞、辅助T细胞等免疫活化细胞的活性，进一步还具有对MDSC细胞或Treg细胞进行分化抑制的活性。本发明的多肽由于具有这些细胞分化诱导活性及抑制活性，因而可对免疫抑制系统进行抑制。因而，本发明的多肽可作为抗癌免疫活化剂、抗癌剂、抗肿瘤剂、免疫细胞分化诱导/抑制剂来进行利用。

编码本发明REIC/Dkk-3蛋白的部分区域多肽的DNA为下述DNA(I)、(II)或(III)等中编码具有单核细胞分化成树突状细胞样细胞的分化诱导活性；CTL细胞、NK细胞、辅助T细胞等免疫活化细胞的分化诱导活性；MDSC细胞、Treg细胞的分化抑制活性的蛋白的DNA，所述DNA(I)与具有下述碱基序列的DNA在严格条件下杂交，所述碱基序列与序列编号4、序列编号6、序列编号8或序列编号10所表示的碱基序列；由序列编号8所示碱基序列的第4位的g至第69位的g构成的碱基序列；或者由下述的部分序列的片段构成的碱基序列互补，所述部分序列由序列编号1所示的碱基序列的第403位的t至第1050位的t构成，所述部分序列的片段含有序列编号1所示的碱基序列的第613位的g至第864位的c构成的部分序列；所述DNA(II)在使用BLAST(BasicLocalAlignmentSearchToolattheNationalCenterforBiologicalInformation(美国国家生物技术信息中心碱基局部对准检索工具))等(使用例如默认即初期设定参数)进行计算时与下述碱基序列所表示的碱基序列具有至少85%以上、优选为90%以上、进一步优选为95%以上、特别优选为97%以上的同源性，所述碱基序列为序列编号4、序列编号6、序列编号8或序列编号10的碱基序列；由序列编号8所示碱基序列的第4位的g至第69位的g构成的碱基序列；或者由下述的部分序列的片段构成的碱基序列互补，所述部分序列由序列编号1所示的碱基序列的第403位的t至第1050位的t构成，所述部分序列的片段含有序列编号1所示的碱基序列的第613位的g至第864位的c构成的部分序列；所述DNA(III)编码由下述氨基酸序列构成的蛋白质，该氨基酸序列是在由上述DNA编码的蛋白质的氨基酸序列中有一个或复数个或者数个(1～10个、优选为1～5个、进一步优选为1个或者2个)氨基酸发生了取代、缺失和/或添加的氨基酸序列。此处，“严格条件”例如为“1×SSC、0.1%SDS、37℃”程度的条件，作为更严格的条件为“0.5×SSC、0.1%SDS、42℃”程度的条件，作为进一步严格的条件为“0.2×SSC、0.1%SDS、65℃”程度的条件。

REIC/Dkk-3蛋白的部分区域多肽可基于上述序列信息通过化学合成来得到。还可通过基因工程方法以重组多肽的形式得到。即，可将编码本发明REIC/Dkk-3蛋白的部分区域多肽的DNA导入到适当的载体中，将该载体插入到宿主中，对该宿主进行培养，由培养物得到多肽。用于插入本发明DNA的载体只要可在宿主中复制就没有特别限定，可以举出例如质粒DNA、噬菌体DNA等，可以使用公知的载体。此时，作为宿主可使用真核细胞或原核细胞系。作为真核细胞，可以举出例如所建立的人、啮齿类等哺乳类细胞系、昆虫细胞系、丝状真菌细胞和酵母细胞等动物细胞等，作为原核细胞，可以举出例如大肠杆菌细胞等细菌细胞。通过在体外或体内对含有本发明的编码REIC/Dkk-3蛋白的部分区域多肽的DNA的宿主细胞进行培养、利用公知方法对该宿主进行培养，可由培养物中得到REIC/Dkk-3蛋白的部分区域多肽。此处，所述“培养物”意味着培养上清、或者培养细胞或培养菌体、或者细胞或菌体的破碎物中的任意一种。经表达产生的多肽可由上述培养物中进行精制。精制使用通常在蛋白质中所用的精制方法即可，例如可通过适当选择并组合离子交换色谱、亲和色谱、凝胶过滤、超滤、盐析、透析等来进行精制。进一步地，本发明REIC/Dkk-3蛋白的部分区域多肽也可按照WO01/038523号公报的记载来得到。

本发明REIC/Dkk-3蛋白的部分区域多肽中，特别是REIC/Dkk-3蛋白的部分区域[Gly184-Phe267]在室温至37℃左右的高温下保存也不会受到分解，是稳定的。并且对PEG等各种试剂也是稳定的。

本发明还包括含有上述编码REIC/Dkk-3蛋白的部分区域多肽的DNA的载体。通过将该载体导入至待测体中，REIC/Dkk-3蛋白的部分区域多肽可在待测体体内进行表达、可在待测体体内发挥出生理活性。

REIC/Dkk-3蛋白的部分区域多肽在癌细胞中诱导凋亡。

在基因治疗中，目的基因(DNA)向待测体中的导入可通过公知方法进行。作为将基因导入到待测体中的方法，有使用病毒载体的方法和使用非病毒载体的方法，各种方法是公知的(实验医学别册，基因治疗的基础技术，羊土社，1996；实验医学别册，基因导入&表达分析实验法，羊土社，1997；日本基因治疗学会编，基因治疗开发研究手册，NTS，1999)。

作为用于基因导入的病毒载体，使用腺病毒、腺相关病毒、逆转录病毒等病毒载体的方法为代表性方法。可以在去毒逆转录病毒、疱疹病毒、牛痘病毒、痘病毒、脊髓灰质炎病毒、辛德比斯病毒、仙台病毒、SV40、人类免疫缺陷病毒(HIV)等DNA病毒或RNA病毒中导入目的基因，使细胞感染重组病毒，从而向细胞内导入基因。

将本发明的基因用于使用病毒进行的基因治疗时，优选使用腺病毒载体。作为腺病毒载体的特征，可以举出以下几点：(1)能够在多种细胞中导入基因；(2)即使对增殖停滞期的细胞也能够有效地进行基因导入；(3)能够通过离心进行浓缩，得到高滴度(10PFU/ml～11PFU/ml以上)病毒；(4)适于向体内组织细胞中直接进行基因导入。作为基因治疗用的腺病毒，已开发出E1/E3区域缺失的第1代腺病毒载体(Miyake,S.,etal.,Proc.Natl.Acad.Sci.USA.,93,1320,1996)、除E1/E3区域外E2或E4区域也缺失的第2代腺病毒载体(Lieber,A.,etal.,J.Virol.,70,8944,1996；Mizuguchi,H.&Kay,M.A.,Hum.GeneTher.,10,2013,1999)、腺病毒基因组基本上完全缺失的(GUTLESS)第3代腺病毒载体(Steinwaerder,D.S.,etal.,J.Virol.,73,9303,1999)，导入本发明的基因时，可以没有特别限定地使用任一腺病毒载体。进一步地，若利用对AAV染色体赋予了重组的能力的Adeno-AAV杂化载体(Recchia,A.,etal.,Proc.Natl.Acad.Sci.USA.,96,2615,1999)或通过使用转座子基因而在染色体中具有重组能力的腺病毒载体等，则也能够应用于长期的基因表达中。另外，通过插入与腺病毒纤维的H1环显示出组织特异的转移性的肽序列，也能够对腺病毒载体赋予组织特异性(Mizuguchi,H.&Hayakawa,T.,NipponRinsho,7,1544,2000)。

此外，也可不使用上述病毒而使用重组有质粒载体等基因表达载体的重组表达载体，将目的基因导入到细胞或组织中。例如，可通过脂质转染法、磷酸钙共沉法、DEAE-葡聚糖法、使用微小玻璃管的DNA的直接注入法等将基因导入到细胞内。此外，还可通过利用了内包型脂质体(internalliposome)的基因导入法、利用了静电型脂质体(electorostatictypeliposome)的基因导入法、HVJ-脂质体法、改良型HVJ-脂质体法(HVJ-AVE脂质体法)、使用了HVJ-E(envelope，包被)载体的方法、受体介导性基因导入法、利用粒子枪将载体(金属颗粒)与DNA分子一同打入到细胞中的方法、裸DNA的直接导入法、利用各种聚合物的导入法等将重组表达载体插入到细胞。作为这种情况下所用的表达载体，只要是能在生物体内表达目的基因的载体，即可使用任意表达载体，可以举出例如pCAGGS(Gene108,193-200(1991))、pBK-CMV、pcDNA3、1、pZeoSV(Invitrogen社、Stratagene社)、pVAX1等表达载体。

包含编码REIC/Dkk-3蛋白的部分区域多肽的DNA的载体可以适当包含用于基因转录的启动子或增强子、PolyA信号、用于导入了基因的细胞的标记和/或选择的标记基因等。作为此时的启动子，可以使用公知的启动子。

为了将包含本发明的编码REIC/Dkk-3蛋白的部分区域多肽的DNA的基因治疗用药物导入到待测体中，可以使用将基因治疗用药物直接导入到体内的体内(invivo)法；以及从人中取出某种细胞、然后在体外向该细胞中导入基因治疗用药物、再将该细胞送回体内的离体(exvivo)法等(NikkeiScience，1994年4月号，20-45页；月刊药事(月刊薬事)，36(1),23-48(1994)；实验医学增刊，12(15)，(1994)；日本基因治疗学会编，基因治疗开发研究手册，NTS，1999)。

本发明的REIC/Dkk-3蛋白的部分区域多肽、编码该多肽的DNA和含有该DNA的载体可作为药物或试剂进行利用。

本发明的REIC/Dkk-3蛋白的部分区域多肽、编码该多肽的DNA和含有该DNA的载体可诱导单核细胞分化为树突状细胞样细胞、提高抗癌免疫活性，可用于癌症的治疗中。

本发明的REIC/Dkk-3蛋白的部分区域多肽、编码该多肽的DNA和含有该DNA的载体可作为单核细胞分化成树突状细胞样细胞的分化诱导剂、癌免疫活化剂和具有癌免疫活化作用的癌症治疗或预防用药物组合物进行使用。此处，单核细胞分化成树突状细胞样细胞的分化诱导活性指的是作用于单核细胞使之分化成树突状细胞样细胞的活性。对于是否通过添加REIC/Dkk-3蛋白的部分区域多肽而分化诱导了树突状细胞样细胞这一点，可通过形态学特征和表面抗原进行检测。即，作为该树突状细胞样细胞的特征，可以举出：在形态学上具有树状突起；以及通过基于流式细胞术的分析，作为表面抗原的树突状细胞标记物CD11c、CD40、CD80、CD86、HLA-DR为阳性。

另外，通过将含有编码REIC/Dkk-3蛋白的部分区域多肽的DNA的载体导入至待测体中，REIC/Dkk-3蛋白的部分区域多肽在待测体体内表达，可通过单核细胞分化成树突状细胞样细胞的分化诱导效果、癌免疫活化效果和癌免疫活化作用发挥出癌症的治疗或预防效果。

单核细胞包括外周血来源单核细胞、骨髓来源单核细胞、脾脏细胞来源单核细胞、脐带血来源单核细胞，其中优选外周血来源单核细胞。单核细胞可以通过以下方式采集：以CD14阳性为特征从生物体采集单核细胞，在利用REIC/Dkk-3蛋白的部分区域多肽诱导为树突状细胞样细胞的情况下，以CD14的存在为指标，通过FACS(荧光激活细胞分类器，Fluorescentactivatedcellsorter)或流式细胞仪等进行采集。对单核细胞的来源动物种并无限定，可以使用小鼠、大鼠、豚鼠、田鼠、兔、猫、犬、绵羊、猪、牛、马、羊、猴、人等哺乳动物。利用FACS分离特定的细胞群时可通过公知方法进行。作为FACS、流式细胞仪，例如可使用FACSvantage(BectonDickinson社制造)、FACSCalibur(BectonDickinson社制造)等。

单核细胞的培养可通过公知的人淋巴系细胞培养技术来进行。作为培养液，可使用例如RPMI1640或DMEM等公知的基本培养基。可向这些基本培养基中添加适当的抗生物质或动物血清等来进行培养。对培养容器并无限制，可根据培养规模适当选择市售的培养板、培养皿、培养瓶来使用。

本发明包括在REIC蛋白的存在下在体外对单核细胞进行培养并诱导单核细胞分化成树突状细胞样细胞的方法。在该方法中，例如可以10⁴～10⁷细胞/ml的浓度使用单核细胞、以1μg/ml～20μg/ml的浓度添加REIC/Dkk-3蛋白的部分区域多肽来进行培养。

在生物体内，树突状细胞在癌免疫、炎症等的机理中发挥出极为重要的作用。利用本发明的方法通过REIC/Dkk-3蛋白分化诱导出的树突状细胞样细胞与经IL-4+GM-CSF诱导出的树突状细胞在形态学上相似，但严格来讲是不同的新型的树突状细胞样细胞。通过REIC/Dkk-3蛋白的部分区域多肽诱导出的树突状细胞样细胞具有树状形态。并且，作为树突状细胞标记物的CD11c、CD40、CD80、CD86、HLA-DR为阳性。在这点上，本发明的新型的树突状细胞样细胞可分类为树突状细胞。但作为树突状细胞标记物的CD1a为阴性、通常在树突状细胞中呈阴性化的CD14为阳性。

在受到REIC/Dkk-3蛋白的部分区域多肽的刺激而由CD14阳性单核细胞诱导的情况下，其被称为“经REIC蛋白活化的、分化为树突状细胞样的细胞(REICactivatedmonocytewithdendriticcellfeatures，具有树突状细胞形态的REIC活化单核细胞)”。

本发明的REIC/Dkk-3蛋白的部分区域多肽的分化诱导树突状细胞样细胞的能力大于全长REIC/Dkk-3蛋白。

本发明包括利用REIC/Dkk-3蛋白的部分区域多肽由CD14阳性单核细胞诱导出的树突状细胞样细胞。

被REIC/Dkk-3蛋白的部分区域多肽诱导而得到的树突状细胞样细胞可用于癌免疫疗法。即，由待测体采集单核细胞，将该单核细胞与REIC/Dkk-3蛋白的部分区域多肽共同进行培养，诱导树突状细胞样细胞，将所得到的树突状细胞样细胞送回到待测体内，由此可将树突状细胞样细胞本身用于癌治疗或预防等中。此时，由REIC/Dkk-3蛋白的部分区域多肽诱导出的树突状细胞样细胞能够发挥出癌种非特异性的作用、发挥出癌免疫治疗效果，但在诱导树突状细胞样细胞时，也可添加癌种特异性肿瘤抗原或自体肿瘤裂解物。并且，也可将诱导出的树突状细胞样细胞与特定的肿瘤抗原或自体肿瘤裂解物一同进行培养。通过利用癌种特异性肿瘤抗原或自体肿瘤裂解物刺激树突状细胞样细胞，能够肿瘤特异性地对癌细胞进行攻击。

树突状细胞样细胞可通过皮内给药、皮下给药、静脉内给药或淋巴结内给药来进行给药。

另外，REIC/Dkk-3蛋白的部分区域多肽被认为具有从细胞外作用于细胞而掌管细胞分化的细胞因子样作用，认为其在生物体内具有与免疫性、炎症性相关的广泛功能。因而，可将REIC/Dkk-3蛋白的部分区域多肽或对其进行编码的DNA给药到待测体中，作为体内的树突状细胞样细胞分化诱导剂、或者树突状细胞样细胞活化剂进行使用。REIC/Dkk-3蛋白的部分区域多肽在待测体内诱导树突状细胞样细胞，其结果，受到树突状细胞样细胞的作用，在待测体内具有抗癌性的淋巴细胞被全身性活化，发挥出癌免疫作用。因而，可将REIC/Dkk-3蛋白的部分区域多肽或对其进行编码的DNA作为癌免疫活化剂来使用。进一步地，由于经REIC/Dkk-3蛋白的部分区域多肽诱导出的树突状细胞样细胞具有癌免疫作用，因而能够将REIC/Dkk-3蛋白的部分区域多肽或对其进行编码的DNA作为癌症治疗或预防用的药物组合物(癌免疫治疗剂)来使用。此时，REIC/Dkk-3蛋白的部分区域多肽或对其进行编码的DNA可单独进行给药，这种情况下，能够癌种非特异性地发挥效果。或者也可将其与特定肿瘤抗原一同进行给药。这种情况下，能够癌种特异性地发挥效果。

另外，在癌变进展的组织内，REIC/Dkk-3蛋白的浓度降低，可认为在癌组织内难以诱导出抗癌免疫活性，生物体免疫错过癌(癌细胞的免疫学耐受)，使癌增殖、恶化。由此表示，本发明的REIC/Dkk-3蛋白的部分区域多肽不仅作为癌症治疗剂(抗癌剂、抗肿瘤剂)是有用的，而且作为基于抗癌免疫活化的癌变、致癌预防剂也是有用的。并且作为癌免疫疗法制剂也是有用的。

进一步地，REIC/Dkk-3蛋白的部分区域多肽、编码该多肽的DNA和含有该DNA的载体具有分化诱导CTL(cytotoxicTlymphocyte；细胞毒性T淋巴细胞)、NK(Naturalkiller；自然杀伤)细胞、辅助T细胞等免疫活化细胞的活性，还进一步具有抑制MDSC(Myeloidderivedsuppressorcell；髓源抑制细胞)及Treg细胞(调节性T细胞)的分化的活性。本发明的多肽能够提高抗癌免疫活性、用于癌症的治疗中，能够对癌症局部灶和转移灶发挥出抗癌效果。具体地说，能够通过促进以树突状细胞、辅助T细胞、CTL、NK细胞为代表的免疫活化细胞的分化诱导来作为抗癌剂、抗肿瘤剂、抗癌免疫活化剂、全身免疫活化剂、免疫活化细胞分化诱导剂、以及以MDSC、Treg为代表的免疫抑制系细胞的分化诱导抑制剂来进行使用。

对于作为本发明药物的治疗或预防对象的癌，可以举出脑/神经肿瘤、皮肤癌、胃癌、肺癌、肝癌、淋巴癌/白血病、结肠癌、胰腺癌、肛门/直肠癌、食道癌、子宫癌、乳腺癌、肾上腺癌、肾癌、肾盂输尿管癌、膀胱癌、前列腺癌、尿道癌、阴茎癌、睾丸癌、骨瘤/骨肉瘤、平滑肌瘤、横纹肌瘤、间皮瘤等。特别优选乳腺癌、膀胱癌。

本发明的药物含有编码REIC/Dkk-3蛋白的部分区域多肽的DNA、含有该DNA的载体或该DNA所编码的多肽；以及药理学可容许的载体、稀释剂或赋形剂。该用于癌症的治疗或预防的药物可以以各种剂型进行给药，可以举出利用片剂、胶囊剂、颗粒剂、散剂、糖浆剂等的口服给药；或者利用注射剂(皮下注、静注、肌注、腹腔内注等)、点滴剂、栓剂、喷雾剂、滴眼剂、经鼻给药剂、经皮给药剂、经粘膜给药剂、经肺给药剂、粘附制剂等的非口服给药。

本发明的药物可通过注射等进行全身给药，并且也可进行局部给药。例如，通过注射给药到癌部位，可发挥出其效果。特别是在将含有编码REIC/Dkk-3蛋白的部分区域多肽的DNA的载体进行局部给药的情况下，能够在癌部位通过载体长期产生肽，从而发挥出效果。

优选对癌病变局部进行1次或多次直接注入以使得该药物遍及癌病变整体。

本发明的药物含有制剂领域中通常应用的载体、稀释剂、赋形剂。例如，对于片剂用载体，使用乳糖、硬脂酸镁等作为赋形剂。作为注射用水性液，使用生理盐水、含有葡萄糖或其它辅助药的等渗液等，也可与适当的助溶剂(例如醇、丙二醇等多元醇；非离子表面活性剂等)合用。作为油性液，使用芝麻油、大豆油等，作为助溶剂可合用苯甲酸苄酯、苯甲醇等。

其给药量根据症状、年龄、体重等不同而不同，可以隔数日或数周或数月给药1次，每次通过皮下注射、肌肉注射、或者静脉注射给药0.001mg～100mg。另外，在使用含有编码REIC/Dkk-3蛋白的部分区域多肽的DNA的载体的情况下，例如可以以载体给药10⁷～10⁹pfu(plaqueformingunit；空斑形成单位)。

对于罹患癌症的癌患者中具有经确认对于抗癌剂治疗等现有的各种治疗具有抗性的癌病变的患者，本发明的药物也是有效的。

本发明的药物经单药给药也确认到了癌细胞死亡、肿瘤缩小的效果。进一步地，通过将本药物与抗癌剂合用，抗癌作用经双重诱导，可期待较强的肿瘤缩小效果。

进一步地，由于本发明的REIC/Dkk-3蛋白的部分区域多肽、编码该多肽的DNA和含有该DNA的载体具有抗癌免疫活性，因而其不仅对给药后的癌局部、而且对癌转移灶也具有治疗效果，并且还可用于癌转移的预防。

另外，通过将现有的各种癌抗原蛋白与本发明的REIC/Dkk-3蛋白的部分区域多肽、编码该多肽的DNA和含有该DNA的载体同时给药，还能够经由树突状(样)细胞等的分化诱导来系统地活化抗癌免疫，对致癌本身进行预防。

通过下述实施例对本发明进行具体说明，但本发明并不受这些实施例的限定。

实施例1人REIC/Dkk-3蛋白的全长、以及部分区域1[Arg121-329]和部分区域2[Gly184-Ile329]的制备

将编码成熟体REIC/Dkk-3蛋白的全长[Ala1-Ile329](样品I)(序列编号2的第22位的Ala至第350位的Ile)、以及编码REIC/Dkk-3蛋白的部分区域REIC[Arg121-Ile329](样品II)的质粒DNA转化到大肠杆菌(T7Express株：NEB社)中，将约10个左右的新鲜菌落在1.6升培养液中大量培养，向对数增殖期的培养液(A600～0.7)中添加0.5mMIPTG来诱导蛋白质的表达。表达诱导条件下在37℃进行3小时培养，通过离心分离回收菌体。使用超声波破碎等对该表达菌体进行溶菌后，进行离心分离，在不溶性级分中回收表达蛋白质。为尽力除去混入到不溶性级分中的菌体来源的核酸，向分散在含有20mMTris-HCl、pH8.0与5mMMgCl₂的缓冲液中的不溶性级分中添加10unit/mL的Benzonase(一种核酸酶，Novagen社)，在25℃温育30分钟，促进核酸的分解。其后再次进行离心分离，从而得到含有高纯度REIC/Dkk-3蛋白的不溶性级分。接下来，将该沉淀充分悬浮、溶解在含有6M盐酸胍的Tris-HCl缓冲液(pH8)中，添加100mM的2-巯基乙醇在37℃进行1小时温育，从而将蛋白质完全还原。在此时，通过Bradford法对蛋白质浓度进行蛋白定量，利用重折叠缓冲液进行稀释，以使蛋白质浓度的最终浓度为0.2mg/mL，在25℃进行24小时温育。重折叠时的缓冲液含有20mMTris-HCl、pH8.0、0.4M盐酸胍、30%甘油，预先对其进行制备以使其组成中含有2-巯基乙醇(其包含在还原蛋白质溶液中并掺入到重折叠缓冲液中)的1/4摩尔量的氧化型谷胱甘肽(NacalaiTesque,INC.)。使用该组成，利用搅拌器充分搅拌的同时对还原的蛋白质溶液立即进行稀释。在该氧化还原条件下进行重折叠之后，使用填充有阴离子交换树脂(DEAE-Toyopearl650M、东曹)的柱进行蛋白质的吸附，之后在20mMTris-HCl、pH8.0缓冲液中利用氯化钠的线性浓度梯度(0～0.8M)进行洗脱，从而在氯化钠浓度为0.5M左右的条件下回收REIC蛋白的峰级分。在该时刻，全长REIC[Ala1-Ile329](样品I)以在分子间形成有二硫(SS)键的低聚物形式得到回收，因而进一步添加30mM的二硫苏糖醇(DTT)，在37℃温育1小时，从而制成仅限制性还原分子间SS键的单体。在该限制性还原反应后，立即利用调节至pH6.0的磷酸缓冲液或MES缓冲液进行平衡化。使用SephadexG25M柱色谱(GEHEALTHCARE社)进行DTT的去除以及向pH6.0缓冲液的置换，从而将可在4℃稳定保存数周的样品回收。该阶段得到的样品为样品I，可根据需要使用仅可透过分子量为10kDa以下物质的超滤过滤器进行浓缩。

通过上述步骤，利用阴离子交换色谱法将部分区域REIC[Arg121-Ile329](样品II)以稳定单体的形式进行分离。为了进一步进行高纯度精制，通过使用Resource-Q柱(GEHEALTHCARE社)等的阴离子交换HPLC利用氯化钠的线性浓度梯度进行洗脱，从而精制出高纯度的REIC/Dkk-3蛋白的部分区域REIC[Arg121-Ile329]。将其利用经pH7.4PBS平衡化的SephadexG25M柱色谱进行缓冲液置换，得到样品II，根据需要使用仅可透过分子量为10kDa以下物质的超滤过滤器进行浓缩。

对于编码REIC/Dkk-3蛋白的部分区域[Gly184-Ile329](样品III)的蛋白质的制备，将表达用质粒DNA转化至大肠杆菌(ShuffleT7Express株：NEB社)中，将约10个左右的新鲜菌落在0.8升培养液中大量培养，向对数增殖期的培养液(A600～0.7)中添加0.5mMIPTG，从而诱导蛋白质的表达。表达诱导条件下在30℃进行16小时培养，通过离心分离回收菌体。使用超声波破碎等对该表达菌体进行溶菌后，进行离心分离，在可溶性级分中回收表达蛋白质。本实施例中所用的REIC蛋白[Gly184-Ile329]中，在N末端侧添加有His标签序列，因而使用TALON金属亲和树脂(Clontech社)进行亲和精制。为进一步对其进行高纯度精制，通过使用Resource-Q柱(GEHEALTHCARE社)等的阴离子交换HPLC进行精制，利用经pH7.4PBS平衡化的SephadexG25M柱色谱进行缓冲液置换，得到样品III。

由氨基酸序列推测的分子量分别为：全长REIC/Dkk-3蛋白为37.5kDa、REIC/Dkk-3蛋白的部分区域1[Arg121-Ile329]为26.9kDa、REIC/Dkk-3蛋白的部分区域2[Gly184-Ile329]为19.7kDa，利用基于SDS-PAGE的分析确认到，其以单条带的形式泳动到大致符合推测的分子量处。

全长REIC/Dkk-3蛋白的氨基酸序列示于序列编号2中、REIC/Dkk-3蛋白的部分区域1[Arg121-Ile329]的氨基酸序列示于序列编号5中、REIC/Dkk-3蛋白的部分区域2[Gly184-Ile329]的氨基酸序列示于序列编号3中。进一步地，含有添加到它们中的His标签的序列示于序列编号11中。需要说明的是，REIC/Dkk-3蛋白的部分区域1[Arg121-Ile329]的氨基酸序列相当于序列编号2所示的氨基酸序列的第142位至第350位氨基酸。

图1中示出了人REIC/Dkk-3蛋白的全长以及部分区域1[Arg121-329]和部分区域2[Gly184-Ile329]的制备方法的概括图。

实施例2由外周血单核细胞向树突状细胞样细胞的分化诱导

人单核细胞的制备

利用使用了Ficoll-Paque离心分离的标准方法从健康供体的血液中进行人PBMC(外周血单核细胞)的制备。利用台盼蓝排除法测定细胞的回收率，确认到生存率为99%以上。为了制备单核细胞，将PBMC再悬浮于LGM-3培养基(淋巴细胞增殖培养基-3，不含血清，Lonza)中，将附着在塑料皿上的细胞(2小时，37℃，利用10cm皿进行温育)作为单核细胞使用。在一些实验中，使用CD14+磁力活化细胞分选微珠(MACS；MiltenyiBiotec)分离CD14+单核细胞。将精制后的CD14+单核细胞再悬浮于LGM-3培养基中。利用流式细胞仪，纯度总是高于95%。

人单核细胞的处理

在单独(无添加)、GM-CSF(R&DSystems)+IL-4(R&DSystems)(分别为2ng/ml)的存在下、或者实施例1中制备的人REIC/Dkk-3蛋白的全长的存在下、部分区域1[Arg121-Ile329]的存在下或部分区域2[Gly184-Ile329](10μg/ml)的存在下进行PBMC的培养。细胞利用相位差显微镜进行观察。

图2中示出了在单独(无添加)、GM-CSF(R&DSystems)+IL-4(R&DSystems)(分别为2ng/ml)的存在下、或者实施例1中制备的人REIC/Dkk-3蛋白的全长的存在下、部分区域1[Arg121-Ile329]的存在下或者部分区域2[Gly184-Ile329](10μg/ml)的存在下培养出的PBMC中在培养第7天时树突状细胞样分化诱导的结果。图2A表示无添加的结果，图2B表示添加了GM-CSF+IL-4的情况下的结果，图2C表示添加了全长REIC/Dkk-3蛋白的情况下的结果，图2D表示添加了REIC/Dkk-3蛋白的部分区域1[Arg121-Ile329]的情况下的结果，图2E表示添加了REIC/Dkk-3蛋白的部分区域2[Gly184-Ile329]的情况下的结果。图2示出了相位差显微镜像的低倍放大像。

根据形态学观察，在REIC/Dkk-3蛋白的部分区域2[Gly184-Ile329]中确认到了最强的由外周血单核细胞向树突状细胞样细胞的分化诱导活性。

图3中示出了单独(无添加)、添加有GM-CSF+IL-4的情况下、以及添加有REIC/Dkk-3蛋白的部分区域2[Gly184-Ile329]的情况下的分化诱导比较。图3A示出了无添加的结果、图3B示出了添加有GM-CSF+IL-4的情况下的结果、图3C示出了添加有REIC/Dkk-3蛋白的部分区域2[Gly184-Ile329]的情况下的结果。图3示出了相位差显微镜像的高倍放大像。

REIC/Dkk-3蛋白的部分区域2中，由外周血单核细胞分化诱导出的树突状细胞样细胞在形态学上小于经IL-4+GM-CSF诱导出的树突状细胞。另一方面，全长REIC/Dkk-3蛋白和REIC/Dkk-3蛋白的部分区域1[Arg121-Ile329]所诱导出的树突状细胞样细胞与REIC/Dkk-3蛋白的部分区域2所诱导出的树突状细胞样细胞之间未确认到形态学上的差异。

图4示出了在单独(无添加)、添加有GM-CSF(R&DSystems)+IL-4(R&DSystems)(分别为2ng/ml)、或者添加有人REIC/Dkk-3蛋白的全长、部分区域1[Arg121-Ile329]或部分区域2[Gly184-Ile329](10μg/ml)的情况下树突状细胞样细胞的出现频率。在第7天，在手动搅拌3分钟后，利用低倍放大照片的倍数随机统计每一视野中的树突状细胞样细胞的数目，进行图表化(n=5视野)。根据形态学观察，在REIC/Dkk-3蛋白的部分区域2[Gly184-Ile329]中确认到最强的由外周血单核细胞向树突状细胞样细胞的分化诱导活性，与添加有全长REIC/Dkk-3蛋白的情况和添加有部分区域1[Arg121-Ile329]的情况相比，确认到了非常强的活性；进一步地，与添加有GM-CSF+IL-4的情况相比，也确认到了强活性。

实施例3人REIC/Dkk-3蛋白的部分区域3[Ser114-Phe267]的制备

作为蛋白质生产用宿主细胞，使用处于对数增殖期的人肾脏来源细胞FreeStyle293-F细胞(invitrogen社)，将该细胞以5～6×10⁵cells/mL的浓度在500mL烧瓶中播种180mL，准备5个该烧瓶，在37℃、8%CO₂存在下，使用Freestyle293表达培养基(invitrogen社)进行一夜振荡培养(125rpm)。翌日调整成1×10⁶cells/mL的浓度，将编码全长REIC[Ala1-Ile329]的基因高表达质粒(下述)各180μg与293Fectin(invitrogen社)混合，对于在500mL烧瓶中播种了180mL的293-F细胞进行瞬时转染。转染后4天，在37℃、8%CO₂存在下进行振荡培养，回收培养上清。

对于所回收的培养上清通过超滤进行浓缩，使用SephadexG25M柱色谱(GEHEALTHCARE社)将溶剂置换为20mMHepes缓冲液(pH7.2)，回收含有REIC蛋白的级分。其后使用阴离子交换柱色谱(DEAE-Toyopearl650M,东曹)对蛋白质进行吸附后，在20mMHepes缓冲液(pH7.2)中利用氯化钠的线性浓度梯度(0～0.7M)进行洗脱，在氯化钠浓度为0.35M左右的条件下确认到REIC蛋白的峰级分。由相比于该峰级分更多且更高纯度地含有REIC蛋白的级分进行REIC蛋白的回收。

使用经pH7.4PBS平衡化的SephadexG25M柱色谱将该全长REIC[Ala1-Ile329]蛋白的缓冲液置换为PBS之后，在37℃或者室温下温育5天，从而限制性分解为编码REIC部分区域[Ser114-Phe267]的蛋白质。使用SephadexG25M柱色谱(GEHEALTHCARE社)将含有该REIC部分区域[Ser114-Phe267]的蛋白质溶液中的溶剂置换为20mMHepes缓冲液(pH7.2)，回收含有REIC蛋白的级分。其后使用阴离子交换柱色谱(DEAE-Toyopearl650M,东曹)进行蛋白质的吸附后，在20mMHepes缓冲液(pH7.2)中利用氯化钠的线性浓度梯度(0～0.6M)进行洗脱，在氯化钠浓度为0.3M左右的条件下，确认到REIC部分区域[Ser114-Phe267]蛋白的峰级分。由该峰级分回收的REIC部分区域[Ser114-Phe267]蛋白为样品IV，根据需要使用仅透过分子量为10kDa以下物质的超滤过滤器进行浓缩。

图5-1中示出了制备方案。并且，图5-2中示出了第1次阴离子交换色谱的精制曲线图(图5-1的(3)阴离子交换色谱)，图5-3中示出了第2次阴离子交换色谱(图5-1的(4)阴离子交换色谱)的精制曲线图。

本实施例中所用的基因高表达质粒为含有具有特定结构的表达盒的质粒，通过可经基因表达进行表达的目的蛋白的超高表达可进行大量生产。该表达用盒具有下述结构：至少在第1启动子的下游具有含有所要表达的蛋白质的基因(所要表达的基因)和PolyA附加序列的DNA构建体，进一步在该构建体的下游连接并含有增强子或第2启动子。在表达用盒的最下游存在上述的增强子或第2启动子，在其下游不具有其它基因表达用结构。即，本发明的表达用盒至少具有在1个第1启动子与至少1个增强子之间夹着要表达的基因的结构、或者在1个第1启动子与1个第2启动子之间夹着要表达的基因的结构。此处，其它基因表达用结构指的是用于表达上述要表达的基因以外的基因的结构。作为启动子，可以使用CMVi启动子、SV40启动子、hTERT启动子、β肌动蛋白启动子或CAG启动子；作为增强子，可以使用CMV增强子、SV40增强子或hTERT增强子。并且，在启动子的下游含有编码所要表达的蛋白质的DNA和PolyA附加序列的DNA构建体的上游也可以连接1～4个CMV增强子。进一步地，也可以含有：(i)连接在紧靠着编码外来蛋白质的DNA的上游的RU5'、(ii)连接在紧靠着增强子和/或启动子的上游的UAS、或者(iii)连接在表达用盒的最上游的SV40-ori。所用质粒中所含有的表达盒的构造见图9。

实施例4基于人REIC/Dkk-3蛋白的部分区域3[Ser114-Phe267]的由外周血单核细胞向树突状细胞样细胞的分化诱导

在实施例2所记载的方法中，制备人PBMC(外周血单核细胞)，在单独(无添加)、实施例1中制备的人REIC/Dkk-3蛋白的全长和部分区域1[Arg121-Ile329]、以及实施例3中制备的部分区域3[Ser114-Phe267](10μg/ml)的存在下进行培养。细胞利用相位差显微镜进行观察。

图6中示出了单独(无添加)、在实施例1中制备的人REIC/Dkk-3蛋白的全长的存在下以及实施例3中制备的部分区域3[Ser114-Phe267](10μg/ml)的存在下培养出的PBMC中在培养第7天时树突状细胞样分化诱导的结果。图6A示出了无添加的情况下的结果，图6B示出了添加有全长REIC/Dkk-3蛋白的情况下的结果，图6C示出了添加有REIC/Dkk-3蛋白的部分区域3[Ser114-Phe267]的情况下的结果。图6示出了相位差显微镜像的低倍放大像。根据形态学观察，REIC/Dkk-3部分区域3确认到了与全长、部分区域1相比为同等或其以上的诱导外周血单核细胞分化为树突状细胞样细胞的分化诱导活性。图7中示出了高倍放大像。如图7所示，REIC/Dkk-3部分区域3中的由外周血单核细胞分化诱导出的树突状细胞样细胞与部分区域1中分化诱导出的树突状细胞样细胞未确认到形态学上的差异。

实施例5REIC/Dkk-3部分区域3的稳定性

使用SDS-PAGE对18μL的在37℃或室温(约20℃)温育5天后的样品进行分离，通过CBB染色检测出分子量约17kDa的编码REIC/Dkk-3的部分区域3的蛋白质。此时，在室温(约20℃)或37℃放置5天，进一步实施SDS-PAGE，确认降解模式。SDS-PAGE的结果见图8。尽管作为蛋白质的保存条件为高温，部分区域3也可以在SDS-PAGE分离后通过CBB染色检测出约17kDa的条带。

另外可知，对于部分区域3的蛋白质溶液，在投入、混合各种PEG、硫化铵-硫化锂等盐、2-甲基-2,4-戊二醇(MPD)-乙醇-2-丙醇等醇类时，也未显示出聚集、沉淀等反应。从而判断出部分区域3的稳定性足够高。

实施例6基于体内实验进行的REIC/Dkk-3蛋白的部分区域3[Ser114-Phe267]的肿瘤抑制效果测定

将RENCa细胞(1×10⁶)注射到小鼠(BALB/c，雌性，n=5)的皮下。在注入后第3、5、7、10、12和14天(将注入后第3天作为全长REIC蛋白和部分区域3的给药起始)向小鼠腹腔注入全长REIC蛋白(100μg(100μl))或部分区域3(100μg(100μl))或作为对照的PBS(100μl)。在第17天确认皮下肿瘤中的治疗效果，进行抗癌免疫活性的测定(实施例7)，对小鼠处以安乐死。体内实验方案如图10所示。肿瘤体积按照0.52×(最小直径)²×(最大直径)来求得。

图11A中示出了治疗后肿瘤体积的经时变化。对于进行了全长REIC蛋白、部分区域3给药的治疗组的肿瘤体积与作为对照的PBS给药组的肿瘤体积进行比较可知，其在统计学上显著减小(以*表示)。图11B中示出了由小鼠中取出的肿瘤的重量。对于进行了全长REIC蛋白、部分区域3给药的治疗组的肿瘤重量与PBS给药组的肿瘤重量进行比较可知，其在统计学上显著减小(以*表示)。图11C中示出了由小鼠中取出的肿瘤的照片。如图11A～图11C所示，通过全长REIC蛋白和部分区域3的给药，抑制了肿瘤增殖。

实施例7实施例6的小鼠静脉血中的免疫活性细胞的流式细胞术

通过流式细胞术对于实施例6中得到的小鼠静脉血中存在的免疫活性细胞的变化进行分析。由下腔静脉采血，向所采集的小鼠血液750μl中加入0.2%EDTA溶液30μl进行抗凝处理。向30μl血液中加入由eBioscience社购入的进行了不同荧光标记的下述各抗体1μl并进行搅拌，在4℃进行60分钟温育，从而进行下述所示免疫活性细胞的染色。

骨髓来源免疫抑制细胞(抗GR-1抗体,抗CD11b抗体)

树突状细胞(抗CD11抗体)

活性型树突状细胞(CD11c+/CD80+)(抗CD11c抗体,抗CD80抗体)

活性型树突状细胞(CD11c+/CD86+)(抗CD11c抗体,抗CD86抗体)

辅助T细胞(抗CD4抗体)

免疫调节性T细胞(抗CD4抗体、抗Foxp3抗体)

细胞毒性T细胞(抗CD8抗体)

活性型细胞毒性T细胞(抗CD69抗体、抗CD8抗体)

NK细胞(抗CD3e抗体,抗NK1.1抗体)

其后，利用红细胞裂解缓冲液对红细胞进行溶解处理，利用PBS对细胞进行2次清洗，再悬浮于PBS200μl中，制成分析用细胞液。使用FACSCalibur流式细胞仪(BectonDickinson)，采集3×10⁴个细胞，利用CellQuest软件(BectonDickinson)进行分析。基于这些细胞的特征性前向角散射图案设定适当的栅极，仅对栅极内的细胞进行分析。结果，对于全长REIC蛋白和部分区域3，几乎在全部的免疫活化细胞中确认到了分化诱导活性(图12B、C、D、E、G、H、I)。还观察到了免疫抑制系细胞的分化诱导抑制(图12A、F)。特别观察到部分区域3对于细胞毒性T细胞(CTL)的分化诱导优异(图12G、H)、并且观察到对免疫调节性T细胞(Treg)的强大的分化抑制(图12F)。由以上结果可判断出，含有部分区域3的蛋白质可作为抗癌免疫活化剂、抗癌剂、抗肿瘤剂、免疫细胞分化诱导/抑制剂进行应用，含有部分区域3的全长REIC蛋白也可同样地进行应用。

实施例8使用肾细胞癌模型小鼠的全长REIC蛋白的抗肿瘤效果实验

通过使Luciferase基因在RENCA细胞株中稳定表达来进行制作小鼠肾细胞癌细胞RENCA-Luc细胞株。为了通过体内实验对于REIC蛋白的肿瘤抑制效果进行研究，使用该RENCA-Luc细胞株制作肾细胞癌模型小鼠。为了制作原位肿瘤，利用耐波他(Nembutal)对雄性BALB/C小鼠进行麻醉后，向左肾局部注入RENCA-Luc细胞(10³cells)。其后立即由尾静脉注入10⁴cells，制成具有肺转移灶的肾细胞癌小鼠模型(Day0)。对于对照组、治疗组进行下述处置。

A：连日(13天)进行计13次的PBS(100μl)腹腔内给药

B：连日(13天)进行计13次的REIC蛋白(10μg/100μlPBS)腹腔内给药

C：连日(13天)进行计13次的REIC蛋白(100μg/100μlPBS)腹腔内给药

给药开始后第14天(Day14)对小鼠施以安乐死，分析所摘出肿瘤的肿瘤尺寸、重量。如图14A所示，相对于无处置和缓冲液给药组，确认到REIC蛋白给药组的肿瘤缩小。暗示出该肿瘤缩小效果随着REIC蛋白的给药量而变得显著(图14B)。并且对于肺转移灶也同样确认到肿瘤的缩小(图15A、B)。

实施例9使用小鼠骨髓细胞的分化诱导实验

由无处置的正常小鼠采集骨髓，利用吸液管进行悬浮，采用平底6孔培养板进行小鼠骨髓细胞的培养。翌日利用PBS进行2次清洗，将附着的细胞用于实验。通过GM-CSF(20ng/ml,由R&DSystems社购入)单独添加、或进而添加全长REIC蛋白(10μg/ml)来分析REIC蛋白对于骨髓来源免疫抑制细胞(MDSC)分化诱导的抑制效果。在小鼠骨髓细胞培养开始后第6天，通过胰岛素处理回收细胞，使用抗MDSC的表面抗原标记物GR-1,CD11b的抗体进行细胞染色。使用FACSCalibur流式细胞仪(BectonDickinson)对3×10⁴个细胞进行分析。在无处置的情况下，MDSC的比例为2.56%，与此相对，在GM-CSF给药的情况下，MDSC的比例增加至53.04%(图16A、B)。这意味着，GM-CSF促进了MDSC的分化诱导、抑制了免疫活性能力。将GM-CSF与全长REIC蛋白这两者混合的情况下，与GM-CSF单独的情况相比，MDSC的分化诱导为低程度(34.71%)。该结果意味着，REIC蛋白对于MDSC细胞的分化诱导具有抑制性作用，发挥出了免疫活化能力。

实施例10实施例8的小鼠静脉血中的免疫活性细胞的流式细胞术

通过流式细胞术对于实施例8中得到的小鼠静脉血中的免疫活性细胞比例进行分析。与实施例7同样地由下腔静脉采血，向所采集的小鼠外周血750μl中加入0.2%EDTA溶液30μl进行抗凝处理。向30μl血液中加入由eBioscience社购入的进行了不同荧光标记的下述各抗体1μl并进行搅拌，在4℃进行60分钟温育，从而进行下述所示各免疫活性细胞的染色。

骨髓来源免疫抑制细胞(抗GR-1抗体,抗CD11b抗体)

活性型树突状细胞(CD11c+/CD80+)(抗CD11c抗体,抗CD80抗体)

免疫调节性T细胞(抗CD4抗体、抗Foxp3抗体)

活性型细胞毒性T细胞(抗CD69抗体、抗CD8抗体)

NK细胞(抗CD3抗体,抗NK1.1抗体)

其后，利用红细胞裂解缓冲液对红细胞进行溶解处理，利用PBS对细胞进行2次清洗，再悬浮于PBS200μl中，制成分析用细胞液。使用FACSCalibur流式细胞仪(BectonDickinson)，采集3×10⁴个细胞，利用CellQuest软件(BectonDickinson)进行分析。基于这些细胞的特征性前向角散射图案设定适当的栅极，仅对栅极内的细胞进行分析。结果示于图17A～E。对于树突状细胞(图17B-1和B-2)、活化细胞毒性T细胞(CTL、图17D-1和D-2)、NK细胞(图17E-1和E-2)，可知阳性率随着REIC蛋白的给药量而提高。这些免疫活性细胞均对免疫活性发挥出促进功能。进一步可知，在对免疫系发挥出抑制性作用的MDSC(图17A-1和A-2)、Treg(图17C-1和C-2)中，阳性率随着REIC蛋白的给药量而降低。

根据上述结果，发现REIC蛋白具有通过减弱免疫抑制系统来活化免疫系统的功能。已知生物体微环境中的免疫功能的降低可促进肿瘤的产生、增殖，免疫抑制系统细胞的产生和诱导是免疫功能降低的主要原因。因而，REIC蛋白和表达该蛋白质的DNA载体可作为免疫抑制的抑制剂以抗癌剂、抗肿瘤剂、抗癌免疫活化剂、免疫活性细胞分化诱导剂的形式进行应用。

实施例11

基于酵母双杂交法(Y2H：Yeast2hybrid法)的REIC蛋白与Tctex-1相互作用分析酵母双杂交法中，使用ProQuest双杂交系统(Invitrogen,Carlsbad,CA)。人REIC/Dkk-3的全长cDNA利用下述所示的2条引物DNA进行扩增。

正向：5’-ACGCGTCGACCATGCAGCGGCTTGGGGCCAC-3’(序列编号12)

反向：5’-TTCCTTTTTTGCGGCCGCTAAATCTCTTCCCCTCCCA-3’(序列编号13)

将扩增的cDNA插入到诱饵载体pDBLeu的SalI与NotI酶切位点之间，导入到酵母MaV203株中。接着分离出REIC/Dkk-3表达克隆体，转化到克隆在pPC86(Invitrogen)中的人心脏cDNA文库中。基因导入成功的克隆体利用添加有β-半乳糖苷酶底物的选择性培养基进行回收。基因导入、质粒分离、DNA构造体的确认以及、酵母裂解液的制备参考Invitrogen的操作指南。

为了鉴定REIC/Dkk-3的相互作用配对物，以REIC/Dkk-3蛋白为诱饵，通过酵母双杂交法实施筛选。由于REIC/Dkk-3的表达在小鼠或人的心脏组织中增强，因而筛选以正常心组织的人cDNA文库为对象。在活化报告基因的克隆体之中，有4个克隆体培养成功。通过质粒拯救法由这些克隆体分离、回收插入基因，再次进行基因导入，利用报告基因选择性培养基进行培养。结果如图18A所示。在图18A中，在含有Tctex-1的右部区域中观察到了蓝色菌落。蓝色菌落表明了REIC/Dkk-3蛋白与Tctex-1蛋白的相互作用(缔合)。该结果暗示出，Tctex-1为REIC/Dkk-3的相互作用配对物(图18A)。

实施例12基于免疫沉降、Western印迹的REIC-Tctex-1相互作用分析

为了通过免疫沉降法进行结合配对物的确认，将REIC/Dkk-3或Tctex-1的人全长cDNA插入到pcDNA3.1/Myc-His(-)A或pcDNA3.2/V5/GW/D-TOPO质粒(Invitrogen)中，进行克隆。为进行瞬时基因的表达，使用Lipofectamine2000将质粒DNA导入到293T细胞中。向293T细胞中同时导入添加Myc-tag的REIC/Dkk-3或添加V5标签的Tctex-1，在基因导入后48小时将293T细胞裂解，加入缓冲液(20mMTris–HCl,pH7.5,1%TritonX-100,150mMNaCl,5mMEDTA,以及Complete蛋白酶抑制剂混合物(Roche,Basel,Switzerland))。向细胞裂解液中添加小鼠来源非特异性IgG抗体(SantaCruzBiotechnology,SantaCruz,CA)1mg进行温育，添加蛋白G琼脂糖凝胶(Invitrogen)1ml、或者抗Myc小鼠来源单克隆抗体(Invitrogen,Cat.No.R95025)。在4℃温育12小时后，清洗沉降物，利用溶解有SDS的缓冲液煮沸。针对沉淀物使用小鼠来源V5单克隆抗体(Invitrogen,Cat.No.R96025)进行Western印迹法。

为了确认REIC/Dkk-3与Tctex-1的相互作用，通过免疫沉降法实施体外下拉实验分析(pulldownassay)。使用表达Myc-REIC/Dkk-3融合蛋白的293T细胞裂解液实施V5-Tctex-1融合蛋白的结合分析。与Tctex-1的结合通过使用V5抗体的Western印迹法进行检测。对于Tctex-1与REIC/Dkk3-蛋白的结合，向同时导入了REIC/Dkk-3与Tctex-1的细胞裂解液中加入Myc抗体，由所得到的免疫沉降样品进行检测。结果如图18B所示。实施例11和12的结果示出了，通过酵母双杂交与免疫沉降法这两者证明、再现了REIC/Dkk-3蛋白与Tctex-1蛋白的相互作用。

实施例13利用哺乳动物双杂交法(M2H)进行REIC蛋白的Tctec-1结合区域分析

为了实施哺乳类细胞双杂交分析，将编码各种氨基酸长度的REIC/Dkk-3的cDNA导入到pMGAL4DNA结合域的克隆用质粒中，进一步将编码全长Tctex-1的cDNA导入到pVP16转录活性域的克隆质粒(ClontechLaboratories,MountainView,CA)中。各氨基酸长度的人REIC/Dkk-3的模板通过使用适当引物对的PCR法进行了生成、扩增。Tctex-1全长cDNA利用如下所示引物进行扩增。

正向5’-CCGGAATTCATGGAAGACTACCAGGCTGC-3’(序列编号14)

反向5’-GGGAAGCTTTCAAATAGACAGTCCGAAGG-3’(序列编号15)

向约2×10⁵个293T细胞中同时进行400ngpVP16、400ngpM、250ngpFR-Luc萤火虫来源荧光素酶报告基因质粒(Promega,Madison,WI)、10ngphRL-TK海肾来源荧光素酶报告基因质粒(Promega)的基因导入。对进行了导入的该细胞进行48小时培养，使用双荧光素酶报告基因检测系统(Promega)对荧光素酶活性进行测定。对于导入效率的差异所致的误差，测定phRL-TK基因导入所致的海萤来源荧光素酶活性来进行标准化。

为了探索在与Tctex-1的相互作用中为重要的REIC/Dkk-3的部分区域，利用哺乳类细胞双杂交法对于REIC/Dkk-3与Tctex-1的相互作用进行分析。对于同时导入了GAL4质粒(导入有各氨基酸长度的REIC/Dkk-3的cDNA)与VP16质粒(导入有全长Tctex-1的cDNA)的293T细胞的裂解液进行荧光素酶活性测定，在确认到活性的情况下，判断REIC/Dkk-3的各部分区域与Tctex-1结合。结果可知，由20～146氨基酸残基构成的REIC/Dkk-3的部分区域作为与Tctex-1结合的区域是重要的。另外可知，具有其以上的氨基酸长度的REIC/Dkk-3部分区域与Tctex-1的结合活性低(图19A)。为了进一步挑出REIC/Dkk-3与Tctex-1结合的区域，阶梯性缩短REIC/Dkk-3的部分区域。在具有20-146氨基酸的REIC/Dkk-3与20-157氨基酸残基的部分区域检测出了显示与Tctex-1结合的荧光素酶活性。由20-135氨基酸残基构成的部分区域仅确认到微弱的活性。这些结果暗示出，REIC/Dkk-3与Tctex-1的相互作用与由136-157氨基酸残基构成的REIC/Dkk-3的部分区域相关(图19B)。

图20A中示出了REIC蛋白与动力蛋白中间链(DIC)的TcTex-1结合区域的氨基酸序列比对。其他研究小组报告了属于动力蛋白轻链蛋白的Tctex-1与动力蛋白中间链(DIC)的部分区域[¹²⁰SDSELGRRLHKLGVSKVTQVDFL¹⁴²](序列编号16)的结合。REIC/Dkk-3的Tctex-1结合区域为[¹³⁶VGDEEGRRSHECIIDEDCGPSM¹⁵⁷](序列编号17)。通过与DIC的Tctex-1结合区域的序列比较，可知其共有序列为[-E-X-G-R-R-X-H-](X表示任意的天然氨基酸)(序列编号18)。

图20B中示出了REIC蛋白的Tctex-1结合域与已知Tctex-1结合蛋白的氨基酸序列比对。Tctex-1结合蛋白的氨基酸序列基序[-R/K-R/K-X-X-R/K-](X表示任意的天然氨基酸)(序列编号20)。REIC/Dkk-3的结合区域的氨基酸序列中，仅含有[-RR-]的基序是一致的，与Tctex-1的其它结合配对物的基序相比，其是具有特征性的。

实施例14REIC/Dkk-3蛋白与Tctex-1的细胞内定位模式的分析

通过内质网的共染色进行OUMS24细胞中的REIC/Dkk-3与Tctex-1的免疫细胞化学染色。在24孔板上，在30～40%汇合的条件对细胞进行培养。进一步利用4%多聚甲醛、100mM磷酸盐缓冲液对细胞进行固定，利用生理盐水与3%BSA进行封闭处理。对于细胞添加兔子来源抗REIC/Dkk-3多克隆抗体(利用生理盐水200倍稀释)、或者兔子来源抗Tctex-1多克隆抗体(100稀释,SantaCruzBiotechnology,sc-28537)，在室温下温育2小时，进一步加入添加有Alexa488绿色荧光色素的兔子来源2次抗体，温育1小时。为了检测出在内质网中的分布，向细胞中添加带有Alexa546红色荧光色素的刀豆球蛋白A(MolecularProbes)，在室温下温育15分钟。

根据在各种分析系统中揭示的REIC/Dkk-3与Tctex-1的相互作用，对于这2种蛋白质在细胞内的共定位进行分析。据报告，REIC/Dkk-3不仅定位在内质网内，而且还定位在细胞质内，而我们最近的研究证明，在REIC/Dkk-3蛋白稳定表达细胞中，REIC/Dkk-3蛋白定位在内质网中。因此，为了确认REIC/Dkk-3蛋白与Tctex-1蛋白在内质网中的定位，使用添加有荧光色素的刀豆球蛋白A(内质网定位标记蛋白)实施双重免疫荧光染色法。图21A为人成纤维细胞OUMS24中的人全长REIC蛋白与内质网标记物刀豆球蛋白A双重荧光染色的共聚焦显微镜照片。红(图21A-a的明亮部分)表示刀豆球蛋白A、绿(图21A-b的明亮部分)表示全长REIC蛋白。内质网与全长REIC蛋白的重叠区域以黄色(图21A-c的明亮部分)表示(重叠像)。图21B为人成纤维细胞OUMS24中的Tctex-1蛋白与内质网标记物刀豆球蛋白A双重荧光染色的共聚焦显微镜照片。红(图21B-a的明亮部分)表示刀豆球蛋白A、绿(图21B-b的明亮部分)表示Tctex-1蛋白。内质网与Tctex-1蛋白的重叠区域以黄色(图21A-c的明亮部分)表示(重叠像)。图21A和图21B的重叠像中，大部分被黄色染色。即，如所期待那样，REIC/Dkk-3(图21A)与Tctex-1(图21B)均在内质网中定位、这些蛋白质在正常成纤维细胞OUMS24的细胞内的定位模式是一致的。即，可判断出，REIC/Dkk-3与Tctex-1均定位在内质网周边、并且REIC/Dkk-3的相互作用配对物为Tctex-1。

实施例15Tctex-1作为REIC凋亡诱导能力促进因子的功能的分析

腺病毒REIC/Dkk-3(Ad-REIC)的制作如下实施。将REIC/Dkk-3的全长cDNA插入到粘粒载体pAxCAwt中，进一步通过COS-TPC法(TakaraBio，滋贺，日本)进行腺病毒载体导入。导入有LacZ基因的腺病毒载体(Ad-LacZ)作为比较对象使用。

凋亡分析法如下述所示。为了验证各处理后的体外凋亡诱导率，将PC3前列腺癌细胞利用6孔平底培养板培养24小时。对于培养后的PC3细胞添加GFP表达质粒(Clonetech)、Tctex-1表达质粒(pcDNA3.2/V5/GW/D-TOPO)、或者Tctex-1-sh-RNA质粒(sc-43319-SH,SantaCruzBiotechnology)，在6小时后进行培养基交换。基因导入中使用FuGENEHD(Roche)。GFP质粒的基因导入效率在质粒添加后48小时为60%以上。在GFP表达质粒基因导入24小时后，添加Ad-LacZ、Ad-REIC50MOI(multiplicityofinfection，感染复数)，利用无血清培养基反应2小时后，进行培养基交换。进一步进行48小时培养后，向培养基中添加2μg/ml的Hoechst33342溶液，在暗室中静置10分钟。Hoechst33342为用于总染色质含量评价与染色质凝聚检测的嵌合剂。通过荧光显微镜观测高度凝聚或断裂的细胞核，鉴定出凋亡诱导所产生的死细胞。在5点不同的显微镜像中计测凋亡诱导细胞数目。每1点显微镜像中对100个细胞进行判定。

统计学检测如下实施。数据以平均值±标准误差表示。2组间使用Student’s不成对T检验进行检测，在P值低于0.05的情况下，判断两者的差异为统计学显著的。

为了验证Tctex-1对于REIC/Dkk-3的凋亡诱导能力的功能，使用本发明人通过以往的研究确立的基于REIC/Dkk-3的过表达的凋亡诱导模型，该模型使用了人前列腺癌细胞PC3与Ad-REIC。根据Western印迹分析的结果，PC3表达内源性Tctex-1蛋白，另一方面，其不表达REIC/Dkk-3蛋白。图22A中示出了基于Hoechst33342的凋亡分析结果。在该分析结果中，在给与了Ad-REIC的PC3中产生了凋亡，但在Ad-LacZ中未产生(图22A、箭头)。图22A表示Ad-REIC的凋亡诱导能力随着Tctex-1的表达减少而减弱、随其表达增强而增强。Ad-REIC给药组中的凋亡诱导率在GFP质粒、shRNA-Tctex-1、Tctex-1表达质粒各给药组中分别为30%、15%、75%(图22B)。即暗示出，Ad-REIC的凋亡诱导能力随着Tctex-1的表达减少而减弱、随其表达增强而增强。可知与给与了Ad-REIC的GFP质粒处置组相比，shRNA-Tctex-1处置组中的凋亡诱导率降低。另外可知，Tctex-1表达质粒促进凋亡诱导。该结果暗示出，Tctex-1的表达水平与使用Ad-REIC的REIC/Dkk-3的过表达所致的凋亡诱导呈正相关。即，可得出Tctex-1促进REIC/Dkk-3的凋亡诱导的结论。

工业实用性

与IL-2、以往已知的多种具有免疫活性作用的细胞因子组、以及全长REIC/Dkk-3蛋白相比，本发明的REIC/Dkk-3蛋白的部分区域多肽具有下述效果：

(1)即使单药使用，也具有基于抗癌免疫活化的抗肿瘤效果；

(2)由于REIC/Dkk-3基因表达在多种癌种中有缺失、降低这一REIC/Dkk-3蛋白本身的特性，REIC/Dkk-3蛋白制剂对于广泛的癌种是有效的；

(3)通过基于REIC/Dkk-3蛋白的抗癌免疫活化，能够期待其不仅对经给药的癌局部、而且对癌转移灶也有改善、预防的作用；以及

(4)通过将现有的各种癌抗原蛋白与本制剂同时给药，能够经由树突状(样)细胞等的分化诱导来系统地活化抗癌免疫、可对致癌本身进行预防。

进一步地，本发明REIC/Dkk-3蛋白的部分区域多肽的尺寸也较小，因而也容易生产，且可低成本地进行生产。

本发明的REIC/Dkk-3蛋白的部分区域可作为癌免疫疗法制剂使用，对于癌症的预防、治疗是有用的。

序列表的自由内容

序列编号11合成

序列编号12～15引物

序列编号16～28合成

本说明书中引用的全部出版物、专利和专利申请直接作为参考并入到本说明书中。

Claims (14)

1.一种由REIC/Dkk-3蛋白的部分区域构成的多肽，其由选自由序列编号3、序列编号5和序列编号7所示的氨基酸序列组成的组中的氨基酸序列构成。

2.一种编码由REIC/Dkk-3蛋白的部分区域构成的多肽的DNA，其为下述(f)和(i)的任意一种；

(f)一种DNA，其由选自由序列编号4、序列编号6和序列编号8所示的碱基序列构成；和

(i)一种DNA，其由编码下述氨基酸序列的DNA序列构成，所述氨基酸序列选自由序列编号3、序列编号5和序列编号7所示的氨基酸序列组成的组。

3.一种载体，其含有权利要求2所述的DNA。

4.如权利要求3所述的载体，其中，载体为腺病毒载体。

5.一种单核细胞分化成树突状细胞样细胞的分化诱导剂，其含有权利要求1所述的由REIC/Dkk-3蛋白的部分区域构成的多肽作为有效成分。

6.一种免疫活化细胞的分化诱导促进剂，所述免疫活化细胞选自由树突状细胞、辅助T细胞、CTL和NK细胞组成的组，所述分化诱导促进剂含有权利要求1所述的由REIC/Dkk-3蛋白的部分区域构成的多肽作为有效成分。

7.一种免疫抑制功能系细胞的分化诱导抑制剂，所述免疫抑制功能系细胞为MDSC或Treg，所述分化诱导抑制剂含有权利要求1所述的由REIC/Dkk-3蛋白的部分区域构成的多肽作为有效成分。

8.一种抗癌剂，其含有权利要求1所述的由REIC/Dkk-3蛋白的部分区域构成的多肽作为有效成分。

9.一种单核细胞分化成树突状细胞样细胞的分化诱导剂，其含有权利要求2所述的编码由REIC/Dkk-3蛋白的部分区域构成的多肽的DNA或者权利要求3或4所述的载体作为有效成分。

10.一种免疫活化细胞的分化诱导促进剂，所述免疫活化细胞选自由树突状细胞、辅助T细胞、CTL和NK细胞组成的组，所述分化诱导促进剂含有权利要求2所述的编码由REIC/Dkk-3蛋白的部分区域构成的多肽的DNA或者权利要求3或4所述的载体作为有效成分。

11.一种免疫抑制系细胞的分化诱导抑制剂，所述免疫抑制系细胞为MDSC或Treg，所述分化诱导抑制剂含有权利要求2所述的编码由REIC/Dkk-3蛋白的部分区域构成的多肽的DNA或者权利要求3或4所述的载体作为有效成分。

12.一种抗癌剂，其含有权利要求2所述的编码由REIC/Dkk-3蛋白的部分区域构成的多肽的DNA或者权利要求3或4所述的载体作为有效成分。

13.权利要求1所述的由REIC/Dkk-3蛋白的部分区域构成的多肽在试剂制备中的应用，所述试剂用于诱导CD14阳性单核细胞分化成树突状细胞样细胞。

14.如权利要求13所述的应用，其中，单核细胞为外周血单核细胞。