CN106459930B

CN106459930B - 表达reic基因的条件复制型腺病毒

Info

Publication number: CN106459930B
Application number: CN201580027897.XA
Authority: CN
Inventors: 公文裕巳; 那须保友; 渡部昌实; 尹彩钰
Original assignee: MOMOTARO-GENE Inc; Okayama University NUC; Industry University Cooperation Foundation IUCF HYU
Current assignee: MOMOTARO-GENE Inc; Okayama University NUC; Industry University Cooperation Foundation IUCF HYU
Priority date: 2014-05-28
Filing date: 2015-05-26
Publication date: 2020-03-03
Anticipated expiration: 2035-05-26
Also published as: WO2015182574A1; US20170202892A1; CN106459930A; KR20170012397A; EP3150706A1; JP6566214B2; EP3150706B1; EP3150706A4; KR102365331B1; US10071126B2; JPWO2015182574A1

Abstract

本发明的目的在于提供具有强抗癌作用的条件复制型腺病毒。一种在癌细胞中特异性地增殖并表达REIC蛋白质或REIC C结构域蛋白质的条件复制型腺病毒，其是在包含5型腺病毒基因组的ITR(末端反向重复)序列并插入有HRE序列、hTERT启动子、编码核心蛋白多糖的DNA和编码包含RGD序列的肽的DNA的条件复制型腺病毒中进一步插入全长REIC DNA或REIC C结构域DNA而成的。

Description

表达REIC基因的条件复制型腺病毒

技术领域

本发明涉及高表达REIC(REIC/Dkk-3)蛋白质的条件复制型腺病毒。

背景技术

迄今为止，已报道了使用条件复制型(进行了在癌细胞中特异性增殖的基因改造)的各种病毒的针对癌症的药品的临床试验(非专利文献1)。在使用这些药品的癌症的治疗中取得了一定的成果，但另一方面，其效果大多是有限的，希望开发出更为有效的药品。

作为截止目前报道了临床试验结果的使用条件复制型病毒的针对癌症的药品的代表例，有将5型腺病毒作为骨架的Telomelysin(非专利文献2)和将1型单纯疱疹病毒作为骨架的Talimogene laherparepvec(T-VEC，原名Oncovex)(非专利文献3)。

近年来，如非专利文献1所示，对于使用各种病毒的针对癌症的药品来说，已经考虑到具有活化抗癌免疫这样的功能是很重要的。从这样的观点考虑，对于Telomelysin(非专利文献2)来说，其不编码活化抗癌免疫的细胞因子等的基因，尽管可在施用了Telomelysin的局部通过该腺病毒的增殖来诱导癌细胞死亡，但并不能期待全身的强抗癌免疫活化这样的作用。这一点可能限制了Telomelysin的治疗效果。

另外，对于T-VEC来说，在施用的局部可以期待由该疱疹病毒的增殖所引起的癌细胞死亡、癌细胞的抗原化以及由细胞因子GM-CSF的表达所带来的抗癌免疫的活化。但是，对于细胞因子GM-CSF来说，除了分化诱导作为癌抗原提呈细胞的树突细胞这样的抗癌免疫活化作用以外(非专利文献1)，还报道了其在高用量下可能诱导免疫抑制系细胞而使抗癌免疫功能减弱，从而使病情恶化(非专利文献4)，这一点可能限制了T-VEC的治疗效果。

即，鉴于现有的使用条件复制型病毒的针对癌症的药品中的这些问题，希望开发出更为有效的该药品。作为用于解决上述问题的条件复制型腺病毒，已经报道了包含各种突变的条件复制型腺病毒(专利文献1和2以及非专利文献5～10)。

另一方面，作为与细胞永生化相关的基因，已知有REIC(REIC/Dkk-3)基因，据报道在癌细胞中该基因的表达受到抑制，还报道了将REIC基因用于癌症治疗(专利文献3)。REIC具有活化抗癌免疫的作用、在基因表达时通过内质网应激而对癌细胞诱导细胞死亡的作用。另外，还报道了REIC基因的部分片段与全长REIC具有同样的效果(专利文献4)，此外还报道了表达REIC/Dkk-3基因的腺病毒(专利文献5和非专利文献11)。

现有技术文献

专利文献

专利文献1：日本专利第4327844号公报

专利文献2：日本特表2008-531010号公报

专利文献3：国际公开第WO2001/038523号

专利文献4：国际公开第WO2012/002582号

专利文献5：国际公开第WO2012/161352号

非专利文献

非专利文献1：R.V.Dave et al.,Surgeon 2014,Feb 4

非专利文献2：John Nemunaitis et al.,Molecular Therapy,Vol.18,No.2,429-434,Feb.2010

非专利文献3：Neil N.Senzer et al.,Journal of Clinical Oncology,Vol.27,No.34,December 1,2009,5763-5771

非专利文献4：G.Parmiani et al.,Annals of Oncology 18；226-232,2007

非专利文献5：Oh-Joon Kwon et al.,Clin Cncer Res；16(24)December 15,2010

非专利文献6：Eunhee Kim et al.,Human Gene Therapy 14：1415-1428(October10,2003),1415-1427

非专利文献7：Candelaria Gomez-Manzano et al.,Onvogene(2004)23,1821-1828

非专利文献8：Jaesung Kim et al.,Cancer Gene Therapy(2002)9,725-736

非专利文献9：I-K Choi et al.,Gene Therapy(2010)17,190-201

非专利文献10：Hao Wu et al.,J Gene Med 2011；13：658-669

非专利文献11：Watanabe M et al.,Oncology Letters 7：595-601,2004

发明内容

发明所要解决的课题

本发明的目的在于提供具有强抗癌作用的条件复制型腺病毒。

用于解决课题的手段

本发明人通过将以往报道的条件复制型腺病毒的技术组(上述专利文献1和2以及非专利文献5～10)有效地组合而制作出独创的条件复制型腺病毒。进一步，将表达具有独特的抗癌免疫活化作用的REIC蛋白质(上述非专利文献11)的REIC基因新编码到该腺病毒中。由此，成功地开发出兼具独创性和新颖性、并且可期待具有凌驾于使用现有的条件增殖件复制型病毒的针对癌症的药品组之上的抗癌作用、创造性高的抗癌病毒制剂，从而完成了本发明。

即，本发明如下所述。

[1]一种在癌细胞中特异性地增殖并表达REIC蛋白质或REIC C结构域蛋白质的条件复制型腺病毒，其是在包含5型腺病毒基因组的ITR(inverted terminal repeart，末端反向重复)序列并插入有HRE序列、hTERT启动子、编码核心蛋白多糖的DNA和编码包含RGD序列的肽的DNA条件的复制型腺病毒中进一步插入全长REIC DNA或REIC C结构域DNA而成的。

[2]如[1]所述的条件复制型腺病毒，其中，在5型腺病毒的E3区域中插入有由启动子序列、编码核心蛋白多糖的DNA和多聚A附加序列构成的DNA构建体。

[3]如[1]或[2]所述的条件复制型腺病毒，其中，

(i)hTERT启动子是通过附加c-Myc结合位点和Sp1结合位点而进行了修饰的hTERT启动子，

(ii)在hTERT启动子的上游插入有6个含有由序列编号3所表示的碱基序列构成的HRE序列，

(iii)属于E1A区域的一部分的、序列编号4所表示的5型腺病毒基因组序列的Rb结合区域(视网膜母细胞瘤基因结合区域)缺失，

(iv)属于E1B区域的一部分的、序列编号4所表示的5型腺病毒基因组序列的编码E1B-19kDa的部分缺失，

(v)E3区域的一部分缺失，

(vi)在E3区域中插入有由启动子序列、编码核心蛋白多糖的DNA和多聚A附加序列构成的DNA构建体，

(vii)在E3区域中插入有编码包含RGD序列的肽的DNA，并且

(viii)在E1区域中插入有由CMV启动子序列、编码REIC或REIC C结构域的DNA和多聚A附加序列构成的DNA构建体。

[4]如[3]所述的条件复制型腺病毒，其中，

(iii)属于E1A区域的一部分的、序列编号4所表示的5型腺病毒基因组序列的第923～946位的作为Rb结合区域(视网膜母细胞瘤基因结合区域)的24个碱基缺失，

(iv)属于E1B区域的一部分的、序列编号4所表示的5型腺病毒基因组序列的第1722～1986位的编码E1B-19kDa的部分的碱基缺失，

(v)属于E3区域的一部分的、序列编号4所表示的5型腺病毒基因组序列的第28592～30479位的碱基缺失。

[5]如[1]～[4]中任一项所述的条件复制型腺病毒，其中，REIC为全长REIC。

[6]如[1]～[4]中任一项所述的条件复制型腺病毒，其中，REIC为REIC的C结构域。

[7]一种癌症治疗剂，其包含[1]～[6]中任一项所述的条件复制型腺病毒作为有效成分。

[8]如[7]所述的癌症治疗剂，其中，条件复制型腺病毒在癌细胞中特异性地增殖并表达REIC蛋白质，所表达的REIC蛋白质通过内质网应激诱导癌细胞的细胞死亡，进而REIC蛋白质诱导全身性的抗癌免疫活性。

本说明书中包含作为本申请的优先权基础的日本专利申请2014-110672号的说明书和/或附图中记载的内容。

发明的效果

本发明的条件复制型腺病毒对现有的条件复制型腺病毒进行改良，具有比现有的条件复制型腺病毒更强的抗癌作用。进一步插入有REIC DNA的该条件复制型腺病毒不仅具有条件复制型腺病毒本身的抗癌作用，而且还兼具活化REIC的抗癌免疫的作用、在基因表达时通过内质网应激而对癌细胞诱导细胞死亡的作用，这些作用协作，对癌症发挥出协同的强治疗效果。

附图说明

图1是表示溶瘤腺病毒的结构的图。

图2是表示m-hTERT启动子的序列的图。

图3是表示通过添加溶瘤腺病毒而产生的各细胞中的REIC蛋白质的表达的图。

图4是表示通过添加溶瘤腺病毒(溶瘤Ad和溶瘤Ad-REIC)而引起的各细胞中的细胞死亡诱导率的图。

图5是表示在施用溶瘤腺病毒(溶瘤Ad和溶瘤Ad-REIC)的情况下各小鼠中的肿瘤体积的变化的图。

图6是表示在施用溶瘤腺病毒(溶瘤Ad和溶瘤Ad-REIC)的情况下各小鼠中的NK细胞诱导的图。

图7是利用肿瘤浸润淋巴细胞(TIL)的分析结果来表示在施用溶瘤腺病毒(溶瘤Ad和溶瘤Ad-REIC)的情况下的抗原特异性免疫应答诱导的图。

具体实施方式

以下详细说明本发明。

本发明涉及包含REIC(REIC/Dkk-3)DNA、能够用于REIC蛋白质的表达的条件复制型腺病毒。

条件复制型腺病毒是指进行了基因改造而仅在癌细胞中增殖的腺病毒。其不作用于正常细胞而仅在癌细胞中增殖，使癌细胞溶解，能够有效地杀死癌细胞。条件复制型腺病毒也称为溶瘤(oncolytic)腺病毒或溶解性腺病毒。另外，由于本发明的条件复制型腺病毒可以插入外源基因来使用，因而也可以称为条件复制型腺病毒载体。

在本发明中，在条件复制型腺病毒中导入全长REIC DNA或REIC DNA片段，不仅可以发挥出上述条件复制型腺病毒本身的杀癌细胞效果，而且还可以通过活化抗癌免疫的效果、在基因表达时通过内质网应激而对癌细胞诱导细胞死亡的效果等REIC针对癌细胞的效果而发挥出协同的杀癌细胞效果。

在本发明中，将条件复制型腺病毒称为溶瘤腺病毒(溶瘤Ad)，将包含全长REICDNA、可表达全长REIC的条件复制型腺病毒称为溶瘤Ad-REIC，将包含REIC C结构域DNA、可表达REIC C结构域的条件复制型腺病毒称为溶瘤Ad-REIC结构域。

本发明中使用的条件复制型腺病毒具有利用人端粒酶逆转录酶(hTERT)启动子来限制增殖的5型腺病毒的骨架。本发明的条件复制型腺病毒的特征在于，包含5型腺病毒的ITR(inverted terminal repeat，末端反向重复序列)、进而包含编码核心蛋白多糖(其是抑制肿瘤的形成和生长的蛋白质)的DNA，并进行了其他修饰(特定序列的插入和缺失)。核心蛋白多糖DNA利用CMV启动子进行表达。5型腺病毒的基因组序列记载于Virology,186(1),1992,pp.280-285中，另外以GenBank登记号M73260进行了登记。5型腺病毒的基因组序列示于序列编号4。腺病毒的基因组在两端具有ITR(末端反向重复序列)，从5’侧起依次具有E1A区域、E1B区域、E2区域、E3区域和E4区域作为早期转录区域。

下面示出本发明的条件复制型腺病毒的特征。

(1)包含5型腺病毒的ITR(末端反向重复序列)。ITR是由100～200个碱基构成的、在腺病毒DNA的DNA复制和包装中必须的元件。

(2)包含人端粒酶逆转录酶(hTERT)启动子。hTERT启动子含有在5型腺病毒基因组的E1区域的上游，例如连接在紧靠E1区域的上游。hTERT启动子优选进行了修饰。将修饰后的hTERT启动子称为m-hTERT启动子。修饰后的hTERT启动子包含1个以上的c-Myc结合位点(cacgtg、cacgcg或catgcg)和/或1个以上的Sp1结合位点(gggcgg、ccgccc、ctccgcctc、cccagcccc、gggcgg、ggggcgg或cccccgcccc(序列编号1)。在野生型hTERT启动子中包含2个c-Myc结合位点和5个Sp1结合位点。本发明的条件复制型腺病毒的hTERT启动子例如进一步附加有1个c-Myc结合位点和5个Sp1结合位点，合计包含3个c-Myc结合位点和10个Sp1结合位点。c-Myc结合位点和Sp1结合位点可以含有在hTERT启动子的3’末端，也可以含有在5’末端，此外还可以含有在hTERT启动子序列的内部。图2和序列编号2中示出了修饰后的hTERT启动子的一例的序列。图1中“E-box”表示c-Myc结合序列。为了制造在hTERT启动子中进一步包含1个c-Myc结合位点和5个Sp1结合位点的m-hTERT启动子(序列编号2)，例如，使包含1个c-Myc结合位点和5个Sp1结合位点的hTERT启动子与存在有2个c-Myc结合位点和5个Sp1结合位点的野生型hTERT启动子结合即可。为此，首先将包含1个c-Myc结合位点和5个Sp1结合位点的pGL2-hTERT载体利用EcoRI和HindIII进行切割，之后插入到利用同种限制酶处理后的pSEAP-TERT中来制造pSEAP-mTERT即可。关于该修饰后的hTERT启动子，记载在日本专利第4327844号公报和EUNHEE KIM et al.,Human Gene Therapy 14:1415-1428(October10,2003)中。

(3)包含缺氧反应元件(Hypoxia Responsive Element：HRE)。HRE是在缺氧状态(hypoxia)下被活化的基因所具有的响应缺氧状态的DNA元件，其包含ACGTG作为共有序列。本发明中使用的条件复制型腺病毒含有包含上述共有序列的5～40个碱基的序列。在正常组织中氧浓度为2％～9％左右，但癌细胞处于氧浓度为约1.3％的缺氧状态。因此，包含HRE的条件复制腺病毒在癌细胞中增殖得到促进。作为HRE序列，例如可以举出人血管内皮细胞生长因子(human vascular endothelial growth factor：hVEGF)基因(GenBank登记号M63971)的包含上述共有序列的序列，具体地说，可以举出hVEGF基因的从第1379位碱基到第1412位碱基的碱基序列(序列编号3)。HRE可以多个连接来使用，可以将3～12个连接来使用，例如可以使用6个连接而成的序列(HRE×6)或12个连接而成的序列(HRE×12)(Oh-JoonKwon et al.,Clin Cancer Res；16(24)December 15,2010,pp.60716082)。优选使用6个连接而成的序列(HRE×6)。HRE连接在hTERT启动子的上游、例如连接在紧靠其上游即可。

(4)E1A区域部分缺失。E1A区域存在于5型腺病毒基因组(序列编号4)的第342位～第1545位，E1A蛋白质与RB(视网膜母细胞瘤)基因产物结合。E1A区域是腺病毒的复制所必须的区域，本发明的条件复制型腺病毒的E1A区域的Rb结合区域(视网膜母细胞瘤基因结合区域)缺失，复制能力本身得以保持。本发明的条件复制型腺病毒中的E1A区域的部分缺失是指包含突变的活性E1A基因。此处，关于突变的活性E1A基因，在编码Rb(视网膜母细胞瘤蛋白质)结合位点的核苷酸序列中，具有第45位Glu残基被Gly置换的突变和第121～127位氨基酸序列整体被Gly置换的突变。在肿瘤细胞中，不仅有p53蛋白质的突变，而且有Rb的突变或者Rb关联信号机制的相当部分受到损伤，因而对于与Rb的结合能力消失的腺病毒来说，在正常细胞中，腺病毒的复制由于Rb的活性而受到抑制，但在Rb的功能受到抑制的肿瘤细胞中，腺病毒活跃地复制，可以选择性地杀伤癌细胞。因此，上述包含Rb结合位点的突变的本发明的重组腺病毒的癌细胞特异性非常大幅地增大。另外，Rb结合位点的突变例如也可以为属于E1A区域的一部分的、序列编号4所表示的5型腺病毒基因组序列的第923～946位的作为Rb结合区域(视网膜母细胞瘤基因结合区域)的24个碱基缺失(ΔE1A(24bp))(Candelaria Gomez-Manzano et al.,Oncogene(2004)23,pp.1821-1828)。

(5)E1B区域部分缺失。E1B区域存在于5型腺病毒基因组(序列编号4)的第1714位～第3509位，作为E1B区域的基因产物的E1B-55kDa蛋白质通过与p53蛋白质结合而参与病毒的复制。E1B区域的部分缺失也称为在E1B区域具有非活化部分，本发明的条件复制型腺病毒具有非活化的E1B 19kDa基因、E1B 55kDa基因或E1B19kDa/E1B 55kDa基因，优选具有非活化的E1B 19kDa和E1B 55kDa基因。在本说明书中，与基因关联使用的术语“非活化”是指，该基因未被正常地转录和/或解读，未表现出由该基因编码的正常蛋白质的功能。例如，非活化E1B 19kDa基因是在该基因中发生突变(置换、附加、部分缺失或整体缺失)而无法生成活性E1B 19kDa蛋白质的基因。在E1B 19kDa基因缺失的情况下，可以增加细胞凋亡能力，在E1B 55kDa基因缺失的情况下，具有肿瘤细胞特异性(韩国专利申请第100528727号)。例如，可以使属于E1B区域的一部分的、序列编号4所表示的5型腺病毒基因组序列的第1722～1986位的碱基缺失。由于该碱基序列的缺失，编码作为55kDa的E1B蛋白质的反式剪接产物的19kDa的E1B-19kDa的部分缺失，因此，将该缺失称为ΔE1B(19kDa)(Jaesung Kim etal.,Cancer Gene Therapy(2002)9,pp.725-736)。另外，也可以导入终止密码子使得仅E1B区域的E1B(19kDa)不表达。

(6)E3区域缺失。编码E3蛋白质的DNA的全部或一部分可以缺失。E3区域存在于5型腺病毒基因组(序列编号4)的第27858位～第30839位。E3区域对于腺病毒的增殖是不需要的，可以在E3区域中插入外源基因。此时，使E3区域部分缺失并在该部分插入外源基因即可。例如，可以使属于E3区域的一部分的、序列编号4所表示的5型腺病毒基因组序列的第28592～30479位的碱基缺失(ΔE3)。可以在该部分插入例如后述的编码核心蛋白多糖的DNA。

(7)插入有编码核心蛋白多糖(Decorin：DCN，其是抑制肿瘤的形成和生长的蛋白质)的DNA。核心蛋白多糖是属于SLRP(small leucin rich proteoglycan，富含亮氨酸小分子蛋白多糖)的蛋白质，由10～12个富含亮氨酸重复序列构成，核心部位呈拱形，与细胞外基质中存在的多种生长因子或核心蛋白多糖受体结合。核心蛋白多糖通过抑制肿瘤生长因子(TGF-β)的活性而防止胶原蛋白的纤维化，参与细胞外基质的构成(matrix assembly)，抑制肿瘤细胞的生长，作为肿瘤的形成和生长中的天然拮抗剂(antagonist)发挥作用。通过在条件复制型腺病毒中导入核心蛋白多糖，容易将其导入到癌细胞中，杀肿瘤细胞活性增加。在本发明的条件复制型腺病毒中，在编码核心蛋白多糖的DNA的上游连接启动子，在编码核心蛋白多糖的DNA的下游连接多聚A附加序列(多聚腺苷酸化序列、polyA)。启动子是优选在动物细胞中、更优选在哺乳动物细胞中起作用的可调节核心蛋白多糖基因的转录的启动子，包括哺乳动物病毒来源的启动子和哺乳动物细胞的基因组来源的启动子，例如包括U6启动子、H1启动子、CMV(Cytomegalo virus，巨细胞病毒)启动子、腺病毒晚期启动子、痘苗病毒7.5K启动子、SV40启动子、HSV的tk启动子、RSV启动子、EF1α启动子、金属硫蛋白启动子、β-肌动蛋白启动子、人IL-2基因的启动子、人IFN基因的启动子、人IL-4基因的启动子、人淋巴毒素基因的启动子、人GM-CSF基因的启动子、诱导型(inducible)启动子、癌细胞特异性启动子(例如，TERT启动子、PSA启动子、PSMA启动子、CEA启动子、E2F启动子和AFP启动子)和组织特异性启动子(例如，白蛋白启动子)，但并不限于此。优选使用CMV启动子或癌细胞特异性启动子。在使用癌细胞特异性启动子的情况下，优选利用TERT启动子或E2F启动子。作为TERT(telomere reverse transcriptase，端粒酶逆转录酶)启动子，可以使用野生型人hTERT(human telomere reverse transcriptase，人端粒酶逆转录酶)启动子或上述(2)的m-hTERT启动子。多聚A附加序列(多聚腺苷酸化序列、polyA)的来源没有限定，可以举出生长激素基因来源的多聚A附加序列，例如牛生长激素基因来源的多聚A附加序列(BGHpolyA)、人生长激素基因来源的多聚A附加序列、SV40病毒来源的多聚A附加序列、人或兔的β球蛋白基因来源的多聚A附加序列等。通过使DNA构建体包含多聚A附加序列，转录效率增大。

关于包含编码核心蛋白多糖的DNA的腺病毒，记载于日本特开2008-531010号公报、I-K Choi et al.,Gene Therapy(2010)17,190-201中。编码核心蛋白多糖的DNA的碱基序列(GenBank登记号NM_001920.3)示于序列编号5中。另外，CMV启动子的碱基序列(GenBank登记号X17403)示于序列编号6中、BGH polyA附加序列的碱基序列(GenBank登记号M57764)示于序列编号7中。

包含编码核心蛋白多糖的DNA的由启动子序列、编码核心蛋白多糖的DNA和多聚A附加序列构成的DNA构建体可以插入到E1A区域、E1B区域或E3区域，优选插入到E3区域。如下所述，在本发明的腺病毒载体中，5型腺病毒基因组的E1A区域、E1B区域和E3区域部分缺失。可以将CMV启动子、编码核心蛋白多糖的DNA和多聚A附加序列按照该顺序连接而成的DNA构建体插入到该缺失部分。例如，可以通过对上述DNA构建体进行同源重组而使E1A区域、E1B区域和E3区域部分缺失，同时将其插入到5型腺病毒基因组中。例如可以插入到上述(6)的使序列编号4所表示的5型腺病毒基因组序列的第28592～30479位的碱基缺失的部分。

(8)插入有编码包含RGD(Arg-Gly-Asp)序列的肽的DNA。作为包含RGD序列的肽，可以举出包含RGD的由4(GRGDS(序列编号8)等)～15个氨基酸构成的肽，例如可以举出由CDCRGDCFC(序列编号9)、GSCDCRGDCFCSG(序列编号10)表示的肽。编码包含RGD序列的肽的DNA例如可以插入到E3区域中，具体地说，可以插入到5型腺病毒基因组E3区域的第32676位碱基与第32677位碱基之间。通过包含编码包含RGD序列的肽的DNA，容易将条件复制型腺病毒导入到癌细胞中。关于包含RGD序列的腺病毒，例如记载于Hao Wu et al.,J Gene Med2011；13:658-669中。

具有上述特征(1)～(8)的本发明的条件复制型腺病毒具有包含5型腺病毒基因组的ITR(末端反向重复序列)序列并插入有HRE序列、hTERT启动子、编码核心蛋白多糖的DNA和编码包含RGD序列的肽的DNA的结构。

本发明的条件复制型腺病毒的结构的示例示于图1A。图1D中图示出本发明的条件复制型腺病毒由野生型5型腺病毒的突变，此外还图示出核心蛋白多糖DNA和REIC DNA的插入位置。图1B和图1C示出插入有REIC DNA的条件复制型腺病毒的结构。图1A所示的条件复制型腺病毒的结构是在图1D所示的结构中在E3区域插入了将CMV启动子、编码核心蛋白多糖的DNA和多聚A附加序列按照该顺序连接而成的DNA构建体。在图1A所示结构的条件复制型腺病毒中，5型腺病毒基因组的E1A区域的一部分缺失、E1B区域的一部分缺失、进而E3区域的一部分缺失，在E1A区域的上游包含HRE序列和修饰后的hTERT启动子，在E3区域的下游包含编码包含RGD序列的肽的DNA，进而在E3区域包含由启动子、编码核心蛋白多糖的DNA和多聚A序列构成的构建体。

例如，图1A所示的本发明的条件复制型腺病毒具有以下的结构特征。

(i)hTERT启动子是通过附加c-Myc结合位点和Sp1结合位点而进行了修饰的hTERT启动子。

(ii)在hTERT启动子的上游插入有6个由序列编号3所表示的碱基序列构成的HRE序列。

(iii)属于E1A区域的一部分的、序列编号4所表示的5型腺病毒基因组序列的Rb结合区域(视网膜母细胞瘤基因结合区域)缺失。例如，序列编号4所表示的5型腺病毒基因组序列的第923～946位的作为Rb结合区域(视网膜母细胞瘤基因结合区域)的24个碱基缺失。

(iv)属于E1B区域的一部分的、序列编号4所表示的5型腺病毒基因组序列的编码E1B-19kDa的部分的碱基缺失。例如，序列编号4所表示的5型腺病毒基因组序列的第1722～1986位的编码E1B-19kDa的部分的碱基缺失。

(v)E3区域的一部分缺失。例如，序列编号4所表示的5型腺病毒基因组序列的第28592～30479位碱基缺失。

(vi)在E3区域插入有由启动子序列、编码核心蛋白多糖的DNA和多聚A附加序列构成的DNA构建体。

(vii)在E3区域插入有编码包含RGD序列的肽的DNA。

另外，在E1A区域、E1B区域或E3区域中可以具有用于插入外源基因的多克隆位点(插入位点)。在该多克隆位点可以插入后述的REIC DNA等外源基因。

上述各元件需要进行功能性连接。此处，功能性连接是指按照各元件发挥出其功能、使所要表达的基因的表达增强的方式进行连接。

例如，本发明的条件复制型腺病毒具有由ITR-ΔE1A-ΔE1B-启动子-核心蛋白多糖DNA-多聚A附加序列-RGD序列-ITR表示的结构，在缺失的E3区域中插入有由“启动子-核心蛋白多糖DNA-多聚A附加序列”构成的构建体。这样的条件复制型腺病毒的结构(基因图谱)示于图1中。

通过在上述的条件复制型腺病毒(溶瘤Ad)中插入全长REIC DNA或REIC C结构域DNA，可以制作溶瘤Ad-REIC或溶瘤Ad-REIC结构域。

REIC DNA的碱基序列由序列编号11表示。另外，REIC DNA所编码的REIC蛋白质的氨基酸序列由序列编号12表示。本发明中，有时也将REIC称为REIC/Dkk-3。

另外，REIC C结构域DNA的碱基序列由序列编号13表示，该结构域所编码的REIC C结构域蛋白质的氨基酸序列由序列编号14表示。

另外，本发明的条件复制型腺病毒中所含有的REIC DNA或REIC C结构域DNA是下述DNA中的编码具有活化抗癌免疫的作用、在基因表达时通过内质网应激而对癌细胞诱导细胞死亡的作用的蛋白质的DNA，所述DNA为：在严格条件下与具有序列编号11或13所表示的碱基序列的互补碱基序列的DNA杂交的DNA；在使用BLAST(Basic Local AlignmentSearch Tool at the National Center for Biological Information(美国国家生物信息中心的基于局部比对算法的检索工具))等(例如，使用默认值即初期设定的参数)进行计算时，与序列编号11或13所表示的碱基序列具有至少85％以上、优选90％以上、进一步优选95％以上、特别优选97％以上的序列同一性的DNA；或者，编码由在上述DNA所编码的蛋白质的氨基酸序列中有1个或多个或者几个(1～10个、优选为1～5个、进一步优选为1个或2个)氨基酸发生了置换、缺失和/或附加的氨基酸序列构成的蛋白质的DNA；等等。此处，所谓“严格条件”例如为“1×SSC、0.1％SDS、37℃”程度的条件，作为更严格的条件，为“0.5×SSC、0.1％SDS、42℃”程度的条件，作为进一步严格的条件，为“0.2×SSC、0.1％SDS、65℃”程度的条件。如此，杂交条件越严格，越可望分离出与探针序列具有高同源性的DNA。但是，上述的SSC、SDS和温度条件的组合为例示，可以通过适当组合探针浓度、探针长度、杂交反应的反应时间等来实现所需要的严格度。关于“严格条件”，本领域技术人员可以以序列同一性高的DNA进行杂交的条件来适当确定。此外，本发明的DNA构建体中所含有的REIC的DNA为编码序列编号2所表示的蛋白质的DNA。

REIC DNA或REIC C结构域DNA可以基于序列编号11～14的序列信息由人细胞、人组织等得到。

在全长REIC DNA或REIC C结构域DNA的上游连接CMV(cytomegarovirus，巨细胞病毒)启动子，在下游连接多聚A附加序列(多聚腺苷酸化序列、polyA)。多聚A附加序列(多聚腺苷酸化序列、polyA)的来源没有限定，可以举出生长激素基因来源的多聚A附加序列，例如牛生长激素基因来源的多聚A附加序列(BGA polyA)或人生长激素基因来源的多聚A附加序列、SV40病毒来源的多聚A附加序列、人或兔的β球蛋白基因来源的多聚A附加序列等。通过使DNA构建体中包含多聚A附加序列，转录效率增大。CMV启动子的碱基序列(GenBank登记号X17403)示于序列编号6中、BGH polyA附加序列的碱基序列(GenBank登记号M57764)示于序列编号7中。

包含编码REIC或REIC C结构域的DNA的、由CMV启动子序列、编码REIC或REIC C结构域的DNA和多聚A附加序列构成的DNA构建体可以插入到E1A区域、E1B区域或E3区域，优选插入到E1区域(E1A或E1B区域)。例如，可以通过对上述DNA构建体进行同源重组而插入到5型腺病毒基因组的E1A区域、E1B区域或E3区域。

例如，可以插入到上述的条件复制型腺病毒的E1区域中。在进行同源重组时，可以仅插入包含编码REIC或REIC C结构域的DNA的、由CMV启动子序列、编码REIC或REIC C结构域的DNA和多聚A附加序列构成的DNA构建体，也可以通过同源重组插入作为包含E1区域的构建体的、在E1区域中插入包含REIC DNA或REIC C结构域DNA的DNA构建体并且使E1A区域的一部分和E1B区域的一部分缺失的构建体。通过该同源重组，能够使5型腺病毒的E1A区域和E1B区域部分缺失(ΔE1A(24bp)和ΔE1B(19kDa))，同时能够在5型腺病毒中插入包含REIC DNA或REIC C结构域DNA的DNA构建体。

例如，具体地说，可以通过同源重组插入到序列编号4所表示的5型腺病毒基因组序列的第342位与第3522位碱基之间。包含编码REIC或REIC C结构域的DNA的、由CMV启动子序列、编码REIC或REIC C结构域的DNA和多聚A附加序列构成的DNA构建体例如可以使用作为E1穿梭载体的pE1sp1B-HmT-Rd19/CMV-REIC-polA((左侧同源部分：22-341)(右侧同源部分：3523-5790))，通过同源重组插入到E1区域。通过使用该穿梭载体，在5型腺病毒基因组序列的第342位～3522位插入下述的DNA构建体。

在E1区域插入有由CMV启动子序列、编码REIC或REIC C结构域的DNA和多聚A附加序列构成的DNA构建体、并且E1A区域的Rb结合位点缺失、编码E1B区域的E1B-19kDa的部分缺失的构建体。

其结果，能够使5型腺病毒的E1A区域和E1B区域部分缺失(ΔE1A(24bp)和ΔE1B(19kDa))，同时能够在5型腺病毒中插入由CMV启动子序列、编码REIC或REIC C结构域的DNA和多聚A附加序列构成的DNA构建体。

另外，例如，可以将由CMV启动子序列、编码REIC或REIC C结构域的DNA和多聚A附加序列构成的DNA构建体插入到5型腺病毒基因组序列的第3524位与第3525位之间、或第3523位与第3524位之间。

插入了编码REIC或REIC C结构域的DNA的条件复制型腺病毒的结构示于图1B(溶瘤Ad-REIC)和图1C(溶瘤AD-REIC结构域)。图1B和图1C所示的结构中，在图1A所示结构的条件复制型腺病毒(溶瘤Ad)的E1区域中在3524的位置插入有由CMV启动子序列、编码REIC或REIC C结构域的DNA和多聚A附加序列构成的DNA构建体。

本发明的条件复制型腺病毒(溶瘤Ad)、包含全长REIC DNA的条件复制型腺病毒(溶瘤Ad-REIC)或包含REIC C结构域DNA的条件复制型腺病毒(Ad-REIC C结构域)可以按照上述记载和引用的文献的记载进行制作。

通过将本发明的条件复制型腺病毒(溶瘤Ad)施用于作为人或其他哺乳动物的被测体，其被输送至被测体的癌细胞，在癌细胞中增殖，消灭癌细胞。

另外，通过将本发明的包含全长REIC DNA的条件复制型腺病毒(溶瘤Ad-REIC)和包含REIC C结构域DNA的条件复制型腺病毒(溶瘤Ad-REC结构域)施用于作为人或其他哺乳动物的被测体，其被输送至被测体的癌细胞。在溶瘤腺病毒的作用下消灭癌细胞，同时全长REIC蛋白质或REIC C结构域蛋白质在癌细胞中表达，通过表达时的内质网应激而对癌细胞选择性地诱导细胞死亡并且活化癌免疫，抑制肿瘤细胞增殖，发挥出癌症治疗效果。另外，基于REIC的抗癌免疫活性不仅局部作用于癌细胞，而且还带来全身的强抗癌免疫活化。对于包含全长REIC DNA的条件复制型腺病毒(溶瘤Ad-REIC)和包含REIC C结构域DNA的条件复制型腺病毒(溶瘤Ad-REC结构域)而言，条件复制型腺病毒本身的杀癌效果与REIC的抗癌免疫活性等所带来的抗癌效果协同作用，可以得到更强的抗癌效果。本发明包括包含这样的条件复制型腺病毒(溶瘤Ad、溶瘤Ad-REIC、溶瘤Ad-REIC结构域)的癌症治疗用病毒制剂。作为治疗对象的癌症没有限定，例如可以举出脑/神经肿瘤、皮肤癌、胃癌、肺癌、肝癌、淋巴瘤/白血病、结肠癌、胰腺癌、肛门/直肠癌、食道癌、子宫癌、乳腺癌、肾上腺癌、肾癌、肾盂输尿管癌、膀胱癌、前列腺癌、尿道癌、阴茎癌、睾丸癌、骨瘤/骨肉瘤、平滑肌瘤、横纹肌瘤、间皮瘤等。本发明的条件复制型腺病毒(溶瘤Ad、溶瘤Ad-REIC、溶瘤Ad-REIC结构域)既可用于原发性癌的治疗、也可用于转移性癌的治疗。

本发明的条件复制型腺病毒(溶瘤Ad、溶瘤Ad-REIC、溶瘤Ad-REIC结构域)可以通过基因治疗领域中可使用的方法、例如静脉内施用或动脉内施用等血管内施用、口服施用、腹腔内施用、胸腔内施用、气管内施用、支气管内施用、皮下施用、经皮施用等进行施用。

本发明的条件复制型腺病毒(溶瘤Ad、溶瘤Ad-REIC、溶瘤Ad-REIC结构域)以治疗有效量进行施用即可。基因治疗领域的本领域技术人员可以容易地确定治疗有效量。此外，施用量可根据被测者的病情的严重程度、性别、年龄、体重、习惯等来适当变更。包含制剂领域中通常使用的载体、稀释剂、赋形剂。例如，作为片剂用的载体、赋形剂，使用乳糖、硬脂酸镁等。作为注射用的水性液，使用生理盐水、含有葡萄糖或其他辅助药的等渗液等，也可以与适当的助溶剂例如醇、丙二醇等多元醇、非离子表面活性剂等合用。作为油性液，使用芝麻油、大豆油等，作为助溶剂，可以合用苯甲酸苄酯、苯甲醇等。

实施例

通过以下的实施例具体地说明本发明，但本发明并不受这些实施例的限定。

实施例1溶瘤腺病毒(Oncolytic Adenovirus：Oncolytic Ad)的制作

为了制作在E1区域和E3区域分别表达REIC或REIC C结构域(REIC-C)以及核心蛋白多糖(DCN)的溶瘤腺病毒，首先制作了表达REIC或REIC C的pCA14Ad E1穿梭载体。使用NheI-blunt-HindIII由pShuttole/REIC或REIC-C切出REIC或REIC C基因，亚克隆到预先利用XbaI-blunt-HindIII消化过的pCA14Ad E1穿梭载体中。将pCA14/REIC和pCA14/REIC-C载体利用BglII进行消化，接着将CMV-REIC-polA和AMV-REIC-C-polA表达盒克隆到预先利用BglII消化过的pΔE1sp1B-HmT-Rd19穿梭载体(Kim E et al.,Hum Gene Ther 2003；14:1415-1428；Kim JH et al.,J Natl Cancer Inst2006；98:1482-1493)中，得到pΔE1sp1B-HmT-Rd19/REIC和pΔE1sp1B-HmT-Rd19/REIC-C腺病毒E1穿梭载体。将pSP72-E3/DCN(I-KChoi et al.,Gene Therapy 2010；17:190-201.)E3穿梭载体使用XmnI线性化，与利用SpeI线性化的腺病毒总载体del-RGD一起共转化BJ5183大肠杆菌株，进行同源重组。其结果，得到了无复制能力的腺病毒载体del-RGD/DCN。将新构建的pΔE1sp1B-HmT-Rd19/REIC和pΔE1sp1B-HmT-Rd19/REIC-C腺病毒E1穿梭载体通过XmnI消化进行线性化，接着与利用BstBI消化后的de1-RGD/DCN一起共转化BJ5183大肠杆菌株，进行同源重组。其结果，得到了表达REIC或REIC-C以及核心蛋白多糖的肿瘤特异性溶瘤腺病毒。将质粒DNA利用PacI进行消化，导入到293A细胞中使其增殖。

腺病毒的提纯、滴度测定和品质分析按照Yoo JY et al.,Mol Ther 2007；15:295-302的记载进行。

将不包含REIC的溶瘤腺病毒载体称为溶瘤Ad、将包含全长REIC DNA的溶瘤腺病毒载体称为溶瘤Ad-REIC、将包含REIC C结构域DNA的溶瘤腺病毒载体称为溶瘤Ad-REIC结构域。

实施例2溶瘤Ad、溶瘤Ad-REIC和溶瘤Ad-REIC结构域的添加所致的各种细胞中的REIC蛋白质的表达

方法

为了测定Ad-REIC处理后的REIC蛋白质表达，将细胞接种到平底6孔板中温育24小时。以图中记载的MOI(multiplicity of infection，感染复数)使腺病毒在完全培养基(300μl)中对细胞进行1小时感染处理，利用PBS(phosphate buffered saline，磷酸盐缓冲生理盐水)清洗2次，使用溶解缓冲液(50mM HEPES、pH 7.4、250mM NaCl、1mM EDTA、1％NP-40、1mM DTT、1mM PMSF、5μg/ml亮抑酶肽、5μg/ml抑肽酶、2mM Na₃VO₄、1mM NaF、10mMβ-GP)进行溶解，提取出REIC蛋白质。

离心分离后，将上清用相同体积的4×SDS样品缓冲液稀释，在95℃加热5分钟。将样品(蛋白质5μg)在10％SDS-PAGE凝胶上分离，电泳转印至聚偏二氟乙烯(PVDF)膜上。使用含有5％脱脂奶粉、0.1％Tween-20的TBS(Tris缓冲生理盐水)将转印后的印迹(blot)在室温下封闭1小时。接着，与小鼠单克隆抗人REIC/Dkk-3抗体(1:1000稀释)(一次抗体)反应，利用含有0.1％Tween-20的TBS(T-TBS)充分清洗后，与利用辣根过氧物酶进行了标记的二次抗体反应。进一步利用T-TBS清洗后，使用作为化学发光检测法试剂盒的ECL试剂盒(Amersham Pharmacia Biotech，钱德勒，AZ)进行显色。通过Western印迹法在60kDa附近确认到REIC蛋白质的条带。

结果

图3中示出了溶瘤Ad(腺病毒)、溶瘤Ad-REIC、溶瘤Ad-REIC结构域的添加所致的各种细胞中的REIC蛋白质在Western印迹法分析中的表达。

通过在各种细胞中添加溶瘤Ad-REIC，能够进行与现有的Ad-REIC同等或其以上水平的REIC蛋白质的表达。由于REIC蛋白质确认到了在生物体内活化抗癌免疫的作用(WO2009/119874号公报)，因此，对于溶瘤Ad-REIC也可以期待在生物体内活化抗癌免疫的作用。

实施例3溶瘤Ad和溶瘤Ad-REIC的添加所致的各种细胞中的细胞死亡诱导率的确认

方法

为了研究Ad-REIC处理后的杀细胞率，将细胞接种到平底6孔板中温育24小时。以图中记载的MOI(multiplicity of infection，感染复数)使腺病毒在完全培养基(300μl)中对细胞进行1小时处理，添加新鲜培养基1700μl。经过图中所示的天数后，通过5视野的显微镜观察测定死细胞率(％)。需要说明的是，在图4～6中，数据以平均值±标准偏差来表示。统计学显著性差异检验利用分散分析或Mann-Whitney U检验进行。p<0.05时判断为具有显著差异。

结果

将溶瘤Ad和溶瘤Ad-REIC的添加所致的各种细胞中的细胞死亡诱导率示于图4。如图4所示，与其他化合物相比，溶瘤Ad-REIC显著诱导了细胞死亡。

实施例4溶瘤Ad和溶瘤Ad-REIC的人前列腺癌治疗效果

方法

将PC3人前列腺癌细胞2×10⁶个/0.1ml PBS通过皮下注射施用于成年雄性裸鼠的右大腿部。在肿瘤体积达到200～300mm³的10天后，进行腺病毒的肿瘤内施用(图5的第0天)。肿瘤体积使用式1/2(w1×w2×w2)进行计算。在该式中，w1表示最大肿瘤直径、w2表示最小肿瘤直径。

结果

结果示于图5。如图5所示，在使用溶瘤Ad-REIC的情况下，以用量依赖性的方式确认到治疗效果。与其他治疗组比较，溶瘤Ad-REIC(10⁷)的效果更大。在供于实验的全部小鼠中未确认到明确的毒性。

实施例5溶瘤Ad和溶瘤Ad-REIC的NK细胞诱导效果

方法

将PC3人前列腺癌细胞2×10⁶个/0.1ml PBS通过皮下注射施用于成年雄性裸鼠的左右大腿部。该小鼠为至少具有2处肿瘤部位的小鼠肿瘤模型。在两侧的肿瘤体积达到200～300mm³的10天后，将腺病毒施用于右侧的肿瘤内。载体注射3天后，通过使用抗NK细胞抗体(eBioscience Inc.,10255Science Center Drive,圣地亚哥,CA92121,USA)的流式细胞术测定末梢淋巴细胞中的自然杀伤(NK)细胞。

结果

结果示于图6。如图6所示，在使用溶瘤Ad-REIC的情况下，与其他治疗组比较，NK细胞诱导效果显著大。

实施例6溶瘤Ad和溶瘤Ad-REIC所致的抗原特异性免疫应答的诱导

方法

进行了如下研究：制作免疫正常小鼠中的荷瘤模型，肿瘤内施用溶瘤Ad-REIC或溶瘤Ad后，对承担抗癌免疫的癌特异性CTL细胞进行鉴定。在具有正常免疫系统的C57/BL6小鼠中皮下移植导入了作为外源抗原的OVA(卵清蛋白)基因的恶性胸腺瘤细胞[EG-7]株(1.0×10⁶细胞)，制作荷瘤小鼠模型。在肿瘤径达到100mm³以上的时刻，将溶瘤Ad-REIC或溶瘤Ad注入到肿瘤内(施用量为1.0×10⁶pfu/肿瘤)。在治疗后第3天回收肿瘤，使用CD8抗体、OVA四聚体(H-2kb限制性识别OVA表位的抗体)利用流失细胞术来分析针对OVA的特异性CD8阳性CTL在肿瘤内浸润淋巴细胞(TIL)中所占的比例的动态。

结果

结果示于图7。如图7所示，在施用溶瘤Ad-REIC的小鼠的肿瘤内，四聚体阳性的CD8细胞的频率上升。即，与施用溶瘤Ad的情况相比，通过施用溶瘤Ad-REIC诱导出了更强的OVA抗原特异性免疫应答。根据本实验的结果可认为，通过在肿瘤内施用编码REIC基因且表达REIC蛋白质的溶瘤Ad-REIC，能够诱导癌抗原特异性的免疫应答。

工业实用性

本发明的条件复制型腺病毒可用于癌症治疗。

序列表自由文本

序列编号1、2、3、8、9、10合成

本说明书中所引用的全部出版物、专利和专利申请直接以参考的形式并入到本说明书中。

序列表

<110> 国立大学法人冈山大学(National University Corporation OkayamaUniversity)

桃太郎源株式会社(Momotaro-Gene Inc.)

汉阳大学校产学协力团(Industry-University Cooperation FoundationHanyang University)

<120> 表达REIC基因的条件复制型腺病毒(A conditionally replication-competent adenovirus which expresses REIC gene)

<130> PH-6182-PCT

<150> JP 2014-110672

<151> 2014-05-28

<160> 14

<170> PatentIn version 3.5

<210> 1

<211> 10

<212> DNA

<213> 人工(Artificial)

<220>

<223> 合成(Synthetic)

<400> 1

cccccgcccc 10

<210> 2

<211> 902

<212> DNA

<213> 人工(Artificial)

<220>

<223> 合成(Synthetic)

<400> 2

agatctctcc gctggggccc tcgctggcgt ccctgcaccc tgggagcgcg agcggcgcgc 60

gggcggggaa gcgcggccca gacccccggg tccgcccgga gcagctgcgc tgtcggggcc 120

aggccgggct cccagtggat tcgcgggcac agacgcccag gaccgcgctt cccacgtggc 180

ggagggactg gggacccggg cacccgtcct gccccttcac cttccagctc cgcctcctcc 240

gcgcggaccc cgccccgtcc cgacccctcc cgggtccccg gcccagcccc ctccgggccc 300

tcccagcccc tccccttcct ttccgcggcc ccgccctctc ctcgcggcgc gagtttcagg 360

cagcgctgcg tcctgctgcg cacgtgggaa gccctggccc cggccacccc cgcgtgaagc 420

ttgcatgcct gcaggtcgac tctagaggat ctactagtca tatggatgag ctcgagctgc 480

accctgggag cgcgagcggc gcgcgggcgg ggaagcgcgg cccagacccc cgggtccgcc 540

cggagcagct gcgctgtcgg ggccaggccg ggctcccagt ggattcgcgg gcacagacgc 600

ccaggaccgc gcttcccacg tggcggaggg actggggacc cgggcacccg tcctgcccct 660

tcaccttcca gctccgcctc ctccgcgcgg accccgcccc gtcccgaccc ctcccgggtc 720

cccggcccag ccccctccgg gccctcccag cccctcccct tcctttccgc ggccccgccc 780

tctcctcgag ctcgagatcg gatccccggg taccgaggcg aattcggctt ctcgagccac 840

tcttgagtgc cagcgagtag agttttctcc tccgagccgc tccgacaccg ggactgaaaa 900

tg 902

<210> 3

<211> 34

<212> DNA

<213> 人工(Artificial)

<220>

<223> 合成(Synthetic)

<400> 3

cacagtgcat acgtgggctc caacaggtcc tctt 34

<210> 4

<211> 35935

<212> DNA

<213> 人腺病毒(Human adenovirus) 5

<400> 4

catcatcaat aatatacctt attttggatt gaagccaata tgataatgag ggggtggagt 60

ttgtgacgtg gcgcggggcg tgggaacggg gcgggtgacg tagtagtgtg gcggaagtgt 120

gatgttgcaa gtgtggcgga acacatgtaa gcgacggatg tggcaaaagt gacgtttttg 180

gtgtgcgccg gtgtacacag gaagtgacaa ttttcgcgcg gttttaggcg gatgttgtag 240

taaatttggg cgtaaccgag taagatttgg ccattttcgc gggaaaactg aataagagga 300

agtgaaatct gaataatttt gtgttactca tagcgcgtaa tatttgtcta gggccgcggg 360

gactttgacc gtttacgtgg agactcgccc aggtgttttt ctcaggtgtt ttccgcgttc 420

cgggtcaaag ttggcgtttt attattatag tcagctgacg tgtagtgtat ttatacccgg 480

tgagttcctc aagaggccac tcttgagtgc cagcgagtag agttttctcc tccgagccgc 540

tccgacaccg ggactgaaaa tgagacatat tatctgccac ggaggtgtta ttaccgaaga 600

aatggccgcc agtcttttgg accagctgat cgaagaggta ctggctgata atcttccacc 660

tcctagccat tttgaaccac ctacccttca cgaactgtat gatttagacg tgacggcccc 720

cgaagatccc aacgaggagg cggtttcgca gatttttccc gactctgtaa tgttggcggt 780

gcaggaaggg attgacttac tcacttttcc gccggcgccc ggttctccgg agccgcctca 840

cctttcccgg cagcccgagc agccggagca gagagccttg ggtccggttt ctatgccaaa 900

ccttgtaccg gaggtgatcg atcttacctg ccacgaggct ggctttccac ccagtgacga 960

cgaggatgaa gagggtgagg agtttgtgtt agattatgtg gagcaccccg ggcacggttg 1020

caggtcttgt cattatcacc ggaggaatac gggggaccca gatattatgt gttcgctttg 1080

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tagagtggtg ggtttggtgt ggtaattttt tttttaattt ttacagtttt gtggtttaaa 1200

gaattttgta ttgtgatttt tttaaaaggt cctgtgtctg aacctgagcc tgagcccgag 1260

ccagaaccgg agcctgcaag acctacccgc cgtcctaaaa tggcgcctgc tatcctgaga 1320

cgcccgacat cacctgtgtc tagagaatgc aatagtagta cggatagctg tgactccggt 1380

ccttctaaca cacctcctga gatacacccg gtggtcccgc tgtgccccat taaaccagtt 1440

gccgtgagag ttggtgggcg tcgccaggct gtggaatgta tcgaggactt gcttaacgag 1500

cctgggcaac ctttggactt gagctgtaaa cgccccaggc cataaggtgt aaacctgtga 1560

ttgcgtgtgt ggttaacgcc tttgtttgct gaatgagttg atgtaagttt aataaagggt 1620

gagataatgt ttaacttgca tggcgtgtta aatggggcgg ggcttaaagg gtatataatg 1680

cgccgtgggc taatcttggt tacatctgac ctcatggagg cttgggagtg tttggaagat 1740

ttttctgctg tgcgtaactt gctggaacag agctctaaca gtacctcttg gttttggagg 1800

tttctgtggg gctcatccca ggcaaagtta gtctgcagaa ttaaggagga ttacaagtgg 1860

gaatttgaag agcttttgaa atcctgtggt gagctgtttg attctttgaa tctgggtcac 1920

caggcgcttt tccaagagaa ggtcatcaag actttggatt tttccacacc ggggcgcgct 1980

gcggctgctg ttgctttttt gagttttata aaggataaat ggagcgaaga aacccatctg 2040

agcggggggt acctgctgga ttttctggcc atgcatctgt ggagagcggt tgtgagacac 2100

aagaatcgcc tgctactgtt gtcttccgtc cgcccggcga taataccgac ggaggagcag 2160

cagcagcagc aggaggaagc caggcggcgg cggcaggagc agagcccatg gaacccgaga 2220

gccggcctgg accctcggga atgaatgttg tacaggtggc tgaactgtat ccagaactga 2280

gacgcatttt gacaattaca gaggatgggc aggggctaaa gggggtaaag agggagcggg 2340

gggcttgtga ggctacagag gaggctagga atctagcttt tagcttaatg accagacacc 2400

gtcctgagtg tattactttt caacagatca aggataattg cgctaatgag cttgatctgc 2460

tggcgcagaa gtattccata gagcagctga ccacttactg gctgcagcca ggggatgatt 2520

ttgaggaggc tattagggta tatgcaaagg tggcacttag gccagattgc aagtacaaga 2580

tcagcaaact tgtaaatatc aggaattgtt gctacatttc tgggaacggg gccgaggtgg 2640

agatagatac ggaggatagg gtggccttta gatgtagcat gataaatatg tggccggggg 2700

tgcttggcat ggacggggtg gttattatga atgtaaggtt tactggcccc aattttagcg 2760

gtacggtttt cctggccaat accaacctta tcctacacgg tgtaagcttc tatgggttta 2820

acaatacctg tgtggaagcc tggaccgatg taagggttcg gggctgtgcc ttttactgct 2880

gctggaaggg ggtggtgtgt cgccccaaaa gcagggcttc aattaagaaa tgcctctttg 2940

aaaggtgtac cttgggtatc ctgtctgagg gtaactccag ggtgcgccac aatgtggcct 3000

ccgactgtgg ttgcttcatg ctagtgaaaa gcgtggctgt gattaagcat aacatggtat 3060

gtggcaactg cgaggacagg gcctctcaga tgctgacctg ctcggacggc aactgtcacc 3120

tgctgaagac cattcacgta gccagccact ctcgcaaggc ctggccagtg tttgagcata 3180

acatactgac ccgctgttcc ttgcatttgg gtaacaggag gggggtgttc ctaccttacc 3240

aatgcaattt gagtcacact aagatattgc ttgagcccga gagcatgtcc aaggtgaacc 3300

tgaacggggt gtttgacatg accatgaaga tctggaaggt gctgaggtac gatgagaccc 3360

gcaccaggtg cagaccctgc gagtgtggcg gtaaacatat taggaaccag cctgtgatgc 3420

tggatgtgac cgaggagctg aggcccgatc acttggtgct ggcctgcacc cgcgctgagt 3480

ttggctctag cgatgaagat acagattgag gtactgaaat gtgtgggcgt ggcttaaggg 3540

tgggaaagaa tatataaggt gggggtctta tgtagttttg tatctgtttt gcagcagccg 3600

ccgccgccat gagcaccaac tcgtttgatg gaagcattgt gagctcatat ttgacaacgc 3660

gcatgccccc atgggccggg gtgcgtcaga atgtgatggg ctccagcatt gatggtcgcc 3720

ccgtcctgcc cgcaaactct actaccttga cctacgagac cgtgtctgga acgccgttgg 3780

agactgcagc ctccgccgcc gcttcagccg ctgcagccac cgcccgcggg attgtgactg 3840

actttgcttt cctgagcccg cttgcaagca gtgcagcttc ccgttcatcc gcccgcgatg 3900

acaagttgac ggctcttttg gcacaattgg attctttgac ccgggaactt aatgtcgttt 3960

ctcagcagct gttggatctg cgccagcagg tttctgccct gaaggcttcc tcccctccca 4020

atgcggttta aaacataaat aaaaaaccag actctgtttg gatttggatc aagcaagtgt 4080

cttgctgtct ttatttaggg gttttgcgcg cgcggtaggc ccgggaccag cggtctcggt 4140

cgttgagggt cctgtgtatt ttttccagga cgtggtaaag gtgactctgg atgttcagat 4200

acatgggcat aagcccgtct ctggggtgga ggtagcacca ctgcagagct tcatgctgcg 4260

gggtggtgtt gtagatgatc cagtcgtagc aggagcgctg ggcgtggtgc ctaaaaatgt 4320

ctttcagtag caagctgatt gccaggggca ggcccttggt gtaagtgttt acaaagcggt 4380

taagctggga tgggtgcata cgtggggata tgagatgcat cttggactgt atttttaggt 4440

tggctatgtt cccagccata tccctccggg gattcatgtt gtgcagaacc accagcacag 4500

tgtatccggt gcacttggga aatttgtcat gtagcttaga aggaaatgcg tggaagaact 4560

tggagacgcc cttgtgacct ccaagatttt ccatgcattc gtccataatg atggcaatgg 4620

gcccacgggc ggcggcctgg gcgaagatat ttctgggatc actaacgtca tagttgtgtt 4680

ccaggatgag atcgtcatag gccattttta caaagcgcgg gcggagggtg ccagactgcg 4740

gtataatggt tccatccggc ccaggggcgt agttaccctc acagatttgc atttcccacg 4800

ctttgagttc agatgggggg atcatgtcta cctgcggggc gatgaagaaa acggtttccg 4860

gggtagggga gatcagctgg gaagaaagca ggttcctgag cagctgcgac ttaccgcagc 4920

cggtgggccc gtaaatcaca cctattaccg ggtgcaactg gtagttaaga gagctgcagc 4980

tgccgtcatc cctgagcagg ggggccactt cgttaagcat gtccctgact cgcatgtttt 5040

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caaagttttt caacggtttg agaccgtccg ccgtaggcat gcttttgagc gtttgaccaa 5160

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ctcctcgttt cgcgggttgg ggcggctttc gctgtacggc agtagtcggt gctcgtccag 5280

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ggtgaagggg tgcgctccgg gctgcgcgct ggccagggtg cgcttgaggc tggtcctgct 5400

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gtcatagtcc agcccctccg cggcgtggcc cttggcgcgc agcttgccct tggaggaggc 5520

gccgcacgag gggcagtgca gacttttgag ggcgtagagc ttgggcgcga gaaataccga 5580

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ggtgagctct ggccgttcgg ggtcaaaaac caggtttccc ccatgctttt tgatgcgttt 5700

cttacctctg gtttccatga gccggtgtcc acgctcggtg acgaaaaggc tgtccgtgtc 5760

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ggaggggtag cggtcgttgt ccactagggg gtccactcgc tccagggtgt gaagacacat 5940

gtcgccctct tcggcatcaa ggaaggtgat tggtttgtag gtgtaggcca cgtgaccggg 6000

tgttcctgaa ggggggctat aaaagggggt gggggcgcgt tcgtcctcac tctcttccgc 6060

atcgctgtct gcgagggcca gctgttgggg tgagtactcc ctctgaaaag cgggcatgac 6120

ttctgcgcta agattgtcag tttccaaaaa cgaggaggat ttgatattca cctggcccgc 6180

ggtgatgcct ttgagggtgg ccgcatccat ctggtcagaa aagacaatct ttttgttgtc 6240

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gcgctcgttg gtccagcaga ggcggccgcc cttgcgcgag cagaatggcg gtagggggtc 6540

tagctgcgtc tcgtccgggg ggtctgcgtc cacggtaaag accccgggca gcaggcgcgc 6600

gtcgaagtag tctatcttgc atccttgcaa gtctagcgcc tgctgccatg cgcgggcggc 6660

aagcgcgcgc tcgtatgggt tgagtggggg accccatggc atggggtggg tgagcgcgga 6720

ggcgtacatg ccgcaaatgt cgtaaacgta gaggggctct ctgagtattc caagatatgt 6780

agggtagcat cttccaccgc ggatgctggc gcgcacgtaa tcgtatagtt cgtgcgaggg 6840

agcgaggagg tcgggaccga ggttgctacg ggcgggctgc tctgctcgga agactatctg 6900

cctgaagatg gcatgtgagt tggatgatat ggttggacgc tggaagacgt tgaagctggc 6960

gtctgtgaga cctaccgcgt cacgcacgaa ggaggcgtag gagtcgcgca gcttgttgac 7020

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atacttatcc tgtccctttt ttttccacag ctcgcggttg aggacaaact cttcgcggtc 7140

tttccagtac tcttggatcg gaaacccgtc ggcctccgaa cggtaagagc ctagcatgta 7200

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gtactggtat ttgaagtcag tgtcgtcgca tccgccctgc tcccagagca aaaagtccgt 7380

gcgctttttg gaacgcggat ttggcagggc gaaggtgaca tcgttgaaga gtatctttcc 7440

cgcgcgaggc ataaagttgc gtgtgatgcg gaagggtccc ggcacctcgg aacggttgtt 7500

aattacctgg gcggcgagca cgatctcgtc aaagccgttg atgttgtggc ccacaatgta 7560

aagttccaag aagcgcggga tgcccttgat ggaaggcaat tttttaagtt cctcgtaggt 7620

gagctcttca ggggagctga gcccgtgctc tgaaagggcc cagtctgcaa gatgagggtt 7680

ggaagcgacg aatgagctcc acaggtcacg ggccattagc atttgcaggt ggtcgcgaaa 7740

ggtcctaaac tggcgaccta tggccatttt ttctggggtg atgcagtaga aggtaagcgg 7800

gtcttgttcc cagcggtccc atccaaggtt cgcggctagg tctcgcgcgg cagtcactag 7860

aggctcatct ccgccgaact tcatgaccag catgaagggc acgagctgct tcccaaaggc 7920

ccccatccaa gtataggtct ctacatcgta ggtgacaaag agacgctcgg tgcgaggatg 7980

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tacttcggct gcttgtcctt gaccgtctgg ctgctcgagg ggagttacgg tggatcggac 8280

caccacgccg cgcgagccca aagtccagat gtccgcgcgc ggcggtcgga gcttgatgac 8340

aacatcgcgc agatgggagc tgtccatggt ctggagctcc cgcggcgtca ggtcaggcgg 8400

gagctcctgc aggtttacct cgcatagacg ggtcagggcg cgggctagat ccaggtgata 8460

cctaatttcc aggggctggt tggtggcggc gtcgatggct tgcaagaggc cgcatccccg 8520

cggcgcgact acggtaccgc gcggcgggcg gtgggccgcg ggggtgtcct tggatgatgc 8580

atctaaaagc ggtgacgcgg gcgagccccc ggaggtaggg ggggctccgg acccgccggg 8640

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ttgctggcga acgcgacgac gcggcggttg atctcctgaa tctggcgcct ctgcgtgaag 8760

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ttgacggcgg cctggcgcaa aatctcctgc acgtctcctg agttgtcttg ataggcgatc 8880

tcggccatga actgctcgat ctcttcctcc tggagatctc cgcgtccggc tcgctccacg 8940

gtggcggcga ggtcgttgga aatgcgggcc atgagctgcg agaaggcgtt gaggcctccc 9000

tcgttccaga cgcggctgta gaccacgccc ccttcggcat cgcgggcgcg catgaccacc 9060

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aggtagttga gggtggtggc ggtgtgttct gccacgaaga agtacataac ccagcgtcgc 9180

aacgtggatt cgttgatatc ccccaaggcc tcaaggcgct ccatggcctc gtagaagtcc 9240

acggcgaagt tgaaaaactg ggagttgcgc gccgacacgg ttaactcctc ctccagaaga 9300

cggatgagct cggcgacagt gtcgcgcacc tcgcgctcaa aggctacagg ggcctcttct 9360

tcttcttcaa tctcctcttc cataagggcc tccccttctt cttcttctgg cggcggtggg 9420

ggagggggga cacggcggcg acgacggcgc accgggaggc ggtcgacaaa gcgctcgatc 9480

atctccccgc ggcgacggcg catggtctcg gtgacggcgc ggccgttctc gcgggggcgc 9540

agttggaaga cgccgcccgt catgtcccgg ttatgggttg gcggggggct gccatgcggc 9600

agggatacgg cgctaacgat gcatctcaac aattgttgtg taggtactcc gccgccgagg 9660

gacctgagcg agtccgcatc gaccggatcg gaaaacctct cgagaaaggc gtctaaccag 9720

tcacagtcgc aaggtaggct gagcaccgtg gcgggcggca gcgggcggcg gtcggggttg 9780

tttctggcgg aggtgctgct gatgatgtaa ttaaagtagg cggtcttgag acggcggatg 9840

gtcgacagaa gcaccatgtc cttgggtccg gcctgctgaa tgcgcaggcg gtcggccatg 9900

ccccaggctt cgttttgaca tcggcgcagg tctttgtagt agtcttgcat gagcctttct 9960

accggcactt cttcttctcc ttcctcttgt cctgcatctc ttgcatctat cgctgcggcg 10020

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ctcatcggct gaagcagggc taggtcggcg acaacgcgct cggctaatat ggcctgctgc 10140

acctgcgtga gggtagactg gaagtcatcc atgtccacaa agcggtggta tgcgcccgtg 10200

ttgatggtgt aagtgcagtt ggccataacg gaccagttaa cggtctggtg acccggctgc 10260

gagagctcgg tgtacctgag acgcgagtaa gccctcgagt caaatacgta gtcgttgcaa 10320

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caggtgtgcg acgtcagaca acgggggagt gctccttttg gcttccttcc aggcgcggcg 10800

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ccgtcatgca agaccccgct tgcaaattcc tccggaaaca gggacgagcc ccttttttgc 11040

ttttcccaga tgcatccggt gctgcggcag atgcgccccc ctcctcagca gcggcaagag 11100

caagagcagc ggcagacatg cagggcaccc tcccctcctc ctaccgcgtc aggaggggcg 11160

acatccgcgg ttgacgcggc agcagatggt gattacgaac ccccgcggcg ccgggcccgg 11220

cactacctgg acttggagga gggcgagggc ctggcgcggc taggagcgcc ctctcctgag 11280

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ctgtttcgcg accgcgaggg agaggagccc gaggagatgc gggatcgaaa gttccacgca 11400

gggcgcgagc tgcggcatgg cctgaatcgc gagcggttgc tgcgcgagga ggactttgag 11460

cccgacgcgc gaaccgggat tagtcccgcg cgcgcacacg tggcggccgc cgacctggta 11520

accgcatacg agcagacggt gaaccaggag attaactttc aaaaaagctt taacaaccac 11580

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gagggccgct ggctgctcga tttgataaac atcctgcaga gcatagtggt gcaggagcgc 11820

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gtcacttgct gacactgtac cgcgaggcca taggtcaggc gcatgtggac gagcatactt 13140

tccaggagat tacaagtgtc agccgcgcgc tggggcagga ggacacgggc agcctggagg 13200

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ccgtgaaccc cgagtatttc accaatgcca tcttgaaccc gcactggcta ccgccccctg 13500

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acgatgactc ggcagacgac agcagcgtcc tggatttggg agggagtggc aacccgtttg 14040

cgcaccttcg ccccaggctg gggagaatgt tttaaaaaaa aaaaagcatg atgcaaaata 14100

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gaactaccag aacgaccaca gcaactttct gaccacggtc attcaaaaca atgactacag 14460

cccgggggag gcaagcacac agaccatcaa tcttgacgac cggtcgcact ggggcggcga 14520

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agacatgatg caagaccccg tgaccttccg ctccacgcgc cagatcagca actttccggt 15540

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caataacaca ggctggggcc tgcgcttccc aagcaagatg tttggcgggg ccaagaagcg 15960

ctccgaccaa cacccagtgc gcgtgcgcgg gcactaccgc gcgccctggg gcgcgcacaa 16020

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ccaccgccgc cgacccggca ctgccgccca acgcgcggcg gcggccctgc ttaaccgcgc 16260

acgtcgcacc ggccgacggg cggccatgcg ggccgctcga aggctggccg cgggtattgt 16320

cactgtgccc cccaggtcca ggcgacgagc ggccgccgca gcagccgcgg ccattagtgc 16380

tatgactcag ggtcgcaggg gcaacgtgta ttgggtgcgc gactcggtta gcggcctgcg 16440

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gtactgttgt atgtatccag cggcggcggc gcgcaacgaa gctatgtcca agcgcaaaat 16560

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gcttgagcag gccaacgagc gcctcgggga gtttgcctac ggaaagcggc ataaggacat 16920

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ggtggcgccg ggactgggcg tgcagaccgt ggacgttcag atacccacta ccagtagcac 17220

cagtattgcc accgccacag agggcatgga gacacaaacg tccccggttg cctcagcggt 17280

ggcggatgcc gcggtgcagg cggtcgctgc ggccgcgtcc aagacctcta cggaggtgca 17340

aacggacccg tggatgtttc gcgtttcagc cccccggcgc ccgcgcggtt cgaggaagta 17400

cggcgccgcc agcgcgctac tgcccgaata tgccctacat ccttccattg cgcctacccc 17460

cggctatcgt ggctacacct accgccccag aagacgagca actacccgac gccgaaccac 17520

cactggaacc cgccgccgcc gtcgccgtcg ccagcccgtg ctggccccga tttccgtgcg 17580

cagggtggct cgcgaaggag gcaggaccct ggtgctgcca acagcgcgct accaccccag 17640

catcgtttaa aagccggtct ttgtggttct tgcagatatg gccctcacct gccgcctccg 17700

tttcccggtg ccgggattcc gaggaagaat gcaccgtagg aggggcatgg ccggccacgg 17760

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gcgcggcggt atcctgcccc tccttattcc actgatcgcc gcggcgattg gcgccgtgcc 17880

cggaattgca tccgtggcct tgcaggcgca gagacactga ttaaaaacaa gttgcatgtg 17940

gaaaaatcaa aataaaaagt ctggactctc acgctcgctt ggtcctgtaa ctattttgta 18000

gaatggaaga catcaacttt gcgtctctgg ccccgcgaca cggctcgcgc ccgttcatgg 18060

gaaactggca agatatcggc accagcaata tgagcggtgg cgccttcagc tggggctcgc 18120

tgtggagcgg cattaaaaat ttcggttcca ccgttaagaa ctatggcagc aaggcctgga 18180

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tggtagatgg cctggcctct ggcattagcg gggtggtgga cctggccaac caggcagtgc 18300

aaaataagat taacagtaag cttgatcccc gccctcccgt agaggagcct ccaccggccg 18360

tggagacagt gtctccagag gggcgtggcg aaaagcgtcc gcgccccgac agggaagaaa 18420

ctctggtgac gcaaatagac gagcctccct cgtacgagga ggcactaaag caaggcctgc 18480

ccaccacccg tcccatcgcg cccatggcta ccggagtgct gggccagcac acacccgtaa 18540

cgctggacct gcctcccccc gccgacaccc agcagaaacc tgtgctgcca ggcccgaccg 18600

ccgttgttgt aacccgtcct agccgcgcgt ccctgcgccg cgccgccagc ggtccgcgat 18660

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atgtatgcgt ccatgtcgcc gccagaggag ctgctgagcc gccgcgcgcc cgctttccaa 18840

gatggctacc ccttcgatga tgccgcagtg gtcttacatg cacatctcgg gccaggacgc 18900

ctcggagtac ctgagccccg ggctggtgca gtttgcccgc gccaccgaga cgtacttcag 18960

cctgaataac aagtttagaa accccacggt ggcgcctacg cacgacgtga ccacagaccg 19020

gtcccagcgt ttgacgctgc ggttcatccc tgtggaccgt gaggatactg cgtactcgta 19080

caaggcgcgg ttcaccctag ctgtgggtga taaccgtgtg ctggacatgg cttccacgta 19140

ctttgacatc cgcggcgtgc tggacagggg ccctactttt aagccctact ctggcactgc 19200

ctacaacgcc ctggctccca agggtgcccc aaatccttgc gaatgggatg aagctgctac 19260

tgctcttgaa ataaacctag aagaagagga cgatgacaac gaagacgaag tagacgagca 19320

agctgagcag caaaaaactc acgtatttgg gcaggcgcct tattctggta taaatattac 19380

aaaggagggt attcaaatag gtgtcgaagg tcaaacacct aaatatgccg ataaaacatt 19440

tcaacctgaa cctcaaatag gagaatctca gtggtacgaa actgaaatta atcatgcagc 19500

tgggagagtc cttaaaaaga ctaccccaat gaaaccatgt tacggttcat atgcaaaacc 19560

cacaaatgaa aatggagggc aaggcattct tgtaaagcaa caaaatggaa agctagaaag 19620

tcaagtggaa atgcaatttt tctcaactac tgaggcgacc gcaggcaatg gtgataactt 19680

gactcctaaa gtggtattgt acagtgaaga tgtagatata gaaaccccag acactcatat 19740

ttcttacatg cccactatta aggaaggtaa ctcacgagaa ctaatgggcc aacaatctat 19800

gcccaacagg cctaattaca ttgcttttag ggacaatttt attggtctaa tgtattacaa 19860

cagcacgggt aatatgggtg ttctggcggg ccaagcatcg cagttgaatg ctgttgtaga 19920

tttgcaagac agaaacacag agctttcata ccagcttttg cttgattcca ttggtgatag 19980

aaccaggtac ttttctatgt ggaatcaggc tgttgacagc tatgatccag atgttagaat 20040

tattgaaaat catggaactg aagatgaact tccaaattac tgctttccac tgggaggtgt 20100

gattaataca gagactctta ccaaggtaaa acctaaaaca ggtcaggaaa atggatggga 20160

aaaagatgct acagaatttt cagataaaaa tgaaataaga gttggaaata attttgccat 20220

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ctacgagtgg aacttcagga aggatgttaa catggttctg cagagctccc taggaaatga 20640

cctaagggtt gacggagcca gcattaagtt tgatagcatt tgcctttacg ccaccttctt 20700

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taccaacgtg cccatatcca tcccctcccg caactgggcg gctttccgcg gctgggcctt 20880

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ctactctggc tctataccct acctagatgg aaccttttac ctcaaccaca cctttaagaa 21000

ggtggccatt acctttgact cttctgtcag ctggcctggc aatgaccgcc tgcttacccc 21060

caacgagttt gaaattaagc gctcagttga cggggagggt tacaacgttg cccagtgtaa 21120

catgaccaaa gactggttcc tggtacaaat gctagctaac tacaacattg gctaccaggg 21180

cttctatatc ccagagagct acaaggaccg catgtactcc ttctttagaa acttccagcc 21240

catgagccgt caggtggtgg atgatactaa atacaaggac taccaacagg tgggcatcct 21300

acaccaacac aacaactctg gatttgttgg ctaccttgcc cccaccatgc gcgaaggaca 21360

ggcctaccct gctaacttcc cctatccgct tataggcaag accgcagttg acagcattac 21420

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gtccatgggc gcactcacag acctgggcca aaaccttctc tacgccaact ccgcccacgc 21540

gctagacatg acttttgagg tggatcccat ggacgagccc acccttcttt atgttttgtt 21600

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gtttaaaaat caaaggggtt ctgccgcgca tcgctatgcg ccactggcag ggacacgttg 22500

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aagttttcac tccacaggct gcgcaccatc accaacgcgt ttagcaggtc gggcgccgat 22620

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tgcttaaaag ccacctgagc ctttgcgcct tcagagaaga acatgccgca agacttgccg 22980

gaaaactgat tggccggaca ggccgcgtcg tgcacgcagc accttgcgtc ggtgttggag 23040

atctgcacca catttcggcc ccaccggttc ttcacgatct tggccttgct agactgctcc 23100

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atcataatgc ttccgtgtag acacttaagc tcgccttcga tctcagcgca gcggtgcagc 23220

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ttcatcaccg taatttcact ttccgcttcg ctgggctctt cctcttcctc ttgcgtccgc 23580

ataccacgcg ccactgggtc gtcttcattc agccgccgca ctgtgcgctt acctcctttg 23640

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agcttagaaa caggattttt cccactctgt atgctatatt tcaacagagc aggggccaag 26940

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tacgtcatct ccagcggcca cacccggcgc cagcacctgt cgtcagcgcc attatgagca 27180

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ctgcccaaga ctactcaacc cgaataaact acatgagcgc gggaccccac atgatatccc 27300

gggtcaacgg aatccgcgcc caccgaaacc gaattctctt ggaacaggcg gctattacca 27360

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taactcacct gacaatcaga gggcgaggta ttcagctcaa cgacgagtcg gtgagctcct 27600

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gattttaagg agccagcctg taatgttaca ttcgcagctg aagctaatga gtgcaccact 28860

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caaaaagtta gcattataat tagaatagga tttaaacccc ccggtcattt cctgctcaat 29340

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caggcttcct ggatgtcagc atctgacttt ggccagcacc tgtcccgcgg atttgttcca 29460

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accggactta catctaccac aaatacaccc caagtttctg cctttgtcaa taactgggat 29580

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ctacacccaa acaatgatgg aatccataga ttggacggac tgaaacacat gttcttttct 29760

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cagccttcac agtctatttg ctttacggat ttgtcaccct cacgctcatc tgcagcctca 29940

tcactgtggt catcgccttt atccagtgca ttgactgggt ctgtgtgcgc tttgcatatc 30000

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gcatgaatca agagctccaa gacatggtta acttgcacca gtgcaaaagg ggtatctttt 30600

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aaaaaaaaat aataaagcat cacttactta aaatcagtta gcaaatttct gtccagttta 30900

ttcagcagca cctccttgcc ctcctcccag ctctggtatt gcagcttcct cctggctgca 30960

aactttctcc acaatctaaa tggaatgtca gtttcctcct gttcctgtcc atccgcaccc 31020

actatcttca tgttgttgca gatgaagcgc gcaagaccgt ctgaagatac cttcaacccc 31080

gtgtatccat atgacacgga aaccggtcct ccaactgtgc cttttcttac tcctcccttt 31140

gtatccccca atgggtttca agagagtccc cctggggtac tctctttgcg cctatccgaa 31200

cctctagtta cctccaatgg catgcttgcg ctcaaaatgg gcaacggcct ctctctggac 31260

gaggccggca accttacctc ccaaaatgta accactgtga gcccacctct caaaaaaacc 31320

aagtcaaaca taaacctgga aatatctgca cccctcacag ttacctcaga agccctaact 31380

gtggctgccg ccgcacctct aatggtcgcg ggcaacacac tcaccatgca atcacaggcc 31440

ccgctaaccg tgcacgactc caaacttagc attgccaccc aaggacccct cacagtgtca 31500

gaaggaaagc tagccctgca aacatcaggc cccctcacca ccaccgatag cagtaccctt 31560

actatcactg cctcaccccc tctaactact gccactggta gcttgggcat tgacttgaaa 31620

gagcccattt atacacaaaa tggaaaacta ggactaaagt acggggctcc tttgcatgta 31680

acagacgacc taaacacttt gaccgtagca actggtccag gtgtgactat taataatact 31740

tccttgcaaa ctaaagttac tggagccttg ggttttgatt cacaaggcaa tatgcaactt 31800

aatgtagcag gaggactaag gattgattct caaaacagac gccttatact tgatgttagt 31860

tatccgtttg atgctcaaaa ccaactaaat ctaagactag gacagggccc tctttttata 31920

aactcagccc acaacttgga tattaactac aacaaaggcc tttacttgtt tacagcttca 31980

aacaattcca aaaagcttga ggttaaccta agcactgcca aggggttgat gtttgacgct 32040

acagccatag ccattaatgc aggagatggg cttgaatttg gttcacctaa tgcaccaaac 32100

acaaatcccc tcaaaacaaa aattggccat ggcctagaat ttgattcaaa caaggctatg 32160

gttcctaaac taggaactgg ccttagtttt gacagcacag gtgccattac agtaggaaac 32220

aaaaataatg ataagctaac tttgtggacc acaccagctc catctcctaa ctgtagacta 32280

aatgcagaga aagatgctaa actcactttg gtcttaacaa aatgtggcag tcaaatactt 32340

gctacagttt cagttttggc tgttaaaggc agtttggctc caatatctgg aacagttcaa 32400

agtgctcatc ttattataag atttgacgaa aatggagtgc tactaaacaa ttccttcctg 32460

gacccagaat attggaactt tagaaatgga gatcttactg aaggcacagc ctatacaaac 32520

gctgttggat ttatgcctaa cctatcagct tatccaaaat ctcacggtaa aactgccaaa 32580

agtaacattg tcagtcaagt ttacttaaac ggagacaaaa ctaaacctgt aacactaacc 32640

attacactaa acggtacaca ggaaacagga gacacaactc caagtgcata ctctatgtca 32700

ttttcatggg actggtctgg ccacaactac attaatgaaa tatttgccac atcctcttac 32760

actttttcat acattgccca agaataaaga atcgtttgtg ttatgtttca acgtgtttat 32820

ttttcaattg cagaaaattt caagtcattt ttcattcagt agtatagccc caccaccaca 32880

tagcttatac agatcaccgt accttaatca aactcacaga accctagtat tcaacctgcc 32940

acctccctcc caacacacag agtacacagt cctttctccc cggctggcct taaaaagcat 33000

catatcatgg gtaacagaca tattcttagg tgttatattc cacacggttt cctgtcgagc 33060

caaacgctca tcagtgatat taataaactc cccgggcagc tcacttaagt tcatgtcgct 33120

gtccagctgc tgagccacag gctgctgtcc aacttgcggt tgcttaacgg gcggcgaagg 33180

agaagtccac gcctacatgg gggtagagtc ataatcgtgc atcaggatag ggcggtggtg 33240

ctgcagcagc gcgcgaataa actgctgccg ccgccgctcc gtcctgcagg aatacaacat 33300

ggcagtggtc tcctcagcga tgattcgcac cgcccgcagc ataaggcgcc ttgtcctccg 33360

ggcacagcag cgcaccctga tctcacttaa atcagcacag taactgcagc acagcaccac 33420

aatattgttc aaaatcccac agtgcaaggc gctgtatcca aagctcatgg cggggaccac 33480

agaacccacg tggccatcat accacaagcg caggtagatt aagtggcgac ccctcataaa 33540

cacgctggac ataaacatta cctcttttgg catgttgtaa ttcaccacct cccggtacca 33600

tataaacctc tgattaaaca tggcgccatc caccaccatc ctaaaccagc tggccaaaac 33660

ctgcccgccg gctatacact gcagggaacc gggactggaa caatgacagt ggagagccca 33720

ggactcgtaa ccatggatca tcatgctcgt catgatatca atgttggcac aacacaggca 33780

cacgtgcata cacttcctca ggattacaag ctcctcccgc gttagaacca tatcccaggg 33840

aacaacccat tcctgaatca gcgtaaatcc cacactgcag ggaagacctc gcacgtaact 33900

cacgttgtgc attgtcaaag tgttacattc gggcagcagc ggatgatcct ccagtatggt 33960

agcgcgggtt tctgtctcaa aaggaggtag acgatcccta ctgtacggag tgcgccgaga 34020

caaccgagat cgtgttggtc gtagtgtcat gccaaatgga acgccggacg tagtcatatt 34080

tcctgaagca aaaccaggtg cgggcgtgac aaacagatct gcgtctccgg tctcgccgct 34140

tagatcgctc tgtgtagtag ttgtagtata tccactctct caaagcatcc aggcgccccc 34200

tggcttcggg ttctatgtaa actccttcat gcgccgctgc cctgataaca tccaccaccg 34260

cagaataagc cacacccagc caacctacac attcgttctg cgagtcacac acgggaggag 34320

cgggaagagc tggaagaacc atgttttttt ttttattcca aaagattatc caaaacctca 34380

aaatgaagat ctattaagtg aacgcgctcc cctccggtgg cgtggtcaaa ctctacagcc 34440

aaagaacaga taatggcatt tgtaagatgt tgcacaatgg cttccaaaag gcaaacggcc 34500

ctcacgtcca agtggacgta aaggctaaac ccttcagggt gaatctcctc tataaacatt 34560

ccagcacctt caaccatgcc caaataattc tcatctcgcc accttctcaa tatatctcta 34620

agcaaatccc gaatattaag tccggccatt gtaaaaatct gctccagagc gccctccacc 34680

ttcagcctca agcagcgaat catgattgca aaaattcagg ttcctcacag acctgtataa 34740

gattcaaaag cggaacatta acaaaaatac cgcgatcccg taggtccctt cgcagggcca 34800

gctgaacata atcgtgcagg tctgcacgga ccagcgcggc cacttccccg ccaggaacct 34860

tgacaaaaga acccacactg attatgacac gcatactcgg agctatgcta accagcgtag 34920

ccccgatgta agctttgttg catgggcggc gatataaaat gcaaggtgct gctcaaaaaa 34980

tcaggcaaag cctcgcgcaa aaaagaaagc acatcgtagt catgctcatg cagataaagg 35040

caggtaagct ccggaaccac cacagaaaaa gacaccattt ttctctcaaa catgtctgcg 35100

ggtttctgca taaacacaaa ataaaataac aaaaaaacat ttaaacatta gaagcctgtc 35160

ttacaacagg aaaaacaacc cttataagca taagacggac tacggccatg ccggcgtgac 35220

cgtaaaaaaa ctggtcaccg tgattaaaaa gcaccaccga cagctcctcg gtcatgtccg 35280

gagtcataat gtaagactcg gtaaacacat caggttgatt catcggtcag tgctaaaaag 35340

cgaccgaaat agcccggggg aatacatacc cgcaggcgta gagacaacat tacagccccc 35400

ataggaggta taacaaaatt aataggagag aaaaacacat aaacacctga aaaaccctcc 35460

tgcctaggca aaatagcacc ctcccgctcc agaacaacat acagcgcttc acagcggcag 35520

cctaacagtc agccttacca gtaaaaaaga aaacctatta aaaaaacacc actcgacacg 35580

gcaccagctc aatcagtcac agtgtaaaaa agggccaagt gcagagcgag tatatatagg 35640

actaaaaaat gacgtaacgg ttaaagtcca caaaaaacac ccagaaaacc gcacgcgaac 35700

ctacgcccag aaacgaaagc caaaaaaccc acaacttcct caaatcgtca cttccgtttt 35760

cccacgttac gtaacttccc attttaagaa aactacaatt cccaacacat acaagttact 35820

ccgccctaaa acctacgtca cccgccccgt tcccacgccc cgcgccacgt cacaaactcc 35880

accccctcat tatcatattg gcttcaatcc aaaataaggt atattattga tgatg 35935

<210> 5

<211> 1080

<212> DNA

<213> 人类(Homo sapiens)

<400> 5

atgaaggcca ctatcatcct ccttctgctt gcacaagttt cctgggctgg accgtttcaa 60

cagagaggct tatttgactt tatgctagaa gatgaggctt ctgggatagg cccagaagtt 120

cctgatgacc gcgacttcga gccctcccta ggcccagtgt gccccttccg ctgtcaatgc 180

catcttcgag tggtccagtg ttctgatttg ggtctggaca aagtgccaaa ggatcttccc 240

cctgacacaa ctctgctaga cctgcaaaac aacaaaataa ccgaaatcaa agatggagac 300

tttaagaacc tgaagaacct tcacgcattg attcttgtca acaataaaat tagcaaagtt 360

agtcctggag catttacacc tttggtgaag ttggaacgac tttatctgtc caagaatcag 420

ctgaaggaat tgccagaaaa aatgcccaaa actcttcagg agctgcgtgc ccatgagaat 480

gagatcacca aagtgcgaaa agttactttc aatggactga accagatgat tgtcatagaa 540

ctgggcacca atccgctgaa gagctcagga attgaaaatg gggctttcca gggaatgaag 600

aagctctcct acatccgcat tgctgatacc aatatcacca gcattcctca aggtcttcct 660

ccttccctta cggaattaca tcttgatggc aacaaaatca gcagagttga tgcagctagc 720

ctgaaaggac tgaataattt ggctaagttg ggattgagtt tcaacagcat ctctgctgtt 780

gacaatggct ctctggccaa cacgcctcat ctgagggagc ttcacttgga caacaacaag 840

cttaccagag tacctggtgg gctggcagag cataagtaca tccaggttgt ctaccttcat 900

aacaacaata tctctgtagt tggatcaagt gacttctgcc cacctggaca caacaccaaa 960

aaggcttctt attcgggtgt gagtcttttc agcaacccgg tccagtactg ggagatacag 1020

ccatccacct tcagatgtgt ctacgtgcgc tctgccattc aactcggaaa ctataagtaa 1080

<210> 6

<211> 588

<212> DNA

<213> 巨细胞病毒(cytomegalovirus)

<400> 6

gttgacattg attattgact agttattaat agtaatcaat tacggggtca ttagttcata 60

gcccatatat ggagttccgc gttacataac ttacggtaaa tggcccgcct ggctgaccgc 120

ccaacgaccc ccgcccattg acgtcaataa tgacgtatgt tcccatagta acgccaatag 180

ggactttcca ttgacgtcaa tgggtggagt atttacggta aactgcccac ttggcagtac 240

atcaagtgta tcatatgcca agtacgcccc ctattgacgt caatgacggt aaatggcccg 300

cctggcatta tgcccagtac atgaccttat gggactttcc tacttggcag tacatctacg 360

tattagtcat cgctattacc atggtgatgc ggttttggca gtacatcaat gggcgtggat 420

agcggtttga ctcacgggga tttccaagtc tccaccccat tgacgtcaat gggagtttgt 480

tttggcacca aaatcaacgg gactttccaa aatgtcgtaa caactccgcc ccattgacgc 540

aaatgggcgg taggcgtgta cggtgggagg tctatataag cagagctc 588

<210> 7

<211> 225

<212> DNA

<213> 牛(Bos taurus)

<400> 7

ctgtgccttc tagttgccag ccatctgttg tttgcccctc ccccgtgcct tccttgaccc 60

tggaaggtgc cactcccact gtcctttcct aataaaatga ggaaattgca tcgcattgtc 120

tgagtaggtg tcattctatt ctggggggtg gggtggggca ggacagcaag ggggaggatt 180

gggaagacaa tagcaggcat gctggggatg cggtgggctc tatgg 225

<210> 8

<211> 5

<212> PRT

<213> 人工(Artificial)

<220>

<223> 合成(Synthetic)

<400> 8

Gly Arg Gly Asp Ser

1 5

<210> 9

<211> 9

<212> PRT

<213> 人工(Artificial)

<220>

<223> 合成(Synthetic)

<400> 9

Cys Asp Cys Arg Gly Asp Cys Phe Cys

1 5

<210> 10

<211> 13

<212> PRT

<213> 人工(Artificial)

<220>

<223> 合成(Synthetic)

<400> 10

Gly Ser Cys Asp Cys Arg Gly Asp Cys Phe Cys Ser Gly

1 5 10

<210> 11

<211> 1053

<212> DNA

<213> 人类(Homo sapiens)

<220>

<221> CDS

<222> (1)..(1053)

<400> 11

atg cag cgg ctt ggg gcc acc ctg ctg tgc ctg ctg ctg gcg gcg gcg 48

Met Gln Arg Leu Gly Ala Thr Leu Leu Cys Leu Leu Leu Ala Ala Ala

1 5 10 15

gtc ccc acg gcc ccc gcg ccc gct ccg acg gcg acc tcg gct cca gtc 96

Val Pro Thr Ala Pro Ala Pro Ala Pro Thr Ala Thr Ser Ala Pro Val

20 25 30

aag ccc ggc ccg gct ctc agc tac ccg cag gag gag gcc acc ctc aat 144

Lys Pro Gly Pro Ala Leu Ser Tyr Pro Gln Glu Glu Ala Thr Leu Asn

35 40 45

gag atg ttc cgc gag gtt gag gaa ctg atg gag gac acg cag cac aaa 192

Glu Met Phe Arg Glu Val Glu Glu Leu Met Glu Asp Thr Gln His Lys

50 55 60

ttg cgc agc gcg gtg gaa gag atg gag gca gaa gaa gct gct gct aaa 240

Leu Arg Ser Ala Val Glu Glu Met Glu Ala Glu Glu Ala Ala Ala Lys

65 70 75 80

gca tca tca gaa gtg aac ctg gca aac tta cct ccc agc tat cac aat 288

Ala Ser Ser Glu Val Asn Leu Ala Asn Leu Pro Pro Ser Tyr His Asn

85 90 95

gag acc aac aca gac acg aag gtt gga aat aat acc atc cat gtg cac 336

Glu Thr Asn Thr Asp Thr Lys Val Gly Asn Asn Thr Ile His Val His

100 105 110

cga gaa att cac aag ata acc aac aac cag act gga caa atg gtc ttt 384

Arg Glu Ile His Lys Ile Thr Asn Asn Gln Thr Gly Gln Met Val Phe

115 120 125

tca gag aca gtt atc aca tct gtg gga gac gaa gaa ggc aga agg agc 432

Ser Glu Thr Val Ile Thr Ser Val Gly Asp Glu Glu Gly Arg Arg Ser

130 135 140

cac gag tgc atc atc gac gag gac tgt ggg ccc agc atg tac tgc cag 480

His Glu Cys Ile Ile Asp Glu Asp Cys Gly Pro Ser Met Tyr Cys Gln

145 150 155 160

ttt gcc agc ttc cag tac acc tgc cag cca tgc cgg ggc cag agg atg 528

Phe Ala Ser Phe Gln Tyr Thr Cys Gln Pro Cys Arg Gly Gln Arg Met

165 170 175

ctc tgc acc cgg gac agt gag tgc tgt gga gac cag ctg tgt gtc tgg 576

Leu Cys Thr Arg Asp Ser Glu Cys Cys Gly Asp Gln Leu Cys Val Trp

180 185 190

ggt cac tgc acc aaa atg gcc acc agg ggc agc aat ggg acc atc tgt 624

Gly His Cys Thr Lys Met Ala Thr Arg Gly Ser Asn Gly Thr Ile Cys

195 200 205

gac aac cag agg gac tgc cag ccg ggg ctg tgc tgt gcc ttc cag aga 672

Asp Asn Gln Arg Asp Cys Gln Pro Gly Leu Cys Cys Ala Phe Gln Arg

210 215 220

ggc ctg ctg ttc cct gtg tgc aca ccc ctg ccc gtg gag ggc gag ctt 720

Gly Leu Leu Phe Pro Val Cys Thr Pro Leu Pro Val Glu Gly Glu Leu

225 230 235 240

tgc cat gac ccc gcc agc cgg ctt ctg gac ctc atc acc tgg gag cta 768

Cys His Asp Pro Ala Ser Arg Leu Leu Asp Leu Ile Thr Trp Glu Leu

245 250 255

gag cct gat gga gcc ttg gac cga tgc cct tgt gcc agt ggc ctc ctc 816

Glu Pro Asp Gly Ala Leu Asp Arg Cys Pro Cys Ala Ser Gly Leu Leu

260 265 270

tgc cag ccc cac agc cac agc ctg gtg tat gtg tgc aag ccg acc ttc 864

Cys Gln Pro His Ser His Ser Leu Val Tyr Val Cys Lys Pro Thr Phe

275 280 285

gtg ggg agc cgt gac caa gat ggg gag atc ctg ctg ccc aga gag gtc 912

Val Gly Ser Arg Asp Gln Asp Gly Glu Ile Leu Leu Pro Arg Glu Val

290 295 300

ccc gat gag tat gaa gtt ggc agc ttc atg gag gag gtg cgc cag gag 960

Pro Asp Glu Tyr Glu Val Gly Ser Phe Met Glu Glu Val Arg Gln Glu

305 310 315 320

ctg gag gac ctg gag agg agc ctg act gaa gag atg gcg ctg ggg gag 1008

Leu Glu Asp Leu Glu Arg Ser Leu Thr Glu Glu Met Ala Leu Gly Glu

325 330 335

cct gcg gct gcc gcc gct gca ctg ctg gga ggg gaa gag att tag 1053

Pro Ala Ala Ala Ala Ala Ala Leu Leu Gly Gly Glu Glu Ile

340 345 350

<210> 12

<211> 350

<212> PRT

<213> 人类(Homo sapiens)

<400> 12

Met Gln Arg Leu Gly Ala Thr Leu Leu Cys Leu Leu Leu Ala Ala Ala

1 5 10 15

Val Pro Thr Ala Pro Ala Pro Ala Pro Thr Ala Thr Ser Ala Pro Val

20 25 30

Lys Pro Gly Pro Ala Leu Ser Tyr Pro Gln Glu Glu Ala Thr Leu Asn

35 40 45

Glu Met Phe Arg Glu Val Glu Glu Leu Met Glu Asp Thr Gln His Lys

50 55 60

Leu Arg Ser Ala Val Glu Glu Met Glu Ala Glu Glu Ala Ala Ala Lys

65 70 75 80

Ala Ser Ser Glu Val Asn Leu Ala Asn Leu Pro Pro Ser Tyr His Asn

85 90 95

Glu Thr Asn Thr Asp Thr Lys Val Gly Asn Asn Thr Ile His Val His

100 105 110

Arg Glu Ile His Lys Ile Thr Asn Asn Gln Thr Gly Gln Met Val Phe

115 120 125

Ser Glu Thr Val Ile Thr Ser Val Gly Asp Glu Glu Gly Arg Arg Ser

130 135 140

His Glu Cys Ile Ile Asp Glu Asp Cys Gly Pro Ser Met Tyr Cys Gln

145 150 155 160

Phe Ala Ser Phe Gln Tyr Thr Cys Gln Pro Cys Arg Gly Gln Arg Met

165 170 175

Leu Cys Thr Arg Asp Ser Glu Cys Cys Gly Asp Gln Leu Cys Val Trp

180 185 190

Gly His Cys Thr Lys Met Ala Thr Arg Gly Ser Asn Gly Thr Ile Cys

195 200 205

Asp Asn Gln Arg Asp Cys Gln Pro Gly Leu Cys Cys Ala Phe Gln Arg

210 215 220

Gly Leu Leu Phe Pro Val Cys Thr Pro Leu Pro Val Glu Gly Glu Leu

225 230 235 240

Cys His Asp Pro Ala Ser Arg Leu Leu Asp Leu Ile Thr Trp Glu Leu

245 250 255

Glu Pro Asp Gly Ala Leu Asp Arg Cys Pro Cys Ala Ser Gly Leu Leu

260 265 270

Cys Gln Pro His Ser His Ser Leu Val Tyr Val Cys Lys Pro Thr Phe

275 280 285

Val Gly Ser Arg Asp Gln Asp Gly Glu Ile Leu Leu Pro Arg Glu Val

290 295 300

Pro Asp Glu Tyr Glu Val Gly Ser Phe Met Glu Glu Val Arg Gln Glu

305 310 315 320

Leu Glu Asp Leu Glu Arg Ser Leu Thr Glu Glu Met Ala Leu Gly Glu

325 330 335

Pro Ala Ala Ala Ala Ala Ala Leu Leu Gly Gly Glu Glu Ile

340 345 350

<210> 13

<211> 720

<212> DNA

<213> 人类(Homo sapiens)

<220>

<221> CDS

<222> (1)..(720)

<400> 13

atg cag cgg ctt ggg gcc acc ctg ctg tgc ctg ctg ctg gcg gcg gcg 48

Met Gln Arg Leu Gly Ala Thr Leu Leu Cys Leu Leu Leu Ala Ala Ala

1 5 10 15

gtc ccc acg gcc ccc gcg ccc gct ccg acg gcg acc tcg ggc aga agg 96

Val Pro Thr Ala Pro Ala Pro Ala Pro Thr Ala Thr Ser Gly Arg Arg

20 25 30

agc cac gag tgc atc atc gac gag gac tgt ggg ccc agc atg tac tgc 144

Ser His Glu Cys Ile Ile Asp Glu Asp Cys Gly Pro Ser Met Tyr Cys

35 40 45

cag ttt gcc agc ttc cag tac acc tgc cag cca tgc cgg ggc cag agg 192

Gln Phe Ala Ser Phe Gln Tyr Thr Cys Gln Pro Cys Arg Gly Gln Arg

50 55 60

atg ctc tgc acc cgg gac agt gag tgc tgt gga gac cag ctg tgt gtc 240

Met Leu Cys Thr Arg Asp Ser Glu Cys Cys Gly Asp Gln Leu Cys Val

65 70 75 80

tgg ggt cac tgc acc aaa atg gcc acc agg ggc agc aat ggg acc atc 288

Trp Gly His Cys Thr Lys Met Ala Thr Arg Gly Ser Asn Gly Thr Ile

85 90 95

tgt gac aac cag agg gac tgc cag ccg ggg ctg tgc tgt gcc ttc cag 336

Cys Asp Asn Gln Arg Asp Cys Gln Pro Gly Leu Cys Cys Ala Phe Gln

100 105 110

aga ggc ctg ctg ttc cct gtg tgc aca ccc ctg ccc gtg gag ggc gag 384

Arg Gly Leu Leu Phe Pro Val Cys Thr Pro Leu Pro Val Glu Gly Glu

115 120 125

ctt tgc cat gac ccc gcc agc cgg ctt ctg gac ctc atc acc tgg gag 432

Leu Cys His Asp Pro Ala Ser Arg Leu Leu Asp Leu Ile Thr Trp Glu

130 135 140

cta gag cct gat gga gcc ttg gac cga tgc cct tgt gcc agt ggc ctc 480

Leu Glu Pro Asp Gly Ala Leu Asp Arg Cys Pro Cys Ala Ser Gly Leu

145 150 155 160

ctc tgc cag ccc cac agc cac agc ctg gtg tat gtg tgc aag ccg acc 528

Leu Cys Gln Pro His Ser His Ser Leu Val Tyr Val Cys Lys Pro Thr

165 170 175

ttc gtg ggg agc cgt gac caa gat ggg gag atc ctg ctg ccc aga gag 576

Phe Val Gly Ser Arg Asp Gln Asp Gly Glu Ile Leu Leu Pro Arg Glu

180 185 190

gtc ccc gat gag tat gaa gtt ggc agc ttc atg gag gag gtg cgc cag 624

Val Pro Asp Glu Tyr Glu Val Gly Ser Phe Met Glu Glu Val Arg Gln

195 200 205

gag ctg gag gac ctg gag agg agc ctg act gaa gag atg gcg ctg ggg 672

Glu Leu Glu Asp Leu Glu Arg Ser Leu Thr Glu Glu Met Ala Leu Gly

210 215 220

gag cct gcg gct gcc gcc gct gca ctg ctg gga ggg gaa gag att tag 720

Glu Pro Ala Ala Ala Ala Ala Ala Leu Leu Gly Gly Glu Glu Ile

225 230 235

<210> 14

<211> 239

<212> PRT

<213> 人类(Homo sapiens)

<400> 14

Met Gln Arg Leu Gly Ala Thr Leu Leu Cys Leu Leu Leu Ala Ala Ala

1 5 10 15

Val Pro Thr Ala Pro Ala Pro Ala Pro Thr Ala Thr Ser Gly Arg Arg

20 25 30

Ser His Glu Cys Ile Ile Asp Glu Asp Cys Gly Pro Ser Met Tyr Cys

35 40 45

Gln Phe Ala Ser Phe Gln Tyr Thr Cys Gln Pro Cys Arg Gly Gln Arg

50 55 60

Met Leu Cys Thr Arg Asp Ser Glu Cys Cys Gly Asp Gln Leu Cys Val

65 70 75 80

Trp Gly His Cys Thr Lys Met Ala Thr Arg Gly Ser Asn Gly Thr Ile

85 90 95

Cys Asp Asn Gln Arg Asp Cys Gln Pro Gly Leu Cys Cys Ala Phe Gln

100 105 110

Arg Gly Leu Leu Phe Pro Val Cys Thr Pro Leu Pro Val Glu Gly Glu

115 120 125

Leu Cys His Asp Pro Ala Ser Arg Leu Leu Asp Leu Ile Thr Trp Glu

130 135 140

Leu Glu Pro Asp Gly Ala Leu Asp Arg Cys Pro Cys Ala Ser Gly Leu

145 150 155 160

Leu Cys Gln Pro His Ser His Ser Leu Val Tyr Val Cys Lys Pro Thr

165 170 175

Phe Val Gly Ser Arg Asp Gln Asp Gly Glu Ile Leu Leu Pro Arg Glu

180 185 190

Val Pro Asp Glu Tyr Glu Val Gly Ser Phe Met Glu Glu Val Arg Gln

195 200 205

Glu Leu Glu Asp Leu Glu Arg Ser Leu Thr Glu Glu Met Ala Leu Gly

210 215 220

Glu Pro Ala Ala Ala Ala Ala Ala Leu Leu Gly Gly Glu Glu Ile

225 230 235

Claims

1.一种条件复制型腺病毒，其为在癌细胞中特异性地增殖并表达REIC蛋白质或REIC C结构域蛋白质的条件复制型腺病毒，其是在包含5型腺病毒基因组的ITR序列即末端反向重复序列并插入有HRE序列、hTERT启动子、编码核心蛋白多糖的DNA和编码包含RGD序列的肽的DNA的条件复制型腺病毒中进一步插入全长REIC DNA或REIC C结构域DNA而成的，其中，

(i)hTERT启动子是通过附加3个c-Myc结合位点和10个Sp1结合位点而进行了修饰的hTERT启动子，

(ii)在hTERT启动子的上游插入有6个由序列编号3所表示的碱基序列构成的HRE序列，

(iii)属于E1A区域的一部分的、序列编号4所表示的5型腺病毒基因组序列的第923～946位的作为Rb结合区域即视网膜母细胞瘤基因结合区域的24个碱基缺失，

(v)属于E3区域的一部分的、序列编号4所表示的5型腺病毒基因组序列的第28592～30479位的碱基缺失，

(vi)从5’侧起将启动子序列、编码核心蛋白多糖的DNA和多聚A附加序列依次连接而成的DNA构建体插入在缺失了属于E3区域的一部分的、序列编号4所表示的5型腺病毒基因组序列的第28592～30479位的碱基的部分，

(vii)编码包含RGD序列的肽的DNA插入在5型腺病毒基因组E3区域的第32676位碱基与第32677位碱基之间，并且

(viii)从5’侧起将CMV启动子序列、编码REIC蛋白质或REIC C结构域蛋白质的DNA和多聚A附加序列依次连接而成的DNA构建体插入在5型腺病毒基因组序列的E1区域的第342位～3522位，

上述元件从5’侧起按照HRE序列、hTERT启动子、E1A区域、E1B区域、E3区域的顺序连接。

2.如权利要求1所述的条件复制型腺病毒，其中，所述条件复制型腺病毒表达全长REIC蛋白质。

3.如权利要求1所述的条件复制型腺病毒，其中，所述条件复制型腺病毒表达REIC的C结构域蛋白质。

4.一种癌症治疗剂，其包含权利要求1～3中任一项所述的条件复制型腺病毒作为有效成分。

5.如权利要求4所述的癌症治疗剂，其中，条件复制型腺病毒在癌细胞中特异性地增殖并表达REIC蛋白质或REIC C结构域蛋白质，所表达的REIC蛋白质或REIC C结构域蛋白质通过内质网应激诱导癌细胞的细胞死亡，进而REIC蛋白质或REIC C结构域蛋白质诱导全身性的抗癌免疫活性。