CN1793343A

CN1793343A - 具有肿瘤靶向性和肿瘤自杀性的溶瘤性抗癌重组腺病毒

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Publication number: CN1793343A
Application number: CN 200510119019
Authority: CN
Inventors: 陈智博
Original assignee: Individual
Current assignee: Individual
Priority date: 2005-11-28
Filing date: 2005-11-28
Publication date: 2006-06-28

Abstract

本发明提供了两组(十种)溶瘤性重组腺病毒。一组由在病毒E1A基因上定点突变而产生。另一组以肿瘤专异性启动子取代E1A启动子而构建成。此外，一部分重组腺病毒因其纤维末端节加了RGD短肽而具有感染癌细胞的靶向性。同时，一部分重组病毒携带有肿瘤自杀性基因HSV₁－tkm。实验表明，这两组病毒能强力地感染肿瘤细胞，并进行大量复制和繁殖，最后将细胞溶解。被释放出来的子代腺病毒再感染周围的肿瘤细胞。如此繁殖感染循环，扩大病毒和肿瘤治疗基因的剂量效应和抗癌能力。这些重组腺病毒在正常细胞内缺乏自我复制能力，对正常组织的影响很轻。在动物皮下、肝脏和肺部的人的肿瘤模型试验中，这两组溶瘤性重组腺病毒都表现出很强的抗癌效应。

Description

具有肿瘤靶向性和肿瘤自杀性的溶瘤性抗癌重组腺病毒

技术领域

本发明属于抗癌领域，涉及恶性肿瘤基因治疗和溶瘤性病毒疗法。以遗传改造腺病毒的E1A基因而使重组腺病毒具有强大的溶瘤能力。同时，遗传修饰腺病毒的纤维基因(fiber)导致溶瘤性重组腺病毒具有肿瘤靶向性。当携带有肿瘤自杀性基因时，这些重组腺病毒表现出更强的抗癌效应。在老鼠身上建立的多种人的肿瘤模型的试验中，这些具有溶瘤性、肿瘤靶向性和肿瘤自杀性的重组腺病毒显示出强大的抗癌能力。在正常细胞中，这些重组腺病毒没有自我复制的能力，对正常组织的致病性很轻微，保证了临床应用的安全性。

背景技术

癌症已成为现代社会头号致死疾病，尤其在我国，随着现代化的进展，人民的生活和饮食习惯的变化(如饮酒、抽烟、吃更多的肉类、等等)和环境污染的加剧，近十年来，肺癌、肝癌、胃癌、鼻咽癌、食道癌、肠癌、宫颈癌等的发病率呈快速上升趋势。目前各国对恶性肿瘤的治疗依然是以手术摘除为主，并加以化疗和放疗，这些常规的治疗方法对早期癌症有一定的效果，但对大多数的中晚期或转移扩散了的恶性肿瘤则效果欠佳，且伴有明显的副作用。因此，人们在研发新的癌症诊断技术的同时，也在不断地探索新的癌症治疗方法。

以腺病毒作载体的肿瘤基因治疗就是近年来兴起的一种很好的新方法。腺病毒自从上个世纪五十年代被分离鉴定以来，有关它的各个学科都得到了广泛的研究，知之甚深。最常用的肿瘤基因治疗的病毒载体是人的腺病毒5型，简称ad5。因为ad5具有如下优点：(1)具有广谱的感染力，能感染人类多种器官和组织的细胞；(2)安全性高，除ad4，ad7，ad11，ad21和ad37型对人有致病性外(如引起气管炎、结膜炎和婴儿胃肠炎等)，ad5和其它型都无明显的致病症状；(3)无引起宿主细胞的基因突变，因为病毒的DNA不整合到宿主细胞的染色体上；(4)易于培养繁殖，便于大规模生产和纯化。

ab5是不含包膜的DNA病毒，形状为规则的二十个三角形面体，并在每个角上长出一条纤维，即在外壳表面共有十二条纤维。腺病毒入侵细胞时主要通过粘附和进入两个步骤。首先是病毒纤维的末端节以高度亲和性粘在细胞表面的腺病毒受体(CAR)上。然后病毒外壳蛋白五邻体的RGD短肽与细胞表面的受体结合，引发细胞摄粒作用，将病毒吞饮入细胞内。病毒在细胞质内解体后，病毒的DNA(总长约36Kb)进入到细胞核内，在那里进行基因转录和DNA复制。根据腺病毒侵入细胞的基理，人们试图通过改造或者修饰病毒纤维的末端和五邻体的RGD短肽来改变腺病毒的宿主范围，达到降低病毒对人正常细胞的感染，使病毒靶向肿瘤细胞，从而提高基因治疗的效果。本发明在这方面有了很好的建树。

腺病毒DNA进入细胞核后，首先是转录病毒的E1A基因。合成的E1A基因产物(蛋白)再引导E1B，E2，E3，和E4等病毒基因的表达。E1A基因产物激发细胞进入DNA复制期(S期)，E1B基因产物则影响mRNA的代谢、宿主细胞的蛋白合成和防止细胞提前进入凋亡期。E2基因产物是病毒DNA复制所必需的，而E3基因产物则主要调节宿主的免役反应。E4基因产物也参与DNA复制和病毒晚期基因(L1，L2，L3，L4和L5)的表达。这5个晚期基因的表达都起始于病毒的主要晚期启动子(MLP)。由于E3基因的产物是病毒DNA复制和病毒组装的非必需品，所以，E3基因常被除去以提供空间来装入外源治疗基因。因为MLP启动子主要在病毒繁殖的晚期活动，它常被用来调控外源治疗基因的表达，以期减少治疗基因的表达对病毒的影响。E1A和E1B基因也常被人们进行改造，以期使ad5成为肿瘤特异性的治疗基因载体。即E1A或者E1B突变型的ad5载体能专一性地在肿瘤细胞中进行复制、繁殖，将肿瘤细胞溶解和杀死(故称为溶瘤性腺病毒载体)，而对正常细胞没有(或者很轻)影响。本发明概括了我们在重组肿瘤特异性ad5载体和组织特异地表达肿瘤治疗基因方面的努力和取得的显著成效。

第一代肿瘤基因治疗的腺病毒载体不具有自我复制的能力。在这类载体上，E1A，E1B和E3基因被去除掉。它们一般只能在带有E1基因的细胞株(如HEK293)中繁殖。E1区间则由治疗基因取代。肿瘤治疗基因常为肿瘤抑制基因(如p53，Rb等)、各种干扰素基因和自杀性(毒性)基因(如CD，HSV₁-tk等)。临床表明，以没有复制能力的ad5作肿瘤治疗基因的载体是安全的。80％的成人都有ad5的抗体，所以少于15％的癌症病人对ad5载体表现免疫反应症状。然而，治疗肿瘤的临床试验效果并不理想。因为腺病毒对肿瘤细胞的感染力较低，限制了治疗基因的表达和疗效。同时，对肝脏细胞则有高度的感染力。当治疗基因为自杀性(毒性)基因且其表达为非专一性(如由CMV启动子调控)时，肝脏会表现中毒反应。

第二代肿瘤基因治疗的ad5载体为溶瘤性重组腺病毒。在这类病毒中，E1A或者E1B基因被遗传突变，或者它们的启动子被具有肿瘤特异性的启动子取代。因此，它们能在肿瘤或者具体一种肿瘤中进行DNA复制和繁殖，最终将肿瘤细胞溶解。而肿瘤细胞裂解所释放出来的腺病毒则可感染周围的肿瘤细胞，扩大它们的溶瘤能力和剂量效应。这类病毒载体对正常细胞也能感染，但无自我复制和繁殖的能力，所以对正常组织影响较轻。例如，ONYX-015(原名d11520)[参见：Bischoff J.R.等，1996.Sciences 274：373-376]，就是一种缺失了E1B-55KD基因的腺病毒(ad2和ad5复合型)。该病毒能在p53缺失型、突变型或失活型的肿瘤细胞中复制、繁殖、从而选择性地杀死肿瘤细胞。在正常细胞和p53正常型的肿瘤细胞中，该病毒则不能自我复制。ONYX-015已在美国进行了III期临床试验，显示一定的疗效。但也存在不少的缺点。首先，它对p53正常型的肿瘤基本无效。此外，它在肿瘤细胞内的自我复制能力仅为其野生型的10％。[参见：Fueyo J等2000，Oncogene 19：2-12]重组了一种E1A突变的腺病毒，名为Ad-△24。该病毒中E1A基因的CR-2区域(与pRb结合的位点)带有一段24bp的缺失，能有效地在pRb缺失型，突变型或细胞复制失控型的肿瘤细胞中复制、繁殖和溶解细胞。在老鼠身上进行的人类恶性肿瘤模型的试验中，该溶瘤性腺病毒表现出很强的抑制肿瘤生长的能力(优于ONYX-015)。由于绝大部分恶性肿瘤都是pRb缺失型或者是pRb信息线路缺陷型，所以，E1A突变型的溶瘤性腺病毒会有更好的应用前景。最近，一种带有E1A和E1B基因突变的溶瘤性腺病毒(CB1)也表现出很好的抗癌能力[参见：Gomez-Manzano C，等2004，oncogene 23：1821-1828]。有关ad-△24和CB₁的临床试验尚未见报道。

另一类的溶瘤性腺病毒则是用外源特异性的启动子来取代E1A或者E1B基因的启动子。利用肿瘤特异性的启动子来调控E1A基因的表达来达成腺病毒溶瘤(复制)能力的肿瘤专一性，从而防止病毒在正常细胞中复制繁殖，提供更好的临床安全性。针对前列腺癌的溶瘤性腺病毒CV706是一个典范[参见：Rodriguez R等1997，Cancer Research 57：2559-2563]。在这种病毒中，前列腺专性抗原基因的启动子(PSA)调控病毒E1A基因的表达。在前列腺抗原阳性的细胞中，CV706表现出很强的自我复制能力，能摧毁移植在老鼠身上人的前列腺肿瘤。第一期的临床试验结果也不错。此外，利用别的组织或者肿瘤专异性的启动子来调控E1A基因而重组成的溶瘤性腺病毒亦有很好的表现。例如以甲胎蛋白启动子(AFP)来调控E1A基因表达的溶瘤性腺病毒[参见：Hallenbeck P，L等1999，Human Gene Therapy10：1721-1733]。该病毒对肝癌有很强的杀伤力。用端粒反转录酶(hTERT)启动子取代E1A启动子而重组出来的腺病毒对多种肿瘤也有很强的溶瘤能力[参见：Wirth T.等2003，Cancer Research63：3181-3188]。

虽然溶瘤性腺病毒作为治疗恶性肿瘤的新方法，在临床前期和临床期的试验中都呈现出令人鼓舞的效果，但仍然存在着腺病毒对肿瘤细胞的低感染力的主要问题。腺病毒主要依赖细胞表面的腺病毒受体(CAR)来感染细胞的，而大部分肿瘤的细胞都携带较少或者缺乏腺病毒受体(CAR)，导致低感染率。为了提高腺病毒载体对肿瘤细胞的感染力，依赖受体CAR的感染途径必须改变。[参见：Dmitriev I.等，1998，Journal of Biology 72：9706-9713]以遗传工程的手段在病毒纤维的末端节插入一段RGD短肽。由于RGD短肽能与受体 integrin亲合，而肿瘤细胞常表达高量的

新的重组腺病毒(无自我复制能力)对肿瘤细胞有较高的感染力。

借鉴如上所述以腺病毒作癌症基因治疗所取得的可喜成果和存在的问题，我们经过多年的研究和探索，重组了一系列肿瘤专异性的溶瘤性腺病毒。这些腺病毒携带有肿瘤治疗基因和具有肿瘤靶向性。实验表明，这些新型的重组腺病毒具有很强的抗癌效果和很好的安全性。

发明内容

本发明提供了两组靶向性的溶瘤性腺病毒。它们能增强对肿瘤细胞的感染，携带有毒性基因HSV₁-tkm，能在肿瘤细胞中自我复制、繁殖和溶解肿瘤细胞。被释放出来的子代腺病毒继续感染周围的肿瘤细胞。如此不断的繁殖和感染循环，扩大病毒和治疗基因的剂量效应和抗癌能力，达到抑制肿瘤的生长和扩散，促使肿瘤缩小和肿瘤细胞凋亡。由于这些重组腺病毒具有肿瘤靶向性，对正常细胞的感染力有所降低，在正常细胞中缺乏自我复制繁殖的能力，所以对正常组织和细胞的副作用很轻或者不明显。提高了临床肿瘤治疗的安全性。

第一组溶瘤性重组腺病毒由在E1A基因上定点突变而产生。病毒的E1A蛋白通过其与p300/CBP和pRb的相互作用来促使宿主细胞进入DNA复制期。蛋白pRb能抑制转录因子E2F-1的活动而使细胞处在静止期。在E1A基因序列中，缺失4-25号氨基酸短肽可阻止E1A蛋白和p300/CBP的结合，而缺失111-123号氨基酸短肽则可使E1A蛋白失去与pRb结合的亲和位点[参见：Egan C.等，1988，Molecular and Cellular Biology，8：3955-3959]。我们使用PCR定点突变的方法，将含4-25号氨基酸短肽和含111-123号氨基酸短肽从E1A基因序列中除去。所产生的突变型E1A蛋白仅失去了与pRb和p300/CPB结合的能力，其他功能则没有改变。以突变型E1A基因(取名E1Ad12p)来重组的腺病毒失去了刺激宿主细胞进入DNA复制期的能力。所以，当这种带有E1Ad12p基因的腺病毒感染正常(或pRb正常型)细胞后，宿主细胞依然处在静止期(Go)，腺病毒无法进行自我复制繁殖。只有当这种E1Ad12p突变型的重组腺病毒感染pRb缺陷型或者pRb信息传递线路缺陷型的肿瘤细胞时，才能进行自我复制和繁殖。迄今为止，所诊断的人类肿瘤，几乎都是pRb缺陷型或者pRb信息传递缺陷型。故此，这组E1Ad12p突变型的重组腺病毒具有广谱溶瘤能力。

第二组溶瘤性重组腺病毒是以肿瘤专异性启动子取代E1A启动子而产生的。鉴于很多肿瘤的细胞都高度表达转录因子E2F-1，我们以人类的E2F-1基因的启动子来调控腺病毒E1A基因的表达。当野生型腺病毒ad5侵入细胞后，首先表达的是E1A基因。然后E1A基因的产物(蛋白)作为引导子启动其它腺病毒基因的表达和刺激宿主细胞进入DNA复制期(S)。当E1A基因由E2F-1启动子控制的重组腺病毒感染正常细胞后(绝大多数正常的细胞都是处在静止期的非增生性细胞)，由于E2F-1启动子不能启动，E1A基因不能表达，所以病毒不能自我复制繁殖，宿主细胞依然在静止期。可是，在这种重组病毒侵入肿瘤细胞后，E2F-1启动子被高频启动，E1A基因被高度表达，从而使腺病毒能有效地进行自我复制、繁殖和再感染，表现强大的抗癌能力。同样的原理，我们也用人类染色体端粒酶的反转录酶(hTERT)启动子来取代E1A基因的启动子。因为在绝大部分人的体细胞中，染色体端粒酶以及它的重要组成部分反转录酶hTERT都没有表达。可是在绝大多数肿瘤中(＞90％)，这两种酶则得到高度表达。所以，以hTERT启动子调控E1A基因表达而重组成的溶瘤性腺病毒能表现出强大的抗癌效应，而对正常体细胞则没有明显的致病性。此外，我们选用人的甲胎蛋白(AFP)启动子来调控重组溶瘤腺病毒的E1A基因的表达。据统计，约80％的肝癌患者都表现出高度的甲胎蛋白水平，即甲胎蛋白启动子呈高频活动。由于肝癌在我国的发病率很高，我们构建由AFP启动子控制E1A基因的溶瘤性腺病毒，就是直接针对肝癌细胞的。这种重组腺病毒能在肝癌细胞中自我复制、繁殖和再感染，对肝癌有很大的杀伤力。这种病毒对正常的肝细胞或者体细胞则没有造成明显的影响。

本发明的大部分溶瘤性腺病毒具有感染肿瘤细胞的靶向性。如在前面背景技术部分所述，腺病毒感染细胞的第一步是通过其纤维蛋白末端节与在细胞表面的腺病毒受体CAR相互认识和结合。这一步很重要，它决定了病毒感染细胞的能力。紧接着的第二步为病毒外壳上的五邻体的RGD短肽与细胞膜上的受体结合，引发细胞摄粒作用，将病毒吞进细胞内。腺病毒受体CAR普遍表达在上皮细胞和肝细胞。但在肿瘤细胞中，CAR的表达水平则变化很大。大部分肿瘤的细胞都含有很少的腺病毒受体CAR。而另一方面，肿瘤细胞普遍高度表达受体

所以，我们以遗传工程的手段，在腺病毒纤维蛋白末端节的H1-环上插入RGD短肽，使RGD与受体integrin的亲合也成为腺病毒感染细胞的关键性第一步。从而显著地提高了这些溶瘤性重组腺病毒对肿瘤细胞的感染力(靶向性)和增强它们的抗癌效应。

在本发明中，有一半溶瘤性重组腺病毒为E3基因部分缺失型。E3基因缺失所留下的空间被用来安置突变型的单纯疱疹病毒胸苷激酶基因(HSV₁-tkm)。胸苷激酶的底物为胸苷类衍生物，例如，acyclovir(ACV)，ganciclovir(GCV)，penciclovir(PCV)。这类衍生物基本上是没有毒性的。当它们被胸苷激酶磷酸化后，就变成对细胞有很强毒性的药物(如2、3-磷酸核苷)。其毒性表现为(1)直接杀死细胞，(2)抑制DNA复制和细胞繁殖。因而HSV₁-tk被称为毒性基因或者自杀性基因，广泛地用于癌症基因治疗。突变型的HSV₁-tkm比其野生型HSV₁-tk有5-7倍强的对胸苷类衍生物(如ACV，GCV)磷酸化的活性，而对胸苷嘧啶的亲和性则有所降低[参见：Black M.E等，2001，Cancer Research 61：3022-3026]。所以突变型的HSV₁-tkm表现更强的抗癌效应，为更好的癌症治疗基因。我们有一半的溶瘤性重组腺病毒携带有毒性基因HSV₁-tkm，以统合腺病毒载体的溶瘤性、靶向性和自杀性基因HSV₁-tkm来攻击肿瘤细胞，提高治疗癌症的临床效果和减轻副作用反应。

在我们的溶瘤性重组腺病毒中，自杀性基因HSV₁-tkm的表达是由ad5的主要晚期启动子(MLP)或者人的循环氧合酶2(COX-2)启动子来调控的。所以，HSV₁-tkm的表达具有时间上或者组织上的特异性。ad5的MLP启动子是在病毒DNA复制完后才高频活动来合成病毒外壳蛋白。故由MLP启动子控制的HSV₁-tkm自杀性基因只能在病毒可自我复制的癌细胞中表达，从而专一性地抑制和杀死癌细胞。另一个被应用的组织特异性启动子为人的循环氧合酶2(COX-2)启动子。在正常的生理条件下，大多数组织都没有表达COX-2基因，尤其在肝脏细胞，COX-2启动子没有活动。但在肠胃癌和肝癌中，COX-2基因呈高度表达。COX-2启动子的这种在肝脏静止而在肿瘤中高度活跃的特性对以腺病毒载体携带毒性基因来治疗癌症显得更为可贵。因为(1)血管内表皮细胞层的阻隔和血流的快速循环，(2)肝脏缺少完整的血管构造和肝细胞表膜存在着大量的腺病毒受体CAR，当腺病毒载体以静脉注射进入人体后，90％的病毒都聚集在肝脏。如果腺病毒载体上的毒性基因能在正常肝细胞中高度表达，则很可能伤害肝脏，导致肝中毒。本发明使用COX-2启动子来调控毒性基因HSV₁-tkm，则HSV₁-tkm只在癌细胞中表达，专一性地杀死癌细胞。在正常肝细胞中，HSV₁-tkm不能表达，没有伤害肝脏。

概括地说，本发明应用了最新的科学知识和技术，综合利用了重组腺病毒的溶瘤性、靶向性和肿瘤毒性基因来进攻癌细胞，明显地提高了抗癌能力和安全性。本发明根据不同种类肿瘤的特异性，提供了多种腺病毒癌症基因治疗的选择方案。例如adE1Adl2p、adE1Adl2p.RGD、adE1Adl2P.MLPtkm.RGD、adE1Adl2p.COXtkm.RGD、adE2F1.RGD、adE2F1.MLPtkm.RGD、adhTERT.RGD和adhTERT.MLPtkm.RGD具有广谱抗癌能力；对肝癌可选用adAFP.RGD、adAFP.COXtkm和adE1Adl2p.COXtkm.RGD；对脑癌、肺癌、卵巢癌、神经胶质瘤、畸胎瘤等则可选用adE1Adl2p.RGD、adE1Adl2P.MLPtkm.RGD、adE2F1.RGD或adE2F1.MLPtkm.RGD。溶瘤性重组腺病毒可通过多种途径到达肿瘤组织，例如肿瘤直接注射、静脉注射、腹腔注射和气管喷射等。本发明的肿瘤基因治疗方法可与传统肿瘤治疗方案(如手术、放疗等)结合使用。例如，对不能手术摘除的原位肿瘤，可用我们的溶瘤性重组腺病毒结合放疗来医治；对于由手术摘除原位肿瘤的病人，也可用我们的溶瘤性重组腺病毒结合放疗来摧毁扩散和转移的肿瘤或者肿瘤细胞。

本发明的溶瘤性重组腺病毒由如下方案构建而成：

一、遗传改造E1A基因成缺失变异基因E1Adl2p：

从ad5质粒pXC1中以内切酶SSPI和XbaI分离出含有大部分E1A基因序列的1Kb DNA片段，克隆到pGEM-7Zf载体质粒上。所产生的重组质粒取名为pGEM-7E1A。采用PCR定点突变的方法，首先使E1A基因序列中的nt10-75片段缺失，然后使nt333-369片段缺失。双缺失突变了的E1A基因序列再从pGEM-7E1Adl2p质粒上以SSPI/XbaI内切酶切出，克隆回到pXC1上。所得到的质粒命名为pXC1E1Adl2p。

二、插入RGD-4C短肽到ad5纤维基因Fiber上：

从质粒pBHGE3i中以BamH1内切酶将ad5右端14.5kb DNA片段切出，克隆到pGEM3载体上。此段DNA含有野生型的E3基因和纤维基因fiber。所得重组质粒取名为pGEM14.5。同样，ad5右端12Kb DNA片段也以BamH1内切酶从pBHGE10i中分离出来，克隆到pGEM3质粒上。该12kb DNA片段含有fiber基因，但缺失E3基因。所得重组质粒名为pGEM12。以内切酶KpnI和SphI同时消化，从pGEM14.5中分离出2.4kb的DNA片段，并克隆到pGEM3载体上，所产生的质粒命名为pGEM2.4。此段2.4kb的DNA含有fiber基因的大部分序列(从nt183到nt1746)。以PCR定点突变的方法，在纤维基因fiber序列的nt1638后插入27nt的序列TGT GAC TGC CGC GGA GAC TGT TTC TGC。此段27nt序列转译成相应的肽链为CDCRGDCFC。也即在病毒纤维蛋白末端节的H1-环上加入了RGD短肽。突变后的2.4kb DNA片段通过KpnI和SphI酶切点从pGEM2.4RGD上载下来，取代pGEM14.5以及pGEM12质粒上相应的野生型2.4kbDNA序列。所构建成的重组质粒分别取名pGEM14.5RGD和pGEM12RGD。最后，突变后的14.5kb和12kb DNA片段分别从pGEM14.5RGD和pGEM12RGD中以BamH1内切酶切出，再分别克隆回到pBHGE3i和pBHGE10i上以取代相应的野生型DNA片段。所构建的质粒取名为pBHGE3iRGD和pBHGE10iRGD。

三、以E2F-1、hTERT和AFP启动子分别取代E1A启动子来调控E1A基因：

首先对在pGEM7E1A上的E1A启动子DNA序列进行定点突变。在ad5序列上的nt 361-366(GACTTT)改变成内切酶EcoRI的切点GAATTC，而在nt517-522(GTAGAG)突变成内切酶SalI的切点GTCGAC。以EcoRI和SalI消化，除去pGEM7E1A上的E1A启动子部分序列(156bp)，插入两端配有相应酶切点E2F-1的启动子DNA(290bp)。所取得质粒名为pGEM7E2F1。同理，270bp的hTERT启动子DNA序列取代在pGEM7E1A上的156bp E1A启动子序列。新的质粒取名为pGEM7hTERT。1.8kb的AFP启动子为改造后的序列。它含有两组AB加强子序列和6组sd抑制子序列来调控AFP启动子的活动。同样，以两端配有EcoRI和SalI切点的1.8kb AFP启动子DNA序列取代了在pGEM7E1A的156bp E1A启动子序列。得到的质粒称为pGEM7AFP。E1A启动子被取代的ad5DNA序列再分别从质粒pGEM7E2F1、pGEM7hTERT和pGEM7AFP中以XbaI和SSPI内切酶切下，克隆回到pXC1上。所得的质粒分别取名为pXC1E2F1、pXC1hTERT和pXC1AFP。

四、产生突变型的HSV₁-tkm：

克隆野生型的1.2kb HSV₁-tk基因序列到pCR2.1载体上，然后以PCR定点突变的方法，将HSV₁-tk酶活性中心的重要氨基酸遗传密码进行定位改变。结果为143号密码CTC(亮氨酸)变为ATC(异亮氨酸)，144号密码ATC(异亮氨酸)变为TTC(笨丙氨酸)，145号密码TTC(笨丙氨酸)变为TTA(亮氨酸)，152号密码GCC(丙氨酸)变为TTC(笨丙氨酸)和153号密码CTC(亮氨酸)变为ATG(蛋氨酸)。突变后的基因取名为HSV₁-tkm，而相应的重组质粒取名为pCRHSV.tkm。

五、构建由MLP启动子和COX-2启动子控制HSV₁-tkm表达的两种质粒：

以EcoRI和HindIII内切酶把1.2kb HSV₁-tkm DNA序列从pCRHSV.tkm质粒切出，分别克隆到pMLP和pCOX-2载体上。所得的质粒命名为pMLP.tkm和pCOX.tkm。在pMLP.tkm中，HSV₁-tkm基因由其5′上游1.5kb的MLP启动子控制其表达。在HSV₁-tkm基因的3′端，则有215bp的BGHpA DNA序列作为HSV₁-tkm基因转录的终止信号。在pCOX.tkm中，HSV₁-tkm基因的表达是由1.5kb的人的COX-2启动子控制，其转录的终止信号也同样是215bp的BGHpA DNA序列。然后，以PacI内切酶将含有MLP启动子HSV₁-tkm基因和BGHpA的3kb DNA序列从pMLP.tkm切出，分别克隆到pBHGE10i和pBHGE10i RGD载体上。所获质粒取名为pBHGE10iMLPtkm和pBHGE10iMLPtkm.RGD。同样的方法，含有COX-2启动子、HSV₁-tkm基因和BGHpA的3kb DNA序列也被分别克隆到pBHGE10i和pBHGE10iRGD载体上，得到重组质粒pBHGE10iCOXtkm和pBHGE10iCOXtkm.RGD。

六、构建E1A突变型溶瘤性重组腺病毒：

在通过上边方案取得ad5穿梭质粒pXC1E1Adl2p以及ad5骨架质粒pBHGE3i、pBHGE3iRGD、pBHGE10iMLPtkm.RGD和pBHGE10iCOXtkm.RGD后，我们以每一个骨架质粒同穿梭质粒pXC1E1Adl2p共同转染HEK 293细胞。通过细胞内病毒DNA同源重组产生出E1A突变型溶瘤性腺病毒。经过三次重复单一噬斑筛选提纯、腺病毒DNA的内切酶图谱比对、PCR鉴定和tkm活性分析而确认所需的各个重组腺病毒。具体的组合为：1)穿梭质粒pXC1E1Adl2p与骨架质粒pBHGE3i在体内重组产生adE1Adl2p；2)穿梭质粒pXC1E1Adl2p与骨架质粒pBHGE3iRGD在体内重组产生adE1Adl2p.RGD；3)穿梭质粒pXC1E1Adl2p与骨架质粒pBHGE10iMLPtkmRGD在体内重组产生adE1Adl2p.MLPtkm.RGD；4)穿梭质粒pXC1E1Adl2p与骨架质粒pBHGE10iCOXtkmRGD在体内重组产生了adE1Adl2p.COXtkm.RGD。在adE1Adl2p中，仅E1A基因是突变型(E1Adl2p)，其它所有的基因都是野生型。adE1Adl2p.RGD对肿瘤细胞具有更强的感染能力。因为此种重组病毒的纤维末端节上加了RGD短肽，能与细胞外膜上腺病毒受体CAR和integrin结合。adE1Adl2p.MLPtkm.RGD和adE1Adl2p.COXtkm.RGD是在adE1Adl2p.RGD基础上增加HSV₁-tkm基因。所以它们除有adE1Adl2p.RGD的功能外，还有以HSV₁-tkm毒杀肿瘤细胞的能力。这四种重组病毒都具有广谱的抗癌能力。

七、构建以肿瘤特异性启动子控制E1A基因表达的溶瘤性重组腺病毒：

通过如前面所述实验取得ad5穿梭质粒pXC1E2F1、pXC1AFP、pXC1hTERT和ad5骨架质粒pBHGE3iRGD、pBHGE10iMLPtkm.RGD、pBHGE10iRGD、pBHGE10iCOXtkm、pBHGE10iMLPtkm后，我们以HEK 293细胞作宿主，重组了如下溶瘤性腺病毒：

A)以穿梭质粒pXC1E2F1与骨架质粒pBHGE3iRGD在293细胞中进行DNA同源重组，产生adE2F1.RGD。以穿梭质粒pXC1E2F1同骨架质粒pBHGE10iMLPtkmRGD进行体内重组，产生adE2F1.MLPtkm.RGD。

B)以穿梭质粒pXC1AFP同骨架质粒pBHGE10iRGD进行体内DNA同源重组，产生adAFP.RGD。以穿梭质粒pXC1AFP与骨架质粒pBHGE10iCOXtkm进行体内重组，得到adAFP.COXtkm。

C)以穿梭质粒pXC1hTERT同骨架质粒pBHGE3iRGD进行体内重组，产生adhTERT.RGD。以穿梭质粒pXC1hTERT同骨架质粒pBHGE10iMLPtkm进行体内重组，获得adhTERT.MLPtkm。

附图说明

图1：本发明所阐述的十种不同溶瘤性重组腺病毒的示意图。

图2：溶瘤性重组腺病毒在肿瘤细胞和正常细胞中自我复制及繁殖能力的比较。

A.肿瘤细胞 B.正常细胞

图3：装配在纤维蛋白末端节上的RGD短肽对增强重组腺病毒感染肿瘤细胞能力的检测。

图4：比较溶瘤性腺病毒对癌细胞和正常细胞的致病性效应。

A.肝癌细胞Hep3B B.正常乳腺上皮细胞HMEC

图5：溶瘤性重组腺病毒中外源毒性基因HSV₁-tkm在肿瘤细胞(肝癌细胞株Hep3B)的表达水平检测。

图6：药物前体GCV被HSV₁-tkm激酶磷酸化后对肿瘤细胞毒性效应的分析。

图7：溶瘤性腺病毒对动物皮下人的肿瘤模型(宫颈癌细胞株C33A)的抗癌效应。

A.老鼠身上人的宫颈癌模型体积变化的照片记录。

B.经溶瘤性重组腺病毒处理后，老鼠身上肿瘤体积变化的测定。

图8：HSV₁-tkm和GCV对动物皮下人的肿瘤模型(肺癌细胞株H2122)的抗癌效应。

A.老鼠身上人的肺癌模型体积变化的照片记录。

B.经携带有HSV₁-tkm毒性基因的溶瘤性重组腺病毒和GCV处理后，肿瘤体积变化的观察结果。

图9：溶瘤性重组腺病毒对动物肝脏人的肿瘤模型(能稳定地表达萤火虫荧光素酶作为肿瘤报告基因的肝癌细胞株Hep3B-ffLuc)的抗癌效应。

A.老鼠肝脏人的肝癌模型的照片记录。

B.经溶瘤性重组腺病毒处理后，老鼠肝脏人的肝癌(Hep3B-ffLuc)报告基因萤火虫荧光素酶(Firefly Luciferase)的总活性。

图10：溶瘤性重组腺病毒对动物肺部人的肿瘤模型(结肠癌细胞株Ls174T-ffLuc)的抗癌效应。

A.老鼠肺部人的结肠癌模型的照片记录。

B.经溶瘤性重组腺病毒处理后，老鼠肺部人的结肠癌(Ls174T-ffLuc)报告基因萤火虫荧光素酶的总活性。

具体实施方式

本发明所使用的分子生物学、细胞生物学、分子病毒学、肿瘤学、实验室动物学，病理学和DNA重组等技术和实验方法，都是相应科学领域中常用和标准的。本发明中所用的初始腺病毒5型(ad5)的质粒pXC1、pBHGE3i和pBHGE10i来自于加拿大的Microbix BiosystemsInc公司。我们按照该公司提供的实验方法进行了本发明的溶瘤性腺病毒的构建、筛选、增殖和提纯。本发明所使用的人的肿瘤细胞株主要购自于美国的ATCC公司，而人的正常细胞(株)则来自于美国的Clonetics公司。

实施例1：溶瘤性腺病毒的重组构建。

本发明共有十种不同的溶瘤性重组腺病毒。具体各种病毒的产生方法和步骤已在前面技术方案中描述，在此不再重复。图1为这十种重组腺病毒基因组DNA简图，主要标明本发明中对ad5所进行遗传改造的位点和基因。

实施例2：噬斑法检测重组腺病毒的自我复制能力。

为了评价本发明的重组腺病毒的复制能力，我们以野生型的ad5d1309(其E3有部分缺失和插入突变)作对照，用同等剂量的病毒(MOI为10)分别感染人的肝癌细胞株Hep3B、宫颈癌细胞株Hela、肺癌细胞株H661、正常肝细胞Chang liver、正常乳腺上皮细胞HMEC和正常肺成纤维细胞WI38。三天后，收集细胞。经三次-80℃和30℃的冻融释放出病毒体后，细胞上清液用以感染HEK 293细胞来进行噬班法滴度测定病毒量(pfu)。在同一种细胞株内，重组病毒和野生型病毒所产生的病毒量的比较，则可表明该重组病毒的复制能力。图二列出各组具有代表性的重组腺病毒在上述3种癌细胞株和3种正常细胞中的复制能力(以野生型的ad5d1309的复制能力当100％作比对)。adE1Adl2p.RGD、adE2F1.RGD和adhTERT.RGD在肿瘤细胞株中都有与野生型相当的复制能力。adAFP.RGD在肝癌细胞株Hep3B中，有强于ad5d1309的复制能力。但在没有表达AFP的癌细胞株H661和Hela中，adAFP.RGD的复制能力则相对较弱。所有这些重组病毒在人的正常细胞中都基本上没有自我复制的能力。

实施例3：检测在纤维蛋白末端节加上RGD短肽对病毒肿瘤细胞感染力的影响。

我们选用了人的膀胱癌细胞株T24、卵巢癌细胞株HEY和胰腺癌细胞株Hs7667来比较adE1Adl2p和adE1Adl2p.RGD的感染力。这三种癌细胞都有中等数量的腺病毒受体CAR和多量的以同等剂量的两种病毒(MOI为50)分别感染癌细胞。5个小时后，收获细胞，并从细胞中提取病毒DNA。然后以数量PCR的方法来扩增腺病毒DNA中1Kb的MLP片段。所得PCR DNA的量如图三所示。在这些癌细胞中，纤维蛋白末端节配有RGD短肽的重组腺病毒adE1Adl2p.RGD的感染力是其对照病毒adE1Adl2p的4-6倍。显然，RGD短肽可有效地增强重组腺病毒对含有多量

的癌细胞感染的靶向性。

实施例4：比较溶瘤性腺病毒对癌细胞和正常细胞的毒性效应。

重组腺病毒和野生型腺病毒ad5d1309以1×10⁵-8×10⁶pfu的剂量范围分别感染肝癌细胞株Hep3B、肺癌细胞株H661、宫颈癌细胞株Hela、正常肝细胞Chang liver、正常乳腺上皮细胞HMEC和正常肺成纤维细胞WI38。我们以细胞增殖试剂WST-1(购自美国Roche公司)来测定细胞毒性。根据Roche公司提供的WST-1实验方法，我们将细胞培养在96-洞的培养盘中，每洞约有1×10⁵个细胞。在病毒感染后72个小时，对每洞细胞加入10微升的WST-1试剂，再培养24个小时，然后用EL1SA测定仪测量每洞细胞在440nM光谱的吸收值(OD440nM)。吸收值高的表明细胞增殖正常，而吸收值低的，则表明细胞受到毒害，没能正常增殖。实验结果为：受测试的重组腺病毒对癌细胞都有很强的毒性效应，而对正常细胞的毒性效应则很轻微。图4A为受测试的重组腺病毒对肝癌细胞株Hep3B的毒性效应。这些重组腺病毒有近似或超过野生型腺病毒ad5d1309对癌细胞的毒性效应。图4B为受测试的重组腺病毒对正常乳腺上皮细胞HMEC的毒性效应。完全不同于野生型ad5d1309，重组腺病毒对正常乳腺上皮细胞的毒性非常轻微，与没有复制能力的腺病毒载体adv对细胞的毒性相似。

实施例5：检测溶瘤性重组腺病毒中毒性基因HSV₁-tkm的表达水平。

重组腺病毒adE1Adl2p.MLPtkm.RGD、adE1Adl2p.COXtkm.RGD、adE2F1.MLPtkm.RGD、adAFP.COXtkm和adhTERT.MLPtkm分别以3×10⁵--1×10⁹pfu的剂量范围感染肝癌细胞株Hep3B、肺癌细胞株A549和HEK 293细胞(培养在12-洞的培养盘中)。两天后，收集细胞、提取蛋白上清液。以[H³]-GCV作底物，分析胸苷激酶HSV₁-tkm的活性。结果表明，HSV₁-tkm毒性基因在这些重组腺病毒中能有效地表达。图5为这些重组腺病毒在肝癌细胞株Hep3B中表达HSV₁-tkm的水平。

实施例6：胸苷激酶HSV₁-tkm对药物前体GCV的磷酸化增强溶瘤性腺病毒对癌细胞的毒性效应。

重组腺病毒adE1Adl2p.MLPtkm.RGD、adE1Adl2p.COXtkm.RGD、adAFP.COXtkm、adE2F1.MLPtkm.RGD和adhTERT.MLPtkm以剂量1×10⁶pfu分别感染肺癌细胞株A549、肝癌细胞株Hep3B和结肠癌细胞株HT29(在96-洞培养盘中)。两天后，加入0.0003-1微克分子(μM)的GCV到培养液中，继续培养两天。然后，以WST-1试剂(如在例4中所述)测定细胞毒性效应。实验结果显示，HSV₁-tkm/GCV对癌细胞有显著的杀伤力。图6为肝癌细胞株Hep3B的试验结果。从图中可见，携带有HSV₁-tkm毒性基因的adE1Adl2p.MLPtkm.RGD或者adE1Adl2p.COXtkm.RGD都比其对照adE1Adl2p.RGD有更强的细胞毒性。

实施例7：溶瘤性重组腺病毒对动物皮下人的肿瘤模型的抗癌效应。

在雄性无胸腺裸鼠的下背部进行皮下注射约1百万个宫颈癌细胞(C33A)以建立人的肿瘤模型。当肿瘤直径约达0.5厘米时，每天对肿瘤注射5×10⁹pfu剂量的重组腺病毒，连续5天。每隔5天测量肿瘤体积(V＝L×W²÷2)的变化，连续记录40天。图7A为肿瘤经adhTERT.RGD和1X PBS(负对照)处理后的照片。图7B为经过adE1Adl2p、adE1Adl2p.RGD、adE2F1.RGD、adAFP.RGD、adhTERT.RGD、野生型腺病毒ad5d1309和1X PBS处理后，各组(每组4个老鼠)老鼠身上肿瘤体积变化(相对起始时的100％)的总结。接受1X PBS处理的负对照组，肿瘤快速生长，40天后肿瘤体积约为原来的12倍。接受重组腺病毒处理的各组，肿瘤生长缓慢，仅为起始时的1.5-2倍，优于野生型腺病毒ad5d1309的抗癌效应(肿瘤长了3.5倍)。重组腺病毒adAFP.RGD对宫颈癌的抗癌能力较差，该组肿瘤的体积为原来的5倍。因为在宫颈癌细胞株C33A中的AFP表达水平很低，使adAFP.RGD的AFP启动子未能充分活动。

实施例8：HSV₁-tkm和GCV对动物皮下人的肿瘤模型的抗癌效应。

皮下注射约1百万个人的肺癌细胞(H2122)到雄性无胸腺裸鼠的下背部以建立人的肿瘤模型。当肿瘤直径约达0.5厘米时，连续5天以每天注射5×10⁹pfu剂量的重组腺病毒到肿瘤中去。然后每天静脉注射2毫克的GCV，连续5天。每5天测量肿瘤的体积变化，连续记录40天。每组处理有4个老鼠。图8A为经adE1Adl2p.MLPtkm.RGD/GCV和1X PBS/GCV处理后肿瘤生长变化的照片记录。图8B为肿瘤经注射重组腺病毒adE1Adl2p.RGD、adE1Adl2p.MLPtkm.RGD、adE1Adl2p.COXtkm.RGD、adE2F1.RGD、adE2F1.MLPtkm.RGD、adhTERT.MLPtkm、adhTERT.RGD、1X PBS和经GCV处理后体积变化的总结。结果清楚地证明，在每小组重组腺病毒中，携带有毒性基因HSV₁-tkm的比其相应没有携带HSV₁-tkm的有更强的抗癌能力。例如，adE1Adl2p.COXtkm.RGD/GCV处理组的肿瘤在45天时的体积是其起始时的1.5倍，而adE1Adl2p.RGD/GCV组的肿瘤体积则为原来的3倍。所以，HSV₁-tkm/GCV能显著地增强溶瘤性腺病毒的抗癌能力。

实施例9：溶瘤性重组腺病毒对动物肝脏人的肿瘤模型的抗癌效应。

我们首先建立了稳定表达萤火虫荧光素酶(Firefly Luciferase，ffLuc)的肝癌细胞株Hep3B-ffLuc。以ffLuc作为肿瘤细胞的报告基因来评估重组腺病毒的抗癌能力。在雄性无胸腺裸鼠的前腹部以外科手术切开一个小口，用平嘴镊子拉出部分前叶肝，并注射入约2×10⁵的Hep3B-ffLuc肝癌细胞，然后缝合伤口。两个星期后，静脉注射5×10⁹pfu剂量的重组腺病毒，连续注射5天(每组处理有4个老鼠)。自病毒注射后一个月，采集老鼠肝脏及查看肿瘤是否扩散到别的器官和腹腔。然后把整个肝脏打烂、提取蛋白质上清夜和测定ffLuc酶的活性(用美国Promega公司的Luciferase Assay System)。图9A为老鼠肝脏的记录照片。在负对照组(1X PBS)，老鼠的肝脏有1到4个较大的肿瘤，并在其中两个老鼠的十二指肠—胃—胰区域发现长有肿瘤。接受重组腺病毒处理的各组老鼠，它们的肝脏一般长有1-2个小肿瘤，也有几个长有3-4个小肿瘤的，但别的器官或组织则没有发现肉眼可见的肿瘤。图9B总结各组老鼠肝脏的肿瘤报告基因ffLuc的产物荧光素酶的活性。经过重组腺病毒处理的各组老鼠的肝脏，它们的荧光素酶的活性仅及负对照组(1X PBS)的6-12％。尤其是以adAFP.RGD处理的一组老鼠，它们肝脏的肿瘤报告基因产物的活性最低，只为其对照组(1XPBS)的6％。这是肝癌细胞株Hep3B的AFP启动子高度活跃，使adAFP.RGD能高效自我复制而表现出更强的溶瘤能力。

实施例10：溶瘤性重组腺病毒对动物肺部人的肿瘤模型的抗癌效应。

我们以稳定表达ffLuc的结肠癌细胞株(Ls174T-ffLuc)，通过静脉注射(2×10⁵细胞)，在雄性无胸腺裸鼠的肺部建立人的肿瘤模型。自细胞注射后两个月，老鼠(每组4个)接受连续5天的5×10⁹pfu/天剂量的重组腺病毒静脉注射。注射的病毒为adE1Adl2p、adE1Adl2p.RGD、adE2F1.RGD、adAFP.RGD和adhTERT.RGD。一个月后，采集老鼠的肺器官，并观察肿瘤是否长在别的器官和腹腔。然后将整个肺来制备蛋白质上清液，并测定肿瘤报告基因产物荧光素酶的活性。图10A为老鼠肺器官的记录照片。经过溶瘤性腺病毒处理的各组老鼠，它们肺的体积与正常老鼠肺体积无异，仅长有一些小的肿瘤。但接受1X PBS注射的负对照组，老鼠的肺长得很大，是正常肺的5-7倍，且长满了肿瘤，呈不均匀的深褐色。其中一个老鼠的肝脏也长有肿瘤。图10B总结各组老鼠肺的肿瘤报告基因ffLuc产物荧光素酶的活性。接受重组腺病毒注射的各组老鼠，它们肺的荧光素酶的活性一般只是对照组(1X PBS)的4-7％(adAFP.RGD组除外，它们肺的ffLuc活性接近对照组的50％。这是由于结肠癌细胞株Ls174T没有表达AFP)。可见，这些溶瘤性腺病毒具有很强的抗癌能力。

Claims

1、一组重组腺病毒，其特征在于突变型的腺病毒E1A基因产物失去与pRb和p300/CBP结合的能力、腺病毒纤维基因fiber上插入RGD-4C短肽遗传密码和携带有肿瘤自杀性基因。

2、一组重组腺病毒，其特征在于腺病毒E1A基因的启动子被肿瘤特异性外源启动子取代、腺病毒fiber基因上插入RGD-4C短肽遗传密码和携带有肿瘤自杀性基因。

3、权利要求1所述的重组腺病毒，其特征在于其中所述病毒能靶向感染肿瘤细胞、在pRb功能缺陷型和pRb信息传递线路缺陷型的肿瘤细胞内大量复制繁殖、肿瘤特异性地表达肿瘤自杀性基因和溶解肿瘤细胞并释放出子代腺病毒继续感染周围的肿瘤细胞。如此繁殖感染循环，扩大病毒和治疗基因的剂量效应和抗癌能力。而在正常细胞中这些腺病毒没有自我复制繁殖能力，对正常组织没有伤害作用。

4、权利要求2所述的重组腺病毒，其特征在于其中所述腺病毒能靶向感染肿瘤细胞、在肿瘤细胞内大量复制繁殖、肿瘤专一性地表达肿瘤自杀性基因和溶解肿瘤细胞并释放出子代腺病毒来继续感染周围的肿瘤细胞。如此繁殖感染循环，扩大腺病毒和治疗基因的剂量效应和抗癌能力。而在正常细胞中这些腺病毒没有自我复制繁殖能力，对正常组织没有伤害作用。

5、权利要求1和2中所述大部分重组腺病毒，其特征在于突变型病毒纤维蛋白末端节的H1--环上带有RGD-4C短肽，使这些病毒能靶向感染带有受体integrin的肿瘤细胞，提高感染力。

6、权利要求1和3所述重组腺病毒，其特征在于被遗传改变的E1A基因产物为289R和243R蛋白。这两种蛋白仅失去了与pRb和p300/CBP结合的能力，其它功能则没有改变。

7、权利要求2和4所述重组腺病毒，其特征在于这些病毒中控制E1A基因表达的肿瘤特异性外源启动子包括人的E2F-1基因的启动子、甲胎蛋白(AFP)基因的启动因子和染色体端粒酶中反转录酶(hTERT)基因的启动子。

8、权利要求1和2所述部分重组腺病毒，其特征在于这些腺病毒携带突变型的单纯疱疹病毒胸苷激酶基因(HSV₁-tkm)作为肿瘤自杀性基因。HSV₁-tkm是由在其野生型HSV₁-tk基因上定点突变胸苷激酶活性中心的5个重要肽链密码子而产生的。突变型HSV₁-tkm的产物胸苷激酶比其野生型具有更强的肿瘤杀伤力。

9、权利要求1、2和8所述部分重组腺病毒，其特征在于这些腺病毒携带的肿瘤自杀性基因HSV₁-tkm是由腺病毒的主要晚期启动子(MLP)或者人的循环氧合酶2(COX-2)启动子调控，从而使HSV₁-tkm主要在肿瘤细胞内高度表达，杀死肿瘤细胞。与之相反，在正常肝细胞中，COX-2和MLP启动子都没有活动，HSV₁-tkm没有表达，所以对人的肝脏没有毒性影响。

10、权利要求1、3、5、6、8、和9中所述的重组腺病毒adE1Adl2p.RGD、adE1Adl2p.MLPtkm.RGD、和adE1Adl2p.COXtkm.RGD，其特征在于这些病毒带有突变型的E1A基因(E1Adl2p)和突变型的纤維基因fiber-RGD。此外，adE1Adl2p.MLPtkm.RGD还携带有由MLP启动子调控的肿瘤自杀性基因HSV₁-tkm，而adE1Adl2p.COXtkm.RGD则携带有由COX-2启动子调控的肿瘤自杀性基因HSV₁-tkm。

11、权利要求2、4、5、7、8、和9中所述的重组腺病毒adE2F1.RGD和adE2F1.MLPtkm.RGD，其特征在于这些病毒的E1A基因的启动子被人的E2F-1基因的启动子取代和携带有突变型的纤維基因fiber-RGD。此外，adE2F1.MLPtkm.RGD还携带有由MLP启动子调控的肿瘤自杀性基因HSV₁-tkm。

12、权利要求2、4、5、7、8、和9中所述的重组腺病毒adAFP.RGD和adAFP.COXtkm，其特征在于这些病毒的E1A基因的启动子被人的AFP基因的启动子取代。此外，adAFP.RGD还携带有突变型的纤維基因fiber-RGD，而adAFP.COXtkm则携带有由COX-2启动子调控的肿瘤自杀性基因HSV₁-tkm。

13、权利要求2、4、5、7、8、和9中所述的重组腺病毒adhTERT.RGD和adhTERT.MLPtkm，其特征在于这些病毒的E1A基因的启动子被人的染色体端粒酶中反转录酶(hTERT)基因的启动子取代。此外，adhTERT.RGD还携带有突变型的纤維基因fiber-RGD，而adhTERT.MLPtkm则携带有由MLP启动子调控的肿瘤自杀性基因HSV₁-tkm。