CN1424401A

CN1424401A - 有条件复制型腺病毒及其构建方法和用途

Info

Publication number: CN1424401A
Application number: CN03114752A
Authority: CN
Inventors: 李川源; 黄倩
Original assignee: Individual
Current assignee: Individual
Priority date: 2003-01-06
Filing date: 2003-01-06
Publication date: 2003-06-18

Abstract

本发明属生物医学领域，涉及一种可以在肿瘤细胞内选择性复制、而在正常细胞中不复制的、用于肿瘤基因治疗的腺病毒及其构建方法和应用。本发明所述腺病毒，其中的两个或两个以上的复制必需的早期基因的启动子，分别被肿瘤细胞或肿瘤组织的启动子所取代，病毒能够通过本身的细胞裂解作用，或携带其它治疗基因，有效地杀伤肿瘤细胞而对正常的组织或细胞基本无害。可单独使用或与现有的肿瘤治疗方法结合使用，能够显著地提高肿瘤治疗效果并减少副作用。

Description

有条件复制型腺病毒及其构建方法和用途

技术领域

本发明属生物医学领域，涉及一种用于肿瘤基因治疗的腺病毒及其构建方法和应用。具体涉及一种可以在肿瘤细胞内选择性复制、而在正常细胞中不复制的、用于肿瘤基因治疗的腺病毒及其构建方法和应用

背景技术

近年来，肿瘤的手术治疗、化学治疗及放射治疗方法均有了明显的改进，肿瘤患者的生存期逐渐增加。但是这些改进仍然只适用于早期、局限的病灶，介于正常与肿瘤细胞间的“治疗窗”仍然很狭窄，且不易拓宽。这些方法在杀伤肿瘤细胞的同时对患者的正常细胞特别是造血与免疫系统也造成严重的损伤。因此，相当大一部分的肿瘤仍然是无法治愈的，肿瘤依然是危害人类健康和生命的最主要的疾病。医疗界迫切需要建立新的、更有效的治疗方法。

基因治疗被认为是很有希望的新方法，其最大的优势在于利用正常与肿瘤细胞间在分子水平方面的差异，可以有效地、选择性地攻击肿瘤细胞，大大拓宽了肿瘤的“治疗窗”，在增强治疗效果的同时减少副作用。不过，现有的各种基因治疗方法在临床应用方面仍然面临着许多的困难和障碍。其中最关键的问题是缺乏针对肿瘤细胞的、高效的基因传递载体或系统。

腺病毒是一种毒性较小的感冒病毒，对人体危害不大。它的最突出的优点是能够以非常高的效率感染各种人类细胞。因此，重组腺病毒是目前世界各国肿瘤基因治疗研究人员的首选基因导入工具。已有研究，从生物安全性的角度出发，采用复制缺陷型腺病毒作为基因传递的载体。但是，在实际应用中发现复制缺陷型腺病毒传递基因的效率和治疗效果仍然不理想。有文献报道肿瘤局部注射复制缺陷型腺病毒，即使在最优化的状态下也仅仅只有10-15％的病毒能感染肿瘤细胞。因此，应用复制缺陷型腺病毒作肿瘤基因治疗，不仅要求病毒用量很大，而且并非所有的肿瘤细胞均能被同时感染，故难以达到治疗目的。采用具有“旁观者效应”的治疗基因，可以改善或增强治疗效果，但仍然不能完全克服复制缺陷型病毒固有的弱点。

随着非复制型腺病毒的大量应用，人们对腺病毒在人体内的分布特点和安全性有了更深入的了解和认识。为了提高治疗基因在肿瘤局部的传递效率和表达水平，研究人员开始使用具有复制能力的腺病毒作为基因传递载体。采用复制型腺病毒必须解决的关键问题是使病毒的复制严格限制在肿瘤细胞内。目前，为了获得肿瘤特异性的复制已有许多不同的方案或策略。典型实例如onyx-015病毒，它能够选择性地在p53基因功能已丧失的肿瘤细胞内复制。由于50％以上的肿瘤均有p53基因失活，理论上讲onyx-015病毒可用于治疗一半以上的肿瘤。不过，目前对onyx015病毒肿瘤特异性问题存在争议，有人观察到onyx-015病毒在p53基因完整的肿瘤细胞内也有复制。尽管如此，onyx-015病毒目前已进入II期临床试验阶段。另一种很有希望的策略是使用肿瘤或组织特异性的启动子控制病毒复制所必须的基因的表达。如CN706病毒，该病毒利用前列腺特异抗原(PSA)基因启动子驱使E1A基因表达，这一病毒已被证实具有前列腺细胞选择毒性。

尽管前述的复制型腺病毒有明显的优越性，但它们仍然有一定的缺陷。首先，目前很多组织特异性启动子的活性，在肿瘤和同源组织中相同如PSA。含有这些启动子的复制型病毒也会在正常组织中复制。这就大大局限了这些病毒的应用前景。另外，许多启动子的控制并不是特别的严格，会造成在非靶向的正常细胞里也有一定的病毒复制，从而关窄了治疗窗口。因此，为了加强有条件复制性病毒的疗效并减少其毒性，有必要采取新的策略以进一步改进现有的病毒设计。

发明内容

本发明的主要目的是为了进一步增强复制性腺病毒在肿瘤细胞中复制的特异性，提供一种新型的、高特异性的、并能够高效地在肿瘤细胞内复制的腺病毒及其构建方法和在肿瘤基因治疗中的新用途。

本发明使腺病毒能够选择性地在肿瘤中复制，其携带的各种治疗基因也选择性地在肿瘤中表达，从而达到有效治疗肿瘤而无副作用的目的。本发明利用近三十年肿瘤生物学研究进展，模仿各种肿瘤细胞或组织特异性基因的遗传调控方式，重新构建腺病毒。从而达到使腺病毒在肿瘤细胞内能够有效复制而在正常细胞里则不复制的目的。

本发明所解决的主要问题，是增强有条件复制性病毒在肿瘤细胞中的复制特异性。其核心是通过同时控制两个或两个以上的病毒复制所必需的基因，达到显著增加病毒复制的靶向性。本发明根据不同类型肿瘤的遗传特点，在有条件复制性腺病毒里嵌入两个或两个以上肿瘤细胞或状态或组织特异性的启动子来控制那些必需基因，使病毒能够高度特异性地在肿瘤细胞中复制。

本发明的技术方案通过下述方法和步骤实现，

1、通过PCR反应和克隆技术，分离肿瘤特异性启动子，

2、构建肿瘤特异性的复制型腺病毒载体，

3、包装、扩增、纯化病毒，以及其感染和复制的鉴定，

4. 构建和鉴定携带治疗基因的、肿瘤特异性复制型腺病毒载体，

5.肿瘤特异性复制型腺病毒载体在活体肿瘤内的复制，

6.肿瘤特异性复制型病毒对肿瘤生长的抑制。

本发明所述的有条件复制性腺病毒，可用于与肿瘤的放射线治疗(radiation therapy)相结合，对肿瘤进行综和治疗。复制性病毒可以在放射治疗以前，放射治疗期间，或放射治疗以后直接注射入肿瘤中。

本发明所述的有条件复制性腺病毒，可用于与肿瘤的光动力学治疗(photodynamic therapy)结合，对肿瘤进行综和治疗。复制性病毒可以在光动力学治疗以前，光动力学治疗期间，或光动力学治疗以后直接注射入肿瘤中。

本发明所述的有条件复制性腺病毒，可用于与肿瘤的自杀基因化学治疗(suicide gene chemotherapy)结合，对肿瘤进行综合治疗。其中，自杀基因包括：细菌或及酵母的cytosine deaminase基因；疱疹病毒的thymidine kinase基因；以及p450基因。与它们相关的化疗药物分别是：5-fluorocytidine(5-FC)，gancyclovir，cyclophosphamide。

具体实施方式

实施例1

通过PCR反应和克隆技术，分离肿瘤特异性启动子A.端粒酶5’端调控顺序

在自然的DNA复制过程中，染色体的末端将随着每一次细胞分裂而缩短。染色体末端端粒的完整对染色体的稳定性至关重要。而端粒的完整是靠端粒酶来维持的。端粒酶在超过99％的正常细胞里没有活性，而在超过90％的肿瘤细胞里被重新激活。实验证明，端粒酶活性是由它的启动子控制的。端粒酶(TERT)的启动子在绝大多数的肿瘤里有活性，而在正常细胞里没有活性。这样，TERT的启动子就成为肿瘤选择性活化的启动子。为了分离端粒酶启动子，本发明采用PCR技术，以人类细胞DNA为模板，扩增出启动子序列一，将它插入质粒pEGFP-1(购自Clontech公司)中，驱动GFP基因表达，构建pTERT-EGFP表达质粒。然后，利用脂质体将pTERT-EGFP转入各种细胞中，经实验，观察到EGFP仅在肿瘤细胞中表达，而在正常细胞中则没有EGFP表达。B.E2F1基因启动子

在绝大多数的肿瘤细胞中，抑癌基因Rb及其相关的信号通路上的其他基因都被失活。这些变化使转录因子E2F1得以激活。因此，E2F1基因的启动子在大多数的肿瘤中高度活化，而在大多数的正常细胞中则没有活性。本发明通过E2F1基因的启动子来控制腺病毒复制所必须的的表达，可以使腺病毒选择性地在肿瘤细胞中复制。本发明通过PCR技术，以人类细胞DNA为模板，扩增出启动子序列二，将这段顺序插入质粒pEGFP-1中，以E2F1基因启动子驱动EGFP表达，获得了表达质粒pE2F1-EGFP。在随后进行的脂质体辅助的转导实验中，观察到GFP在肿瘤细胞中高水平表达，而在正常成纤维细胞中表达量很低。表明这个启动子的活性在正常与肿瘤细胞之间的区别很大，可以用于调控腺病毒选性地在肿瘤内复制。C.缺氧诱导性启动子

氧气的分压降低已被确定为各种实体肿瘤的共同特征。其产生的主要原因是由于肿瘤细胞快速生长，而新生血管的生长速度跟不上新长出来的肿瘤组织。组织内的各种营养成分，如氧气、葡萄糖等都处于长期或间歇性的短缺状态。处于这种微环境状况下的肿瘤细胞会激活一系列的基因。而这些基因的激活，都由缺氧诱导因子(HIF-1α)的转录因子调控。所述因子本身的激活机制则主要是通过其下游的5’调控顺序中的所谓缺氧反应单元(HRE)。针对上述特点，本发明通过PCR技术，以人类细胞DNA为模板，扩增分离缺氧诱导性的启动子序列三，所述启动子是血管生长因子/血管通透性因子(VEGF)的5’端的启动子，其已被多种实验证明，是能被缺氧微环境所诱导的最强烈的基因。而它的启动子也被证实在肿瘤中选择性的活化。本发明将所述启动子插入到质粒pEGFP-1中，得到pHRP-EGFP-1。实验证明，上述启动子在缺氧的肿瘤细胞中被选择性激活，而在正常氧气分压下它的活性很低。D.α-胚胎蛋白基因启动子

α-胚胎蛋白(α-fetoprotein)是一种在人类胚胎发育期高水平表达的蛋白。在成年人中它几乎没有表达。但是，在肝癌患者的血液中它的水平明显增加。这主要是因为肝癌细胞高水平地表达α-胚胎蛋白。这一表达已被证实是通过增加其启动子的活性引起的。鉴于它在正常细胞中的表达活性非常低，α-胚胎蛋白基因启动子是能区分肝癌和正常肝组织的启动子。本发明通过PCR技术，以人类细胞DNA为模板，扩增出α-胚胎蛋白基因启动子序列四，将其克隆到质粒pEGFP-1中，得到pAFP-EGFP。将所得质粒导入细胞中，结果发现，只有在肝癌细胞中才观察到有高水平的GFP报告基因表达，而在正常细胞和没有α-胚胎蛋白表达的肿瘤细胞中均没有GFP表达。E.MUC-1基因启动子

MUC-1基因是一种在乳腺癌和其他几种癌症如卵巢癌，结肠癌，胃癌等中激活的一种基因。本发明通过PCR技术，以人类细胞DNA为模板，扩增分离MUC-1基因启动子序列五，将其顺序插入质粒pEGFP-1中，得到pMUC1-EGFP。细胞转染实验证明，GFP仅在MUC1基因高水平表达的肿瘤细胞中特异性表达，而在没有MUC1基因表达的细胞中则基本不表达。

实施例2

构建肿瘤特异性的复制型腺病毒载体

将实施例1中所分离出的肿瘤特异性启动子通过遗传工程的方法嵌入腺病毒的DNA中，用其控制腺病毒复制必需的早期基因的表达。图1所述的是重组病毒的构建方法。所述病毒的特点是它们的E1A和E4基因同时被肿瘤组织特异性的启动子所调控。其中控制E1A和E4的启动子，可以是同一个启动子，也可以是不同的启动子。下述组合是本发明采用的有条件复制性腺病毒的组合。

1)AdHRPE1aTERTE4-dsRed2，TSP1为缺氧诱导性启动子，TSP2为端粒酶启动子；

2)AdAFPE1aTERTE4-dsRed2，TSP1为α-胚胎蛋白启动子，TSP2为端粒酶启动子；

3)AdE2F1E1aTERTE4-dsRed2，TSP1为E2F1启动子，TSP2为端粒酶启动子；

4)AdMuc1E1aTERTE4-dsRed2，TSP1为MUC1基因启动子，TSP2为端粒酶启动子，

5)AdTERTE1a-E4-dsRed2，TSP1为端粒酶启动子，TSP2为端粒酶启动子。上述组合的共同特点是它们的E4基因都在端粒酶启动子的控制之下。因此，它们的复制主要局限在有端粒酶活性的肿瘤细胞内。在此基础上再加上第二个启动子，赋予病毒更高的组织或细胞复制特异性。

为了能够准确、客观地观察和分析病毒的存在、感染和复制，本发明还可在腺病毒载体中加入荧光蛋白报告基因dsRed2。所述报告基因是来源于珊瑚礁、能自发红色荧光的蛋白基因。其有CMV启动子及SV40多聚腺苷尾。它的存在使所述病毒对细胞的感染及其在细胞内的复制等均可通过荧光显微镜和流式细胞仪进行观察和评估。

实施例3

包装、扩增、纯化病毒，以及感染和复制的鉴定

采用人胚肾293细胞对上述构建病毒进行包装，经过噬菌斑(plaquepurification)筛选后再进行扩增，采用氯化铯密度梯度离心及透析纯化病毒。纯化的病毒滴度均可达3~5×10¹⁰pfu/ml。观测病毒在各种肿瘤和正常细胞中的复制情况。其结果如下：

1)AdTERTE1a-E4-dsRed2能够感染下述肿瘤细胞，如乳腺癌、前列腺癌、卵巢癌、宫颈癌、结肠癌等细胞，并在这些细胞中大量复制。感染后3~5天出现明显的细胞病变，然后细胞裂解并继续感染周围的肿瘤细胞，3~7天之内所有的肿瘤细胞几乎都被杀死。所述病毒也可感染人的成纤维细胞和正常的上皮细胞，但不复制或只有极少量的复制，被感染的细胞存活状态良好，证明没有毒性。图2，3和4显示的是经过病毒感染的肿瘤和成纤维细胞的情况。从图2可以清楚地看到，成纤维细胞中的荧光蛋白远较肿瘤细胞中少，而且随时间增加基本上没有变化。证明病毒在成纤维细胞中没有复制。相反，Du145细胞中的荧光蛋白则随时间变得越来越亮，证明病毒在细胞中进行复制。证明E1a在肿瘤细胞里明显表达，在成纤维细胞则几乎没有表达。

2)AdAFPE1aTERTE4-dsRed能感染人类肝癌细胞，如HepG2，并在其中复制并杀死宿主细胞。而在其他肿瘤细胞中，感染效率并没有降低，但它的复制效率极低。

3)AdE2F1E1aTERTE4-dsRed2能感染所有检验过的肿瘤细胞，并在其中复制并杀死宿主细胞，尽管它能够有效地感染正常成纤维细胞或上皮细胞，但它在这些细胞中却极少复制。

4)AdMuc1E1aTERTE4-dsRed2能有效地感染有MUC1基因表达的乳腺癌细胞，如MCF-7，并在其中复制和杀死宿主细胞。但在没有MUC1基因表达的乳腺癌细胞中，如MDA-MB-231细胞中，它尽管能感染这些细胞，但并不能在其中复制和杀死这些细胞。

5)AdHRPE1aTERTE4-dsRed2能有效地感染各种肿瘤细胞。但是，在正常生长情况下该病毒的复制很少，而在缺氧的情况下该病毒的复制迅速增加。嗜菌斑检测证明所述病毒在缺氧情况下的复制(滴度)是常氧情况下的500倍。

实施例4

构建和鉴定携带治疗基因的、肿瘤特异性复制型腺病毒载体

按本领域常规方法构建下述携带治疗基因的复制型腺病毒，

1)携带具有刺激机体免疫能力的GM-CSF编码基因：TERT-E1aE4-GM-CSF。

2)携带肿瘤坏死因子TNFα编码基因：TERT-E1aE4-TNFα。

将上述病毒感染肿瘤细胞和正常的成纤维细胞，观察病毒的复制和治疗基因的表达。结果证明，上述病毒能够在肿瘤细胞里有效地复制，但在成纤维细胞里几乎不复制。用ELISA进行治疗基因的表达水平检测，结果证明，GM-CSF和TNFα的表达量都非常高。与非复制型病毒相比，其表达量高出350(TNF-α)到970倍(GM-CSF)。

实施例5

肿瘤特异性复制型腺病毒载体在活体肿瘤内的复制

将5×10⁶人的肿瘤细胞(LnCap)注射到裸鼠体内，当肿瘤生长至1cm直径大小后，分别向肿瘤内注射1×10⁸pfu的复制型腺病毒(AdTERT-E1A-dsRed2)与非复制型腺病毒(Ad-dsRed2)，注射病毒后5天切片检查肿瘤组织RFP表达情况。如图5所示，注射AdTERT-E1A-dsRed2，肿瘤内几乎90％以上的区域表达RFP；注射Ad-dsRed2，肿瘤内仅10％表达RFP。荧光定量分析显示，注射AdTERT-E1A-dsRed2的肿瘤RFP的亮度是注射Ad-dsRed2的肿瘤的100倍以上。

实施例6

肿瘤特异性复制型病毒对肿瘤生长的抑制

将纯化后的复制型和非复制型病毒注射到已经在裸鼠体内生长到5~10毫米直径的人结肠癌HCT116肿瘤内，然后对肿瘤的生长进行跟踪。将1×10⁷HCT116细胞接种到裸鼠皮下，7~10天后肿瘤生长至5~10毫米直径大小。此时，将2×10⁹腺病毒注射到肿瘤内，跟踪观察肿瘤生长情况。每2~3天测量肿瘤大小一次。结果表明，端粒酶特异性的腺病毒与携带抗肿瘤新生血管形成基因Ex-FLK1的非复制型病毒联合应用疗效最佳，超过一半的肿瘤在观察末期仍然处于消失状态。结果表明，肿瘤特异性的复制型病毒本身就具有抑制肿瘤生长的能力。当复制型病毒携带了治疗基因时，所取得的抗癌效果明显增强。显示了新型复制型病毒在肿瘤治疗中的优越性。这一类病毒的单独使用或与现有的肿瘤治疗方法结合使用，能够显著地提高肿瘤治疗效果并减少副作用。

附图说明

图1是由两个组织特异性基因启动子(TSP)控制的复制型腺病毒载体构建示意图。

其中，E1A基因由第一个组织特异性基因启动子(TSP1)调控，而E4基因由第二个组织特异性基因启动子(TSP2)调控。dsRed基因作为监测病毒感染和复制的标记，也被嵌入到E1区域。

图2是AdTERTE1a-E4-dsRed2选择性地在肿瘤细胞内复制。

其中A：利用AdTERTE1a-E4-dsRed2感染人成纤维细胞GM8429和人前列腺癌细胞Du145后，在不同时间点经荧光显微镜观察红色荧光蛋白基因的表达情况，

B：各种不同的肿瘤细胞(人乳腺癌细胞株MCF-7，人结肠癌细胞株HCT116，人前列腺癌细胞株LnCap)和人成纤维细胞经AdTERTE1a-E4-dsRed2和Ad-GFP感染后E1A表达的Western blot检测结果。

图3是经复制型AdTERTE1a-E4-dsRed2感染肿瘤细胞及成纤维细胞后产生的活性病毒数。

其中不同的肿瘤细胞及人成纤维细胞(GM8429，GM5658)经AdTERTE1a-E4-dsRed2(实验组)或Ad-dsRed(对照组)感染后，将细胞裂解并进一步感染人胚肾293细胞，通过噬菌斑数目来统计有活性的病毒的滴度。直方图代表实验组与对照组的比值。

图4是复制型腺病毒复制所导致的肿瘤细胞裂解。

其中肿瘤细胞(人前列腺癌细胞株LnCap，Du145)和人成纤维细胞(GM8429，GM5658)受AdTERTE1a-E4-dsRed2感染后10天，结晶紫染色显示肿瘤细胞大部分裂解、消失，而成纤维细胞保存完好。

图5是AdTERTE1a-E4-dsRed2选择性地在动物体内肿瘤组织中复制图。

其中裸小鼠皮下接种5×10⁶人前列腺癌LnCap细胞后生长至直径1cm左右，肿瘤内注射1×10⁸pfu AdTERTE1a-E4-dsRed2或Ad-dsRed2，5天后肿瘤切片荧光显微镜观察。受AdTERTE1a-E4-dsRed2感染的肿瘤显示明显的红色荧光，受Ad-dsRed2感染的肿瘤仅很少的区域发出微弱的红色荧光。

图6是AdTERTE1a-E4-dsRed2抑制裸鼠体内人结肠癌HCT116细胞的生长图。

其中显示的是各种治疗情况下肿瘤的相对生长曲线。

SEQUENCE LISTING<110>川源，李

倩，黄<120>有条件复制型腺病毒及其构建方法和用途<130><160>5<170>PatentIn version 3.1<210>1<211>454<212>DNA<213>Human<400>1tcatggcccc tccctcgggt taccccacag cctaggccga ttcgacctct ctccgctggg60gccctcgctg gcgtccctgc accctgggag cgtgagcggt gcgcgggcgg ggaaacgcgg120cccagaaccc cgggtccgcc cggagcagct gcgctgtcgg gccaggccgg gctcccagtg180gattcgcggg cacagacgcc caggaccgcg cttccacgtg gcggaggact gggacccggg240caccgtcctg cccccttcac cttccagttc cgcttcttcc gcgcggaccc cgccccgtcc300cgacccttcc cgggtccccg gcccagcccc ttccgggccc tcccagccct tccccttcct360ttccgcggcc ccgccctctc ctcgcggcgc gagtttcagg cagcgctgcg tcctgctgcg420cacgtgggaa gccctggccc cggccacccc cgcg454<210>2<211>265<212>DNA<213>Human<400>2ccgttgttcc cgtcacggcc ggggcagcca attgtggcgg cgccggcggc tcgtggctct60ttcgcggcaa aaaggatttg gcgcgtaaaa gtggccggga cttgcaggca gcggcggccg120ggggcggagc gggatcgagc cctcgccgag gcctgccgcc agggcccgcg ccgccgccgc180cgcctgtcac ccgggccgcg cgggccgtga gcgtcatggc tggccggggc ccctgcgggc240ggcccatgcg cgccggcgct ggagg265<210>3<211>2024<212>DNA<213>Human<400>3ggggtgctag aggcgcacaa ggaggaaagt tagtggcttc ccttccatat cccgttcata60gcctagagca tggagcccag gtgaggaggc ctgcctggga gggggccctg agccaggaat120aaacatttac taactgtaca aagaccttgt ccctgctgct ggggagcctg ccaagtgtgg180agacaggact agtgcacgaa tgatggaaag ggagggttgg ggtgggtggg agccagcttt240tcctcataag ggccttagga caccataccg atggaactgg gggtactggg gaggaaccta300gcacctccac caaaccacag caacatgtgc tgaggatggg gctgactagg taactccctg360gagcgttttg gttaaattga gggaaattgc tgcattccca ttctcagtcc atcctccaca420gaggctatgc cagctgtagg ccagaccctg gcaagatctg ggtggataat cgactgactg480gcctcagagc cccaactttg ttccctgggg cagcctggaa atagccaggt agaaaccagc540caggaatttt tccaagctgc ttcctatatg caagaatggg atgggggcct tgggagcact600tagggaagat gtggagagtt ggaggaaaag ggggcttgga ggtaaggggg ggactggggg660aaggataggg gagaagctgt gagcctggag aagtagccaa gggatccgag ggaatggggg720agctgagacg aaacccccat ttctattcag aagatgagct atgagttggg cttgggctga780tagaagcctt ggcccctggc ctggtgggag ctctgggcag ctggctacag acgttcctta840gtgctggcgg gtaggtttga atcatcacgc aggccctggc ctcccccgcc cccaccagcc900ccctggcctc agttccctgg caacatctgg ggttgggggg gcacaggaac aagggcctct960gtctgcccag ctgcctcccc ctttgggttt tgccagactc caagtgcata cgtgggctcc1020aacaggtcct cttccctccc agtcactgac taaccccgga aacacagctt cccgttctca1080gctccacaaa cttggtgcca aattcttctc ccctgggaac atccctggac acttcccaaa1140ggaccccagt cactccagcc tgttggctgc cgctcactga tgtctgcagg ccagatgagg1200gctccagatg gcacattgtc agagggacac actgtgcccc tgtgcccagc cctgggctct1260ctgtacatga agcaactcca gtcccaaata tgtagtgttt gggaggtcag aaataggggg1320tccaggagca aactcccccc accccctttc caaagcccat tccctcttta gccagagccg1380gggtgtgcag acggcagtca ctagggggcg ctcgccacca cagggaagct gggtgaatgg1440agcgagcagc gtcttcgaga gtgaggacgt gtggtctgtg tgggtgagtg agtgtgtgcg1500tgtggggttg agggtgttgg agcggggaga agccaggggt cactccagga ttccaacaga1560tctgtgtgtc cctctcccca cccgtccctg tcggctctcc gccttcccct gcccccttca1620atattcctag caaagaggga acggctctca gccctgtccg cacgtaacct cactttcctg1680ctccctcctc gccaatgccc cgcgggcgct gtctctggac agagtttccg ggggcggatg1740ggtaattttc aggctgtgaa ccttggtggg gtcgagcttc cccttcattg cggcgggctg1800cgggccaggc ttcactgggc gtccgcaagc ccgggcccga gccgcgtgtg gaggggctga1860ggctcgcctg tccccgcccc ccgggggggc cgggggcggg gtcccggcgg ggcggagcca1920tgcgcccccc cctttttttt ttaaagtcgg ctggtagcgg ggaggatcgc ggaggcttgg1980ggcagccggg tagctcggag gtcgtggcgc tgggggctag cacc2024<210>4<211>341<212>DNA<213>Human<400>4ttaacttaat ttgagagaaa ttaattattc tgcaacttag ggacaagtca tctctttgaa60tattctgtag tttgaggaga atatttgtta tatttgcaaa ataaaataag tttgcaagtt120ttttttttct gccccaaaga gctctgtgtc cttgaacata aaatacaaat aaccgctatg180ctgttaatta ttggcaaatg tcccattttc aacctaagga aataccataa agtaacagat240ataccaacaa aaggttacta gttaacaggc attgcctgaa aagagtataa aagaatttca300gcatgatttt ccatattgtg cttccaccac tgccaataac a341<210>5<211>832<212>DNA<213>Human<400>5cccgcaaggc tcccggtgac cactagaggg cgggaggagc tcctggccag tggtggagag60tggcaaggaa ggaccctagg gttcatcgga gcccaggttt actcccttaa gtggaaattt120cttcccccac tccctccttg gctttctcca aggagggaac ccaggctgct ggaaagtccg180gctggggcgg ggactgtggg tttcagggta gaactgcgtg tggaacggga cagggagcgg240ttagaagggt ggggctattc cgggaagtgg tggggggagg gagcccaaaa ctagcaccta300gtccactcat tatccagccc tcttatttct cggccccgct ctgcttcagt ggacccgggg360agggcgggga agtggagtgg gagacctagg ggtgggcttc ccgaccttgc tgtacaggac420ctcgacctag ctggctttct tccccatccc cacgttagtt gttgccctga ggctaaaact480agagcccagg ggccccaagt tccagactgc ccctcccccc tcccccggag ccagggagtg540gttggtgaaa gggggaggcc agctggagaa caaacgggta gtcagggggt tgagcgatta600gagcccttgt accctaccca ggaatggttg gggaggagga ggaagaggta ggaggtaggg660gagggggcgg ggttttgtca cctgtcacct gctccggctg tgcctagggc gggcgggcgg720ggagtggggg gaccggtata aagcggtagg cgcctgtgcc cgctccacct ctcaagcagc780cagcgcctgc ctgaatctgt tctgccccct ccccacccat ttcaccacca cc832

Claims

1、一种有条件复制型腺病毒，其特征是其中的两个或两个以上的复制必需的早期基因的启动子，分别被肿瘤细胞或肿瘤组织的启动子所取代，它能够特异性地在肿瘤细胞中复制，而在正常细胞或组织中基本不复制。

2、根据权利要求1所述的有条件复制型腺病毒，其特征是其中的两个或两个以上的复制必需的早期基因的启动子，分别被人肿瘤细胞或肿瘤组织的启动子所取代。

3、根据权利要求1所述的有条件复制型腺病毒，其特征是所述的腺病毒必需基因是腺病毒早期基因E1A，E1B，E2，或E4。

4、根据权利要求1所述的有条件复制型腺病毒，其特征是所述的启动子包括肿瘤细胞或微环境特异性的启动子和肿瘤组织特异性启动子。

5、根据权利要求4所述的有条件复制型腺病毒，其特征是所述的肿瘤细胞或微环境特异性的启动子包括低氧诱导性基因的启动子，E2F1基因启动子，Midikin基因启动子，端粒酶(TERT)基因启动子和热休克蛋白基因启动子。

6、根据权利要求4所述的有条件复制型腺病毒，其特征是所述的肿瘤组织特异性启动子包括前列腺组织特异性抗原基因启动子，MUC1基因启动子，肺细胞表面蛋白基因启动子，α-胚胎蛋白，甲状腺球蛋白基因启动子，Tyrosinase基因的启动子，神经鞘基础蛋白基因启动子，乳球白蛋白基因启动子，癌胚胎抗原蛋白(CEA)基因启动子和GFAP基因的启动子。

7、根据权利要求1所述的有条件复制型腺病毒，其特征是所述腺病毒DNA的E1或E3区域嵌入抗癌基因。

8、根据权利要求7所述的有条件复制型腺病毒，其特征是所述抗癌基因包括：细胞凋亡诱导基因，抗新生血管形成基因，自杀基因，细菌毒素基因，肿瘤抑制基因，免疫调节因子和放射线增敏基因的反义基因或干扰RNA片段。

9、根据权力要求1和2所述的有条件复制型腺病毒在制备治疗肿瘤药物中的用途。

10、根据权力要求1和2所述的有条件复制型腺病毒在制备治疗人类原位或转移肿瘤的药物中的用途。