CN101880688B - 一种使复制缺陷型腺病毒选择性复制的方法和用途 - Google Patents

Abstract

本发明属生物医学领域，涉及一种使复制缺陷型腺病毒选择性复制的方法和用途。本发明所述复制缺陷型腺病毒，其复制必需元件E1A基因受肿瘤细胞或肿瘤组织特异性启动子调控，由真核表达质粒或重组腺相关病毒载体携带，在肿瘤局部反式提供。腺病毒能够通过本身的溶瘤作用、携带的治疗基因的作用以及E1A的抑癌作用三种作用协同有效杀伤肿瘤细胞而对正常的组织或细胞基本无害。本发明可以方便、快捷地在肿瘤局部赋予任何一个用于肿瘤基因治疗的复制缺陷型腺病毒以选择性增殖、复制能力。能单独使用或与现有的肿瘤治疗方法结合使用，显著提高肿瘤治疗效果并减少副作用。

Description

一种使复制缺陷型腺病毒选择性复制的方法和用途

技术领域

本发明属生物医学领域，涉及复制缺陷型腺病毒，具体涉及一种使复制缺陷型腺病毒选择性复制的方法，尤其涉及一种用于肿瘤基因治疗的复制缺陷型腺病毒在肿瘤原位选择性复制的方法和应用。

背景技术

恶性肿瘤是危害人类健康的最主要的疾病。传统的手术、化疗和放疗等方法目前仍然无法明显改善人们对这类疾病相对无奈的局面。基因治疗经过二十年的发展，作为一种新的治疗肿瘤的手段越来越受到人们的关注，截止2009年1月，全球已实施的1472项基因治疗临床试验方案中，用于肿瘤治疗的有960项，占65.2％。腺病毒(Adenovirus，Ad)是目前基因治疗研究和临床试验中应用最广的病毒载体之一。据报道，在已实施的基因治疗临床试验方案中，使用腺病毒作为载体的有360项，占24.5％，居首位。2004年1月及2005年10月我国SFDA在国际上率先批准了二个以腺病毒作为载体的治疗恶性肿瘤的I类新药。

腺病毒的有效性和安全性问题一直是制约腺病毒在基因治疗临床实践中广泛应用的瓶颈。现有技术公开了腺病毒载体用于基因治疗有许多优点：如可插入较大的外源基因片断(8.5kb)、容易制备且病毒滴度较高、宿主范围广、可介导外源基因短时高水平表达、基因转移效率不受细胞增殖状态影响、其基因组通常不会整合入宿主细胞染色体，故不易发生插入突变，较安全等。但腺病毒载体在应用特别是体内应用时仍存在一些问题：①腺病毒载体介导外源基因表达时间短。由于腺病毒载体的免疫原性较高，进入体内的病毒很快被机体清除，一般仅持续7-10天。②外源基因表达水平仍然不够理想。虽然腺病毒载体可介导外源基因短时高水平表达，但由于目前治疗基因都不够有效，并且用于基因治疗的腺病毒载体多数是复制缺陷型载体，在体内不能复制，而用药剂量过大会导致急性毒性反应，所以对于肿瘤基因治疗来讲外源基因表达水平显得仍然不够理想，而通过加大用药剂量提高外源基因表达水平的空间几乎为零。③非特异性分布及病毒泄漏导致的毒副作用。由于腺病毒的宿主范围较广，在感染靶组织的同时也感染其他正常组织，体内应用时存在明显的组织细胞非特异性分布，特别是易在肝脏内聚集，产生毒副作用，且该问题随着腺病毒在临床实践中的应用而日见突出，因此，临床应用时大都直接或通过介入方式将腺病毒注射到肿瘤内。然而，实践表明，即使是肿瘤内给药，大量的腺病毒仍然会泄漏到循环血液中，并感染其他正常组织特别是肝细胞，其中，在使用复制型腺病毒时更为严重。以上问题已成为制约腺病毒在基因治疗临床实践中广泛应用的瓶颈。故，基因治疗的有效性和安全性问题一直是基因治疗研究和临床试验的一大热点和难点问题。

研究人员认为，解决上述腺病毒有效性的策略之一是采用“增殖型腺病毒系统”也称“溶瘤病毒”，但安全性会降低。由于增殖型腺病毒存在潜在的安全性问题，目前已实施的基因治疗临床试验方案中大多数使用的仍然是复制缺陷型腺病毒载体，此类病毒基因组中不含腺病毒复制必须的E1区基因，E1区是腺病毒基因组进入细胞核后立早表达的基因，对后续其他基因的表达以及病毒复制起到至关重要的作用。有研究在一些细胞系的基因组中整合了腺病毒基因组左端一段包括E1区基因的序列，构建了所谓腺病毒包装细胞系(如293、911以及PERC6等)，这些细胞系可以反式提供E1区的功能，使E1区缺失的腺病毒载体增殖并产生成熟的腺病毒颗粒。此类腺病毒在体内不能复制，比较安全，但限于客观情况，目前基因治疗效果仍不理想。

增殖型腺病毒系统又称为肿瘤特异性增殖型腺病毒，该载体利用肿瘤与正常组织及细胞间结构或代谢途径上的差异，使病毒可以特异性地靶向肿瘤细胞内复制、增殖，大量表达目的基因并最终裂解肿瘤细胞。增殖型腺病毒与传统的复制缺陷型腺病毒载体比较有以下几个优点：①病毒的大量增殖可以直接杀死感染的肿瘤细胞，并扩散到邻近肿瘤细胞；②腺病毒溶解肿瘤细胞能释放肿瘤抗原，提呈给树突状细胞和T细胞识别，起到″瘤苗″的作用，产生抗肿瘤免疫反应；③除了自身的溶瘤能力，增殖型腺病毒载体在大量复制增殖的同时还可使所携带的外源基因大量表达，通过多种途径杀灭肿瘤，即病毒-基因疗法。如果治疗基因和增殖病毒的优势都能充分发挥的话，增殖病毒携带治疗基因的药物很可能将是临床最成功的基因治疗药物。但大量的腺病毒泄漏到循环血液中，直接感染其他正常组织以及由于免疫反应而导致急性毒性反应，这一安全性问题在使用复制型腺病毒时显得更为突出。

解决上述复制型腺病毒安全性的策略之一是采用肿瘤组织特异性启动子调控腺病毒复制的必需元件E1基因，但有效性会降低。对于增殖型腺病毒载体来说，最重要的莫过于安全性的问题，也就是如何使其识别何者为肿瘤细胞，何者为正常细胞，目前常用的策略之一是采用肿瘤组织特异性启动子如缺氧启动子、端粒酶启动子等调控腺病毒复制的必需元件E1基因，使其特异地在肿瘤细胞中复制。但仍存在下述缺陷：①大多数肿瘤组织特异性启动子活性较低，在安全性提高的同时基因治疗的有效性则会降低；②肿瘤组织特异性启动子的严紧性是相对的，如果大量的腺病毒泄漏到循环血液中仍然会带来潜在的危险；③构建过程比较繁琐，并且需要一病毒一构建。

与本发明相关的现有技术有如下参考文献：

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发明内容

本发明的目的是为克服现有技术的缺陷，提供一种使复制缺陷型腺病毒选择性复制的方法。

具体而言，本发明以真核表达载体或重组腺相关病毒(rAAV)为载体，根据不同类型肿瘤的遗传特点，选择肿瘤细胞或状态或组织特异性的启动子调控腺病毒复制必需元件E1A基因，在肿瘤局部反式提供腺病毒复制必须的E1区的功能，使腺病毒在肿瘤细胞内特异性地复制而在正常细胞内不复制。

本发明所述复制缺陷型腺病毒，其复制必需元件E1A基因受肿瘤细胞或肿瘤组织特异性启动子调控，由真核表达质粒或重组腺相关病毒载体携带，在肿瘤局部反式提供。腺病毒能够通过本身的溶瘤作用、携带的治疗基因的作用以及E1A的抑癌作用三种作用协同有效杀伤肿瘤细胞而对正常的组织或细胞基本无害。

本发明中，所述腺病毒复制必需的早期基因的启动子，被人肿瘤细胞或肿瘤组织的启动子所取代。所述的腺病毒早期基因包括E1A，E1AE1B，E1AE1B19k；所述的启动子包括肿瘤细胞或微环境特异性的启动子或肿瘤组织特异性启动子，其中，肿瘤细胞或微环境特异性的启动子可以是低氧诱导性基因的启动子，E2F1基因启动子，Midikin基因启动子，端粒酶(TERT)基因启动子或热休克蛋白基因启动子；所述的肿瘤组织特异性启动子可以是前列腺组织特异性抗原基因启动子，MUC1基因启动子，肺细胞表面蛋白基因启动子，α-甲胎蛋白(AFP)基因启动子，erbB2基因启动子，甲状腺球蛋白基因启动子，Tyrosinase基因的启动子，神经鞘基础蛋白基因启动子，乳球白蛋白基因启动子或癌胚抗原蛋白(CEA)基因启动子。

本发明中，所述的重组腺相关病毒载体可以是本领域技术人员知悉的所有血清型重组腺相关病毒载体。

本发明中，所述的真核表达质粒导入肿瘤局部的方法包括与脂质体混合注入、与超声微泡共孵育超声导入、电击导入等。

本发明中，所述腺病毒DNA的E1或E3区域嵌入抗癌基因。

所述抗癌基因包括：细胞凋亡诱导基因，抗新生血管形成基因，自杀基因，细菌毒素基因，肿瘤抑制基因，免疫调节因子和放射线增敏基因及其反义基因或干扰RNA片段。

所述的抗癌基因的启动子包括强效启动子(如CMV)、肿瘤细胞或微环境特异性的启动子和肿瘤组织特异性启动子。

本发明的另一目的是提供所述使复制缺陷型腺病毒选择性复制的方法的医用用途。尤其涉及所述使复制缺陷型腺病毒选择性复制的方法在用于制备肿瘤基因治疗药物中的新用途。

本发明中，所述的复制缺陷型腺病毒在肿瘤原位选择性复制。

本发明方法可以方便、快捷地在肿瘤局部赋予任何一个的复制缺陷型腺病毒以选择性增殖、复制及用于肿瘤基因治疗。

本发明使复制缺陷型腺病毒在肿瘤原位选择性复制的方法能用于治疗肿瘤药物的制备。尤其是用于制备治疗人类原位或转移肿瘤的药物。

本发明所述的复制缺陷型腺病毒肿瘤原位复制系统可单独用于肿瘤的治疗。携带E1A基因的真核表达质粒可于复制缺陷型腺病毒治疗前导入肿瘤局部；携带E1A基因的rAAV可同时或先后与复制缺陷型腺病毒注射入肿瘤局部。

本发明所述的复制缺陷型腺病毒肿瘤原位复制系统，可与肿瘤的放射线治疗(radiation therapy)相结合，对肿瘤进行综合治疗。腺病毒与携带E1A基因的rAAV或真核表达质粒可以在放射治疗前，放射治疗期间，或放射治疗后直接注射入肿瘤中。

本发明所述的复制缺陷型腺病毒肿瘤原位复制系统，可与肿瘤化学治疗结合，对肿瘤进行综合治疗。腺病毒与携带E1A基因的rAAV或真核表达质粒可以在化学治疗前，化学治疗期间，或化学治疗后直接注射入肿瘤中。

本发明所述的复制缺陷型腺病毒肿瘤原位复制系统，可与肿瘤的光动力学治疗(photodynamic therapy)结合，对肿瘤进行综合治疗。腺病毒与携带E1A基因的rAAV或真核表达质粒可以在光动力学治疗前，光动力学治疗期间，或光动力学治疗后直接注射入肿瘤中。

本发明所述的复制缺陷型腺病毒肿瘤原位复制系统，可与肿瘤温热治疗结合，对肿瘤进行综合治疗。腺病毒与携带E1A基因的rAAV或真核表达质粒可以在温热治疗前，温热治疗期间，或温热治疗后直接注射入肿瘤中。

本发明所述的复制缺陷型腺病毒肿瘤原位复制系统，可与肿瘤的免疫基因、细胞凋亡诱导基因、抗新生血管形成基因、细菌毒素基因、肿瘤抑制基因、免疫调节因子和放射线增敏基因及其反义基因或干扰RNA片段、自杀基因化学治疗(suicide genechemotherapy)及其它治疗基因治疗相结合，对肿瘤进行综合治疗。其中，免疫基因包括：白介素(IL)，各种集落刺激因子(CSF)，肿瘤坏死因子(TNFα)，各种细胞粘附分子等；自杀基因包括：细菌或及酵母的cytosine deaminase(CD)基因；疱疹病毒的thymidine kinase(TK)基因；以及p450基因。与它们相关的化疗药物分别是：5-fluorocytidine(5-FC)，gancyclovir，cyclophosphamide.

本发明的技术方案通过下述方法和步骤实现：

1、通过PCR反应和克隆技术，分离肿瘤或组织特异性启动子；

2、构建携带肿瘤或组织特异性启动子调控腺病毒复制必需元件E1A基因的真核表达载体和rAAV载体；

3、包装、扩增、纯化重组腺相关病毒(rAAV)，并进行测序及功能鉴定；

4.构建和鉴定携带报告基因及治疗基因的复制缺陷型腺病毒载体；

5.包装、扩增、纯化腺病毒，并进行病毒滴度及功能鉴定；

6.活体肿瘤内复制缺陷型腺病毒原位增殖、复制；

7.活体肿瘤内复制缺陷型腺病毒原位复制对肿瘤生长的抑制。

本发明的有益效果在于，

本发明只要将携带肿瘤或组织特异性启动子调控腺病毒复制必需元件E1A基因的真核表达载体或rAAV与任何一个已有的复制缺陷型腺病毒同时或先后导入肿瘤局部，即可方便、快捷地在肿瘤局部赋予任何一个复制缺陷型腺病毒以增殖、复制的能力，解决增殖型腺病毒一病毒一构建带来的麻烦。

本发明协同了“病毒溶瘤作用、E1A抑癌作用、治疗基因作用”三大作用，特别是使用rAAV系统，会将上述协同作用进一步放大，基因治疗效果进一步提高，最终将有望降低腺病毒用量。

本发明所使用的病毒即使外漏，也仅为复制缺陷型病毒，克服了增殖型腺病毒外漏带来的潜在安全性问题。

本发明只要根据不同类型肿瘤的遗传特点，选择合适的肿瘤细胞或状态或组织特异性的启动子，适用于不同组织来源的肿瘤及疾病的治疗，具有广阔的应用前景。

为了便于理解，以下将通过具体的附图和实施例对本发明的进行详细地描述。需要特别指出的是，具体实例和附图仅是为了说明，显然本领域的普通技术人员可以根据本文说明，在本发明的范围内对本发明做出各种各样的修正和改变，这些修正和改变也纳入本发明的范围内。

附图说明

图1.AAV2-EGFP联合应用不同滴度的非复制型腺病毒感染NCI-H460肿瘤细胞7d时荧光显微镜记录结果(×400)，

其中，随着非复制型腺病毒用量增加，受感染的阳性细胞明显增加，GFP表达明显增强，显示小剂量非复制型腺病毒即能提高AAV携带基因的表达水平，呈明显量效关系，A：AAV2-EGFP组；B-F：AAV2-EGFP+Ad-null组，Ad-null剂量分别为0.001/0.01/0.1/1/10MOI。

图2.AAV2-EGFP联合应用不同滴度的非复制型腺病毒感染NCI-H460肿瘤细胞，

其中，随着非复制型腺病毒用量增加，流式细胞仪检测被感染的肿瘤细胞EGFP阳性率逐渐增强，显示小剂量非复制型腺病毒即能提高AAV的转导效率，呈明显量效关系。

图3.NCI-H460转质粒24h后加病毒AdGFP(10moi)，48h时荧光显微镜记录结果(×50)，其中，显示E1A基因能明显提高腺病毒所携带报告基因GFP的表达水平。

图4.E1A基因对腺病毒增殖、复制的影响，

其中，腺病毒(10moi)感染A549细胞，4h后用PBS系3遍，换新鲜培养基，72h后收取细胞和上清测病毒滴度，显示腺病毒只要有E1A即可复制，对E1B的依赖性不大，A：AdGFP；B：Ad-hTERT-E1A；C：Ad-hTERT-E1A-E1B；D：DL309。

图5.活体肿瘤原位复制缺陷型腺病毒Ad-CMV-IL2的增殖、复制，

其中，将纯化后的质粒pcDNA3.1-TERTp-E1A和非复制型病毒Ad-CMV-IL2先后导入人非小细胞肺癌NCI-H460裸鼠皮下移植瘤内，病毒注射后72h取肿瘤，将肿瘤匀浆进行腺病毒滴度测定，结果表明，pcDNA3.1-TERTp-E1A联合Ad-CMV-IL2组腺病毒滴度明显高于对照质粒pcDNA3.1联合Ad-CMV-IL2组(未进入细胞的病毒背景量)。

图6.活体肿瘤内复制缺陷型腺病毒携带治疗基因IL2的表达测定，

其中，将纯化后的质粒pcDNA3.1-TERTp-E1A和非复制型病毒Ad-CMV-IL2先后导入人非小细胞肺癌NCI-H460裸鼠皮下移植瘤内，病毒注射后72h取肿瘤，将肿瘤匀浆进行IL2表达水平测定，结果表明，pcDNA3.1-TERTp-E1A联合Ad-CMV-IL2组IL2表达水平明显高于对照质粒pcDNA3.1联合Ad-CMV-IL2组。

具体实施方式

实施例1

通过PCR反应和克隆技术，分离肿瘤特异性启动子

A.端粒酶5’端调控顺序

在自然的DNA复制过程中，染色体的末端将随着每一次细胞分裂而缩短。染色体末端端粒的完整对染色体的稳定性至关重要。而端粒的完整是靠端粒酶来维持的。端粒酶在超过99％的正常细胞里没有活性，而在超过90％的肿瘤细胞里被重新激活。实验证明，端粒酶活性是由它的启动子控制的。端粒酶(TERT)的启动子在绝大多数的肿瘤里有活性，而在正常细胞里没有活性。由此，TERT的启动子成为肿瘤选择性活化的启动子。为了分离端粒酶启动子，本发明采用P C R技术，以人类细胞DNA为模板，扩增启动子(序列一)，将其插入质粒pEGFP-1(购自Clontech公司)中，驱动GFP基因表达，构建pTERT-EGFP表达质粒，然后，用脂质体将pTERT-EGFP转入各种细胞中，实验显示，EGFP仅在肿瘤细胞中表达，而在正常细胞中则没有EGFP表达。

B.E2F1基因启动子

在绝大多数的肿瘤细胞中，抑癌基因Rb及其相关的信号通路上的其他基因都被失活。这些变化使转录因子E2F1得以激活。因此，E2F1基因的启动子在大多数的肿瘤中高度活化，而在大多数的正常细胞中则没有活性。本发明通过E2F1基因的启动子来控制腺病毒复制所必须的E1A基因的表达，能使腺病毒选择性地在肿瘤细胞中复制。本发明通过P C R技术，以人类细胞DNA为模板，扩增出启动子(序列二)，将该段顺序插入质粒pEGFP-1中，以E2F1基因启动子驱动EGFP表达，获得表达质粒pE2F1-EGFP。之后的脂质体辅助的转导实验结果显示，GFP在肿瘤细胞中高水平表达，而在正常成纤维细胞中表达量很低。表明该启动子的活性在正常与肿瘤细胞之间的区别很大，可用于调控腺病毒选择性地在肿瘤内复制。

C.缺氧诱导性启动子

氧气的分压降低已被确定为各种实体肿瘤的共同特征。其产生的主要原因是由于肿瘤细胞快速生长，而新生血管的生长速度跟不上新长出来的肿瘤组织。组织内的各种营养成分，如氧气、葡萄糖等都处于长期或间歇性的短缺状态。处于这种微环境状况下的肿瘤细胞会激活一系列的基因。而这些基因的激活，均由缺氧诱导因子(HIF-1α)的转录因子调控。所述因子本身的激活机制则主要是通过其下游的5’调控顺序中的所谓缺氧反应单元(HRE)。针对上述特点，本发明通过P C R技术，以人类细胞DNA为模板，扩增分离缺氧诱导性的启动子(序列三)，所述启动子是血管生长因子/血管通透性因子(VEGF)的5’端的启动子，其已被多种实验证明，是能被缺氧微环境所诱导的最强烈的基因。而它的启动子也被证实在肿瘤中选择性的活化。本发明将所述启动子插入到质粒pEGFP-1中，得到pHRP-EGFP-1。实验证明，上述启动子在缺氧的肿瘤细胞中被选择性激活，而在正常氧气分压下它的活性很低。

D.α-胚胎蛋白(AFP)基因启动子

α-胚胎蛋白(α-fetoprotein)是一种在人类胚胎发育期高水平表达的蛋白。在成年人中它几乎没有表达。但是，在肝癌患者的血液中其水平明显增加。这一表达已被证实是通过增加其启动子的活性引起。鉴于它在正常细胞中的表达活性非常低，α-胚胎蛋白基因启动子是能区分肝癌和正常肝组织的启动子。本发明通过P C R技术，以人类细胞DNA为模板，扩增出α-胚胎蛋白基因启动子(序列四)，将其克隆到质粒pEGFP-1中，得到pAFP-EGFP。将所得质粒导入细胞中，结果显示，只有在肝癌细胞中才观察到有高水平的GFP报告基因表达，而在正常细胞和没有α-胚胎蛋白表达的肿瘤细胞中均没有GFP表达。

E.癌胚抗原(CEA)基因启动子

癌胚抗原基因(CEA)在结直肠癌细胞中重新激活，而在正常组织中不表达或表达很低。本发明通过P C R技术，以人类细胞DNA为模板，扩增出CEA启动子(序列五)，将其克隆到质粒pEGFP-1中，得到pCEA-EGFP。将所得质粒导入细胞中，结果显示，在CEA阳性的直肠癌细胞Lovo和SW620中观察到有高水平的GFP报告基因表达，而在正常细胞和无CEA表达的肿瘤细胞(如ChangLiver和Hela细胞)中均没有GFP表达。

F.热休克蛋白(HSP)基因启动子

热休克蛋白(HSP)由至少5个不同分子质量和生物功能各异的分子伴侣组成，其诱导表达是细胞中转录因子——热休克因子1(heat shock factor 1，HSF1)与HSP基因5’端启动子区的热休克元件(heat shock element，HSE)相互作用的结果。现有技术公开了在几乎所有HSP基因5’端的启动子区，都含有HSE。在正常状态下，HSF1以无活性的单体形式存在于细胞浆中，并与某些HSP结合在一起。在各种应激原作用下，胞浆中的变性蛋白质增多，HSP与受损伤蛋白质结合后释放出HSF1单体，HSF1单体再聚合成具有转录活性的的三聚体迅速和各种HSP的启动子区HSE结合并激活转录，HSP启动子活性在热休克(41～45℃)后显著增强。本发明通过P C R技术，以人类细胞DNA为模板，扩增出HSP启动子(序列六)，将其克隆到质粒pEGFP-1中，得到pHSP-EGFP。将所得质粒导入细胞中，结果显示，上述启动子在加热的肿瘤细胞中被选择性激活，而在正常情况下它的活性很低。

G.MUC-1基因启动子

MUC-1基因是在乳腺癌和其他几种癌症如卵巢癌，结肠癌或胃癌中激活的一种基因。本发明通过P C R技术，以人类细胞DNA为模板，扩增分离MUC-1基因启动子(序列七)，将其顺序插入质粒pEGFP-1中，得到pMUC1-EGFP。细胞转染实验证明，GFP仅在MUC1基因高水平表达的肿瘤细胞中特异性表达，而在没有MUC1基因表达的细胞中则基本不表达。

F.c-erbB2启动子

erbB2通常只在胎盘、胚胎上皮组织表达，成年以后正常组织中为阴性或微量表达。然而在多种人类肿瘤中却过度表达，如乳腺癌、卵巢癌、肺癌、原发性肾细胞癌等。本发明通过P C R技术，以人类细胞DNA为模板，扩增分离erbB2基因启动子(序列八)，将其顺序插入质粒pEGFP-1中，得到perbB2-EGFP。细胞转染实验证明，GFP仅在erbB2基因高水平表达的肿瘤细胞(如乳腺癌细胞株SKBR-3)中特异性表达，而在没有erbB2基因表达的细胞中则基本不表达。

实施例2

构建携带肿瘤特异性启动子调控腺病毒复制必需元件E1A基因的真核表达载体。

将实施例1中所分离出的肿瘤特异性启动子(TSP)通过遗传工程的方法嵌入真核表达载体，用其控制腺病毒复制必需的早期基因E1A的表达。所述质粒的特点是其携带的腺病毒复制必需元件E1A基因被肿瘤组织特异性的启动子所调控。下本发明采用的真核表达载体结构示意为：Plasmid-TSP-E1A，其中，Plasmid为任何一个真核表达质粒(比如：pcDNA3.1)；TSP为实施例1中所分离出的肿瘤特异性启动子及其它未提及的肿瘤特异性启动子。

实施例3

构建携带肿瘤特异性启动子调控腺病毒复制必需元件E1A基因的腺相关病毒(rAAV)载体。

将实施例1中所分离出的肿瘤特异性启动子(TSP)通过遗传工程的方法嵌入腺相关病毒的穿梭质粒中，用其控制腺病毒复制必需的早期基因E1A的表达。所述质粒和病毒的特点是其携带的腺病毒复制必需元件E1A基因被肿瘤组织特异性的启动子所调控。本发明采用的腺相关病毒的穿梭质粒结构示意为pSNAV-TSP-E1A，其中，pSNAV为包装不同血清型AAV通用的穿梭质粒，可用于包装任一血清型的腺相关病毒；TSP为实施例1中所分离出的肿瘤特异性启动子及其它未提及的肿瘤特异性启动子。

实施例4

包装、扩增、纯化rAAV，并进行功能鉴定

按本领域常规方法包装下述AAV，纯化病毒，感染肿瘤细胞并进行功能鉴定。

①.包装纯化AAV-TERTp-E1A

②.包装纯化AAV-E2Fp-E1A

③.包装纯化AAV-AFPp-E1A

④.包装纯化AAV-CEAp-E1A

⑤.包装纯化AAV-HSP70p-E1A

⑥.包装纯化AAV-HRPp-E1A

⑦.包装纯化AAV-MUC1p-E1A

⑧.包装纯化AAV-erbB2p-E1A

1).AAV-TERTp-E1A感染下述肿瘤细胞，包括乳腺癌、前列腺癌、卵巢癌、宫颈癌、结肠癌、肺癌等细胞，经Western检测证明E1A蛋白表达；而在成纤维细胞中则未检测到E1A蛋白表达。

2).AAV-E2Fp-E1A感染所有检验过的肿瘤细胞，经Western检测证明E1A蛋白表达；而在成纤维细胞中则未检测到E1A蛋白表达。

3).AAV-AFPp-E1A感染人类肝癌细胞，包括HepG2、Hep3B等，经Western检测证明E1A蛋白表达；而在其他肿瘤细胞中则未检测到E1A蛋白表达。

4).AAV-CEAp-E1A感染人类结肠癌细胞，经Western检测证明E1A蛋白表达；而在其他肿瘤细胞中则未检测到E1A蛋白表达。

5).AAV-HSP70p-E1A感染各种肿瘤细胞，在正常生长情况下E1A蛋白几乎不表达，而在加热情况下E1A蛋白表达量迅速增加。

6).AAV-HRPp-E1A感染各种肿瘤细胞，在正常生长情况下E1A蛋白表达很低，而在缺氧的情况下E1A蛋白表达量迅速增加。

7).AAV-MUC1p-E1A感染有MUC1基因表达的乳腺癌细胞，如MCF-7，检测证明E1A蛋白表达；感染没有MUC1基因表达的乳腺癌细胞，如MDA-MB-231细胞，则未检测到E1A蛋白表达。

8).AAV-erbB2p-E1A感染有erbB2基因表达的乳腺癌细胞，如SKBR-3，检测证明E1A蛋白表达；感染没有MUC1基因表达的乳腺癌细胞，则未检测到E1A蛋白表达。

实施例5

构建和鉴定携带报告基因及治疗基因的复制缺陷型腺病毒载体

按本领域常规方法构建下述携带报告基因及治疗基因的复制缺陷型腺病毒载体，包装、扩增、纯化病毒，并进行功能鉴定。

①.携带报告基因EGFP编码基因：Ad-CMV-EGFP

②.携带具有刺激机体免疫能力的IL2编码基因：Ad-CMV-IL2

③.携带具有刺激机体免疫能力的GM-CSF编码基因：Ad-CMV-GM-CSF

④.携带肿瘤坏死因子TNFα编码基因：Ad-CMV-TNFα

采用人胚肾293细胞对上述构建病毒进行包装，经过噬菌斑(plaquepurification)筛选后再进行扩增，采用氯化铯密度梯度离心及透析纯化病毒。纯化的病毒滴度均可达3-5×10¹⁰pfu/ml。

将上述病毒感染肿瘤细胞测定报告基因EGFP及治疗基因的表达。结果证明，荧光显微镜下观察上述Ad-CMV-EGFP感染的肿瘤细胞，表达绿色荧光蛋白；ELISA检测治疗基因的表达水平，IL2，GM-CSF和TNFα的表达量都较高。

实施例6

由质粒反式提供腺病毒复制所必需的E1A的功能，复制缺陷型腺病毒在活体肿瘤内原位增殖、复制

将纯化后的质粒pcDNA3.1-TERTp-E1A和非复制型病毒Ad-CMV-EGFP先后注射到人非小细胞肺癌NCI-H460裸鼠皮下移植瘤内，由pcDNA3.1-TERTp-E1A在肿瘤原位反式提供腺病毒复制所必需的E1A的功能，然后对肿瘤原位复制缺陷型腺病毒Ad-CMV-EGFP的增殖、复制进行检测。

将3×10⁶NCI-H460细胞接种到裸鼠皮下，7-10天后肿瘤生长至5-10毫米直径大小。此时将20ug的pcDNA3.1-TERTp-E1A通过高频电击导入肿瘤内，24h后将2×10⁸Ad-CMV-EGFP注射到肿瘤内，病毒注射后72h取肿瘤，将肿瘤匀浆进行腺病毒滴度测定。结果表明，pcDNA3.1-TERTp-E1A联合Ad-CMV-EGFP组腺病毒滴度明显高于单独注射Ad-CMV-EGFP组(未进入细胞的病毒背景量)。

实施例7

由AAV反式提供腺病毒复制所必需的E1A的功能，复制缺陷型腺病毒在活体肿瘤内原位增殖、复制

将纯化后的AAV-TERTp-E1A和非复制型病毒Ad-CMV-EGFP同时或先后注射到人非小细胞肺癌NCI-H460裸鼠皮下移植瘤内，由AAV-TERTp-E1A在肿瘤原位提供腺病毒复制所必需的E1A的功能，然后对肿瘤原位复制缺陷型腺病毒Ad-CMV-EGFP的增殖、复制进行检测。

将3×10⁶NCI-H460细胞接种到裸鼠皮下，7-10天后肿瘤生长至5-10毫米直径大小。此时，将2×10¹⁰AAV-TERTp-E1A和2×10⁸Ad-CMV-EGFP同时或先后注射到肿瘤内，72h取肿瘤，将肿瘤匀浆后进行腺病毒滴度测定。结果表明，AAV-TERTp-E1A联合Ad-CMV-EGFP组腺病毒滴度明显高于单独注射Ad-CMV-EGFP组(未进入细胞的病毒背景量)；两病毒先后注射(先给AAV-TERTp-E1A，48h后再给Ad-CMV-EGFP)组腺病毒滴度比两病毒同时注射组更高。

实施例8

由质粒反式提供腺病毒复制所必需的E1A的功能，活体肿瘤内复制缺陷型腺病毒原位复制对肿瘤生长的抑制

将纯化后的质粒pcDNA3.1-TERTp-E1A和非复制型病毒Ad-CMV-IL2先后注射到人非小细胞肺癌NCI-H460裸鼠皮下移植瘤内，由pcDNA3.1-TERTp-E1A在肿瘤原位反式提供腺病毒复制所必需的E1A的功能，然后对肿瘤的生长进行跟踪。由于在肿瘤局部反式提供了E1A功能，复制缺陷型腺病毒可在肿瘤局部增殖并产生成熟的腺病毒颗粒，产生溶瘤作用；同时与E1A基因的抑癌作用以及我们前期发现的E1A提高腺病毒携带治疗基因表达水平的作用相协同，势必会大大提高基因治疗的效果。就安全性而言，即使病毒外漏，也仅为复制缺陷型腺病毒。

将3×10⁶NCI-H460细胞接种到裸鼠皮下，7-10天后肿瘤生长至5-10毫米直径大小。此时将20ug的pcDNA3.1-TERTp-E1A通过高频电击导入肿瘤内，24h后将2×10⁸Ad-CMV-IL2注射到肿瘤内，对照组注射2×10⁸Adnull，每2-3天测量肿瘤大小一次，跟踪观察肿瘤生长情况。

结果表明，Ad-CMV-IL2、pcDNA3.1-TERTp-E1A单独应用以及pcDNA3.1-TERTp-E1A和Adnull联合应用本身就具有一定抑制肿瘤生长的能力；当pcDNA3.1-TERTp-E1A和携带了治疗基因IL2的腺病毒联合应用时，所取得的抗癌效果明显增强，将近一半的肿瘤在观察末期仍然处于消失状态。显示了携带治疗基因的复制缺陷型腺病毒肿瘤原位复制在肿瘤治疗中的优越性。这种方案的单独使用或与现有的肿瘤治疗方法结合使用，能够显著地提高肿瘤治疗效果并减少副作用。

实施例9

由AAV反式提供腺病毒复制所必需的E1A的功能，活体肿瘤内复制缺陷型腺病毒原位复制对肿瘤生长的抑制。

将纯化后的AAV-TERTp-E1A和非复制型病毒Ad-CMV-IL2同时或先后注射到人非小细胞肺癌NCI-H460裸鼠皮下移植瘤内，然后对肿瘤的生长进行跟踪。由于rAAV可以介导E1A基因长时间表达，所以一方面复制缺陷型可在肿瘤局部不断地增殖，同时其携带的治疗基因维持高表达水平；另一方面腺病毒反过来又会提高rAAV携带的E1A基因的表达，二者形成正反馈。这势必会将上述三种作用(病毒溶瘤作用、E1A抑癌作用、治疗基因的作用)的协同作用进一步放大，基因治疗效果进一步提高。就安全性而言，即使病毒外漏，也仍为复制缺陷型腺病毒。

将3×10⁶NCI-H460细胞接种到裸鼠皮下，7-10天后肿瘤生长至5-10毫米直径大小。此时，将2×10¹⁰ AAV-TERTp-E1A和2×10⁸Ad-CMV-IL2以及对照2×10¹⁰AAV-TERTp-E1A和2×10⁸Adnull同时或先后注射到肿瘤内，每2-3天测量肿瘤大小一次，跟踪观察肿瘤生长情况。

结果表明，Ad-CMV-IL2、AAV-TERTp-E1A单独应用以及AAV-TERTp-E1A和Adnull联合应用本身就具有一定抑制肿瘤生长的能力；当AAV-TERTp-E1A和携带了治疗基因IL2的腺病毒联合应用时，所取得的抗癌效果明显增强，超过一半的肿瘤在观察末期仍然处于消失状态。显示了携带治疗基因的复制缺陷型腺病毒肿瘤原位复制在肿瘤治疗中的优越性。这种方案的单独使用或与现有的肿瘤治疗方法结合使用，能够显著地提高肿瘤治疗效果并减少副作用。

本发明所涉及的启动子序列及质粒做如下说明：

序列一：

GenBank：AF097365

Homo sapiens telomerase reverse transcriptase(TERT)gene，promoter and partialcds.

序列二：

GenBank：U47675

Human transcription factor E2F1(E2F1)gene，promoter and exon 1.

序列三：

GenBank：AH006957

Homo sapiens hypoxia-inducible factor 1 alpha subunit(HIF1A)gene，completecds

序列四：

GenBank：L34019

Homo sapiens(clone Ch-HAF3)alpha-fetoprotein(AFP)gene，promoter region

序列五：

GenBank：Z21818

H.sapiens carcinoembryonic antigen gene

序列六：

GenBank：X13229

Human hsp70B gene 5’-region

序列七：

GenBank：M35093

Homo sapiens tumor mucin antigen(MUC1)gene，complete cds.

序列八：

GenBank：M16892

Human c-erbB-2proto-oncogene，promoter region

质粒：

1.质粒pcDNA3.1为Invitrogen^TM life technologies产品，Catalog nos.V790-20，

2.质粒pEGFP-N1为CLONTECH L aboratories，Inc.产品，GenBank Accession#U55762

3.质粒pSNAV为北京本元正阳基因技术有限公司产品。

Claims (5)

1.选择性复制的复制缺陷型腺病毒在制备用于肿瘤治疗制剂中的应用；所述的选择性复制的复制缺陷型腺病毒在肿瘤细胞内特异性地复制而在正常细胞内不复制；

所述的选择性复制的复制缺陷型腺病毒通过下述方法制备：采用肿瘤细胞或肿瘤组织特异性的启动子取代腺病毒复制必需的早期基因的启动子，由真核表达质粒或重组腺相关病毒载体rAAV携带，联合携带治疗基因的复制缺陷型腺病毒载体RDA进行选择性复制，包括下述步骤:

①产生真核表达载体和重组腺相关病毒载体rAAV

1）通过PCR反应和克隆技术，分离肿瘤或组织特异性启动子；

2）构建携带肿瘤或组织特异性启动子调控腺病毒复制必需元件的重组腺相关病毒载体rAAV；

3）包装、扩增、纯化重组腺相关病毒rAAV，并进行测序及功能鉴定；

②产生复制缺陷型腺病毒载体RDA

1）构建和鉴定携带报告基因及治疗基因的复制缺陷型腺病毒载体RDA；

2）包装、扩增、纯化腺病毒，并进行病毒滴度及功能鉴定；

③在肿瘤或组织特异性启动子活化的细胞或组织中联合所构建的重组腺相关病毒载体rAAV和复制缺陷型腺病毒载体RDA，产生选择性复制的复制缺陷型腺病毒；

所述的腺病毒复制必需的早期基因是E1A,E1AE1B或E1AE1B19k；

所述的肿瘤细胞或肿瘤组织特异性的启动子选自低氧诱导性基因的启动子，E2F1基因启动子，Midikin基因启动子，或热休克蛋白基因启动子或前列腺组织特异性抗原基因启动子，MUC1基因启动子，肺细胞表面蛋白基因启动子，α-甲胎蛋白基因启动子，erbB2基因启动子，甲状腺球蛋白基因启动子，Tyrosinase基因的启动子，神经鞘基础蛋白基因启动子，乳球白蛋白基因启动子或癌胚抗原蛋白基因启动子。

2.根据权利要求1所述的应用，其特征是，所述的重组腺相关病毒载体rAAV为所有血清型重组腺相关病毒载体rAAV。

3.根据权利要求1所述的应用，其特征是，所述腺病毒DNA的E1或E3区域嵌入抗癌基因。

4.根据权利要求3所述的应用，其特征是，所述抗癌基因选自细胞凋亡诱导基因，抗新生血管形成基因，自杀基因，细菌毒素基因，肿瘤抑制基因，免疫调节因子或放射线增敏基因及其反义基因或干扰RNA片段。

5.根据权利要求4的应用，其中所述的肿瘤是人类原位或转移肿瘤。

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