JP4361708B2 - 複製−コンピテント抗癌ベクター - Google Patents
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Description
(政府助成金への参照)
本発明はNational Insutitutes of Healthからの補助金(補助金番号RO1 CA71704およびCA81829)下で政府の支援により成された。合衆国政府は本発明においてある種の権利を有する。
【0002】
(発明の背景)
(1)発明の分野
本発明は一般に癌の治療、さらに詳しくは、新形成細胞において複製し、アデノウイルス死滅蛋白質(ADP)を過剰発現するベクターおよびヒト癌を治療するにおけるこのベクターの使用に関する。
【0003】
(2)関連技術の記載
癌は合衆国および他の国において死亡の主たる原因である。癌のタイプに応じて、それは典型的には外科手術、化学療法および/または放射線照射で治療される。これらの治療はしばしば失敗する。すなわち外科手術は全ての癌を除去することができないことがあるし、いくつかの癌は化学療法および放射線照射療法に対して抵抗性であるし、化学療法−抵抗性腫瘍が頻繁に発生する。新しい療法は単独で、または古典的な技術と組み合わせて使用される必要がある。
【0004】
活発な研究中の1つの潜在的療法は、抗癌治療蛋白質を発現する組換えウイルスベクターで腫瘍を治療することである。アデノウイルス−ベースのベクターは、癌の治療における使用のために、ならびに遺伝的障害の療法のために、それらを概念的に訴えるものとするいくつかの特徴を含む。アデノウイルス(以後、「Ads」と相互交換的に用いる)は、培養にて安定である高力価ストックまで容易に増殖させることができる。それらはほとんどのヒト癌細胞タイプで複製する広い宿主範囲を有する。それらのゲノムは部位特異的突然変異および外来性プロモーターから発現された外来性遺伝子の挿入によって操作することができる。
【0005】
アデノウイルスは蛋白質キャプシド内のDNA−蛋白質コアよりなる(Stwartら,「Adenovirus structure by X−ray crystallography and electron microscopy」 in:The Molecular Repertoire of Adenoviruses,Doerfler,W.ら(編) Springer−Verlag,Heidelberg,Germany,p.25−38によってレビューされている)。ビリオンは特異的細胞受容体に結合し、エンドサイトーシスに付され、ゲノムはエンドソームから押し出され、核に輸送される。該ゲノムは約36遺伝子をコードする、約36kdpの線状デュプレックスDNAである(図1A)。核においては、「即時型」E1A蛋白質が最初に発現され、これらの蛋白質はE1B、E2、E3およびE4転写ユニットによってコードされた「遅延初期」蛋白質の発現を誘導する(Shenk,T.「Adenoviridae:the viruses and their replication」 in:Fields Virology,Field,B.N.ら,Lippencott−Raven,Philadelphia,p.2111−2148によってレビューされている)。また、E1A蛋白質は細胞遺伝子を誘導または抑制し、その結果、細胞周期が刺激される。約23の初期蛋白質は細胞を侵奪するように機能し、ウイルスDNA複製を開始させる。ウイルスDNAは感染後(p.i.)約7時間の時点において複製し、次いで、後期遺伝子が「主要後期」転写ユニットから発現される。主要後期mRNAは、代替プレ−mRNAプロセッシングによって、通常の「主要後期プロモーター」から合成される。各後期mRNAはその5’−末端において通常の「3部リーダー」を含み(図1中エクソン1、2および3)、これはAd後期mRNAの効果的な翻訳を可能とする。細胞蛋白質合成は停止し、細胞はウイルス蛋白質を作成するための工場となる。ビリオンは感染後約1日の時点で核で組み立てられ、2ないし3日後には細胞は溶解し、子孫ウイルスを放出する。細胞溶解はE3 11.6K蛋白質によって媒介され、これは「アデノウイルス死滅蛋白質」(ADP)と再命名されている(Tollefsonら,J.Virol.70:2296−2306,1996;Tollefsonら,Virol.220:152−162,1996)。本明細書中で上位概念的意味で用いられる用語ADPとは、集合的に、その全てが高度な配列同様性で持って相同ADPを発現する、例えば、Adタイプ1(Ad1)、Adタイプ2(Ad2)、Adタイプ5(Ad5)またはAdタイプ6(Ad6)のごときアデノウイルスからのADP群を言う。
【0006】
ヒト・アデノウイルス5型(Ad5)は癌遺伝子治療で特に有用である。それは、主として、年少の子供で無兆候または穏やかな気管感染、続いて長期の実質的免疫性を引き起こす。患者が免疫無防備状態である場合を除き、死を招く状態は極端に希である(Horwitz,M.S.,Adenoviruses,p.2149−2171 In B.N.Fields,D.M.Knipe,and P.M.Howley(編),Fields Virology,Lippincott−Raven Publishers,Philadelphia,PA,1996)。Ad5は非常によく理解されており、培養において、安定である高力価ストックまで増殖させることができ、ほとんどのヒト癌細胞型で複製することができる(Shenk,T.,Adenoviridae:the viruses and their replication,p.2111−2148.In B.N.Fields,D.M.Knipe,and P.M.Howley (編),Fields Virology,Lippincott−Raven,Philadelphia,1996)。そのゲノムは部位特異的突然変異誘発および外来性配列の挿入によって操作することができる。
【0007】
抗癌および遺伝子治療での使用が調べられつつあるAdベクターは、複製−欠陥または複製−コンピテントいずれかである組換えAdに基づく。典型的な複製−欠陥AdベクターはE1AおよびE1B遺伝子(集合的にE1として知られている)を欠き、外来性遺伝子の発現を駆動するプロモーターおよびプレ−mRNAプロセッシングシグナルよりなる発現カセットを所定の箇所に含有する。E1A蛋白質は他のAd遺伝子の転写を誘導し、非形質転換細胞において、それは細胞周期を脱調節し、種々の細胞遺伝子を誘導または抑制し、細胞をG0からS−相48に入れる(White,E.,Semin.Virol.8:505−513,1998;Woldら,pp.200−232 In A.J.Cann(編),DNA Virus Replication:Frontiers in Molecular Biology,Oxford University Press,Oxford)。 E1B蛋白質は細胞アポトーシスを阻害する(同上)。これらのベクターは、Ad遺伝子発現およびDNA複製を誘導するのに必要なE1A遺伝子を欠くので、複製することができない。加えて、E3遺伝子は培養中の細胞におけるウイルス複製で必須ではないので通常は欠失している。
【0008】
多数の研究者が、抗癌治療蛋白質を発現する複製−欠陥Adベクターを組み立てた。通常、これらのベクターはマウスモデルで増殖するヒト腫瘍の直接的注入によってテストされてきた。最も普通には、これらのベクターは単純疱疹ウイルスからのチミジンキナーゼ遺伝子を発現し、ベクターによって形質導入された細胞を殺すためにマウスがガンシクロビールで処理される(例えば、Felzmannら,Gene Ther.4:1322−1329,1997参照)。もう1つの自殺遺伝子治療アプローチは、シトシンデアミナーゼを発現する複製欠陥Adベクターを腫瘍に注入し、続いて、5−フルオロシトシンを投与する(Topfら,Gene Ther.5:507−513,1998)。研究者は、Ad−発現サイトカインが腫瘍に対する細胞毒性T−リンパ球(CTL)を含めた免疫応答を刺激するという予測のもとに、IL−2、IL−12、IL−6、腫瘍壊死因子(TNF)、I型インターフェロン、または共刺激分子B7−1のごときサイトカインを発現する複製−欠陥Adベクターを調製し、テストしてきた(Felzmannら,supra;Putzerら,Proc.Natl.Acad.Sci.USA 94:10889−10894,1997)。他のベクターは腫瘍抗原(例えば、メラノーマMART1)、細胞周期を脱調節し、アポトーシスを誘導する蛋白質(p53、pRB、p21Kip1/WAF1,p16CDKN2、およびAd E1Aでさえ)、およびリボザイムを発現する。FasLを発現するAdベクターはマウス腫瘍のアポトーシスおよび腫瘍退行を誘導する(Araiら,Proc.Natl.Acad.Sci.USA 94:13862−13867,1997)。
【0009】
これらの一般的に肯定的な報告とは無関係に、当該分野においては、複製−欠陥Adベクターはそれを治療で用いるのに次善にするいくつかの特徴を有すると認められている。例えば、複製−欠陥ベクターの生産は、それが、E1A蛋白質をトランスにて提供する補充細胞系で増殖することを必要とする。そのような細胞系は栄養条件が面倒であり、ウイルスストックの創製は時間を消費しかつ費用がかかる。加えて、多くの外来性蛋白質がそのようなベクターから発現されているが、発現のレベルはAd後期蛋白質と比較して低い。
【0010】
これらの問題と取り組むために、いくつかのグループは治療的使用のために複製−コンピテントAdベクターを用いることを提案している。複製−コンピテントベクターは複製に必須のAd遺伝子を保有し、かくして、複製するのに補充細胞系を必要としない。複製−コンピテントAdベクターは、当該ベクターの細胞周期の天然の一部として細胞を溶解させる。ベクターが外来性蛋白質をコードしそれを発現するように作成されている場合、複製−コンピテントAdベクターのもう1つの利点が生じる。そのようなベクターは、ベクターが複製するにつれてイン・ビボでコードされた蛋白質の合成を大いに増幅すると期待される。しかしながら、RCベクターが正常な組織を損傷し、散在性ウイルス血症を引き起こすのを防ぐためには、それが癌細胞に対するその複製を制限するいくつかの特徴を有することが重要である。
【0011】
Wyeth研究所は、Ad血清型4、7および5のワクチン株を用い、ワクチン摂取目的で複製−コンピテントAdベクターを開発した(Lubeckら,AIDS Res.Hum.Retroviruses 10:1443−1449,1994)。外来性遺伝子は(E3遺伝子が欠失した)E3領域に挿入され、またはゲノムの右側末端の部位に挿入される。用いる2つの外来性遺伝子はB型肝炎表面抗原およびHIVエンベロープ蛋白質であった。それらは培養中に良好な発現を得、動物モデルにおいて抗血清を生起させることができた。I相ヒト試験は不明瞭であり、プロジェクトはほとんど放棄された。
【0012】
Onyx Pharmaceuticalsは、最近、非新形成細胞で複製欠陥であるが、機能的p53および/または網膜芽細胞腫(pRB)腫瘍サプレッサー蛋白質を欠く新形成細胞において複製表現型を呈するアデノウイルス−ベースの抗癌ベクターについて報告している(米国特許第5,677,178号;Heiseら,Nature Med.6:639−645,1997;Bischoffら,Science 274:373−376,1996)。この表現型は、報告されているところによると、p53に結合することができないコードされたE1B−55K蛋白質を作成するE1B領域中の突然変異および/またはpRBおよび/もしくは細胞300kDポリペプチドおよび/もしくは107kDポリペプチドに結合できないコードされたE1A蛋白質(p289Rまたはp243R)を作成するE1A領域中の突然変異(群)を含有する組換えアデノウイルスによって達成される。E1B−55Kは少なくとも2つの独立した機能を有する:それは腫瘍サプレッサー蛋白質p53に結合しそれを不活化し、それは核からのAd mRNAの効果的な輸送で必要である。これらのE1BおよびE1Aウイルス蛋白質は、アデノウイルスDNAの複製に必要な、細胞のS−相への強制に関与する故に、かつp53およびpRB蛋白質は細胞周期の進行をブロックする故に、Onyxによって記載された組換えアデノウイルスベクターはp53および/またはpRBが不足する細胞で複製し、これは多くの癌細胞で当てはまるが、野生型p53および/またはpRBを持つ細胞では当てはまらない。Onyxは、ONYX−015と命名された、E1B−55Kを欠くアデノウイルスの複製がp53−マイナス癌細胞系に制限され(Bischoffら,前掲)、およびONYX−015が、ヌードマウスで増殖するp53−マイナスヒト腫瘍の増殖を遅らせ、またはその退行を引き起こす(Heiseら、前掲)ことを報告している。他の者は、ONYX−015の複製がp53遺伝子型から独立しており、いくつかの初代培養ヒト細胞で効果的に起こることを主張するOnyx報告に挑戦したHaradaおよびBerk,J.Virol 73:5333−5344,1999)。今日、ONYX−015が野生型p53を持つ細胞で複製できることが知られている(Goodrumら,J.Virol.72:9479−9490,1998;Haradaら,J.Virol.73:5333−5344,1999;Hayら,Hum.Gene Ther.10:579−590,1999;Rothmannら,J.Virol.72:9470−9478,1998;Turnellら,J.Virol.73:2074−2083,1999)。ONYX−015は複製せず、並びに野生型アデノウイルスは複製しない。何故ならば、E1B−55Kは核からのウイルスmRNA輸送を促進するのに利用できないからである。また、ONYX−015は野生型ウイルスよりもADPを発現するのは低い(後記実施例1参照)。
【0013】
ONYX−015の概念の拡張として、単純疱疹ウイルスチミジンキナーゼ遺伝子で置き換えたE1B−55Kについての遺伝子を有する複製−コンピテントアデノウイルスベクターが設計された(Wilderら,Gene Therapy 6:57−62,1999)。このベクターを構築したグループは、ベクター+ガンシクロビールの組合せがヌードマウスモデルにおいてヒト結腸癌に対して治療効果を示した効果を報告している(Wilderら,Cancer Res.59:410−413,1999)。しかしながら、このベクターはADPに対する遺伝子を欠き、それに応じて、該ベクターは細胞を溶解させ、ADPを発現する同等なベクターよりも効率低く細胞間に広がる。また、記載されているヒト前立腺特異的抗原の最小エンハンサー/プロモーターがアデノウイルスE1Aエンハンサー/プロモーターに挿入された、もう1つの複製−コンピテントアデノウイルスベクターで、ADPに対する遺伝子が欠けている(Rodriguezら,Cancer Res.57:2559−2563,1997)。
【0014】
複製−コンピテントベクターの改良についてのもう1つの戦略は、組織特異的プロモーターの制御下に複製を置くことである。1つのグループは、基礎E1Aプロモーターをα−フェト蛋白質(AFP)に対する修飾プロモーターで置き換えた(Hallenbeckら,Hum.Gene Ther.10:1721−1733,1999)。AFPは発生の間に肝臓で発現されるが、それは成人では発現されない。しかしながら、それは肝臓細胞癌腫を持つ患者の70−80%で発現される。このベクターの増殖はAFP−発現細胞に制限され、ベクターは異物トランスプラントのいくらかの抑制を示した(同上)。前立腺腫瘍特異的前立腺特異的抗原(PSA)およびカリクレインプロモーター/エンハンサーに依存したE1AおよびE1B遺伝子の発現を有する一連のRCベクターも開発されている(Rodriguezら,Cancer Res.60:1196,1997;Yuら,Cancer Res.59:4200−4203,2000;Yuら,Cancer Res 59:1498−1504,1999)。
【0015】
かくして、腫瘍において効果的に複製し、広がるが、それが正常な組織においては貧弱にしかまたは全く複製しないように修飾することができるベクターが継続的に必要とされている。
【0016】
(発明の概要)
略言すれば、従って、本発明は、新形成細胞において複製コンピテントであって、アデノウイルス死滅蛋白質(ADP)を過剰発現する新規なベクターに指向される。本明細書中で報告する実績は、組換えアデノウイルスによるADPの過剰発現が、組換えアデノウイルスが、非新形成細胞においてその複製速度をさもなければ低下させる突然変異を含有する場合においてさえ、野生型レベルのABPを発現するアデノウイルスによって呈されるものと同様またはそれよりも速い速度で、新形成細胞を殺し、細胞間に広がる複製−コンピテントアデノウイルスの構築を可能とするという発見を示すものである。ADPを過剰発現するAdベクターは活力があるままであり、Adベクターが他の腫瘍細胞に広がることができる新しいウイルス粒子を生産する前に多量のADPによって感染細胞が死滅されないことは、アデノウイルス生物学について知られていたものからは予測することができなかったので、この発見は予測されなかった。事実、天然に生じるアデノウイルスは、感染の初期段階においてE3プロモーターから少量でADPを発現し、一旦ビリオンが細胞核で組み立てられると、感染後24ないし30時間においてのみ大量にADPを作成し始める。他の非アデノウイルスベクターを含めた他のウイルスベクターおよびプラスミド発現ベクターを含めた他の非アデノウイルスベクターを用いて、ADP細胞−殺傷活性を新形成細胞に送達することができると考えられる。
【0017】
かくして、1つの好ましい具体例において、ADP−発現ベクターは、gp19K;RIDα(10.4Kとしても知られている);RIDβ(14.5Kとしても知られている)および14.7Kよりなる群から選択される少なくとも1つのE3蛋白質の発現を欠く組換えアデノウイルスを含む。これらのE3蛋白質はAd−感染細胞の免疫−媒介炎症および/またはアポトーシスを阻害するので、これらのE3蛋白質の1以上を欠く組換えアデノウイルスは、アデノウイルスで処理された腫瘍へ炎症および免疫細胞が侵潤するよう刺激し、この宿主免疫応答は腫瘍の破壊並びに転移した腫瘍の破壊を助けると考えられる。好ましい具体例によって発現されたADPは、サブグループCのヒトアデノウイルス、すなわち、Ad1、Ad2、Ad5およびAd6からの天然に生じるアミノ酸配列を含む。
【0018】
もう1つの具体例において、ベクターの複製は新形成細胞に制限される。そのような複製−制限ベクターは、ベクター、特に、その細胞周期の一部として宿主細胞を殺すウイルスベクターによって引き起こされ得る正常細胞および組織に対する損傷を排除または低下させるのが望ましい癌患者を治療するのに有用である。好ましい具体例において、組換えアデノウイルスは複製−制限表現型を有する。なぜならば、組換えアデノウイルスは、pRBおよびp300/CBP蛋白質に結合するE1Aウイルス蛋白質を発現できないからであり、かつE4プロモーターは、新形成細胞および/または特異的組織の細胞においてのみ活性化されるプロモーターで置き換えられているからである。
【0019】
さらにもう1つの具体例において、本発明はADPを過剰発現し、その複製が組織特異的プロモーター、腫瘍特異的プロモーターまたは誘導性プロモーターの制御下にあるベクターを提供する。好ましい具体例において、ベクターは、組織特異的プロモーターまたは誘導性プロモーターがE4プロモーターに代えて置き換えられた組換えアデノウイルスを含む。そのようなベクターは、該ベクターおよびそのADP−媒介細胞殺傷の複製を、特定タイプの細胞に、またはプロモーターを活性化する外来性剤に暴露された細胞に制限するのに有用である。また、好ましい組織特異的または誘導性ベクターは、その複製を新形成細胞に制限する表現型を発現する。
【0020】
さらにもう1つの具体例において、本発明は、ADPを過剰発現するが、特異的遺伝子修飾によって腫瘍に制限されないベクターを提供する。そのようなベクターは、サブグループCの天然に生じるAdさえよりも新形成細胞に対して破壊的である。好ましい具体例において、このベクターは、もう1つの方法によって治療できないが、Adに対する予め存在する中和抗体を有するか、あるいは中和抗体を投与することができる末期癌を持つ患者で用いることができる。
【0021】
さらにもう1つの具体例において、本発明は、新形成細胞において複製コンピテントであって、アデノウイルス死滅蛋白質を過剰発現する第1の組換えウイルスを含む組成物を提供する。1つの具体例において、組換えウイルスは、ウイルスのあるタイプの細胞への送達を制限する標的化部位を含む送達ビヒクル内に含有される。この具体例では、複製−コンピテントベクターは本明細書中に記載されるいずれのADP−過剰発現形態のものであってもよい。いくつかの具体例において、該組成物は、複製−欠陥であって、抗癌遺伝子産物を発現する第2の組換えウイルスを含む。いくつかの具体例において、複製−欠陥ベクターは、このベクターの複製が複製−コンピテントベクターによって補われる場合にADPを過剰発現するように作成することができる。該組換えウイルスは、複製−欠陥ウイルス、並びにそのコードされた抗癌産物の腫瘍を通じての拡大を補充する。好ましい具体例において、該第1の組換えウイルスは、その複製が新形成細胞に制限されるおよび/またはE3 gp19K;RIDα;RIDβ;および14.7K蛋白質の1以上の発現を欠く組換えアデノウイルスである。
【0022】
さらなる具体例において、本発明は、ADPを過剰発現し、また、抗癌産物を発現する複製−コンピテントベクターを提供する。これまでの具体例に関しては、該ベクターは、ここに提供されるいずれのADP−過剰発現形態のものであってもよい。好ましくは、ウイルスの複製は、(a)例えば、組織特異的または腫瘍特異的プロモーターでE4プロモーターを置き換えることによって、新形成細胞に制限されるおよび/または(b)E3 gp19t;RIDα;RIDβ;および14.7K蛋白質の1以上の発現を欠くように作成される。いくつかの具体例において、抗癌産物がE3領域に挿入される。
【0023】
本発明のADP−発現ベクターおよび組成物は、新形成細胞の死滅を促進する方法で有用である。該方法は、新形成細胞を、新形成細胞において複製−コンピテントであって、ADPを過剰発現するベクターと接触させることを含む。新形成細胞が患者における腫瘍を含む場合、該ベクターは腫瘍に直接投与されるか、あるいは、他の具体例において、ベクターは全身にあるいはベクターの腫瘍への送達を指令する標的化部位を含有する送達ビヒクル中にて患者に投与される。該ベクターは組換えウイルスである具体例において、該方法はウイルスに対して患者を受動的に免疫化することを含むことができる。
【0024】
本発明のさらにもう1つの具体例において、ベクターは放射線照射療法と組み合わせて用いることができる。放射線照射療法は、例えば、x線治療のごとき外部ビーム照射、ガンマ線放出放射性核種での治療のごとき腫瘍部位近くのまたは該部位における身体内への放射線活性物質の挿入によって送達される放射線照射、中性子または荷電粒子等を利用する粒子ビーム療法のような当該分野で用いられるいずれの形態の放射線照射療法であってもよい。加えて、この具体例は、放射線照射療法と組み合わせたカクテル中の本発明の1を超えるベクターの使用を含む。
【0025】
本発明のもう1つの具体例は、他のアデノウイルスベクターで開示されているごとく(米国特許第5,846,945号)、化学療法と組み合わせた組換えベクターの使用を含む。化学治療剤は当該分野で知られており、ピリミジン−アナログおよびプリン−アナログ抗代謝剤を含めた抗代謝剤、植物アルカロイド、抗腫瘍抗生物質、アルキル化剤等を含む。化学治療剤(類)と一緒に本発明の1を超えるベクターを使用することも本具体例内であると考えられる。
【0026】
本発明によって達成されることが判明したいくつかの利点の中には、従って、迅速に癌細胞を殺し、腫瘍において細胞間に広がる複製−コンピテントベクター、特にウイルスの提供;その複製が誘導されることができるか、または腫瘍および/またはある組織型の細胞に制限されるかかるベクターの提供;および正常な組織においてほとんどまたは全く副作用を引き起こさない抗癌療法のための組成物および方法の提供を挙げることができる。
【0027】
(好ましい具体例の記載)
本発明によると、組換えアデノウイルスによるADPの過剰発現の結果、野生型レベルのADPを発現するウイルスよりも細胞単層全体を通じて細胞のより速い溶解およびウイルスの拡大がもたらされることが判明した。また、ADPについてのこの機能は、アデノウイルス複製を新形成細胞に制限するE1A突然変異を含有するアデノウイルスで発現されることも判明した。かくして、新形成細胞において複製コンピテントであって、ADPを過剰発現するベクターは抗癌療法で有用なはずである。
【0028】
本開示の関係では、以下の用語は特記しない限り、以下のように定義される。
【0029】
ポリヌクレオチド、ポリペプチドまたはウイルスのごとき対象に適用される「天然に生じる」は、該対象が天然における源から単離でき、ヒトによって意図して修飾されていないことを意味する。
【0030】
「新形成細胞」は、細胞増殖の制御の有意な喪失によって特徴付けられる異常増殖表現型を呈する細胞を意味し、能動的に複製する細胞ならびに一時的に非複製休止状態にある(G1またはG2)細胞を含む。新形成細胞はよく分化した表現型または貧弱に分化した表現型を有することができ、良性新形成または悪性新形成を含むことができる。
【0031】
「組換えウイルス」は、野生型ウイルスゲノムにおける1以上のヌクレオチドの欠失、挿入または置換により野生型ウイルスとは異なるいずれかのウイルスゲノムまたはビリオンを意味する。組換えウイルスは、コードされ発現されるアミノ酸配列の数、またはウイルスによって発現される蛋白質の量または活性の変化を有することができる。特に、該用語はヒトの介入によって創製された組換えウイルスを含む。
【0032】
ベクターに適用される「複製−コンピテント」は、ベクターが正常および/または新形成細胞において複製できることを意味する。組換えウイルスに適用されるごとく、「複製−コンピテント」は、該ウイルスが正常および/または新形成細胞において以下の表現型特徴:細胞感染;ウイルスゲノムの複製;および新しいウイルス粒子の生産および放出を呈することを意味するが、これらの特徴の1以上はそれらが野生型ウイルスによって感染した同一細胞型で起こるので同一速度で起こる必要はなく、より速いまたはより遅い速度で起こり得る。組換えウイルスは、その細胞周期の一部として細胞を溶解するアデノウイルスのごときウイルスに由来する場合、細胞培養単層における細胞の少なくとも5ないし25%が感染の5日後に死滅しているのが好ましい。好ましくは、複製−コンピテントウイルスは感染後5日までに単層の細胞の少なくとも25ないし50%、より好ましくは少なくとも75%、最も好ましくは少なくとも90%に感染し、それを溶解する。
【0033】
組換えウイルスに適用される「複製−欠陥」は、該ウイルスが、補充複製−コンピテントウイルスの不存在下でいずれかの細胞型においてそのゲノムを複製することができない、または大いに損なわれることを意味する。この例外は、アデノウイルスE1AおよびE1B蛋白質を発現するように作成されている293細胞のごとき細胞系である。
【0034】
本発明のベクターに適用される「複製−制限」は、該ベクターが、正常な非分裂細胞ともここではいう、新形成ではないおよび/または分裂しない同一タイプの細胞におけるよりも、分裂細胞、すなわち、新形成細胞もしくは非新形成分裂細胞において良好に複製することを意味する。好ましくは、複製−制限ウイルスは、感染後5日において細胞障害効果(CPE)を示す細胞の数によって測定して、同一サイズの細胞培養単層における正常な非分裂細胞よりも少なくとも10%多く新形成細胞を殺す。より好ましくは、正常細胞よりも25%および50%の間、より好ましくは50%および75%の間より多い新形成細胞が複製−制限ウイルスによって殺される。最も好ましくは、複製−制限アデノウイルスは、感染後5日までに、等しいサイズの単層において正常細胞よりも75%および100%の間より多い新形成細胞を殺す。
【0035】
1つの具体例において、本発明は、新形成細胞において複製−コンピテントであって、ADPを過剰発現するベクターを提供する。本発明で有用なベクターは、限定されるものではないが、プラスミド−発現ベクター、多数の異なる細胞型に侵入し、そこで生存することができるSalmonella種のごとき細菌ベクター、ヒトおよび非ヒトアデノウイルス、アデノウイルス関連ウイルス(AAV)、ポックスウイルス、ヘルペスウイルスのようなDNAウイルスに由来するベクター、およびレトロウイルスおよびアルファウイルスのごときRNAウイルスに由来するベクターを含む。好ましいベクターは、ADPを過剰発現するように作成された組換えウイルスを含む。組換えアデノウイルスは、ベクター、特にAd1、Ad2、Ad5またはAd6に由来するベクターとして用いるのに特に好ましい。
【0036】
本発明によるベクターはADPを過剰発現する。組換えAdおよびAAVベクターに適用されるごとく、用語「ADPを過剰発現する」は、同一タイプの分裂細胞においていずれかの以前に知られている組換えアデノウイルスベクターまたはAAVによって発現されるよりも当該ベクターによって感染された分裂細胞に存在するウイルスゲノム当たりより多くのADP分子が作成されることを意味する。他の非アデノウイルスベクターに適用されるごとく、「ADPを過剰発現する」は、当該ウイルスが、ベクターを含有する細胞を溶解するのに十分なADPを発現することを意味する。
【0037】
ADPを過剰発現するベクターはルーチン的な方法を用いて調製することができる。例えば、A Laboratory Cloning Manual,2nd Ed.,vol.3,Sambrookら編、Cold Spring Harbor Laboratory Press,1989参照。例えば、ADPをコードするポリヌクレオチドは、哺乳動物細胞において異種蛋白質を効果的に発現することが知られているプラスミド発現ベクターにクローンすることができる。該ポリヌクレオチドは適当な終止およびポリアデニル化シグナルも含むべきである。エンハンサーエレメントをプラスミドに添加して、ADP発現の量を増加させることもできる。ADPを過剰発現するウイルスベクターは、同様の材料および技術を用いて調製することができる。
【0038】
ウイルスが組換えアデノウイルスである場合、ADPの過剰発現は多くの方法で達成することができる。一般に、E3プレ−mRNA分子のより多くがADPに対するmRNAにプロセッシングされるので、E3mRNAのいずれかに対するスプライス部位を除去するE3領域におけるいずれのタイプの欠失も、ADPに対するmRNAの過剰発現に導く。これは、その構築を後記するKD1、KD3、GZ1およびGZ3ベクター(配列番号:1−4)に例示されている。AdベクターにおいてADPの過剰発現を達成する他の手段は、限定されるものではないが、プレ−mRNAスプライシングおよび切断/ポリアデニル化シグナルの、ADPに対する遺伝子を近接にて挟む部位における挿入;Adゲノム中の種々の部位に挿入されたもう1つのプロモーター、例えば、ヒト・サイトメガロウイルスプロモーターからのADPの発現;およびADPの翻訳の内部開始を可能とするADP配列の5’側にある配列、例えば、Ad三部リーダーまたはウイルス内部リボソーム開始配列と共に、もう1つのAd mRNAに対する遺伝子の背後へのADPに対する遺伝子の挿入を含む。
【0039】
本発明によるベクターによって発現されたADPは、ベクターの複製されたコピーが感染細胞から放出されるように、ベクターを含有する細胞を溶解させる能力をADPを発現するベクターに付与する天然に生じる全長ADPアミノ酸配列またはその変種を含むいずれかのポリペプチドである。好ましい全長ADPはAd1、Ad2、Ad5またはAd6によってコードされるADPアミノ酸配列を含む。これらの天然に生じるADP配列は、各々、配列番号:5−8に記載されている。ADP変種は、天然に生じるアデノウイルス死滅蛋白質の断片および欠失突然変異体、ならびに保存的アミノ酸置換を含有する全長分子、断片および欠失突然変異体を含む。但し、そのような変種は、細胞内部でベクターによって発現されると、該細胞を溶解する能力を保有するものとする。
【0040】
保存的アミノ酸置換とは、同様の側鎖を有する残基の相互交換性をいう。保存的に置換されたアミノ酸は、それらの側鎖の化学的特性に従ってグループ分けすることができる。例えば、アミノ酸の1つのグループ分けは、中性および疎水性側鎖を有するアミノ酸(A、V、L、I、P、W、F、およびM)を含み;もう1つのグループ分けは中性および極性側鎖を有するアミノ酸(G、S、T、Y、C、NおよびQ)であり;もう1つのグループ分けは塩基性側鎖を有するアミノ酸(K、R、およびH)であり;もう1つのグループ分けは酸性側鎖を有するアミノ酸(DおよびE)であり;もう1つのグループ分けは脂肪族側鎖を有するアミノ酸(G、A、V、LおよびI)であり;もう1つのグループ分けは脂肪族−ヒドロキシル側鎖を有するアミノ酸(SおよびT)であり;もう1つのグループ分けはアミン−含有側鎖を有するアミノ酸(N、Q、K、R、およびH)であり;もう1つのグループ分けは芳香族側鎖を有するアミノ酸(F、Y、およびW)であり;およびもう1つのグループ分けは硫黄−含有側鎖を有するアミノ酸(CおよびM)である。好ましい保存的アミノ酸置換グループはR−K;E−D,Y−F,L−M;V−1,およびQ−Hである。
【0041】
本明細書で用いるごとく、ADP変種は、1以上のアミノ酸が挿入され、欠失され、または異なるアミノ酸または修飾されたもしくは異常なアミノ酸で置換された天然に生じるADPの修飾、ならびに修飾された配列を含有するADP変種が細胞溶解活性を保有する限り、1以上のアミノ酸のグリコシル化またはリン酸化のごとき修飾も含むことができる。
【0042】
後記するごとく、本発明者らは、ここに、細胞死滅を促進するのに必要なADP中の特定のドメインを規定するADPの構造−機能分析を行った。この情報を用い、既知の組換えDNAおよびクローニング方法と組み合わせると、当業者であれば、天然に生じるアデノウイルス死滅蛋白質のADP変種を容易に構築し、それらを細胞溶解活性につきテストすることができると考えられる。好ましいADP欠失突然変異体は、そのADP配列が、各々、配列番号:9−12に記載された、欠失突然変異体dl716、dl715、dl714およびdl737のいずれかからのADPアミノ酸配列を含む。
【0043】
ベクターがウイルスに由来する場合、ウイルスは、感染細胞の免疫−媒介炎症および/またはアポトーシスのごとき宿主抗ウイルス防御の回避に関与する1以上のウイルス蛋白質の発現を欠くのが好ましい。例えば、アデノウイルスは、免疫系によるAd−感染細胞の殺傷を防止する遺伝子のカセットを含有する(Woldら,Semin.Virol.,1998(8:515−523,1998)。RIDαおよびRIDβよりなる複合体である、E3−14.7K蛋白質およびE3 RID(受容体内部化および分解)蛋白質は、活性化されたマクロファージ、ナチュラルキラー(NK)細胞、および細胞毒性リンパ球(CTL)で発現される、またはそれらによって分泌される腫瘍壊死因子(TNF)およびFasリガンドによって誘導されたAd−感染細胞のアポトーシスを阻害する(Tollefsonら,Nature 392:727−730,1998)。E3−gp19K蛋白質は、細胞表面へのMHCクラスI抗原の輸送をブロックすることによって感染細胞のCTL−殺傷を阻害する(Woldら,前掲)。かくして、かかるウイルスベクターによる腫瘍細胞の感染は炎症細胞およびリンパ球の腫瘍への侵潤を刺激し、免疫系の細胞溶解細胞によって誘導されるアポトーシスから、またはサイトカインを誘導するアポトーシスに対して感染腫瘍細胞を妨げないであろうと考えられる。例えば、マウスをE3 gp19K、RIDおよび14.7K蛋白質を欠くAd突然変異体で感染させると、炎症細胞およびリンパ球の感染組織への侵潤の劇的な増加(E3−陽性Adと比較して)があることが知られている(Sparerら,J.Virol.70:2431−2439,1996)。本発明のADP−発現ウイルスベクターによって感染された腫瘍の同様の侵潤は、免疫系の攻撃をADP−媒介殺傷活性に添加することによって、さらに腫瘍の破壊を促進すると期待されるであろう。例えば、ウイルス感染は、腫瘍細胞におけるのみならず転移したものにおいて新形成細胞を殺すことができる腫瘍−特異的CTLの形成を刺激するであろうと考えられる。加えて、また、もしベクターが腫瘍から正常細胞へと広がるならば、ベクター−感染細胞を攻撃できるベクター−特異的CTLが創製されるであろうと予測される。ADPを過剰発現するウイルスベクターは腫瘍を通じて迅速に広がるので、これらの免疫メカニズムはベクターの広がりに対してほとんど効果を有しないであろうと考えられる。
【0044】
ベクターが組換えアデノウイルスである場合、アデノウイルスはE3 gp19K、RIDおよび14.7K蛋白質の各々の発現を欠くのが好ましい。蛋白質の「発現を欠く」および「発現を欠いている」とは、当該ウイルスゲノムが、機能的蛋白質、すなわち、野生型蛋白質の全ての機能を有するものの発現を不活化する1以上の突然変異を含有することを意味する。不活化突然変異体は、限定されるものではないが、機能的転写体の発現を防止する、あるいは非機能的翻訳産物をコードする転写体をもたらす、コーディング遺伝子中の1以上のヌクレオチドの置換または欠失を含む。Ad E3 gp19K、RIDおよび14.7K蛋白質の発現を不活化するための特に好ましい方法は、これらの蛋白質をコードする遺伝子を含有するE3領域を欠失することによるものである。好ましくは、E3 6.7Kおよび12.5K蛋白質をコードするE3遺伝子の一方または双方もまた欠失させる。なぜならば、後記する実施例で議論するごとく、ADP遺伝子以外のE3遺伝子のほとんどまたは全てが、主要後期プレ−mRNAのスプライシングについての競合を低下させることによってADP mRNAの過剰発現を容易にすると考えられるからである。ADPを過剰発現するE3欠失を含有する好ましいAdベクターは、その構築および特性が後記実施例に記載されているGZ1(配列番号:3)およびGZ3(配列番号:4)である。
【0045】
また、本発明は、その複製が分裂細胞に制限されるADP−発現ベクターを提供する。そのような複製−制限表現型を供することが知られているいずれの手段も用いることができる。例えば、WO96/40238は腫瘍細胞に選択的に侵入する微生物ならびに腫瘍において選択的に活性化される細菌プロモーターを同定し単離するための方法を記載する。また、複製に必須の1以上のベクター蛋白質の発現は、その発現が新形成細胞で上昇調節されることが知られている細胞遺伝子のためのプロモーターの制御下に置くことができると考えられる。そのような遺伝子の例は、限定されるものではないが、乳癌マーカーママグロビン(Watsonら,Oncogene 16:817−824,1998);BRCA1(Norrisら,J.Biol.Chem.270:22777−22782,1995)her2/neu(Scottら,J.Biol.Chem.269:19848−19858,1994);前立腺特異的抗原(米国特許第5,698,443号);肺胞についてのサーファクタント蛋白質(surfactant protein)B(Yanら,J.Biol.Chem.270:24852−24857,1995);肺についての第VII因子(Greenbergら,Proc.Natl.Acad.Sci.USA 92:12347−12351,1995);および一般に癌についてのスルビビン(Liら,Nature 396:580−584)を含む。ベクターがアデノウイルスである場合、そのような腫瘍−特異的プロモーターをE4プロモーターに代えて置き換えることができると考えられるE4遺伝子産物はAd複製に必須であるので、それらの発現を腫瘍−特異的プロモーターの制御下に置くことは、プロモーターが活性化される腫瘍細胞へのベクターの複製を制限するはずである。
【0046】
ADP−発現Adベクターの複製を新形成細胞に制限するためのもう1つの戦略は、その構築および特性が後記実施例に記載された、KD1(配列番号:1)、KD2(配列番号:13)およびKD3(配列番号:2)ベクターによって例示される。この戦略は、癌細胞においてのみよく増殖することができる、ここではdl01/07とも言うdl1101/1107と命名された(Howeら,Proc.Natl.Acad.Sci.,87:5883−5887,1990)、E1A遺伝子中の予め存在するAd5突然変異体を開発する。E1Aの役割は、細胞周期のG0およびG1相からS−相へ細胞を駆動することにある。これは、2つのメカニズムによって達成され、1つはpRB(およびファミリーメンバー)に関与し、他方はp300および関連蛋白質CBPに関与する(DePinho,R.A.,Nature,391:533−536,1998)。E1Aにおける1つのドメインはpRBファミリーのメンバーに結合する。pRBは、通常は、S−相において発現される細胞のプロモーター中のE2FないしE2F結合部位を介して連結した、転写因子E2F−1およびE2Fファミリーメンバー(E2F)との複合体として細胞に存在する。ここに、pRBは転写共リプレッサーとして働く。pRBへのE1Aの結合はこの抑制を軽減し、pRB/E2F複合体からのE2Fの放出を引き起こす。次いで、遊離E2Fは、S−相で発現される遺伝子、例えば、チミジンキナーゼ、リボヌクレオチドレダクターゼ等のプロモーターを活性化する。E1Aにおけるもう1つのドメインはp300/CBP転写アダプター蛋白質複合体に結合する。p300/CBPは、多くの異なる転写因子に結合する転写共アクチベーターであり、従って、プロモーターに標的化される。p300CBPは固有のヒストンアセチルトランスフェラーゼ活性を有する。p300/CBPへのE1Aの結合はこのヒストンアセチルトランスフェラーゼ活性を阻害すると考えられ、ヒストンのアセチル化および転写の抑制を行う(Chakravartiら,Cell 96:393−403,1999;Hamamoriら,Cell 96:405−413,1999)。概念的には、p300/CBPと相互作用するE1Aの結果として抑制される遺伝子のいくつかは細胞周期をブロックする役割を演じるが、これは知られていない。癌細胞は周期を進行させ、従って、それは遊離E2Fを有し、恐らくは、いくつかのp300/CBP−調節遺伝子は抑制される。この考え方と合致し、E1Aはp300/CBPおよびpRBファミリー双方と結合して、初代細胞を構成的に周期を進行させる状態に変換するに違いない(Howeら,前掲)。突然変異体dl01/07は、p300/CBP−およびpRB−結合ドメイン双方を欠如し、予測されるごとく、非分裂「正常」細胞または血清飢餓癌細胞において非常に貧弱にしか複製しないが、増殖する癌細胞においてはよく複製する。後記するごとく、dl01/07 E1A突然変異を含有するKD1およびKD3ベクターの増殖は、非分裂細胞と比較して分裂癌細胞においてかなり良好である。dl01/07突然変異体がラット細胞のオンコジーン形質転換で完全に欠けている(Howeら,前掲)ので、このE1A突然変異を含有する本発明によるベクターは、E1A−依存性メカニズムを介する(ことができるので,離れて)ヒトにおいて癌を誘導することができない。
【0047】
また本発明は、複製に必須の1以上の蛋白質の発現を、組織特異的プロモーターおよび/または腫瘍特異的プロモーターの制御下に置くことによって、その複製が特異的組織に制限されるADPを過剰発現するベクターを含む。多数の組織特異的および/または腫瘍特異的プロモーターが当該分野で記載されている。非限定的例は、内皮系の細胞において特異的に遺伝子発現を指令する、Breitmanらに対する米国特許第5,466,596号に記載されたTTFI転写因子を含有する細胞(すなわち、II型歯槽細胞(Yanら,前掲))においてのみ活性であるサーファクタント蛋白質Bプロモーター;前立腺細胞で発現される前立腺特異的抗原(Rodriguezら,前掲);ヒト・テロメラーゼ蛋白質(hTERT)プロモーター(例えば、米国特許第6,054,575号参照);乳癌細胞で発現されるヒトα−ラクトアルブミン遺伝子(Andersonら,Gene Therapy 6:854−864,1999)を含む。多くの他の組織−特異的、腫瘍特異的または組織−好ましいエンハンサー/プロモーターが報告されている(MillerおよびWhelan,Human Gene Therapy 8:803−815,1997)。実施例6および10においてサーファクタント蛋白質Bプロモーターで例示されているごとく、組織−特異的プロモーターを発現するベクターは、ウイルス複製、ウイルス拡大、細胞溶解および腫瘍抑制において組織特異性を示すと予測される。
【0048】
本発明によるベクターの複製は、ベクター複製に必須の1以上の遺伝子を、金属、ホルモン、抗生物質および温度変化のごとき外因性誘導剤によって活性化されるプロモーターの制御下に置くことによって制御することができる。そのような誘導性プロモーターの例は、限定されるものではないが、メタロチオネインプロモーター、糖質コルチコイドプロモーター、テトラサイクリン応答プロモーター、hsp65および70プロモーターのごとき熱ショック蛋白質(hsp)プロモーターを含む。
【0049】
また、本発明は、新形成細胞の死滅を促進する有効量のADPを過剰発現する組換えベクターを含む組成物、および治療上有効量のベクターを患者における新形成細胞に投与することを含む方法を提供する。本発明の組成物および方法はいずれの起源の新形成細胞を殺すのにも有用であり、腫瘍を含む新形成細胞ならびに転移性新形成細胞を含む。
【0050】
また、ADP−発現ウイルスベクターを、抗癌遺伝子産物を発現する複製−欠陥ウイルスと共に新形成細胞に投与することができると考えられる。例えば、癌療法で用いられる多くの複製−欠陥E1-Adベクターはよく特徴付けられている。複製−欠陥ベクターの制限は、それが最初に感染し、それが他の細胞に拡大できない細胞において治療蛋白質を合成するに過ぎないことである。また、ゲノムは複製しないので、転写はインプットゲノムからのみ起こることができ、これは細胞当たり1コピーと低くすることができる。対照的に、複製−コンピテントAdベクターのゲノムは、最初に感染した細胞において約104だけ増幅され、転写のためのより多くの鋳型を提供する。より多くの増幅は、ベクターが他の細胞に拡大するにつれて達成される。抗癌遺伝子産物を発現する複製−欠陥ウイルスベクターをここに記載する複製−コンピテントウイルスベクターと組み合わせることによって、鋳型が増幅され、双方のベクターが周囲の細胞に迅速に拡大される結果となると考えられる。例えば、Ad−ベースのベクターでは、各ベクターについてのバーストサイズは大きい(〜104PFU/細胞)はずであり、従って、双方のベクターによる周囲細胞の共感染の確率は高いであろう。かくして、複製−コンピテントおよび複製−欠陥ベクター双方は腫瘍を通じて同時に広がり、より効果的な抗癌療法さえ提供する。
【0051】
ADP過剰発現Adベクターと共に抗癌遺伝子産物を送達する別の方法として、抗癌遺伝子をここに記載したADP過剰発現複製−コンピテントベクターのいずれかに入れて作成して、単一ベクター中にADPおよび抗癌機能双方を提供することができる。当業者が容易に測定することができるごとく、抗癌遺伝子をベクターのいずれかの適当な位置に作成することができる。例えば、抗癌遺伝子をE3領域に作成することができる。
【0052】
複製−欠陥ベクターによってコードされた抗癌遺伝子産物の発現は構成的、誘導性または細胞型特異的プロモーターいずれかの制御下にあるようにできる。抗癌遺伝子産物は、新形成細胞の死滅を促進するいずれかの物質であり得る。本明細書中で用いる用語「遺伝子産物」とは、遺伝子の制御下で起こる生化学反応の結果として生じるいずれの生物学的産物または産物類をもいう。遺伝子産物は、例えば、遺伝子の初期産物、すなわち、代謝産物である酵素または他の分子の制御下で生じたRNA分子、ペプチド、蛋白質または産物であり得る。例えば、遺伝子は、まず、リボソームの作用によって、癌患者に投与された非毒性プロドラッグを細胞殺傷剤に変換するプロドラッグ変換酵素に翻訳されるRNA分子の合成を制御することができる;該酵素によって生じたRNA分子、酵素、および細胞殺傷剤は該用語がここに用いられるごとく全ての遺伝子産物である。抗癌遺伝子産物の例は、限定されるものではないが、アポトーシス−促進剤およびトキシン;プロドラッグ変換酵素;脈管形成阻害剤;および新形成細胞に対して免疫応答(液性および/または細胞性)を刺激することができる免疫調節分子および抗原等の細胞殺傷剤を含む。
【0053】
アポトーシス−促進剤は、限定されるものではないが、BAX、BAD、BIDおよびBIKのごときBCL−2ファミリーのプロ−アポトーシスメンバー、ならびに該BCL−2ファミリーの抗アポトーシスメンバーの発現をブロックするアンチセンス分子を含む。免疫調節分子の例は腫瘍壊死因子、Fas/Apo1/CD95リガンド、腫瘍壊死因子関連アポトーシス誘導リガンド、インターロイキン、マクロファージ活性化因子およびインターフェロンγのごときサイトカインである。脈管形成阻害剤は、限定されるものではないが、エンドスタチンおよびアンジオスタチンを含む。トキシンは、限定されるものではないが、腫瘍壊死因子、リンフォトキシン、動物細胞においてリシン受容体の欠如のためヒトに対して毒性でない植物トキシンリシン、および細菌トキシンの毒性サブユニットを含む。プロドラッグ変換酵素およびプロドラッグの組合せの例はWO96/40238に記載されており、チミジンキナーゼおよびアシクロビールまたはガンシクロビーム;および細菌シトシンデアミナーゼおよび5−フルオロシトシンを含む。
【0054】
例えば、本発明の治療もしくは医薬組成物は、例えば、腫瘍への直接的注入による、または静脈内、皮下、筋肉内、経皮、クモ膜下腔内および脳内のごとき他の注入経路によることを含めた、当該分野で知られたいずれかの適当な経路によって投与することができる。投与は、注射によるように迅速に、または遅延放出処方の遅延注入または投与によるような一定時間にわたるものとすることができる。中枢神経系中の組織を治療するには、投与は脳脊髄液(CSF)への注射または注入によることができる。本発明の組換えベクターを中枢神経系の細胞に投与することを意図する場合、投与は、脳−血液関門を横切ってのベクターの浸透を促進することができる1以上の剤を用いて行うことができる。好ましくは、本発明のベクターは、標的化部位を含有するリポソームまたはポリマーのごとき担体と共に投与して、ベクターの送達を標的化細胞に限定する。標的化部位の例は、限定されるものではないが、特異的細胞表面分子に対する抗体、リガンドまたは受容体を含む。
【0055】
本発明による組成物は医薬製剤の形態で使用することができる。そのような製剤は製薬分野でよく知られている方法で作成される。1つの好ましい製剤は生理食塩水のビヒクルを利用するが、生理学的濃度の他の毒性塩、5%水性グルコース溶液、滅菌水等のごとき他の医薬上許容される担体を用いることもできると考えられる。また、適当な緩衝液を組成物に存在させることも望ましい。そのような溶液は、所望ならば、容易な注射のための滅菌水の添加によって復元が容易な滅菌アンプル中に凍結乾燥し、貯蔵することができる。主な溶媒は水性であるか、あるいは非水性とすることができる。
【0056】
また、担体は、pH、浸透圧、粘度、透明性、色、滅菌性、安定性、溶解速度、または処方の臭いを修飾しまたは維持するための他の医薬上許容される賦形剤を含有することもできる。同様に、担体は、脳−血液関門を横切る放出または吸収または浸透を修飾するかまたは維持するためにさらに他の医薬上許容される賦形剤を含有することができる。そのような賦形剤は、単位投与または多用量形態いずれかでの非経口投与のための、または連続的または中期的注入による脳脊髄液への直接的注入のための投与を処方するのに通常および慣用的に使用される物質である。
【0057】
ADP−発現ベクターを含有するある種の手法は経口投与されると考えられる。そのような処方は、好ましくは、個体投与形態にて適当な担体でカプセル化し処方される。適当な担体、賦形剤および希釈剤のいくつかの例はラクトース、デキストロース、スクロース、ソルビトール、マンニトール、澱粉、ガムアカシア、リン酸カルシウム、アルギネート、ケイ酸カルシウム、マイクロクリスタリンセルロース、ポリビニルピロリドン、セルロース、ゼラチン、シロップ、メチルセルロース、メチル−およびプロピルヒドロキシベンゾエート、タルク、マグネシウム、ステアリン酸塩、水、鉱油等を含む。該処方は、加えて、滑沢剤、湿潤剤、乳化剤および懸濁化剤、防腐剤、甘味剤または香味剤を含む。組成物は、当該分野で用いた手法を用いることによって、患者への投与後に有効成分の迅速、保持または遅延放出を供するように処方することができる。また、処方は、蛋白質分解を減少させ、例えば、界面活性剤のごとき吸収を促進する物質を含有することもできる。
【0058】
特異的用量は、患者の近似的体重または体表面積または占めるべき身体スペースの容量に従って計算される。該用量は選択された特定の投与経路に応じても計算される。治療用の適当な投与量を決定するのに必要な計算のさらなる工夫は当業者がルーチン的になすものである。そのような計算は、当業者による過度な実験なくして行うことができる。正確な投与量は標準的な用量−応答実験と組み合わせて決定される。現実に投与される組成物の量は、治療すべき疾患または疾患類、投与すべき組成物の選択、個々の患者の年齢、体重および応答、患者の兆候のひどさ、および選択された投与の経路を含めた関連状況に徴して、実行者によって決定されるであろう。用量の投与が、投与処方の薬物動態学パラメーターおよび用いる投与経路に応じて反復することができる。
【0059】
また、本発明では、ADPを過剰発現するウイルスベクターで治療された患者を受動的に免疫化することも考えられる。受動的免疫化は、ウイルスベクター、または抗血清から単離されたガンマ−グロブリンまたはベクター−特異的精製ポリクローナルもしくはモノクローナル抗体に対して生起した抗血清を患者に投与することを含むことができる。好ましくは、ウイルスベクターが、腫瘍中で複製し、それを通って広がるのに十分な時間の後に患者を受動的に免疫化する。
【0060】
本発明の好ましい具体例は、以下の実施例に記載される。特許請求の範囲内にある他の具体例は、本明細書中に開示した本発明の仕様または実施を考慮して当業者に明らかである。実施例と共に、明細書は例示的なものであると意図され、本発明の範囲および精神は実施例に続く請求の範囲によって示される。
【0061】
実施例1
本実施例はKD1およびKD3抗癌ベクターの構築および特徴付けを説明する。
【0062】
KD1を構築するため、本発明者らは、ユニークなプラスミドの全E3領域を欠失させ、後にクローニング用のユニークなPacI部位のみが残された。出発プラスミドはpCRIIであり、これは、全てのE3遺伝子の欠失を有するAd5 BamHIA断片を含有し、Invitrogenから購入し;E3欠失は、その配列が、各々、配列番号:1および配列番号:4に与えられるKD1およびGZ3についてのそれと同一である。Ad5からのADP遺伝子をPacI部位にクローンし、次いで、dl01/07と命名されたAd5 E1A突然変異体のゲノムのE3領域に組み立てた。これは、dl01/07から得られた重複するEcoRIA制限断片と共にADP遺伝子を含有する前記したBamHIA断片をヒト胚腎臓293細胞に共トランスフェクトすることによって成された。完全なウイルスゲノムが、プラスミド中のBamHIM断片でおよびEcoRIA断片中のAd配列間の重複組換えによって細胞内に形成される。12.5K蛋白質に対するE3遺伝子が出発プラスミドに保持された以外は、KD3は同様に構築された。かろうじてADPを過剰発現するKD2と命名されたベクターも調製した。各組換えAdのプラークを拾い、スクリーニングし、精製し、CsCl−バンデッドストックに増殖させ、配列決定し、力価測定し、特徴付けた。GZ1およびGZ3は、GZ1およびGZ3がAD5またはAd5突然変異体dl309に見出される野生型E1A配列を有する以外は、KD1およびKD3と同一であるAdベクターである。Ad5のEcoRIA断片をGZ1およびGZ3で用いた以外は、GZ1およびGZ3はKD1およびKD3で記載したごとく構築した。
【0063】
これらの組換えベクターの1つの高力価(1ml当たり1−8×1010プラーク形成単位[PFU])ウイルスストックで、または対照ウイルスdl01/07、dl309、dl327およびAd5(野生型)の1つでヒトA549肺癌腫細胞系を感染させることによって、KD1およびKD3を特徴付けた。細胞当たり50PFUを各ウイルスで用いた。これらのウイルスならびにこれらの実施例で用いたいくつかの他のウイルスの記載は表1に掲げる。
【0064】
【表1】
【0065】
ポリメラーゼ鎖反応(PCR)−ベースのプロトコルを用い、Ad5突然変異体dl309のE3領域中のE3−gp19K蛋白質に対する遺伝子にイン・フレーム停止コドンを導入した(Jones and Shenk,Cell 17:683−689,1979)。SunI−BstI 107I断片、Ad5ゲノム中のヌクレオチド28,390ないし29,012を用い、突然変異誘発を行い、次いで、これをdl309中の同等断片に代えて置き換えた。dl01/07はKD1おおびKD3に対して親である。今度は、dl309と命名されたAd5突然変異体はdl01/07の親であり、すなわち、dl309がE1A突然変異体を有しない以外はdl309はdl01/07と同一である。dl01/07およびdl309は共にE3 RIDα、RIDβおよび14.7K蛋白質に対する遺伝子の欠失を有するが、ADPに対する遺伝子を保有する。Ad5突然変異体dl327は野生型E1Aを有し、それはADPに対する遺伝子を欠き、それは12.5K蛋白質に対するものを除いて全ての他のE3遺伝子を欠く。
【0066】
感染後24および36時間において、蛋白質をA549細胞から抽出し、ADPに対するウサギ抗血清を用いる免疫ブロットにおいてADPにつき分析した(Tollefsonら,J.Virol.66:3633−3642,1992)。結果を図2に示す。より多くのADPが、dl01/07で感染した細胞におけるよりもKD1−およびKD3−感染細胞において感染後24時間および36時間に検出された。また、dl309または他のウイルスよりもGZ1およびGZ3によって、より多くのADPが合成された。最も重要には、KD1、KD3、GZ1およびGZ3は、dl01/07またはdl309よりも感染後24時間においてかなり多くのADPを発現した(図2)。この結果は、KD1、KD3、GZ1またはGZ3で感染した細胞がより速く溶解し、これらのウイルスがdl01/07またはdl309よりも速く細胞間に広がるという後に議論する観察と合致する。KD1、KD3、GZ1およびGZ3がAd5突然変異体dl1520よりも感染後24および36時間においてかなり多くのADPを発現するのは注目に値する(図2);dl1520はONYX−015に与えられた元来の名称である(Heiseら,Nature Medicine 3:639−645,1997)。予測されるごとく、pm734.1で感染した細胞(図2)、ADPにおいてアミノ酸1ないし48を欠く突然変異体(Tollefsonら,J.Virol.70:2296−2306,1996)においてADPは検出されなかった。dl01/07、KD1、KD2およびKD3によるE1A蛋白質の発現はAd5、dl309またはdl327によるよりもわずかに低く、dl01/07欠失から予測されるごとく、蛋白質はより小さかった(図3A)。dl327はdl324と同質遺伝子であり(Thimmappayaら,1982 Cell 31:543−51,1983)、それはADPおよび12.5K蛋白質以外の全ての他のE3蛋白質に対する遺伝子を欠く。
【0067】
KD1およびKD3感染細胞で検出されたADPの量は、dl309感染細胞で検出された量よりも有意に高い(図2)。もしE1A突然変異を持つウイルスが、後期蛋白質の遅れた出現によって証明されるごとく幾分遅く複製するという事実を考慮するならば(図3B)、KD1およびKD3はdl309よりも細胞に存在するウイルスゲノム当たりかなり多くのADPを発現することは明瞭である。この知見は、A549細胞をE1A突然変異を含有するウイルス、およびADPを欠くが野生型E1Aを有するdl327で共感染させた場合、後期蛋白質のより早い出現によって示されるごとく、E1A突然変異体ウイルスの複製速度はスピードアップされるという事実によって支持される(図3Bおよび3Dを比較されたし)。かくして、dl327はE1A突然変異を補充する。結論として、これらの実験は、ADPがKD1、KD3、GZ1およびGZ3によって劇的に過剰発現されることを示す。ADPはかろうじてKD2によって過剰発現される(示さず)。
【0068】
実施例2
本実施例は、KD1およびKD3が他のアデノウイルスよりも迅速に細胞を溶解させ、より速く細胞間に広がることを示す。
【0069】
細胞を溶解させるKD1およびKD3の能力は、Tollefsonら(J.Virol.70:2296−2306,1996)によって実質的に記載されているごとく行ったトリパンブルー排除細胞生存率アッセイによって調べた。簡単に述べれば、A549細胞を20PFU/細胞のKD1、KD3、dl01/07、dl327またはdl309でモック感染させるか、または感染させた。種々の感染後日数において、生きた細胞の数をヘモサイトメーターを用いて測定し(600ないし1000の細胞を時点当たりカウントした)、結果を図4に示す。
【0070】
KD1およびKD3と同一のE1A突然変異を有する、dl01/07で感染した細胞の44%と比較して、KD1−感染細胞の25%およびKD3−感染細胞の9%のみが感染後5日において生存した。また、KD1およびKD3ベクターは、野生型E1A領域を有するdl309よりも速く細胞を溶解させた。dl327(ADP−、EIA+)で感染させると、細胞の94%が5日後に生存した。細胞溶解を乳酸デヒドロゲナーゼの放出によって見積もると、KD1およびKD3はdl01/07およびdl309よりも速く細胞をもう一度溶解させ、dl327はほとんど細胞溶解を引き起こさなかった(データは示さず)。かくして、ADPは効果的な細胞溶解に必要であり、ADPの過剰発現は細胞溶解の速度を増加させる。
【0071】
細胞溶解を測定し、癌細胞におけるウイルス複製を調べるためのもう1つの手段として、A549細胞の別々の群を20PFU/細胞のKD1、KD3、dl01/07またはdl309で感染させ、A549細胞でのプラークアッセイによって、細胞内および細胞外ウイルスの量を測定した。感染後2日において、各群で形成されたウイルスの全量は同様であり(2−4×108PFU/ml)、これは、全てのウイルスの複製が同様であることを示す。しかしながら、細胞内ウイルスに対する細胞外ウイルスの比率を計算すると、KD1およびKD3に対する値はAd5、dl309またはdl01/07に対するよりも2−3log高かった(データは示さず)。かくして、野生型量のADPを発現するウイルスよりも、ADPを過剰発現する、KD1およびKD3で感染させた細胞からウイルスがかなり速く放出される。
【0072】
細胞間に広がるKD1およびKD3の能力は「細胞広がり」アッセイで測定した。このアッセイにおいて、48ウェル培養皿中のA549細胞の単層を10−3、10−2、10−1、100または10PFU/細胞のdl327、dl309、Ad5、dl01/07、KD1またはKD3でモック感染または感染させた。低いPFU/細胞において、ウイルスは2または3ラウンドの複製を通過して、単層の各細胞を感染しなければならない。1.0および10PFU/細胞において、単層は、最初に細胞を感染したウイルスによって破壊されるべきである。感染後7日までに単層での広がりの量を評価するために、生きた細胞を染めるが死んだ細胞を染めないクリスタルバイオレットを単層に添加した。結果を図5に示す。
【0073】
顕著には、感染後7日において、単層は10−3PFU/細胞においてKD1およびKD3によって実質的に排除され、他方、1.0PFU/細胞がdl01/07、dl309およびAd5で必要であった。この結果は、細胞溶解およびA549細胞におけるウイルス拡大を媒介するにおけるADPの能力を阻止する。また、この細胞広がりアッセイで測定して、KD1およびKD3は、他のタイプのヒト癌細胞系(ほとんどは、American Type Culture Collection[ATCC]から購入した)を殺すにおいてdl01/07よりも効果的である。10−2PFU/細胞におけるKD1および/またはKD3で殺傷したHeLa(頸癌)、DU145(前立腺)、およびpC3(前立腺)細胞、10−1PFU/細胞におけるME−180(頸部)およびHep3B(肝臓)、および10PFU/細胞におけるU118(神経膠芽細胞腫)およびU373(神経膠芽細胞腫)。これらの細胞を殺すのに10ないし100倍多くのdl01/07が必要であった(データは示さず)。これらの結果は、KD1およびKD3が多くのタイプの癌に対して効果的であり得ることを示す。
【0074】
ADP過剰発現ベクターが非常に低い多重度の感染において細胞を溶解するという知見の重要な態様は、ヒト腫瘍における感染の多重度が、ベクター注入の見地に対して末端側、または腫瘍へベクターを運ぶ血管に対して末端側にある部位において低いようであるということである。かくして、ADP過剰発現ベクターは、ADPをより少量またはADPを全く発現しないベクターよりも優れた利点を有する。
【0075】
実施例3
本実施例は、KD1およびKD3が増殖しない非癌性細胞で貧弱にしか複製しないことを示す。KD1およびKD3の複製表現型は、「正常」HEL−299ヒト繊維芽細胞(10%血清中で増殖するものまたは0.1%血清を用いて休止としたもの)を用いて評価した。全てのAdは増殖する細胞中でよく複製するはずであるが、dl01/07 E1A突然変異を持つウイルスは休止細胞において貧弱にしか複製しない。何故ならば、G0からそれを出すのにE1Aが必要だからである。野生型E1Aを有するdl309は、増殖するおよび増殖阻止細胞双方においてよく複製するはずである。
【0076】
細胞は100PFU/細胞のKD1、KD3、dl01/07またはdl309で感染させた。異なる感染後日数において、ウイルスを抽出し、力価測定した。10%血清において、KD1、KD3およびdl01/07はよく複製し、106−107PFU/mlの力価に到達し、これはdl309よりもわずかに低いだけであった(図6)。しかしながら、休止細胞において、KD1、KD3およびdl01/07の複製は増殖細胞におけるよりも1.5〜2log低く、104ないし2×105PFU/mlの範囲であった。dl309の力価は増殖する細胞で達成されたレベル近くの107PFU/mlに到達した。感染後10日において、100PFU/細胞のKD1、KD3またはdl01/07で感染させた休止HEL−299細胞単層は無傷であり、他方、野生型E1Aを有するdl309またはdl327で感染させたものは、細胞死滅を示す強力な典型的Ad細胞障害効果を示した(データは示さず)。かくして、KD1およびKD3の複製は増殖する細胞系に厳格に制限される。
【0077】
dl01/07 E1A突然変異に関連した制限は、単層として増殖する初代ヒト細胞(Cloneticsから購入した)でテストした。気管支上皮細胞(図7)および小さな気道上皮細胞は感染後5日において10PFU/細胞のKD1、KD3またはdl01/07によって殺されず、他方、それらは10PFU/細胞のdl309またはdl327によって殺された(データは示さず)。肺内皮細胞は10日後に10PFU/細胞のKD1、KD3またはdl01/07によって殺されなかったが、それらは1PFU/細胞のdl309によって殺された。最初に感染させると、これらの単層は密集下であり、次いで、密集するまで増殖した。ここでの刺激の結果は、これらの初代細胞は増殖しつつあったが、それらはこの時点のフレームにおいて複製を支持せず、KD1またはKD3によって殺されなかったことである。かくして、これらのベクターは癌性細胞に制限され、身体中で正常に分裂する基底細胞のごとき細胞に対してほとんどまたは全く効果を有しないと考えられる。加えて、KD1およびKD3は、そのような細胞はAdによって貧弱にしか感染されないので分裂する白血球に影響するようではない。
【0078】
まとめると、前記実験は、KD1およびKD3は癌細胞を溶解させ、細胞間に迅速に拡大し、休止および非癌性細胞において貧弱にしか複製しないことを示す。これらの特性はそれらを抗癌療法において有用なものとするはずである。
【0079】
実施例4
本実施例は、KD1およびKD3が動物モデルにおいてヒト腫瘍の増殖を阻害することを示す。
【0080】
本発明者らは、正常なマウスまたはラットにおいてマウスまたはラットの腫瘍を評価することができなかった。何故ならば、それらは全体的に非許容性であるからである。ヌードマウスにおいて増殖しつつあるヒト癌細胞系は、Onyx Pharmaceuticals (Richmond,CA)によって用いられて、ONYX−015、E1B 55kDa蛋白質の発現を欠くAdベクターの有効性を評価した(Heiseら,Nature Mde.3:639−645,1997)。本発明者らは、我々の細胞培養実験の多くで用いたA549細胞が、ヌードマウスに皮下注射した場合に、優れた、迅速に増殖する固体腫瘍を形成することを見い出した。平均腫瘍は4週間のうちに約500μlに到達し、カプセル化され、血管形成され、マウスの皮膚(通常)または筋肉に付着した。
【0081】
ヌードマウスを2×107A549細胞で各後側腹部に接種した。1週間後、腫瘍が形成され、約20μlないし50μlのサイズ範囲であった。個々の腫瘍を、3×108PFUの腫瘍当たりの合計ウイルス用量にて、50μlの緩衝液または5×107PFUのdl309、dl01/07、KD1、KD3またはpm734.1を含有する50μlの緩衝液を、3日後に、および4週間引き続いての週に注入した(合計5つの注入)。突然変異体pm734.1はADPに対する遺伝子において2つのナンセンス突然変異のためADP活性を欠くが、全ての他のAd蛋白質は野生型レベルで合成されると予測される(Tollefsonら,J.Virol.70:2296−2306,1996)。各ウイルス(または緩衝液)の効果を6つの腫瘍についてテストした。週間隔にて、Mitutoyoデジタルカリパーを用い、腫瘍の長さ(L)および幅(W)を測定した。腫瘍の容量は、L×W×W/2を乗じることによって計算した。この値を初期ウイルス注入の時点における腫瘍容量で割り、腫瘍増殖の倍増加を計算し、6つの腫瘍についての平均をグラフ化した。
【0082】
図8Aに示すごとく、緩衝液を接種した腫瘍は増殖し続け、5週間までに約14倍増加した。対照的に、正常な量のADPを発現し、E3 RIDおよび14.7Kおよび蛋白質を欠くdl309を注入した腫瘍は、5週間まで約2.5倍増殖したに過ぎなかった。ADPを欠くpm734.1では、腫瘍ならびに緩衝液を摂取したものは増殖した。かくして、dl309は腫瘍の増殖速度を顕著に減少させ、ADPはこの減少に必要である。dl01/07を接種した腫瘍は5週間にわたって約8倍増殖した。dl01/07はE1A突然変異を除いてdl309と同一であるので、この結果は、E1A突然変異が、腫瘍の増殖を妨げるAdの能力を有意に低下させることを示す。この効果は、恐らくは、より低いADP発現をもたらす腫瘍におけるウイルス複製の低下によるものであるが、それは腫瘍細胞におけるE1Aの他の特性、例えば、突然変異体E1A蛋白質がアポトーシスを誘導できないことも反映できた。最も重要には、KD1またはKD3を接種した腫瘍は約2.5倍増殖したに過ぎなかった。かくして、KD1およびKD3によるADPの過剰発現は、KD1およびKD3がdl01/07(その親対照ウイルス)よりも顕著に遅い速度まで、およびdl309のそれと同様の速度までさえ腫瘍の増殖を低下させるようにする。
【0083】
KD1およびKD3は癌細胞に制限されるが、野生型Adはそのような制限を有しない故に、KD1およびKD3はA549腫瘍増殖の速度を低下させるにおいて野生型Ad(すなわち、dl309)と同程度効果的であるという知見は癌の治療の意味においてかなり有意義である。
【0084】
ベクターの5回の注入を摂取したが、ベクターの1用量(この場合、5×108の各KD3またはGZ3)を摂取したに過ぎない図8Aにおける腫瘍は、A549腫瘍増殖の速度を有意に低下させるのに十分である(図8B)。
【0085】
本発明者らは、KD1およびKD3がヒト肝臓癌細胞系、Hep3B細胞のヌードマウスにおける増殖速度を低下させることも見い出した。これらの細胞は、かなり血管形成される迅速に増殖する腫瘍を形成する。ヌードマウスに1×107のHep3B細胞を各後側腹部に接種した。腫瘍が約100μlに到達した後、それらを50μlの緩衝液または5×107PFUのKD1、KD3またはdl309を3週間の間1週間当たり2回注入した。典型的には、テストウイルス当たり8〜10の腫瘍があった。腫瘍のサイズを測定し、初期ウイルス注入後0ないし3.5におけるサイズの倍増加をA549腫瘍につき前記したごとくグラフ化した。緩衝液単独を摂取した腫瘍は3週間にわたって9倍増殖し、突出して3.5週間にわたって約12倍増殖した(3週間後、マウスは犠牲にしなければならなかった。何故ならば腫瘍が余りにも大きくなりつつあったからである)(図9)。KD1またはKD3を摂取した腫瘍は約4倍増殖し、KD1およびKD3がヌードマウスにおいてHep3B腫瘍の増殖を低下させることが確立された。dl309を注入した腫瘍は2倍増殖した(図9)。KD1およびKD3がdl309よりも幾分効果的でないという知見は、培養における細胞広がりアッセイにおいて示されるごとく(データは示さず)、恐らくは、それら、ならびにHep3B細胞においてdl309が増殖しないという事実による。いずれの場合においても、重要な点は、KD1およびKD2がHep3B腫瘍に対して効果的であり、それらがそれらの複製を癌細胞に制限するE1A突然変異を含有することである。
【0086】
これらの結果は、Adベクターにおいて発現される場合、抗腫瘍剤としてのADPの能力を示す。KD1およびKD3は、ヒトで増殖する腫瘍を感染させるのに用いた場合にかなりの臨床的利点を高い確率で提供するであろう。
【0087】
実施例5
本実施例は、KD1またはKD3と組み合わせた複製−血管Adベクターの使用を説明する。
【0088】
複製−コンピテント(RC)ウイルスが複製−血管(RD)突然変異体を補充することはよく確立されている。すなわち、同一細胞を感染させた場合、コンピテントウイルスは突然変異体ゲノムから作成することができない蛋白質を供給し、両者のウイルスは増殖するであろう。RDウイルスを補充するKD1およびKD3の能力をテストするために、β−ガラクトシダーゼを発現する2つのRDベクターを構築した。Ad−β−galと命名された最初のものは、欠失したE1領域に代えて置き換えられたラウス肉腫ウイルスプロモーターの制御下にあるβ−galをコードするcDNAを有する。Ad−β−galはADPに対する遺伝子を含めた、欠失されたE3領域を有する。Ad−β−gal/FasLと命名された第2のものは、それがヒト・サイトメガロウイルスプロモーター/エンハンサーからのネズミFasLを発現する以外はAd−β−galと同一である。これらのベクターは、Ad E1AおよびE1B遺伝子を構成的に発現し、E1−マイナスベクターの複製を補充するヒト293細胞における重複組換えによって構築した。
【0089】
これらのRDベクターはA549細胞においてβ−galを感染させ、それを発現するはずであるが、複製しないはずである。何故ならば、E1A蛋白質が欠けているからである。しかしながら、細胞をRC Adで共感染させた場合には該ベクターは複製するはずである。これを証明するために、A549細胞を、10PFU/細胞のAd−β−gal単独で、または10PFU/細胞のAd−β−gal+10PFU/細胞のKD1、KD3、dl01/07、dl309またはdl327で感染させた。感染後2日において、ウイルスを抽出し、A549細胞におけるβ−gal発現によってAd−β−gal力価を測定した。収率は以下の表2に示す。
【0090】
【表2】
【0091】
表2におけるベータは、補充ウイルスがAd−β−galの収率を103だけ増加させたことを示す。
【0092】
KD1およびKD3の鍵となる特徴は、それらが他のAdよりも速く細胞間に広がることである。従って、それらはAd−β−galの広がりを補充するはずである。これをテストするために、感染中心アッセイを行った。A549細胞をAd−β−gal+KD1、KD3またはdl01/07で感染させた。2時間後、細胞を収集し、希釈し、新鮮なA549細胞の単層に接種した。4日後、細胞をX−galで染色し、結果を図10に示す。
【0093】
Ad−β−gal単独では、元来感染された細胞(接種前)のみが染色されるはずであり、ベクターは接種した単層上の他の細胞まで広がるはずがない。これは事実当てはまった。A549を接種した単層において、Ad−β−gal単独で感染した細胞(図10Aの頂部左側に示す皿)は、多数の個々の青色細胞(印刷中に見えない)を含有した;その例を拡大した図10Bに示す。しかしながら、該単層にAd−β−galおよびKD1またはKD3を共感染したA549細胞を接種した場合、青色細胞の多数の「コメット」があった(図10A)。各コメットは、1つの最初に−感染された細胞から広がったAd−β−galを表す。コメット内の細胞のほとんどはX−galで染色された(図10C)。また、dl01/07でコメットが観察されたが、KD1およびKD3の程度までではなかった(図10A)。dl327(ADP−)では、元来感染した細胞からの広がりはほとんどなかった(データは示さず)。要約すると、KD1およびKD3はAd−β−galの複製を補充するのみならず、それらはその迅速な広がりを増強する。
【0094】
KD1およびKD3は抗癌治療遺伝子産物を発現するRDベクターの広がりを補充し、それを増強すると予測され、この予測は、複製および前記した感染中心アッセイでAd−β−gal/FasLを用いて容易に証明することができる。
【0095】
KD1およびKD3は細胞培養においてRDベクターの複製を補充するのみならず、それらはヌードマウスの後側腹部で増殖するHep3B腫瘍においてもそうする。使用したRDベクターはAdLuc(E1およびE3領域を欠くAd)であり、ホタル・ルシフェラーゼ遺伝子がラウス肉腫ウイルスプロモーターから発現される発現カセットをE1領域に挿入する(Harrodら,Human Gene Therapy 9:1885−1898,1998)。Hep3B腫瘍に1×107PFUのAdLuc+緩衝液、または1×107PFUのAdLuc+5×107PFUのKD1、KD3、dl01/07またはdl309を注射した。2週間後、マウスを犠牲にし、腫瘍を切り出した。蛋白質を腫瘍から抽出し、ルミノメーターを用いてルシフェラーゼ活性を測定した。腫瘍当たりのルシフェラーゼカウントはAdLuc+緩衝液では6,800であり、KD1では113,500であり、KD3では146,900であった(図11)。かくして、KD3およびKD1は、各々、ルシフェラーゼ活性の22倍および17倍増加を引き起こした。この増加は、最初に共感染されたAdLucおよびKD1またはKD3である細胞におけるルシフェラーゼの上昇した合成によるものであり、それはKD1またはKD3によって媒介される腫瘍における細胞間のAdLucの広がりのためであった。
【0096】
まとめると、抗癌遺伝子産物を発現するRDベクターと共に本発明による複製−コンピテントADP−過剰発現ベクターでの腫瘍の感染は、腫瘍で合成される抗癌蛋白質の量を大いに増加させるはずであり、それにより、腫瘍の破壊を促進する複製−血管ベクターの能力を増加させる。
【0097】
実施例6
本実施例は、癌性タイプII肺胞細胞に複製−制限された本発明による組換えAdベクターの構築および特徴付けを説明する。
【0098】
前記で示したごとく、KD1およびKD3におけるdl01/07突然変異がこれらのベクターの増殖を癌細胞に制限する。その複製表現型をさらに制限するために、各ウイルスにおけるE4プロモーターを欠失し、サーファクタント蛋白質B(SPB)プロモーターによって置き換えて、KD1−SPB(配列番号:14)、KD3−SPB(配列番号:15)およびdl01/07−SPB(配列番号:16)と命名されたベクターを得た。これらのSPBプロモーターは、かくしてヒト肺のII型肺胞細胞で主として見い出されているTTF1転写因子を含有する細胞でのみ活性である(Lazzaroら,Development 113:1093−1104,1991)。かくして、KD1−SPB、KD3−SPBおよびdl01/07−SPBは、ヒト肺の癌性II型肺胞細胞にひどく制限されるべきである。多くの肺癌はこのタイプのものである。
【0099】
KD1−SPBおよびKD3−SPBベクターは以下のごとく調製した。E4プロモーターはAdゲノムの右側端部に位置する(図1)。BamHI部位(59マップ単位)からゲノムの右側端部のAd5 DNA配列を含有するpCRII−ベースのプラスミド(Invitrogen)を用い、かつPCR−ベースのプロトコルを用い、ほとんど全ての転写因子結合部位をE4プロモーターAd5塩基対35,623ないし35,775から欠失し、SPBプロモーターを含有する500塩基対断片で置き換えた(Yanら,J.Biol.Chem.270:24852−24857,1995)。最終プラスミドは、ウイルスdl01/07−SPB、KD1−SPB、およびKD3−SPBにつき、E4領域およびE3領域のdl01/07、KD1またはKD3バージョンにE4−SPB置換を含む。これらのプラスミドを、dl01/07のゲノムの左側部分を含有する断片で293細胞に共トランスフェクトし、プラークを生成させた。プラークを予測される特徴につきスクリーニングし、精製し、次いで、増殖させてストックした。
【0100】
A549−TTF1細胞系を発生させて、dl01/07−SPB、KD1−SPBおよびKD3−SPBの複製がTTF1転写因子を発現する癌性細胞に制限されるであろうという予測をテストした。これらの細胞を2つのプラスミドで共トランスフェクトした(1つは、TTF1がCMVプロモーターから発現されるものであり、ネオマイシン耐性クローンに対する抵抗性につきコードするもう1つは単離され、サーファクタント蛋白質Cプロモーターを要求するTTF1からのクロラムフェニコールアセチルトランスフェラーゼを発現するプラスミドでの一過性トランスフェクションによって判断してTTF1活性を発現することが示されている)。
【0101】
KD1−SPBおよびKD1を、A549−TTF1細胞および親A549細胞についての標準的なプラーク発生アッセイに付した。結果を図12に示す。A549細胞上のKD1−SPBでは、プラークは8日後には目に見えず、10日後にはプラークの最終数の約4%のみが観察され、12日後には最終プラークの約50%が観察された。A549−TTF1細胞上のKD1−SPBでは、プラークは6日後に目に見え、10日後にはプラークの約60%が観察された。かくして、予測されるごとく、KD1−SPBは、TTF1を含有する細胞でかなり速く増殖した。KD1はA549およびA549−TTF1細胞双方でKD1−SPBよりも迅速にプラークを形成し、これは、E4プロモーター−SPB置換がAd複製を誘導するにおいて野生型E4プロモーターと同程度には効果的でないことを示す。しかしながら、A549−TTF1細胞上のKD1−SPBおよびKD1の間のこの差異は許容され、KD1−SPBは約1日だけ遅延する。奇妙なことには、16日までに全てのウイルスストックにつき得られた最終力価は同様であり、A549細胞は非常に少量の内因性TTF1活性を含有できることを示す。KD3−SPBおよびdl01/07−SPBは、A549−TTF1細胞およびA549細胞で増殖させるとKD1−SPBと同様に挙動するであろうと予測される。
【0102】
KD1−SPBのTTF1を含有する細胞への制限を、さらに、H441細胞、TTF1−発現ヒト肺腺癌細胞系(Yanら,前掲)、およびHep3B細胞、TTF1を発現すると予測されない肺癌細胞系を用いて細胞拡大アッセイで調べた。H441またはHep3B細胞を含有する培養皿ウェルを、10ないし10−4PFU/細胞の範囲の多重度にてKD1−SPBまたはKD1で感染させた。H441およびHep3B細胞を、各々、感染後5日および8日においてクリスタルバイオレットで染色した。KD1−SPBおよびKD1はH441細胞上で等しくよく増殖し、広がり、細胞当たり10−1PFUにおいて単層の破壊を引き起こした(図13)。(H441単層のいくらかは、細胞当たり10−2PFUにおいてKD1−SPBを含むウェルにおいて、および細胞当たり10−4PFUのKD1およびKD1−SPBを含むウェルにおいてでよくはがれた;これは、場合によって、細胞広がりアッセイで起こり、それはウイルス感染を反映しない)。Hep3B細胞では、KD1はKD1−SPBよりもかなり良好に増殖し、広がり、KD1の細胞当たり10−2PFUでは、KD1−SPBの細胞当たり1.0PFUとして単層のより多い破壊を引き起こす(図13)。
【0103】
要約すると、本実施例は、適当な転写因子を発現する細胞上でよく複製する複製−コンピテントAdが、E4プロモーターの代わりに置き換えられた組織−特異的プロモーターで構築することができるのを示す。この方法は多くの他の組織特異的および細胞型特異的プロモーターに適用できるはずである。1つの可能性は肝臓−特異的プロモーターであろう。プロモーターは遊離E2Fを有する癌細胞のごとき細胞でのみ活性である故に、もう1つの可能性はE2Fプロモーター、またはE2F部位を持つもう1つのプロモーターを使用することであろう。第3の可能性は調節可能なプロモーター、合成テトラサイクリン応答プロモーター(Massieら,J.Virol.72:2289−2296,1998)を用いることであり、ここに、プロモーターの活性は患者におけるテトラサイクリンまたはテトラサイクリンアナログのレベルによって制御される。
【0104】
実施例7
本実施例は、ADPを過剰発現し、複製制限されないベクターの構築および特徴づけを説明する。
【0105】
前記したごとく、KD1およびKD3におけるdl01/07 E1A突然変異は減衰し、非分裂および分裂初代ヒト上皮および内皮細胞において増殖を阻害する。この突然変異を持つAdは分裂癌細胞においてよく複製することができる。しかしながら、そのようなE1A突然変異体の複製は、例えば、野生型E1A遺伝子を有するdl309と同程度には効果的ではない。例えば、プラークが発生する速度によって測定して、dl01/07の複製の速度は、dl01/07プラークがdl309のものよりも1日遅く出現するように低下する(データは示さず)。この遅延は、部分的にはAd後期遺伝子の発現における遅延による(図13参照)。dl01/07突然変異がA549細胞において複製の速度を遅延させるという考えは、図8A中のデータによってさらに支持され、ここに、dl01/07は腫瘍増殖をほとんど阻害せず、同様にdl309もそうであった。dl01/07 E1A突然変異のこの負の効果にかかわらず、議論したごとく、KD1およびKD3ベクターにこの突然変異を有する理論的および実践的態様がある。それにもかかわらず、容易にシナリオ(例えば末期癌を持つ患者)を容易に描くことができ、ここに腫瘍を破壊するAdベクターの能力は、ベクターが腫瘍細胞に全く制限されるという要件に取って代わる。そのような場合、野生型E1A遺伝子を持つ以外はKD1およびKD3と同様のベクターを有するのが有利であろう。そのようなベクターがその遺伝子を発現し、細胞を溶解し、細胞間に広がる速度はKD1およびKD3のそれよりも高いはずである。そのようなベクターは非癌性細胞および組織に対するいくらかの損傷を引き起こすが、これは、外科手術、化学療法および放射線照射療法のごとき抗癌治療の他の様式でも当てはまる。
【0106】
これらの考慮に徴すると、野生型E1A領域を有する以外は、各々、KD1およびKD3と同一であるGZ1およびおよびGZ3と命名されたベクターが構築された。これらのベクターは、A549細胞において重複組換えによって構築された。左側の断片はAd5の野生型E1A領域を含有し、右側端部断片はKD1またはKD3のE3修飾を含有した。プラークを拾い、予測される遺伝子型について分析し、プラーク精製し、増殖させてCsCl−バンデットストックとした。A549細胞上のこれらのストックの力価はGZ1では2.9×1010PFU/mlであり、GZ3では1.6×1011PFU/mlであった。かくして、これらのベクターは、野生型Adに匹敵する高力価ストックに増殖させることができる。GZ1およびGZ3プラークはより大きく、dl309についてのプラークよりもかなり早く出現する。大きな迅速に出現するプラークは、細胞を溶解し、細胞間に広がるAdの能力を反映し(Tollefsonら,J.Virol.70:2296−2306,1996;Tollefsonら,Virology 220:152−162,1996)、議論したこの特性はADPの機能によるものである。
【0107】
プラーク出現の率はプラーク発生アッセイで定量することができる(Tollefsonら,前掲)。ここに、典型的なプラークアッセイを行い、アッセイの翌日に観察されたプラークを、プラークアッセイの最後に観察されたプラークの数のパーセンテージとして計算する。図14に示されるごとく、A549細胞でのプラークアッセイの4日後に、GZ1およびGZ3はプラークの最終数の、各々、48%および34%を有し、他方、dl309は1%を有したに過ぎなかった。ただ4日後に出現するのはプラークについてのA549細胞でのAdプラークアッセイでは非常に異常である。これらの大きなプラークはADPの過剰発現を反映する。これらのGZ1およびGZ3プラークはKD1およびKD3のものよりも早く出現する(データは示さず)。何故ならば、疑いなく、GZ1およびGZ3は野生型E1A領域を有するのでより速く複製するからである。
【0108】
GZ1およびGZ3は細胞を溶解させ、dl309よりもかなり効果的に細胞間に広がる。A549細胞の感染後6日において、細胞当たり10−1PFUにおいてdl309で観察されたのとほぼ同様に多くの単層破壊が細胞当たり10−3PFUにおいてGZ1およびGZ3で観察された(図15、頂部パネル)。この結果は、さらに、ADPの過剰発現が細胞溶解およびウイルス広がりを促進するという結論を過小評価する。
【0109】
理論的には、GZ1およびGZ3は腫瘍細胞のみならず正常細胞において複製することができるはずである。それらは正常細胞で複製できるが、GZ1およびGZ3は抗癌ベクターとして有用である可能性が高い。まず、GZ1およびGZ3は腫瘍に直接注入することができた。多くの腫瘍は血液供給を除いて自己含有性である(カプセル化されている)。腫瘍の物理的障害はウイルスの他の組織への蒔種を最小化できる。第2に、Adは一般にかなり良性である。Ad5のほとんどの感染は幼児におけるものであり、その結果、穏やかなまたは無兆候病気となり、強力な液性および細胞性免疫によってチェックされる。抗Ad免疫性は生涯続くようである。GZ1およびGZ3は無傷免疫系を有し、恐らくは予め存在する抗Ad免疫性をも持つ患者においてのみ用いることができる。さらに、ガンマ−グロブリンまたは特異的精製抗Ad中和抗体を用い、患者をAdに対して受動的に免疫化することができる。第3に、Ad5が、特異的Ad5受容体(CARと命名)ならびに特異的インテグリン(例えば、avb5)を呈する肺上皮細胞に最も効果的に感染する呼吸器系ウイルスであることを考慮し、Ad5に由来する複製−コンピテントベクターは身体の多くの非癌組織で効果的に広がることができない。加えて、腫瘍−特異的、組織−特異的、細胞−特異的、または合成プロモーターで置換されたE4プロモーターを有するGZ1およびGZ3のバージョンを構築することができると考えられる。そのようなベクターは野生型E1AおよびADPに関連する陽性特徴を有するが、腫瘍組織および/または特定の細胞型に複製が制限される。
【0110】
実施例8
本実施例は、KD1、KD3、GZ1またはGZ3と放射線照射との組合せが、ベクター単独または放射線照射単独よりも、培養で増殖する、またはヌードマウスにおいて腫瘍として増殖するA549細胞を破壊するにおいてより効果的であることを説明する。
【0111】
これは細胞広がりアッセイで示された。3つの48ウェル培養皿中で増殖するA549細胞を、図15に示されるごとく、細胞当たり10ないし10−4PFUの範囲の感染の多重度にて異なるウイルスでモック感染または感染させた。1つの皿は照射しなかった。第2の皿は感染後24時間において600セントリグレイ(cGy)を摂取し、第3の皿は同時に2000cGyの放射線照射を摂取した。全ての皿を感染後6日においてクリスタルバイオレットで染色した。照射されなかった細胞では(図15において頂部パネル)、KD1およびKD3はそれらの親対照dl01/07よりもより低い感染の多重度において単層破壊を引き起こした。これは、それらの親対照dl309と比較してGZ1およびGZ3についての当てはまる。(細胞当たり10−4PFUにおいてGZ1またはGZ3で感染させた細胞における細胞の不足は実験的な人工物であり、GZ1またはGZ3による感染によって引き起こされない)。これらのKD1、KD3、GZ1およびGZ3の結果は初期の結果と合致し、ADPの過剰発現は増大した細胞溶解およびウイルス広がりに至ることを示す。
【0112】
感染させ、次いで、600cGyで照射した皿では、非照射細胞と比較して顕著に増大した細胞殺傷およびウイルス拡大があった(図15の底部パネルを頂部パネルと比較されたし)。例えば、KD1、KD3、GZ1およびGZ3では、細胞当たり10−2PFUにおける非照射ウェル中におけるように、細胞当たり10−4PFUにおいて照射ウェルでほぼ同一量の細胞破壊があった。同様の結果が、2000cGyの放射線照射を受けた皿で観察され(データは示さず)、および感染に24時間先立って600または2000cGyの放射線照射を受けた皿でも観察された(データは示さず)。
【0113】
細胞破壊の量は、細胞からのクリスタルバイオレットを33%酢酸で抽出し、次いで、490nmにおける吸光度を測定することによって定量した(データは示さず)。非照射モック感染細胞での吸光度は100%細胞生存率に設定した。600cGyを受容したモック感染細胞では、生存率において15%喪失があった(すなわち、15%低いクリスタルバイオレットが抽出された)。細胞当たり10−3PFUにおけるKD1では、非照射細胞は80%生存であり、他方、600cGyの照射を受容した細胞は約30%生存に過ぎなかった。照射および非照射細胞の間の生存率の同様の差がKD3、GZ1およびGZ3で観察された。これらの結果は、放射線照射+ベクターの組合せが、相加的効果よりはむしろ、細胞溶解およびベクター広がりに対して相乗的な効果を有することを議論する。もし効果が相加的に過ぎなければ、細胞当たり10−3PFUにおけるKD1試料では、細胞生存率は65%であったはずである(照射単独により生存率の15%低下、KD1単独により20%低下)。事実、細胞生存率は65%よりはむしろ30%であった。
【0114】
前記したごとく、2000cGyとほぼ同程度に多量の細胞溶解およびウイルス広がりが600cGyで観察された。ベクターと相乗する照射の最適用量を決定するために、前記したのと同様の実験をモック−、dl01/07−、KD1−、KD3−、dl309、GZ1−、またはGZ3−感染A549細胞で行った。48ウェルプレートには、感染後24時間において0、150、300または600cGyの照射を受容させた。細胞をクリスタルバイオレットで染色した。0対600cGyの照射を受容した細胞での結果は図15におけるものと同様であった。クリスタルバイオレットは、相違ウイルスの細胞当たり10−3PFUで感染させた細胞から抽出した。クリスタルバイオレットの吸光度を測定し、100%細胞生存率として非照射モック感染細胞の吸光度を用いてパーセント細胞生存率をグラフ化した。図16に示すごとく、全てのウェルにおける細胞生存率のほぼ直線的減少が増大する照射用量で観察されたが、直線の傾きはモック、dl01/07、またはdl309におけるよりもKD1、KD3、GZ1またはGZ3でより負であった。KD1、KD3、GZ1およびGZ3では、それらの親対照ウイルスでかなり多い細胞溶解およびベクター広がりがあり、ベクターおよび照射の間に相乗性があった。例えば、モック感染細胞では、600cGyは約30%だけ細胞生存率を低下させた(細胞の70%が生存した)。照射なくしてもKD1は約23%だけ細胞生存率を低下させた。600cGy照射+KD1の組合せは細胞生存率を約85%まで低下させ、その53%を超えるものは、照射単独およびKD1単独の総和である。図15および16中のデータを一緒に考えると、約600cGyの用量が細胞培養実験のこのタイプで最適である。
【0115】
また、KD3またはGZ3と照射との組合せをA549腫瘍−ヌードマウスモデルで調べた(実施例4参照)。A549細胞をヌードマウスの後側腹部に注射し、腫瘍を形成させた。腫瘍がほぼ50μlに到達すれば、それらを緩衝液と共に、または5×108PFUのKD3またはGZ3と共に注射した。8ないし10の腫瘍をテスト条件当たり注射した。感染後1日において、マウスの半分に600cGyの全身照射を受容させた。腫瘍のサイズを経時的に測定し、(実施例4に記載されているごとく)腫瘍サイズ対感染後日数の倍増加としてプロットした。図17に示すごとく、非照射緩衝液注射腫瘍はKD3またはGZ3を注射したものよりも速く増殖した。KD3および照射の組合せを受容した腫瘍は増殖せず、GZ3および照射の組合せを受容したものは14日後にサイズが縮んだ。これらの結果は、KD3+照射またはGZ3+照射の組合せが、ヌードマウスにおいてA549腫瘍増殖の速度を低下させるにおいて、ベクター単独または照射単独いずれかよりも効果的であることを示す。照射は、KD1およびDZ1、または事実いずれかの他の複製−コンピテントまたは複製−欠陥Adベクターの腫瘍を治療するにおける効果を増加させるようである。
【0116】
照射がADP過剰発現ベクターが細胞を溶解させ、細胞間でより効果的に広がるようにするメカニズムは理解されていない。照射は細胞DNA修復メカニズムを誘導すると予測され、それはAd DNAのより効果的な合成を可能とし得る。照射はADPの機能を増強することができる。ADPは、1以上の細胞蛋白質と相互作用することによって恐らくは機能し、照射は、ADPがより効果的に機能するようにこの蛋白質(類)に影響し得る。
【0117】
KD1、KD3、GZ1またはGZ3あるいはいずらかの他の複製−コンピテントAdベクターは、照射と組み合わせて用いると、癌を持つ患者に臨床的利益を与えるにおいて、ベクター単独または照射単独よりも効果的であろうと考えられる。該ベクターは、与えられた量の照射でのより大きな腫瘍破壊を可能とするはずである。もう1つの方法を述べると、照射は与えられた量のベクターでのより大きな腫瘍破壊を引き起こすはずである。また、これらのベクターは、放射線照射腫瘍学者が、より少量の照射を用いて同一量の腫瘍破壊を達成するのを可能とする。より少量の照射は照射の副作用を低下させるであろう。
【0118】
また、照射と組み合わせて用いると、ベクターのカクテルはカクテル単独または照射単独よりも効果的であろう。該カクテルは、ADP生産ベクター+抗癌治療蛋白質を発現する1以上の複製欠陥ベクターよりなることができる(実施例5参照)。
【0119】
実施例9
本実施例はアデノウイルス死滅蛋白質の構造−機能分析を説明する。
【0120】
ADPは内部核膜(NM)に局所化される11.6kDaのN結合O結合一体化膜糖蛋白質である(Scariaら,Virology 191:743−753)。図18に示すごとく、Ad2−コードADP(配列番号:6)は101アミノ酸よりなり;aa1−40(配列番号:17)はルーメンであり、aa41−59(配列番号:18)は膜貫通シグナルアンカー(SA)ドメインを構成し、aa63−70(配列番号:19)は核質(NP)ドメイン内の塩基性プロリン(BP)ドメインを構成し、これはaa61−101(配列番号:20)を構成する。ADP中のいずれのドメインが細胞死滅を促進するのに必要かを決定するために、ADP遺伝子の種々の一部を欠く多数のrec700の欠失突然変異体を調製し、NMに局所化され、死滅を促進するADPの能力につき調べた。rec700ウイルスはAd5−Ad−Ad5組換え体であり、これは他の文献に記載されている(Woldら,Virology 148:168−180,1986)。
【0121】
rec700および各欠失突然変異体中のADPの構造は図18に模式的に示す。各欠失突然変異体におけるADP遺伝子が、PCR方法を用いて配列決定して、突然変異が正しいことを保証した。欠失突然変異体におけるADPの構造および活性は、A549細胞を感染させ、続いて、ADP突然変異体蛋白質の免疫ブロット分析によってテストし、ならびに細胞を溶解する能力をテストした。全ての欠失突然変異体はpm734.1を除いて安定なADP蛋白質を発現した(Δ1−48、すなわち、aa1−48は欠失されている)。Serに突然変異されたAsn14を有するpm734.7(N14)ADPはO−グリコシル化されているがN−グリコシル化されていない。何故ならば、Asn14は唯一のN−グリコシル化部位であるからである(データは示さず)。dl735(Δ4−11)ADPはN−グリコシル化されているがO−グリコシル化されていない。何故ならば、O−グリコシル化についての部位は欠失されているからである(データは示さず)。Serに突然変異されたSAドメイン中にMet56を有するpm734.4(M56)ADPは、専らN結合高マンノースオリゴ糖を含有する(データは示さず);Met56突然変異は小胞体(ER)からのADPの脱出を排除するのでこれが起こる。シグナルアンカードメインにおいてaa46−60を欠くdl738ADPは細胞質において不溶性凝集体を形成し;従って、aa41−59は、事実、シグナルアンカードメインを含む。SAドメインのN−末端にあるMet41で開始するpm734(Δ1−40)ADPは、蛋白質分解プロセッシングによって生じたより低い群のバンドと共に移動した(データは示さず)。これは、蛋白質分解部位がMet41近くで起こることを示す。これに合致して、蛋白質分解生成物はdl737(Δ29−45)で観察されなかった(データは示さず)。また、生成物のサイズはaa41−101内に欠失を持つ全ての突然変異体(dl715.1、dl715、dl714、dl716)において減少した(データは示さず)。
【0122】
細胞死滅を促進するこれらの突然変異体の能力は、トリパンブルー排除、プラーク発生、および乳酸デヒドロゲナーゼ放出アッセイによってモニターした(Tollefsonら,J.Virol.70:2296−2306,1996)。図15Aにおけるトリパンブルーの結果は、ADPの死滅促進機能がaa1−40(pm734)、aa11−26(dl736.1)、aa18−22(dl735.1)、またはaa4−11(dl735)の欠失によってなくなることを示す。Asn14におけるN−グリコシル化部位の突然変異(pm734.7)は死滅促進活性をrec700(WT)の約50%まで低下させた。dl737(Δ29−45)は細胞死滅を促進するにおいてrec700として効果的であった;これは、蛋白質分解プロセッシング産物が細胞死滅を促進するのに必要でなくてもよいことを示す。何故ならば、それらはdl737で形成されないからである。dl738(Δ46−60)およびpm734.4(M56)は完全に欠失しているので、SAドメインは死滅に必須である(図19)。dl715.1はほとんど完全に欠陥であり、これはBPドメインが極端に重要であることを示す。驚くべきことに、aa71−94(dl714)、76−89(dl715)、および79−101(dl716)は、ADPの死滅促進活性に影響することなく欠失できた(図19)。他方、aa81−88の欠失(dl717)はADPの活性をほとんど完全に無くした(図19);これは、恐らくは、ADPの異常ソーティングの結果である(後記参照)。同様の結果が、細胞死滅を促進するこれらのADP突然変異体の能力を標準的なプラーク発生、LDH−放出およびMTTアッセイで調べた場合に得られた。
【0123】
ADPの細胞内局所化に対するこれらの突然変異の効果は極端に興味深い。感染後33時間において免疫蛍光(IF)によって調べると(データは示さず)、rec700(WT)からのADPはNPに明瞭に局所化された;また、ゴルジ体への局所化も明らかであった。dl714(Δ71−94)およびdl715(Δ76−89)では、ADPは全ての膜、すなわち、ER、ゴルジ体、原形質膜およびNMに局所化された。これは感染後45時間においてさえ、より明らかであった(データは示さず)。かくして、aa71−94は、ADPを特異的にNMに向けるシグナルを含むようである。ADPはトランス−ゴルジ体ネットワーク(TGN)からNMに集められるようであり、従って、ADPにおけるこの推定シグナルは、恐らくは、このソーティング経路で機能する。dl717(Δ81−88)からのADPは興味深い;それはNMおよびゴルジ体に局所化されるが、多くの細胞では、「ドット」および円状構造が観察された。再度、これらの構造が支配的な特徴である場合、これは感染後45時間においてより明らかであった。dl717−感染細胞は感染後45時間において死滅し始めず、従って、これらの構造は細胞の残物ではない。興味深い可能性は、これらの構造物は、TGNから出されたが、NMに標的化しおよび/またはそれと融合するのに欠陥がある膜小胞であるということである。
【0124】
dl738(SAドメインにおいてΔ46−60)では、ADPは細胞質に凝集した。これは、再度、aa46−60がSA配列を含むことを示す。pm734.4(M56)では、ADPは主としてNMに局所化した。前記したごとく、pm734.4ADPは専ら高マンノースN結合オリゴ糖を有し、これは、それが決してERを去らないことを示す。恐らく、pm734.4ADPのC−末端領域における推定NM−局所化シグナルが、(外側および内側NMと連続する)ERからの横方向拡散によってADPをNMに標的化する。
【0125】
dl737(Δ29−45)では、ADPはNMに局所化した。pm734(Δ1−40)、pm734.7(N14)(N結合グリコシル化は起こり得ない)、およびdl735(Δ4−11;O−グリコシル化部位は欠失されている)からのADPはNMよりもかなりより支配的にゴルジ体に局所化した。(dl735.1(Δ18−22)およびdl736.1(Δ11−26)からのADPもまた、NMよりもゴルジ体にかなり強力に局所化した。かくして、残基1−26および/またはグリコシル化は、ゴルジ体/TGNからNMへのADPの効果的な輸送に必要なようである。
【0126】
まとめると、aa41−59はSAドメインを含み、該SAドメイン中のMet56はERから出るのに必要であり、aa1−26はゴルジ体から効果的に出るのに必要であり、およびaa76−94はADPを特異的にNMに標的化するのに必要である。細胞死滅を促進するに関しては、必須の領域はaa1−26、SAドメイン(ADPは膜に侵入しない)、SAドメイン中のMet56、およびBPドメイン(aa63−70)である。pm734(Δ1−40),dl735(Δ4−11)、dl735.1(Δ18−22)、dl736.1(Δ11−26)およびpm734.7(N14)の欠陥死滅促進表現型が、死滅を促進する配列(またはオリゴ糖)の欠如のためであるか否か、あるいはADPがゴルジ体からNMへかなり遅く出ることによるか否かは明瞭でない。dl714(Δ71−94)およびdl715(Δ76−89)は、それらがNMへ特異的に局所化するにおいて欠陥があるにもかかわらず、死滅を促進するための野生型表現型を発現する;これは、恐らくは、十分なADPがNMに依然として侵入して死滅を促進するからである。dl717(Δ81−88)中の欠失はdl715(Δ76−89)およびdl714(Δ71−94)における欠失内にあるが、dl717ADPは、死滅を促進するにおいて、rec700(WT)、dl715およびdl714の約15%効果的であるに過ぎない。これは、dl717ADPがNMに対して局所化されるよりもむしろ小胞に止まる傾向があるからであろう。考え合わすと、これらのデータは、細胞死滅を促進するためにはADPはNMに局所化されなければならないことを示す。
【0127】
実施例10
本実施例は、実施例6に記載された組織特異的Adベクターをさらに特徴づける。そこで議論したごとく、Ad E4プロモーターは欠失され、これらのベクターにおいてサーファクタント蛋白質B(SPB)に代えて該プロモーターで置き換えられる(図24)。
【0128】
材料および方法
本実施例においては、やはり、実施例6に記載された細胞、ベクターおよび方法を用いた。実施例6で用いたヒト癌細胞系A549(ヒト肺癌腫)、Hep 3B(ヒト肝細胞癌腫)、およびH441(乳頭状肺腺癌)に加えて、(Microbix(Toronto,ON)から得られた)HEK293細胞およびVK10−9細胞を用いた。VK10−9細胞は、E1に加えて、E4およびpIXを含有しそれを発現する293細胞である。これらの細胞を293−E4細胞と言う。
【0129】
Hep3BおよびH441細胞の位相差顕微鏡を使用する実験は以下のごとく行った。Hep3BまたはH441細胞の単層を、5mlのDMEM(10%FBS)を含む60mm皿中で増殖させ、細胞当たり10プラーク形成単位(PFU)の感染多重度にてKD1またはKD1−SPBでモック感染または感染させた。単層の位相差写真は感染後4および7日において取った。
【0130】
H441またはHep3B細胞のウエスタンブロットを使用する実験は以下のごとく行った。(60mm皿中の)H441またはHep3B細胞を10PFU/細胞のKD1またはKD1−SPBで感染させた。感染後24時間において、細胞をPBSで3回洗浄し、掻き取ることによって収穫した。RIPA緩衝液によって細胞を溶解させた。BIO−RAD DC Protein Assay Kit(BIO−RAD Laboratories,Hercules,CA)によって蛋白質濃度を測定し、10μgの各試料を15%ドデシル硫酸ナトリウムポリアクリルアミドゲル(SDS−PAGE)上で電気泳動に付した。ゲルをPVDF膜(Immobilon,Millipore,Bedford,MA)上で電気ブロットした。10%乾燥乳(Carnation)を含有するTBST(50mMトリス−Cl、pH7.6、150mM NaCl、0.2%Tween20)中で膜を4℃にて一晩ブロックした。ブロッキングの後、膜を、E4ORF3(Gary Ketnerの贈物)またはADP(Tollefsonら,J.Virol.66:3633−3642,1992)に対するウサギ・ポリクローナル抗血清と共に、またはM73、E1Aに対するモノクローナル抗体(Harlowら,J.Virol.55:533−546,1985)と共にインキュベートした。二次抗体はヤギ抗ウサギIgG−HRPまたはヤギ抗マウスIgG−HRPであった。ELCプロトコル(Amersham Pharmacia,Arlington Heights,IL)を用いてブロットを発生させた。
【0131】
細胞溶解のために乳酸デヒドロゲナーゼ放出アッセイ(Tollefsonら,J.Virol.70:2296−2306)を使用する実験は以下のごとく行った。H441細胞(35mm皿当たり7.7×105細胞)およびHep 3B細胞(35mm皿当たり9.0×105細胞)を1mlの無血清DMEM中で20PFU/細胞にて感染させた。1時間の吸着時間の後、3mlのDMEM(10%FBS)を添加した(7.5%の最終FBS濃度)。細胞を37℃にて6%CO2でインキュベートした。日間隔で、上清を集め、ミクロ遠心に付して浮遊細胞を除去し、無細胞上清をアッセイするまで−70℃で凍結した。Cyto Tox96キット(Promega,Madison,WI)に含まれた10×溶解緩衝液の添加によって、全溶解試料を調製した。全ての試料を収集した後、LDHアッセイキットCyto Tox96を用いて20μlの試料を三連にてアッセイし、490nmにおいてEL360マイクロプレートリーダー(BioTecTM Instruments,Inc.)で読み取った。
【0132】
H441およびHep 3B細胞の免疫蛍光評価を使用する実験は以下のごとく行った。H441およびHep 3B細胞を35mm皿中のCorning#1カバーグラス上で平板培養した。H441(1.5×106細胞/mm皿)およびHep 3B(9.0×105細胞/mm皿)を、1mlの無血清DMEM中の20PFU/細胞の示されたウイルスで感染させた。1時間後、1mlのDMEM/20%FBSを添加した(10%FBSの最終濃度)。示された時間(感染後48時間または6日)において、細胞をPBS中の3.7%パラホルムアルデヒドで10分間固定し、次いで、メタノール(−20℃)中で6分間浸透させ、PBS中で再水和させた。カバーグラスを、Ad E2A−コーデッドDNA結合蛋白質(DBP)(1:400希釈;Maurice Greenの贈物)に対するウサギ抗ペプチド抗血清および繊維(1:400希釈;Jeff Englerの贈物)に対するマウスモノクローナル抗体で染色し、あるいはE4ORF3(1:250希釈;Gary Ketnerの贈物)に対するウサギ抗血清で染色した。二次抗体(Cappel/ICN)は1:50希釈で用いた。全ての抗体は、1%BSAおよび0.1%アジ化ナトリウムを含有するPBS中で希釈した。100×PlanapoレンズおよびTmax400フィルム(Kodak)を用いて、Nikonエピ蛍光顕微鏡で写真を取った。Diafine現像液でフィルムを現像した。
【0133】
サザーンハイブリダイゼーションによるウイルスDNA複製の分析は以下のごとく行った。10%FBSを補足したDMEMにて60mm皿中で、H441およびHep3B細胞を増殖させた。細胞を10PFU/細胞のKD1またはKD1−SPBで70%密集において感染させた。皿を37℃の湿潤化5%CO2雰囲気中でインキュベートした。全ゲノムDNAを感染後5、24、48、72および96時間に単離した。等量の全ゲノムDNAをHindIIIで消化し、膜への移動に先立って1%アガロースゲルで分解した。ランダムプライマー32P−標識pBHG10プラスミドプローブ(Bettら,Proc.Natl.Acad.Sci.USA 91:8802−8806,1994)をハイブリダイゼーションのために用い、ブロットをオートラジオグラフィーに付した。DNA断片をMolecular Dynamics PhosphorImagerで定量した。
【0134】
ウイルスの収率は以下のごとく測定した。35mm皿にて単層として増殖させたHep 3B細胞またはH441細胞を10PFU/細胞のKD1またはKD1−SPBで感染させた。感染後0ないし4日(H441につき)または0ないし9日(Hep 3Bにつき)において、細胞および培養培地を−70℃で凍結させた。試料を3回凍結させ解凍させて細胞からウイルスを放出させ、全ウイルス収率はA549単層でのプラークアッセイによって測定した。
【0135】
H441およびHep 3B腫瘍に対するKD1−SPBおよびKD1の効果は、ヌードマウスモデル(Doroninら,J.Virol.74:6147−6155,2000)で調べた。腫瘍細胞(H441細胞では200μlのBMEM、50%Matrigel[Becton Dickinson Labware,Bedford,MA]中の107細胞、またはHep 3B細胞では200μlのDMEM+10%Matrigel中の107細胞)を5〜6週齢無胸腺ヌードマウスの側腹部に注入し、約100μl(H441)または150μl(Hep 3B)容量まで3週間増殖させた。予め確立された腫瘍(n=10)に、50μlのDMEMまたはDMEM中の5×107PFUの示されたウイルスを注入した。ウイルスの注入は、腫瘍当たり3.0×108PFUの合計用量になるまで3週間の間毎週2回反復した。腫瘍のサイズの測定は、Sylvacデジタルカリパーを用い、H441細胞では一週間当たり2回、またはHep 3B細胞では毎週行った。腫瘍の用量は式:長さ×幅2/2に従って計算した。データは初期注入における腫瘍サイズに対する腫瘍サイズの増加の平均として表す。
【0136】
結果
種々の細胞型におけるKD1−SPBの特性をその「親」KD1のものと比較した。図25は、293−E4、293、およびA549細胞についてのこれらのベクターのプラーク発生特性を示す。データは、アッセイの最後(すなわち、新しいプラークが出現するのが止む時)に観察されたプラークの数のパーセンテージとして、プラークアッセイのいずれかの日に観察されたプラークの数としてプロットする(Tollefsonら、J.Virol.70:2296−2306,1966)。このアッセイはプラークのサイズのインジケーターである。KD1は293−E4および293細胞で等しくよくプラークを形成した(図25A)。KD1−SPBでは、プラークは、293細胞と比較して293−E4では約3ないし4日早く観察された(図2A)。A549細胞では、KD1は、KD1−SPBよりも4ないし6日早くプラークを形成した(図25B)。
【0137】
KD1−SPB対KD1の特性をH441細胞、TTF1転写因子を発現することが知られており、SPBプロモーターがその中で活性であるヒト乳頭状肺腺癌細胞系において詳細に特徴付けた(Yanら,J.Biol.Chem.270:24852−24857,1995)。その中でSPBプロモーターが活性ではないはずであるHep 3B細胞、ヒト肝細胞癌腫を陰性対照として用いた。H441およびHep 3B単層を10PFU/細胞のKD1またはKD1−SPBで感染させ、感染後4および7日において写真を取った。モック感染Hep 3B細胞は比較的均一な単層を形成したが、H441細胞はシンシチウムに似た構造を形成する傾向がある(図26A、B)。予測されるごとく、KD1は、感染後4および7日において双方の細胞系で細胞障害効果(CPE)を生じた(図26A、B)。また、予測されるごとく、KD1−SBPはH441細胞でCPEを引き起こしたが、Hep 3B細胞では引き起こさなかった。Ad−感染細胞におけるCPEは、通常、ウイルス増殖のインジケーターであるので、これらの結果は、KD1−SPBがH441で増殖するが、Hep3B細胞では増殖しないことを示唆する。
【0138】
ウイルスDNA複製を調べるために、H441およびHep 3B細胞を10PFU/細胞のKD1またはKD1−SPBで感染させ、次いで、DNAブロットによってウイルスDNAの蓄積を測定した。H441細胞では、KD1およびKD1−SPBのDNAは、感染後48−96時間において、同様レベルで容易に検出できた(図27A)。Hep 3B細胞では、KD1 DNAレベルはH441細胞におけるものと同様であるが、KD1−SPBのDNAはほとんど検出されなかった。これは、DNAバンドのPhosphorImager分析によって確認した(図27B)。
【0139】
H441およびHep 3B細胞におけるKD1−SPBおよびKD1の増殖は単一工程増殖アッセイによって測定した。細胞を10PFU/細胞のベクターで感染させ、次いで、全ベクター収率をプラークアッセイによって測定した。両方のベクターの全収率はH441細胞で同様であり、2日後にプラトーに到達した(図28A)。KD1収率は感染後2ないし4日後にHep 3B細胞でプラトーに達した(図28B)。しかしながら、KD1−SPBレベルは、2ないし4日後に、Hep 3B細胞において約5log低く、9日までさえ、それらはKD1のレベルを達成しなかった。本発明者らは、KD1−SPBは、H441対Hep 3B細胞に対する有意な特異性をもって増殖すると結論する。さらに、KD1−SPBはH441細胞でのKD1と同程度によく増殖し、これは、それ自体によるE4プロモーター欠失が有意にベクターを損なわず、E4プロモーターが複製−コンピテントベクターにおいて組織−特異的プロモーターによって置き換えることができるのを示す。
【0140】
H441およびHep 3B細胞におけるKD1−SPB対KD1の複製についてさらなる詳細を得るために、KD1−SPBおよびKD1による代表的なAd蛋白質の発現を調べた。H441またはHep 3B細胞を10PFU/mlのKD1またはKD1−SPBでモック感染または感染させ、次いで、感染後24時間において、蛋白質を抽出し、E1A、E4ORF3、およびADP蛋白質をイムノブロットによって調べた。E4ORF3はE4転写単位によってコードされた6つの蛋白質のうちの1つである(Leppard,J.Gen.Virol.78:2131−2138,1997)。予測されるごとく、KD1−SPBはH441細胞においてE4ORF3をよく発現したが、Hep 3B細胞においては痕跡レベルにおけるに過ぎなかった(図29)。KD1−SPBはHep 3B細胞においてE1A蛋白質を発現した。Hep 3B細胞におけるKD1−SPBによるE1A蛋白質の合成が予測される。何故ならば、E1A発現はE4蛋白質を必要としないからである;それは、また、KD1−SPBでの感染に対するブロックがE1Aの下流であることを示す。KD1は双方の細胞系においてE1Aを発現したが、その量はHep 3B細胞においてKD1−SPBで得られたものよりも低かった(図29)。KD1−SPBで観察された増大したE1Aレベルは、感染の後期相に入るその貧弱な能力を反映し得る(考察参照)。KD1−SPBはH441細胞におけるKD1と同程度によくADPを発現したが、それはHep 3B細胞において検出可能なADPを作成しなかった。ADPは主として後期蛋白質であり、従って、この結果は、Hep 3B細胞におけるE4蛋白質発現、DNA複製およびKD1−SPBの増殖の相対的欠如と一致する。
【0141】
個々の細胞で起こる複製事象に対する洞察を得るために、E4ORF3、E2A−DBPおよび繊維後期蛋白質の発現を免疫蛍光によって調べた。H441またはHep 3B細胞を20PFU/細胞で感染させた。感染後48時間または6日後に、細胞を固定し、免疫染色した。E4ORF3は、KD1、KD1−SPBまたはdl309では、感染後48時間においてH441細胞の核で検出された(図30A)。(dl309は野生型E1Aを有し、Ad5レベルのADPを発現し、かつE3−RIDおよびE3−14.7K遺伝子を欠くAd5突然変異体である)。E4ORF3は、感染後6日においてさえ、KD1−SPB(図30A)で感染させたHep 3B細胞のほとんど大部分で検出できなかった(図30B)。かくして、KD1−SPBはH441においてE4ORF3をよく発現するが、Hep 3B細胞においては発現しない。
【0142】
図31Aは、KD1またはKD1−SPBでは、感染後48時間において同一のHep 3B細胞でDBPおよび繊維の二重標識免疫蛍光を示す。KD1では、感染後48時間においてDBPに典型的な核における強力な斑点染色パターンがあった(図31A、頂部左側パネル)。これらの同一の細胞を通じて繊維の強力な染色があった(図31A、頂部右側パネル)。細胞質および核の染色が予測される。何故ならば、繊維は細胞質で合成され、次いで、ビリオンが組み立てられる核に移動するからである。感染後48時間におけるKD1−SPBでは、細胞の約25%がDBPについての斑点染色を示し、進行した斑点パターンを持つ1つの細胞(合計の7%)のみが繊維でも染色された(図31A、底部2つのパネル)。感染後6日においてさえ、細胞の約30%のみがDBPにつき染色を示し、約20%のみが繊維につき示した(図31B)。かくして、KD1−SPBで感染した顕著により少ないHep 3B細胞が、KD1と比較して、DBPおよび特に繊維を発現した。これらの結果は、KD1−SPBがH441細胞においてKD1と同程度よく複製することを示す。何故ならば、疑いなく、SPBプロモーターはH441細胞で活性だからである(Yanら,J.Biol.Chem.270:24852−24857,1995)。恐らくは、SPBプロモーターはこれらの細胞において最小に活性である故に、KD1−SPBはHep 3B細胞でほとんど複製しない。
【0143】
複製の最高点において、Ad−感染細胞が溶解され、ウイルスは他の細胞に広がる;このプロセスはADPによって大部分が媒介される(Tollefsonら,Virology 220:152−162,1996;Tollefsonら,J.Virol.70:2296−2306,1996)。ベクター誘導細胞溶解を調べるために、H441およびHep 3B細胞を20PFU/細胞のKD1、KD1−SPBまたはdl309でモック感染させるか、感染させ、乳酸デヒドロゲナーゼの放出によって細胞溶解を測定した(Tollefsonら,J.Virol.70:2296−2306,1996)。全てのベクターは、感染後2ないし3日においてはじまり、H441細胞を溶解させた(図32A)。KD1およびdl309もまた同一期間でHep 3B細胞を溶解させた;しかしながら、KD1−SPBは最小の細胞溶解を引き起こしたに過ぎなかった(図9B)。かくして、実施例6および図13における細胞広がりデータと共にこれらのデータは、KD1−SPBが、H441において細胞を溶解させ、細胞間に効果的に広がるが、Hep 3B細胞ではそうならないことを示す。
【0144】
ヌードマウスにおいてKD1−SPBまたはKD1がH441腫瘍を抑制するか否かを決定するために実験を行った。H441細胞を各後側腹部に注入した。腫瘍が約100μl(H441)または150μl(Hep 3B)まで増殖すれば、それらに、DMEM(モック)または50μlのDMEM中の5×107PFUのテストウイルス(3.0×108合計PFU)を3週間の間毎週2回注入した。10腫瘍(5匹)を各ウイルスで用いた。H441腫瘍の増殖はKD1−SPBおよびKD1によって同様に抑制された(図33A)。KD1はHep 3B腫瘍の増殖を抑制し、他方、KD1−SPBは最小抑制のみを引き起こした(図33B)。これらの結果は、SPBプロモーターが活性である場合、KD1−SPBが腫瘍を抑制するにおいてKD1と同程度効果的であることを示す。さらに、イン・ビトロにてKD1−SPBで観察された細胞型特異性はイン・ビボで維持される。
【0145】
考察
腫瘍の特異性は、癌遺伝子療法が直面する最大の攻撃の1つであり、すなわち、治療遺伝子を有することは癌細胞において特異的に発現される。特異性はRCウイルスで非常に重要である。理論的には、特異性:形質導入標的化および転写標的化を付与する2つの主な戦略が記載されている。標的細胞上の特異的細胞表面受容体にベクターの特異性を向けることが種々の方法を介して試みられてきた。このアプローチは理論的には魅力的ではあるが、それは、作成蛋白質のビリオンへの取り込みの欠如(Scariaら,Virology 191:743−753,1992)または標的化受容体を通じる感染性の欠如(Cossetら,J.Virol.69:6314−6322,1995)のごとき複数の障害に遭遇し得る。転写標的化は腫瘍および組織特異的プロモーターを利用する。複製−欠陥ベクターにおいて、これらの調節配列は細胞毒性遺伝子の発現を特異的組織に制限する。複製−コンピテントベクターにおいて、調節の付加された層として、ベクターの複製それ自体を腫瘍または組織特異的プロモーター/エンハンサー配列の制御下に置くことができる。複製−コンピテントAdにおいて、組織または腫瘍特異的プロモーター/エンハンサーのE1Aプロモーター/エンハンサー領域への挿入が専ら用いられてきた(Hallenbeckら,Hum.Gene Ther.10:1721−1733,1999;Rodriguezら,Cancer Res.57:2559−2463,1997;Yuら,Cancer Res.59,4200−4203,1999,Yuら,Cancer Res.59:1498−1504,1999)。これらのベクターの背後にある合理性はE1Aの発現、従って、全Ad転写プログラムがこれらの組織または腫瘍特異的プロモーターに依存するであろうことである。しかしながら、上位概念的アプローチとして、困難性があろう。E1Aエンハンサー/プロモーターは非常に複雑である。エンハンサーはE1AプロモーターのみならずE4プロモーターのごとき区別されるプロモーターも制御する(Shenk,T.pp.2111−2148 In B.N.Fields,D.M.Knipe,およびP.M.Howley(編),Fields Virology,Lippincott−Raven,Philadelphia,1996)。加えて、逆転末端反復領域におけるE1Aエンハンサーが細胞プロモーターの組織特異性を変化させることが示されている(Shiら,Hum.Gene Ther.8:403−410,1997)。また、E1Aエンハンサー/プロモーターは、Adゲノムをビリオンにパッケージするのに必要なシグナル内に部分的に埋もれており、ウイルス生産を損なうことなく全てのE1Aエンハンサーエレメントを除去するのは問題であろう。従って、本発明者らは、E4プロモーターを組織特異的プロモーターで置き換えることを選択した。E4遺伝子はAd複製に必須であり、従って、本発明者らは、組換えウイルスの複製が組織特異的調節エレメントに依存するであろうと予測した。
【0146】
KD1−SPBを構築するために、約300bpのE4プロモーターを欠失し、SPBプロモーターのB−500バージョン(約500bp)を挿入した(Yanら,前掲)(図24C、D)。本発明者らは、その厳格な組織特異性のためSPBプロモーターを選択した:それは肺のタイプII肺胞細胞および気管支上皮細胞で専ら活性である(Bohinskiら,1994,Mol.Cell.Biol.14:5671−5681,1994)。親ウイルスKD1は、ウイルス複製を腫瘍細胞に制限する2つのE1A突然変異を含有しそれを発現する(Doroninら,前掲)ので、本発明者らは、該ウイルスは肺腫瘍に由来する細胞において選択的に複製するであろうと予測した。かくして、H441細胞、乳頭状肺癌腫細胞系を用いて、KD1−SPBの複製、遺伝子発現、および機能プロフィールを特徴付けた。
【0147】
KD1−SPBは、293細胞上よりも、E4蛋白質を発現する293−E4細胞上で3ないし4日早くプラークを形成し、他方、KD1は双方の細胞系で同一のキメティックスにてプラークを形成した。これらのデータは、E4プロモーターが、293細胞で活性であり、SPBプロモーターが293細胞において非常に低い活性を呈することを示す。何故KD1−SPBが293細胞でプラークを形成するかは明らかでない;これらの細胞はヒト胚腎臓に由来し、SPBプロモーター(Bohinskiら,前掲)を調節する転写因子の少なくとも1つ、肝細胞核因子3が胚腎臓で発現される。また、TTF1、SPB発現のマスター調節因子は293細胞で最小に活性である可能性がある。
【0148】
KD1はH441およびHep 3B細胞において等しく高い力価まで増殖した(図28A、B)。対照的に、KD1−SPBは、その中でSPBプロモーターが活性である(Yanら,前掲)(図28A)H441細胞においてKD1と同程度に効果的に複製するが、Hep 3B細胞においては貧弱にしか複製しない。これは、SPBプロモーターが不活性であるからであろう(図28B)。この選択性は、2つの細胞系においてウイルスDNA生産を測定することによって確認されている。KD1−SPB DNA複製は、H441においてキネティックス的にかつ定量的にKD1 DNA複製に似ているが、しかしながら、Hep 3B細胞においては、KD1−SPB DNAはほとんど検出できなかった(図27A,B)。細胞障害効果、Ad複製の代理マーカーは同様の特異性を示した(図26)。
【0149】
観察された組織特異性の分子的基礎についての我々の予測をさらに確認するために、我々はウイルス蛋白質の発現をモニターした。細胞をKD1−SPBで感染させると、E1Aを除いて全てのウイルス蛋白質(初期または後期)は組織特異的に発現された(H441では高発現、Hep 3Bでは検出できない発現と低い)(図29−31)。我々はE4プロモーター活性(E4ORF3発現)およびE2A−DBP、ADP、および繊維蛋白質の発現のレベルの間に良好な相関を見い出した。かくして、SPBプロモーターはAdゲノムにおいてその組織特異性を保持し、それは、テストした細胞系におけるAd遺伝子発現の限定的因子であるらしい。予測されるごとく、E1Aの発現は組織特異的ではない。かくして、組織−特異的Ad DNA複製の調節工程はE1Aの下流にある。Hep 3B細胞において、KD1−SPBはKD1よりも高レベルでE1Aを発現し(図29)、これは、Hep3B細胞のほとんどにおけるKD1−SPB複製が初期段階に止まっていることを強く示唆する。
【0150】
KD1−SPBの細胞溶解効果は組織−特異的プロフィール(図32;実施例6の図13)、すなわち、Hep 3B細胞よりもH441細胞の優先的溶解、DNA複製のレベルで観察された特異性に類似のパターン(図27)およびウイルス蛋白質合成(図29−31)を示した。この細胞型特異性は、これらの細胞がヌードマウスにおいて腫瘍として増殖しつつある場合にも観察された。H441腫瘍の増殖は、同様の効率にて、KD1−SPBおよびKD1によって抑制された(図33A)。対照的に、KD1とは異なってKD1−SPBはHep 3B腫瘍の増殖に対して最小効果を有したに過ぎない(図33B)。
【0151】
まとめると、E4プロモーターの組織特異的プロモーターとの置き換えは、Adベクターの高度に組織特異的な複製を可能とし、標的組織においては、それは親ウイルスの複製と同程度に効果的である。KD1−SPBはADPを除いて全てのE3遺伝子を欠く。E3 gp19K、RIDおよび14.7Kは、細胞特性リンパ球ならびに腫瘍壊死因子およびFasリガンドのごときアポトーシス−誘導サイトカインによる攻撃からAd−感染細胞を保護することが示されている(Woldら,pp.200−232 In A.J.Cann(編)、DNA Virus Replication:Frontiers in Molecular Biology,Oxford University Press,Oxford,2000;Woldら,Curr.Opin.Immunol.11:380−386,1999)。
【0152】
KD1−SPBの治療指標(Hep 3B細胞と比較したH441細胞で生産されたウイルス)は最初の4ないし5日間は104〜105である(図28)。これらのデータを、それらの前立腺特異的ウイルスについてのCalydonによって報告されているデータ(104−105)(Rodriguezら,前掲、Yuら,Cancer Res.59,4200−4203,1999;Yuら,Cancer Res.59:1498−1504,1999)と比較する。我々は、KD1−SPBは、複製を癌細胞に制限するE1Aの突然変異体形態をコードする故に、他の研究所によって報告されたベクターよりもいくらか付加された利点を有するということを示唆する(Doroninら,前掲)。
【0153】
肺は合衆国において男性および女性双方につき第2に高い癌部位としてランク付けされているが(Reisら,Cancer Res.88:2398−2424,2000)、肺癌は癌ベクター遺伝子治療の主な標的ではなかった。というのは、ウイルスの腫瘍内注入は一般に肺では可能でないからである。しかしながら、複製−欠陥Adベクターの肺腫瘍への腫瘍内注入の最近の報告があり、そのようなアプローチはKD1−SPBで試みることができた。また、KD1−SPBを肺において全身投与することもできる。
【0154】
前記を考慮すれば、本発明のいくつかの利点が達成され、他の有利な結果が得られることが理解されよう。
【0155】
本発明の精神を逸脱することなく種々の変形を前記方法および組成物でなすことができ、前記記載に含まれ、添付の図面に示された全ての事項は例示的なものであって限定的な意味ではないと解釈されるべきである。
【0156】
特許および特許出願を含めた本明細書中で引用した全ての文献は、出典明示によって本明細書の一部と見なす。本明細書中における文献の考察は、単に、その著者によってなされた主張をまとめる意図であり、いずれの文献も先行技術を構成することを許容するものではない。出願人は、引用した文献の正確性および関連性を攻撃する権利を保有する。
【図面の簡単な説明】
【図1】 図1はAd5(図1A)および本発明の好ましい具体例(図1B)であるKD3における遺伝子発現の模式図であり、ここに、各ゲノムは斑点をつけた棒線によって表され、転写単位は棒線の上方および下方の矢印によって表され、E3蛋白質は、E3転写単位、および示された後期mRNAのL1ないしL5ファミリーについての矢印の上方にリストされる。
【図2】 図2は、KD1、KD3、GZ1およびGZ3によるADPの過剰発現を説明し、示されたウイルスで感染させ、抗ADP抗体でプローブされたヒトA549細胞から単離された蛋白質の免疫ブロットを示し、ADPは、異なってグリコシル化され、蛋白質分解的に処理されたADPの形態を示す。
【図3】 図3は、図面中および以後dl01/07というE1A dl1101/1107突然変異体が後期蛋白質の発現を遅らせることを説明し、野生型E1A領域を有し、および12.5K蛋白質をコードする遺伝子を除いて全てのE3遺伝子の欠失を有する、dl327の不存在下(図3Aおよび3B)または存在下(図3Cおよび3D)で示されたウイルスで感染させたA549細胞におけるE1A蛋白質および後期蛋白質の免疫ブロットを示す(図3Cおよび3D)。E1A蛋白質に特異的な抗血清を図3Aおよび3Cで用いた。Ad5ビリオンに対して生起した抗血清を図3Bおよび3Dで用いた。
【図4】 図4はADPを少量しかまたは全く発現しない対照ウイルスよりも効果的にKD1およびKD3が細胞を殺すことを説明し、トリパンブルー排除によって測定して、感染後示された日において生存した示されたウイルスで感染させたA549細胞のパーセントのグラフを示す。
【図5】 図5は、ADPの過剰発現がウイルスの細胞間広がりを増強することを説明する細胞広がりアッセイであり、生きた細胞を染色するが死滅した細胞を染色しないクリスタルバイオレットで感染後7日において処理した示されたPFU/細胞での示された細胞で感染させた単層を示す。
【図6】 図6は、増殖する細胞においてKD1およびKD3がよく複製するが、増殖阻止細胞においてはそうではないことを説明し、100PFU/mlの以下のウイルス:dl309(図6A)、dl01/07(図6B)、KD1(図6C)およびKD3(図6D)での感染に続いて種々の回数、増殖するまたは増殖阻止HEL−229細胞から抽出されたウイルス力価を示す。
【図7】 図7は初代ヒト気管支上皮細胞を殺すにおいてKD1およびKD3が効果的であることを説明し、10PFU/mlの示されたウイルスで30%密集において感染させ、ニュートラルレッドで感染後5日において染色したこれらの細胞単層を示す。
【図8】 図8は、KD1およびKD3がヌードマウスにおいて増殖するヒトA549細胞腫瘍の増殖速度を低下させることを説明し、図8Bにおいては、週間隔にて緩衝液または示されたウイルスの5×107PFUでの腫瘍の感染に続く週の数に対してプロットした腫瘍サイズの平均倍増加のグラフを示し、図8Bにおいては、5×108PFUのKD3またはGZ3で一回注射した腫瘍の同様のグラフを示す。
【図9】 図9は、KD1およびKD3がヌードマウスで増殖するヒトHep 3B細胞腫瘍の増殖速度を低下させることを説明し、毎週2回の間隔での緩衝液または示されたウイルス(dl309、KD1またはKD3)の5×107PFUでの腫瘍の注射に続く週の数に対してプロットした腫瘍サイズの平均倍増加のグラフを示す。
【図10】 図10は、感染性中心アッセイを用い、β−ガラクトシダーゼを発現するAd−β−gal、複製−欠陥ベクターの複製および広がりをKD1およびKD3が補充することを説明し、図10Aでは、Ad−β−gal単独または示されたウイルスで感染させたA549細胞を接種したA549細胞単層の図を示し、図10Bおよび10Cでは、図10Aの単層の2つのクローズアップ図を示す。
【図11】 図11は、腫瘍に示された組合せのウイルスが注入され、次いで、感染後2週間において抽出し、ルシフェラーゼ活性につきアッセイするアッセイを用い、ヌードマウスで増殖するヒトHep 3B細胞腫瘍においてKD1およびKD3がルシフェラーゼの発現を増加させることを示す棒グラフである。括弧に入れた数は、Adlucベクター+緩衝液のそれと比較したルシフェラーゼ活性の倍増加を示した。
【図12】 図12は、TTF1転写因子を発現するように作成されたA549細胞(A549/TTF1)および親549細胞に対するKD1およびKD1−SPBについての標準的プラーク発生アッセイの結果を示すグラフであり、ここに、データは、アッセイにおける特定の日に観察されたプラークの数をそのウイルスで観察されたプラークの最終数で割り、100を掛けたものとしてプロットする。
【図13】 図13はH441およびHep 3B細胞についてのKD1およびKD1−SPBについての細胞広がりアッセイであり、ここに、細胞はKD1またはKD1−SPBの示された量で感染させ、H441およびHep 3B細胞は、各々、感染後5日においておよび感染後8日においてクリスタルバイオレットで染色した。
【図14】 図14は、bl309および本発明の2つの好ましい実施例、GZ1およびGZ3についての標準的プラーク発生アッセイの結果を示すグラフであり、ここに、データは、アッセイにおける特定の日に観察されたプラークの数をそのウイルスで観察されたプラークの最終数で割り、100を掛けたものとしてプロットする。
【図15】 図15は、KD1、KD3、GZ1またはGZ3とX線照射の組合せが、ウイルスベクター単独または照射単独よりもA549細胞単層を破壊するにおいてより効果的であることを示す細胞広がりアッセイであり、ここに、細胞は示された量の示されたウイルスで感染させ、600センチグレイ(cGy)のx−照射で照射し(底部パネル)、またはモック照射し(頂部パネル)、次いで感染後6日においてクリスタルバイオレットで染色した。
【図16】 図16は、150、300または600センチグレイの照射と組み合わせて用いた10−3PFUのKD1、KD3、GZ1またはGZ3が、ウイルスベクター単独または照射単独よりもA549細胞単層を破壊するにおいてより効果的であることを説明する細胞広がりアッセイのグラフである。細胞生存率は、モック感染非照射ウェルを100%生存率として用い、培養ウェルから抽出したクリスタルバイオレットの量に基づく。
【図17】 図17は、KD3またはGZ3+x線照射の組み合わせが、KD3単独またはGZ3単独よりもヌードマウスで増殖するA549細胞腫瘍の増殖を低下させるにおいて効果的であることを説明する。
【図18】 図18はADPの構造−機能分析を説明し、図18Aにおいて、種々の推定ドメインおよび標識されたグリコシル化部位を持つ、Ad2によってコードされたアデノウイルス死滅蛋白質のアミノ酸配列を示し、図18Bにおいて、rec700および示された欠失突然変異体におけるADP遺伝子の模式図を示し、右欄は野生型表現型のパーセンテージとしての種々の突然変異体の死滅促進表現型をまとめる。
【図19】 図19Aおよび19Bは示されたADP突然変異体の細胞生存率アッセイを説明し、感染後の時間(図19A)または日数(図19B)に対してプロットしたトリパンブルー排除によって測定された生存率のグラフを示す。
【図20】 図20は、Ad1、Ad2、Ad5およびAd6(配列番号:5−8)のADP蛋白質についての、Ad2 ADP突然変異体dl716、dl715、dl714およびdl737(配列番号:9−12)についての、および推定ルーメンドメイン(配列番号:17)、膜貫通ドメイン(配列番号:18)、サイトゾル塩基性−プロリンドメイン(配列番号:19)、およびAd2のADP蛋白質のサイトゾルドメインの残り(配列番号:20)についての、単一文字暗号で示したアミノ酸配列を示す。
【図21】 図21はAd5のゲノムの完全なヌクレオチド配列を表す。
【図22】 図22はKD1のゲノムの完全なヌクレオチド配列(配列番号:1)を表す。
【図23】 図23はKD3のゲノムの完全なヌクレオチド配列(配列番号:2)を表す。
【図24】 図24は以下のベクターの模式図である:A.Ad5。斑点を入れた棒線は36kbpのDNAゲノムを示す。塗り潰ぶしていない矢印は即時型E1A転写ユニットを示し、黒色矢印は遅延した初期E1B、E2、E3およびE4転写ユニットである。ハッチングを施した矢印は主な後期mRNAの5つのファミリー、および主な後期転写ユニットの一部として合成されるADP mRNAを示す。各主要後期mRNAはその5’末端にスプライスされた三部リーダー(リーダー1、2および3)を有する。B.dl309。dl309はそれが欠失されたE3−RIDおよびE3−14.7K遺伝子を有する以外はAd5と同一である。dl309はAd5と同様なレベルでADPを発現する。C.KD1。KD1は、E1A蛋白質のpRBまたはp300/CBPへの結合をなくするE1A遺伝子中の2つの小さな欠失(「X」マークで示す)を有する。それはadp以外の全てのE3遺伝子を欠く。ADPは、Ad5またはdl309からのADPよりも感染において初期に、かつより豊富に発現される。Doroninら,J.virol.74:6147−6155。D.KD1−SPB。KD1−SPBは、それがサーファクタント蛋白質B(SPB−P)に代えてプロモーターによって置き換えられたE4プロモーターを有する以外はKD1と同一である。
【図25】 図25は、KD1−SPBがH441肺癌腫細胞においてKD1と同程度よく増殖するが、Hep 3B肝臓腫瘍細胞においてはKD1よりもかなり貧弱にしか増殖しないことを示すグラフを表す。KD1−SPBおよびKD1のCsCl−バンデッドストックは標準的な方法を用い(Tollefsonら,P.1−9 In W.S.M.Wold(編)、Adenovirus Methods およびProtocols.Human Press,Inc.,Totowa,NJ,1998)、293E4または293−細胞(A)につき、またはA549細胞(B)につき力価測定した。データは、アッセイの最終日に観察されたプラークの数のパーセンテージとしてのプラークアッセイのいずれかの日に観察されたプラークの数としてプロットする(Tollefsonら,Virology 220:152−162,1996)。
【図26】 図26は、KD1−SPBがH441細胞においてCPEを誘導するが、Hep 3B細胞では誘導しないことを示す顕微鏡写真を表す。H441およびHep 3B単層をモック感染させ、または10PFU/細胞のKD1またはKD1−SPBで感染させ、次いで、感染後4または7日において位相差下で写真を取った。
【図27】 図27は、KD1−SPB DNAがH441細胞では効果的に合成されるが、Hep 3B細胞ではそうではないことを説明するサザーンハイブリダイゼーションおよびグラフを示す。H441またはHep 3B細胞を10PFU/細胞のKD1またはKD1−SPBで感染させた。全ゲノムDNAを感染後0、5、24、48、72および96時間において単離し、HindIIIで消化し、アガロースゲル電気泳動によって分解し、ブロットし、32P−標識Ad DNAとハイブリダイズさせた。A.オートラジオグラム。B.パネルAにおけるDNAバンドのPhosphorImager定量。
【図28】 図28は単一工程増殖曲線を示すグラフを表し、KD1−SPBがH441でよく増殖するが、Hep 3B細胞では増殖しないことを示す。細胞は10PFU/細胞のKD1またはKD1−SPBで感染させた。ベクターは感染後示された日に抽出し、力価はプラークアッセイによって測定した。
【図29】 図29は、KD1−SPBがH441においてE4ORF3およびADPを発現するが、Hep 3B細胞では発現しないことを示す免疫ブロットを表す。細胞は10PFU/細胞のKD1またはKD1−SPBで感染させた。感染後24時間において、蛋白質抽出物を、特異的抗血清を用いてE1A、E4ORF3およびADPにつき分析した。E1A蛋白質は複数バンドとして出現する。ADPは2つのバンドとして出現する;上方バンドはグリコシル化されており、下方バンドは蛋白質分解により切断された種である(Scariaら,Virology 191:743−753,1992;Tollefsonら,J.Virol.66:3633−3642)。
【図30】 図30は、KD1−SPBがH441ではE4ORF3を発現するが、Hep 3B細胞では発現しないことを示す免疫蛍光顕微鏡写真を示す。カバーグラス上で増殖する細胞を20PFU/細胞のKD1、KD1−SPBまたはdl309(野生型)で感染させた。48時間(パネルA)または6日(パネルB)において、細胞を固定し、E4ORF3に対するウサギ・ポリクローナル抗ペプチド抗血清で染色した。写真は100×Planapoレンズを用いて取った。各パネルは約8つの核を示す。この図面は図31に示した同一実験の一部である。
【図31】 図31は、KD1−SPBがHep 3B細胞においてE2−DBPまたは繊維を効果的に発現しないことを示す免疫蛍光顕微鏡写真を表す。Hep 3B細胞は20PFU/細胞のKD1−SPBまたはKD1で感染させた。感染後48時間(A)または6日(B)において、細胞を固定し、DBPに対するウサギ・ポリクローナル抗血清および繊維に対するマウス・モノクローナル抗体を用いて二重染色した。同一視野をDBPおよび繊維につき示す。この図面は図30に示した同一実験の一部である。
【図32】 図32は、KD1−SPBがKD1と同程度に効果的にH441を溶解するが、Hep 3Bを溶解しないことを説明するグラフを表す。H441またはHep 3B細胞をモック感染し、あるいは20PFU/細胞のKD1またはKD1−SPBで感染させた。細胞溶解は、細胞から培地への乳酸デヒドロゲナーゼの放出によって測定した。
【図33】 図33はKD1−SPBがKD1と同程度よくヌードマウスにおいてH441腫瘍の増殖を抑制することを説明するグラフを表す。腫瘍細胞はヌードマウスの側腹部に注射し、約100μl(H441)または150μl(Hep 3B)容量まで増殖させた。腫瘍(n=10)はDMEM(モック)を、または5×107PFUのKD1またはKD1−SPBを注入した。ウイルスの注射は、腫瘍当たり3.0×108PFUの合計用量まで3週間の間毎週2回反復した。腫瘍を測定し、腫瘍サイズの平均倍増加を計算した。
【配列表】
Claims (3)
- アデノウィルス死滅蛋白質を過剰発現し、且つ新形成細胞において複製可能である組換えアデノウィルスであって、前記組換えアデノウィルスが、配列番号:1または配列番号:2から選択されることを特徴とする組換えアデノウィルス。
- 前記組換えアデノウィルスが配列番号:1である、請求項1に記載の組換えアデノウィルス。
- 前記組換えアデノウィルスが配列番号:2である、請求項1に記載の組換えアデノウィルス。
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