JP4361708B2 - 複製−コンピテント抗癌ベクター - Google Patents

Description

【０００１】
（政府助成金への参照）
本発明はＮａｔｉｏｎａｌ Ｉｎｓｕｔｉｔｕｔｅｓ ｏｆ Ｈｅａｌｔｈからの補助金（補助金番号ＲＯ１ ＣＡ７１７０４およびＣＡ８１８２９）下で政府の支援により成された。合衆国政府は本発明においてある種の権利を有する。
【０００２】
（発明の背景）
（１）発明の分野
本発明は一般に癌の治療、さらに詳しくは、新形成細胞において複製し、アデノウイルス死滅蛋白質（ＡＤＰ）を過剰発現するベクターおよびヒト癌を治療するにおけるこのベクターの使用に関する。
【０００３】
（２）関連技術の記載
癌は合衆国および他の国において死亡の主たる原因である。癌のタイプに応じて、それは典型的には外科手術、化学療法および／または放射線照射で治療される。これらの治療はしばしば失敗する。すなわち外科手術は全ての癌を除去することができないことがあるし、いくつかの癌は化学療法および放射線照射療法に対して抵抗性であるし、化学療法−抵抗性腫瘍が頻繁に発生する。新しい療法は単独で、または古典的な技術と組み合わせて使用される必要がある。
【０００４】
活発な研究中の１つの潜在的療法は、抗癌治療蛋白質を発現する組換えウイルスベクターで腫瘍を治療することである。アデノウイルス−ベースのベクターは、癌の治療における使用のために、ならびに遺伝的障害の療法のために、それらを概念的に訴えるものとするいくつかの特徴を含む。アデノウイルス（以後、「Ａｄｓ」と相互交換的に用いる）は、培養にて安定である高力価ストックまで容易に増殖させることができる。それらはほとんどのヒト癌細胞タイプで複製する広い宿主範囲を有する。それらのゲノムは部位特異的突然変異および外来性プロモーターから発現された外来性遺伝子の挿入によって操作することができる。
【０００５】
アデノウイルスは蛋白質キャプシド内のＤＮＡ−蛋白質コアよりなる（Ｓｔｗａｒｔら，「Ａｄｅｎｏｖｉｒｕｓ ｓｔｒｕｃｔｕｒｅ ｂｙ Ｘ−ｒａｙ ｃｒｙｓｔａｌｌｏｇｒａｐｈｙ ａｎｄ ｅｌｅｃｔｒｏｎ ｍｉｃｒｏｓｃｏｐｙ」 ｉｎ：Ｔｈｅ Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ Ｒｅｐｅｒｔｏｉｒｅ ｏｆ Ａｄｅｎｏｖｉｒｕｓｅｓ，Ｄｏｅｒｆｌｅｒ，Ｗ．ら（編） Ｓｐｒｉｎｇｅｒ−Ｖｅｒｌａｇ，Ｈｅｉｄｅｌｂｅｒｇ，Ｇｅｒｍａｎｙ，ｐ．２５−３８によってレビューされている）。ビリオンは特異的細胞受容体に結合し、エンドサイトーシスに付され、ゲノムはエンドソームから押し出され、核に輸送される。該ゲノムは約３６遺伝子をコードする、約３６ｋｄｐの線状デュプレックスＤＮＡである（図１Ａ）。核においては、「即時型」Ｅ１Ａ蛋白質が最初に発現され、これらの蛋白質はＥ１Ｂ、Ｅ２、Ｅ３およびＥ４転写ユニットによってコードされた「遅延初期」蛋白質の発現を誘導する（Ｓｈｅｎｋ，Ｔ．「Ａｄｅｎｏｖｉｒｉｄａｅ：ｔｈｅ ｖｉｒｕｓｅｓ ａｎｄ ｔｈｅｉｒ ｒｅｐｌｉｃａｔｉｏｎ」 ｉｎ：Ｆｉｅｌｄｓ Ｖｉｒｏｌｏｇｙ，Ｆｉｅｌｄ，Ｂ．Ｎ．ら，Ｌｉｐｐｅｎｃｏｔｔ−Ｒａｖｅｎ，Ｐｈｉｌａｄｅｌｐｈｉａ，ｐ．２１１１−２１４８によってレビューされている）。また、Ｅ１Ａ蛋白質は細胞遺伝子を誘導または抑制し、その結果、細胞周期が刺激される。約２３の初期蛋白質は細胞を侵奪するように機能し、ウイルスＤＮＡ複製を開始させる。ウイルスＤＮＡは感染後（ｐ．ｉ．）約７時間の時点において複製し、次いで、後期遺伝子が「主要後期」転写ユニットから発現される。主要後期ｍＲＮＡは、代替プレ−ｍＲＮＡプロセッシングによって、通常の「主要後期プロモーター」から合成される。各後期ｍＲＮＡはその５’−末端において通常の「３部リーダー」を含み（図１中エクソン１、２および３）、これはＡｄ後期ｍＲＮＡの効果的な翻訳を可能とする。細胞蛋白質合成は停止し、細胞はウイルス蛋白質を作成するための工場となる。ビリオンは感染後約１日の時点で核で組み立てられ、２ないし３日後には細胞は溶解し、子孫ウイルスを放出する。細胞溶解はＥ３ １１．６Ｋ蛋白質によって媒介され、これは「アデノウイルス死滅蛋白質」（ＡＤＰ）と再命名されている（Ｔｏｌｌｅｆｓｏｎら，Ｊ．Ｖｉｒｏｌ．７０：２２９６−２３０６，１９９６；Ｔｏｌｌｅｆｓｏｎら，Ｖｉｒｏｌ．２２０：１５２−１６２，１９９６）。本明細書中で上位概念的意味で用いられる用語ＡＤＰとは、集合的に、その全てが高度な配列同様性で持って相同ＡＤＰを発現する、例えば、Ａｄタイプ１（Ａｄ１）、Ａｄタイプ２（Ａｄ２）、Ａｄタイプ５（Ａｄ５）またはＡｄタイプ６（Ａｄ６）のごときアデノウイルスからのＡＤＰ群を言う。
【０００６】
ヒト・アデノウイルス５型（Ａｄ５）は癌遺伝子治療で特に有用である。それは、主として、年少の子供で無兆候または穏やかな気管感染、続いて長期の実質的免疫性を引き起こす。患者が免疫無防備状態である場合を除き、死を招く状態は極端に希である（Ｈｏｒｗｉｔｚ，Ｍ．Ｓ．，Ａｄｅｎｏｖｉｒｕｓｅｓ，ｐ．２１４９−２１７１ Ｉｎ Ｂ．Ｎ．Ｆｉｅｌｄｓ，Ｄ．Ｍ．Ｋｎｉｐｅ，ａｎｄ Ｐ．Ｍ．Ｈｏｗｌｅｙ（編），Ｆｉｅｌｄｓ Ｖｉｒｏｌｏｇｙ，Ｌｉｐｐｉｎｃｏｔｔ−Ｒａｖｅｎ Ｐｕｂｌｉｓｈｅｒｓ，Ｐｈｉｌａｄｅｌｐｈｉａ，ＰＡ，１９９６）。Ａｄ５は非常によく理解されており、培養において、安定である高力価ストックまで増殖させることができ、ほとんどのヒト癌細胞型で複製することができる（Ｓｈｅｎｋ，Ｔ．，Ａｄｅｎｏｖｉｒｉｄａｅ：ｔｈｅ ｖｉｒｕｓｅｓ ａｎｄ ｔｈｅｉｒ ｒｅｐｌｉｃａｔｉｏｎ，ｐ．２１１１−２１４８．Ｉｎ Ｂ．Ｎ．Ｆｉｅｌｄｓ，Ｄ．Ｍ．Ｋｎｉｐｅ，ａｎｄ Ｐ．Ｍ．Ｈｏｗｌｅｙ （編），Ｆｉｅｌｄｓ Ｖｉｒｏｌｏｇｙ，Ｌｉｐｐｉｎｃｏｔｔ−Ｒａｖｅｎ，Ｐｈｉｌａｄｅｌｐｈｉａ，１９９６）。そのゲノムは部位特異的突然変異誘発および外来性配列の挿入によって操作することができる。
【０００７】
抗癌および遺伝子治療での使用が調べられつつあるＡｄベクターは、複製−欠陥または複製−コンピテントいずれかである組換えＡｄに基づく。典型的な複製−欠陥ＡｄベクターはＥ１ＡおよびＥ１Ｂ遺伝子（集合的にＥ１として知られている）を欠き、外来性遺伝子の発現を駆動するプロモーターおよびプレ−ｍＲＮＡプロセッシングシグナルよりなる発現カセットを所定の箇所に含有する。Ｅ１Ａ蛋白質は他のＡｄ遺伝子の転写を誘導し、非形質転換細胞において、それは細胞周期を脱調節し、種々の細胞遺伝子を誘導または抑制し、細胞をＧ_０からＳ−相４８に入れる（Ｗｈｉｔｅ，Ｅ．，Ｓｅｍｉｎ．Ｖｉｒｏｌ．８：５０５−５１３，１９９８；Ｗｏｌｄら，ｐｐ．２００−２３２ Ｉｎ Ａ．Ｊ．Ｃａｎｎ（編），ＤＮＡ Ｖｉｒｕｓ Ｒｅｐｌｉｃａｔｉｏｎ：Ｆｒｏｎｔｉｅｒｓ ｉｎ Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ Ｂｉｏｌｏｇｙ，Ｏｘｆｏｒｄ Ｕｎｉｖｅｒｓｉｔｙ Ｐｒｅｓｓ，Ｏｘｆｏｒｄ）。 Ｅ１Ｂ蛋白質は細胞アポトーシスを阻害する（同上）。これらのベクターは、Ａｄ遺伝子発現およびＤＮＡ複製を誘導するのに必要なＥ１Ａ遺伝子を欠くので、複製することができない。加えて、Ｅ３遺伝子は培養中の細胞におけるウイルス複製で必須ではないので通常は欠失している。
【０００８】
多数の研究者が、抗癌治療蛋白質を発現する複製−欠陥Ａｄベクターを組み立てた。通常、これらのベクターはマウスモデルで増殖するヒト腫瘍の直接的注入によってテストされてきた。最も普通には、これらのベクターは単純疱疹ウイルスからのチミジンキナーゼ遺伝子を発現し、ベクターによって形質導入された細胞を殺すためにマウスがガンシクロビールで処理される（例えば、Ｆｅｌｚｍａｎｎら，Ｇｅｎｅ Ｔｈｅｒ．４：１３２２−１３２９，１９９７参照）。もう１つの自殺遺伝子治療アプローチは、シトシンデアミナーゼを発現する複製欠陥Ａｄベクターを腫瘍に注入し、続いて、５−フルオロシトシンを投与する（Ｔｏｐｆら，Ｇｅｎｅ Ｔｈｅｒ．５：５０７−５１３，１９９８）。研究者は、Ａｄ−発現サイトカインが腫瘍に対する細胞毒性Ｔ−リンパ球（ＣＴＬ）を含めた免疫応答を刺激するという予測のもとに、ＩＬ−２、ＩＬ−１２、ＩＬ−６、腫瘍壊死因子（ＴＮＦ）、Ｉ型インターフェロン、または共刺激分子Ｂ７−１のごときサイトカインを発現する複製−欠陥Ａｄベクターを調製し、テストしてきた（Ｆｅｌｚｍａｎｎら，ｓｕｐｒａ；Ｐｕｔｚｅｒら，Ｐｒｏｃ．Ｎａｔｌ．Ａｃａｄ．Ｓｃｉ．ＵＳＡ ９４：１０８８９−１０８９４，１９９７）。他のベクターは腫瘍抗原（例えば、メラノーマＭＡＲＴ１）、細胞周期を脱調節し、アポトーシスを誘導する蛋白質（ｐ５３、ｐＲＢ、ｐ２１^{Ｋｉｐ１／ＷＡＦ１}，ｐ１６^{ＣＤＫＮ２}、およびＡｄ Ｅ１Ａでさえ）、およびリボザイムを発現する。ＦａｓＬを発現するＡｄベクターはマウス腫瘍のアポトーシスおよび腫瘍退行を誘導する（Ａｒａｉら，Ｐｒｏｃ．Ｎａｔｌ．Ａｃａｄ．Ｓｃｉ．ＵＳＡ ９４：１３８６２−１３８６７，１９９７）。
【０００９】
これらの一般的に肯定的な報告とは無関係に、当該分野においては、複製−欠陥Ａｄベクターはそれを治療で用いるのに次善にするいくつかの特徴を有すると認められている。例えば、複製−欠陥ベクターの生産は、それが、Ｅ１Ａ蛋白質をトランスにて提供する補充細胞系で増殖することを必要とする。そのような細胞系は栄養条件が面倒であり、ウイルスストックの創製は時間を消費しかつ費用がかかる。加えて、多くの外来性蛋白質がそのようなベクターから発現されているが、発現のレベルはＡｄ後期蛋白質と比較して低い。
【００１０】
これらの問題と取り組むために、いくつかのグループは治療的使用のために複製−コンピテントＡｄベクターを用いることを提案している。複製−コンピテントベクターは複製に必須のＡｄ遺伝子を保有し、かくして、複製するのに補充細胞系を必要としない。複製−コンピテントＡｄベクターは、当該ベクターの細胞周期の天然の一部として細胞を溶解させる。ベクターが外来性蛋白質をコードしそれを発現するように作成されている場合、複製−コンピテントＡｄベクターのもう１つの利点が生じる。そのようなベクターは、ベクターが複製するにつれてイン・ビボでコードされた蛋白質の合成を大いに増幅すると期待される。しかしながら、ＲＣベクターが正常な組織を損傷し、散在性ウイルス血症を引き起こすのを防ぐためには、それが癌細胞に対するその複製を制限するいくつかの特徴を有することが重要である。
【００１１】
Ｗｙｅｔｈ研究所は、Ａｄ血清型４、７および５のワクチン株を用い、ワクチン摂取目的で複製−コンピテントＡｄベクターを開発した（Ｌｕｂｅｃｋら，ＡＩＤＳ Ｒｅｓ．Ｈｕｍ．Ｒｅｔｒｏｖｉｒｕｓｅｓ １０：１４４３−１４４９，１９９４）。外来性遺伝子は（Ｅ３遺伝子が欠失した）Ｅ３領域に挿入され、またはゲノムの右側末端の部位に挿入される。用いる２つの外来性遺伝子はＢ型肝炎表面抗原およびＨＩＶエンベロープ蛋白質であった。それらは培養中に良好な発現を得、動物モデルにおいて抗血清を生起させることができた。Ｉ相ヒト試験は不明瞭であり、プロジェクトはほとんど放棄された。
【００１２】
Ｏｎｙｘ Ｐｈａｒｍａｃｅｕｔｉｃａｌｓは、最近、非新形成細胞で複製欠陥であるが、機能的ｐ５３および／または網膜芽細胞腫（ｐＲＢ）腫瘍サプレッサー蛋白質を欠く新形成細胞において複製表現型を呈するアデノウイルス−ベースの抗癌ベクターについて報告している（米国特許第５，６７７，１７８号；Ｈｅｉｓｅら，Ｎａｔｕｒｅ Ｍｅｄ．６：６３９−６４５，１９９７；Ｂｉｓｃｈｏｆｆら，Ｓｃｉｅｎｃｅ ２７４：３７３−３７６，１９９６）。この表現型は、報告されているところによると、ｐ５３に結合することができないコードされたＥ１Ｂ−５５Ｋ蛋白質を作成するＥ１Ｂ領域中の突然変異および／またはｐＲＢおよび／もしくは細胞３００ｋＤポリペプチドおよび／もしくは１０７ｋＤポリペプチドに結合できないコードされたＥ１Ａ蛋白質（ｐ２８９Ｒまたはｐ２４３Ｒ）を作成するＥ１Ａ領域中の突然変異（群）を含有する組換えアデノウイルスによって達成される。Ｅ１Ｂ−５５Ｋは少なくとも２つの独立した機能を有する：それは腫瘍サプレッサー蛋白質ｐ５３に結合しそれを不活化し、それは核からのＡｄ ｍＲＮＡの効果的な輸送で必要である。これらのＥ１ＢおよびＥ１Ａウイルス蛋白質は、アデノウイルスＤＮＡの複製に必要な、細胞のＳ−相への強制に関与する故に、かつｐ５３およびｐＲＢ蛋白質は細胞周期の進行をブロックする故に、Ｏｎｙｘによって記載された組換えアデノウイルスベクターはｐ５３および／またはｐＲＢが不足する細胞で複製し、これは多くの癌細胞で当てはまるが、野生型ｐ５３および／またはｐＲＢを持つ細胞では当てはまらない。Ｏｎｙｘは、ＯＮＹＸ−０１５と命名された、Ｅ１Ｂ−５５Ｋを欠くアデノウイルスの複製がｐ５３−マイナス癌細胞系に制限され（Ｂｉｓｃｈｏｆｆら，前掲）、およびＯＮＹＸ−０１５が、ヌードマウスで増殖するｐ５３−マイナスヒト腫瘍の増殖を遅らせ、またはその退行を引き起こす（Ｈｅｉｓｅら、前掲）ことを報告している。他の者は、ＯＮＹＸ−０１５の複製がｐ５３遺伝子型から独立しており、いくつかの初代培養ヒト細胞で効果的に起こることを主張するＯｎｙｘ報告に挑戦したＨａｒａｄａおよびＢｅｒｋ，Ｊ．Ｖｉｒｏｌ ７３：５３３３−５３４４，１９９９）。今日、ＯＮＹＸ−０１５が野生型ｐ５３を持つ細胞で複製できることが知られている（Ｇｏｏｄｒｕｍら，Ｊ．Ｖｉｒｏｌ．７２：９４７９−９４９０，１９９８；Ｈａｒａｄａら，Ｊ．Ｖｉｒｏｌ．７３：５３３３−５３４４，１９９９；Ｈａｙら，Ｈｕｍ．Ｇｅｎｅ Ｔｈｅｒ．１０：５７９−５９０，１９９９；Ｒｏｔｈｍａｎｎら，Ｊ．Ｖｉｒｏｌ．７２：９４７０−９４７８，１９９８；Ｔｕｒｎｅｌｌら，Ｊ．Ｖｉｒｏｌ．７３：２０７４−２０８３，１９９９）。ＯＮＹＸ−０１５は複製せず、並びに野生型アデノウイルスは複製しない。何故ならば、Ｅ１Ｂ−５５Ｋは核からのウイルスｍＲＮＡ輸送を促進するのに利用できないからである。また、ＯＮＹＸ−０１５は野生型ウイルスよりもＡＤＰを発現するのは低い（後記実施例１参照）。
【００１３】
ＯＮＹＸ−０１５の概念の拡張として、単純疱疹ウイルスチミジンキナーゼ遺伝子で置き換えたＥ１Ｂ−５５Ｋについての遺伝子を有する複製−コンピテントアデノウイルスベクターが設計された（Ｗｉｌｄｅｒら，Ｇｅｎｅ Ｔｈｅｒａｐｙ ６：５７−６２，１９９９）。このベクターを構築したグループは、ベクター＋ガンシクロビールの組合せがヌードマウスモデルにおいてヒト結腸癌に対して治療効果を示した効果を報告している（Ｗｉｌｄｅｒら，Ｃａｎｃｅｒ Ｒｅｓ．５９：４１０−４１３，１９９９）。しかしながら、このベクターはＡＤＰに対する遺伝子を欠き、それに応じて、該ベクターは細胞を溶解させ、ＡＤＰを発現する同等なベクターよりも効率低く細胞間に広がる。また、記載されているヒト前立腺特異的抗原の最小エンハンサー／プロモーターがアデノウイルスＥ１Ａエンハンサー／プロモーターに挿入された、もう１つの複製−コンピテントアデノウイルスベクターで、ＡＤＰに対する遺伝子が欠けている（Ｒｏｄｒｉｇｕｅｚら，Ｃａｎｃｅｒ Ｒｅｓ．５７：２５５９−２５６３，１９９７）。
【００１４】
複製−コンピテントベクターの改良についてのもう１つの戦略は、組織特異的プロモーターの制御下に複製を置くことである。１つのグループは、基礎Ｅ１Ａプロモーターをα−フェト蛋白質（ＡＦＰ）に対する修飾プロモーターで置き換えた（Ｈａｌｌｅｎｂｅｃｋら，Ｈｕｍ．Ｇｅｎｅ Ｔｈｅｒ．１０：１７２１−１７３３，１９９９）。ＡＦＰは発生の間に肝臓で発現されるが、それは成人では発現されない。しかしながら、それは肝臓細胞癌腫を持つ患者の７０−８０％で発現される。このベクターの増殖はＡＦＰ−発現細胞に制限され、ベクターは異物トランスプラントのいくらかの抑制を示した（同上）。前立腺腫瘍特異的前立腺特異的抗原（ＰＳＡ）およびカリクレインプロモーター／エンハンサーに依存したＥ１ＡおよびＥ１Ｂ遺伝子の発現を有する一連のＲＣベクターも開発されている（Ｒｏｄｒｉｇｕｅｚら，Ｃａｎｃｅｒ Ｒｅｓ．６０：１１９６，１９９７；Ｙｕら，Ｃａｎｃｅｒ Ｒｅｓ．５９：４２００−４２０３，２０００；Ｙｕら，Ｃａｎｃｅｒ Ｒｅｓ ５９：１４９８−１５０４，１９９９）。
【００１５】
かくして、腫瘍において効果的に複製し、広がるが、それが正常な組織においては貧弱にしかまたは全く複製しないように修飾することができるベクターが継続的に必要とされている。
【００１６】
（発明の概要）
略言すれば、従って、本発明は、新形成細胞において複製コンピテントであって、アデノウイルス死滅蛋白質（ＡＤＰ）を過剰発現する新規なベクターに指向される。本明細書中で報告する実績は、組換えアデノウイルスによるＡＤＰの過剰発現が、組換えアデノウイルスが、非新形成細胞においてその複製速度をさもなければ低下させる突然変異を含有する場合においてさえ、野生型レベルのＡＢＰを発現するアデノウイルスによって呈されるものと同様またはそれよりも速い速度で、新形成細胞を殺し、細胞間に広がる複製−コンピテントアデノウイルスの構築を可能とするという発見を示すものである。ＡＤＰを過剰発現するＡｄベクターは活力があるままであり、Ａｄベクターが他の腫瘍細胞に広がることができる新しいウイルス粒子を生産する前に多量のＡＤＰによって感染細胞が死滅されないことは、アデノウイルス生物学について知られていたものからは予測することができなかったので、この発見は予測されなかった。事実、天然に生じるアデノウイルスは、感染の初期段階においてＥ３プロモーターから少量でＡＤＰを発現し、一旦ビリオンが細胞核で組み立てられると、感染後２４ないし３０時間においてのみ大量にＡＤＰを作成し始める。他の非アデノウイルスベクターを含めた他のウイルスベクターおよびプラスミド発現ベクターを含めた他の非アデノウイルスベクターを用いて、ＡＤＰ細胞−殺傷活性を新形成細胞に送達することができると考えられる。
【００１７】
かくして、１つの好ましい具体例において、ＡＤＰ−発現ベクターは、ｇｐ１９Ｋ；ＲＩＤα（１０．４Ｋとしても知られている）；ＲＩＤβ（１４．５Ｋとしても知られている）および１４．７Ｋよりなる群から選択される少なくとも１つのＥ３蛋白質の発現を欠く組換えアデノウイルスを含む。これらのＥ３蛋白質はＡｄ−感染細胞の免疫−媒介炎症および／またはアポトーシスを阻害するので、これらのＥ３蛋白質の１以上を欠く組換えアデノウイルスは、アデノウイルスで処理された腫瘍へ炎症および免疫細胞が侵潤するよう刺激し、この宿主免疫応答は腫瘍の破壊並びに転移した腫瘍の破壊を助けると考えられる。好ましい具体例によって発現されたＡＤＰは、サブグループＣのヒトアデノウイルス、すなわち、Ａｄ１、Ａｄ２、Ａｄ５およびＡｄ６からの天然に生じるアミノ酸配列を含む。
【００１８】
もう１つの具体例において、ベクターの複製は新形成細胞に制限される。そのような複製−制限ベクターは、ベクター、特に、その細胞周期の一部として宿主細胞を殺すウイルスベクターによって引き起こされ得る正常細胞および組織に対する損傷を排除または低下させるのが望ましい癌患者を治療するのに有用である。好ましい具体例において、組換えアデノウイルスは複製−制限表現型を有する。なぜならば、組換えアデノウイルスは、ｐＲＢおよびｐ３００／ＣＢＰ蛋白質に結合するＥ１Ａウイルス蛋白質を発現できないからであり、かつＥ４プロモーターは、新形成細胞および／または特異的組織の細胞においてのみ活性化されるプロモーターで置き換えられているからである。
【００１９】
さらにもう１つの具体例において、本発明はＡＤＰを過剰発現し、その複製が組織特異的プロモーター、腫瘍特異的プロモーターまたは誘導性プロモーターの制御下にあるベクターを提供する。好ましい具体例において、ベクターは、組織特異的プロモーターまたは誘導性プロモーターがＥ４プロモーターに代えて置き換えられた組換えアデノウイルスを含む。そのようなベクターは、該ベクターおよびそのＡＤＰ−媒介細胞殺傷の複製を、特定タイプの細胞に、またはプロモーターを活性化する外来性剤に暴露された細胞に制限するのに有用である。また、好ましい組織特異的または誘導性ベクターは、その複製を新形成細胞に制限する表現型を発現する。
【００２０】
さらにもう１つの具体例において、本発明は、ＡＤＰを過剰発現するが、特異的遺伝子修飾によって腫瘍に制限されないベクターを提供する。そのようなベクターは、サブグループＣの天然に生じるＡｄさえよりも新形成細胞に対して破壊的である。好ましい具体例において、このベクターは、もう１つの方法によって治療できないが、Ａｄに対する予め存在する中和抗体を有するか、あるいは中和抗体を投与することができる末期癌を持つ患者で用いることができる。
【００２１】
さらにもう１つの具体例において、本発明は、新形成細胞において複製コンピテントであって、アデノウイルス死滅蛋白質を過剰発現する第１の組換えウイルスを含む組成物を提供する。１つの具体例において、組換えウイルスは、ウイルスのあるタイプの細胞への送達を制限する標的化部位を含む送達ビヒクル内に含有される。この具体例では、複製−コンピテントベクターは本明細書中に記載されるいずれのＡＤＰ−過剰発現形態のものであってもよい。いくつかの具体例において、該組成物は、複製−欠陥であって、抗癌遺伝子産物を発現する第２の組換えウイルスを含む。いくつかの具体例において、複製−欠陥ベクターは、このベクターの複製が複製−コンピテントベクターによって補われる場合にＡＤＰを過剰発現するように作成することができる。該組換えウイルスは、複製−欠陥ウイルス、並びにそのコードされた抗癌産物の腫瘍を通じての拡大を補充する。好ましい具体例において、該第１の組換えウイルスは、その複製が新形成細胞に制限されるおよび／またはＥ３ ｇｐ１９Ｋ；ＲＩＤα；ＲＩＤβ；および１４．７Ｋ蛋白質の１以上の発現を欠く組換えアデノウイルスである。
【００２２】
さらなる具体例において、本発明は、ＡＤＰを過剰発現し、また、抗癌産物を発現する複製−コンピテントベクターを提供する。これまでの具体例に関しては、該ベクターは、ここに提供されるいずれのＡＤＰ−過剰発現形態のものであってもよい。好ましくは、ウイルスの複製は、（ａ）例えば、組織特異的または腫瘍特異的プロモーターでＥ４プロモーターを置き換えることによって、新形成細胞に制限されるおよび／または（ｂ）Ｅ３ ｇｐ１９ｔ；ＲＩＤα；ＲＩＤβ；および１４．７Ｋ蛋白質の１以上の発現を欠くように作成される。いくつかの具体例において、抗癌産物がＥ３領域に挿入される。
【００２３】
本発明のＡＤＰ−発現ベクターおよび組成物は、新形成細胞の死滅を促進する方法で有用である。該方法は、新形成細胞を、新形成細胞において複製−コンピテントであって、ＡＤＰを過剰発現するベクターと接触させることを含む。新形成細胞が患者における腫瘍を含む場合、該ベクターは腫瘍に直接投与されるか、あるいは、他の具体例において、ベクターは全身にあるいはベクターの腫瘍への送達を指令する標的化部位を含有する送達ビヒクル中にて患者に投与される。該ベクターは組換えウイルスである具体例において、該方法はウイルスに対して患者を受動的に免疫化することを含むことができる。
【００２４】
本発明のさらにもう１つの具体例において、ベクターは放射線照射療法と組み合わせて用いることができる。放射線照射療法は、例えば、ｘ線治療のごとき外部ビーム照射、ガンマ線放出放射性核種での治療のごとき腫瘍部位近くのまたは該部位における身体内への放射線活性物質の挿入によって送達される放射線照射、中性子または荷電粒子等を利用する粒子ビーム療法のような当該分野で用いられるいずれの形態の放射線照射療法であってもよい。加えて、この具体例は、放射線照射療法と組み合わせたカクテル中の本発明の１を超えるベクターの使用を含む。
【００２５】
本発明のもう１つの具体例は、他のアデノウイルスベクターで開示されているごとく（米国特許第５，８４６，９４５号）、化学療法と組み合わせた組換えベクターの使用を含む。化学治療剤は当該分野で知られており、ピリミジン−アナログおよびプリン−アナログ抗代謝剤を含めた抗代謝剤、植物アルカロイド、抗腫瘍抗生物質、アルキル化剤等を含む。化学治療剤（類）と一緒に本発明の１を超えるベクターを使用することも本具体例内であると考えられる。
【００２６】
本発明によって達成されることが判明したいくつかの利点の中には、従って、迅速に癌細胞を殺し、腫瘍において細胞間に広がる複製−コンピテントベクター、特にウイルスの提供；その複製が誘導されることができるか、または腫瘍および／またはある組織型の細胞に制限されるかかるベクターの提供；および正常な組織においてほとんどまたは全く副作用を引き起こさない抗癌療法のための組成物および方法の提供を挙げることができる。
【００２７】
（好ましい具体例の記載）
本発明によると、組換えアデノウイルスによるＡＤＰの過剰発現の結果、野生型レベルのＡＤＰを発現するウイルスよりも細胞単層全体を通じて細胞のより速い溶解およびウイルスの拡大がもたらされることが判明した。また、ＡＤＰについてのこの機能は、アデノウイルス複製を新形成細胞に制限するＥ１Ａ突然変異を含有するアデノウイルスで発現されることも判明した。かくして、新形成細胞において複製コンピテントであって、ＡＤＰを過剰発現するベクターは抗癌療法で有用なはずである。
【００２８】
本開示の関係では、以下の用語は特記しない限り、以下のように定義される。
【００２９】
ポリヌクレオチド、ポリペプチドまたはウイルスのごとき対象に適用される「天然に生じる」は、該対象が天然における源から単離でき、ヒトによって意図して修飾されていないことを意味する。
【００３０】
「新形成細胞」は、細胞増殖の制御の有意な喪失によって特徴付けられる異常増殖表現型を呈する細胞を意味し、能動的に複製する細胞ならびに一時的に非複製休止状態にある（Ｇ_１またはＧ_２）細胞を含む。新形成細胞はよく分化した表現型または貧弱に分化した表現型を有することができ、良性新形成または悪性新形成を含むことができる。
【００３１】
「組換えウイルス」は、野生型ウイルスゲノムにおける１以上のヌクレオチドの欠失、挿入または置換により野生型ウイルスとは異なるいずれかのウイルスゲノムまたはビリオンを意味する。組換えウイルスは、コードされ発現されるアミノ酸配列の数、またはウイルスによって発現される蛋白質の量または活性の変化を有することができる。特に、該用語はヒトの介入によって創製された組換えウイルスを含む。
【００３２】
ベクターに適用される「複製−コンピテント」は、ベクターが正常および／または新形成細胞において複製できることを意味する。組換えウイルスに適用されるごとく、「複製−コンピテント」は、該ウイルスが正常および／または新形成細胞において以下の表現型特徴：細胞感染；ウイルスゲノムの複製；および新しいウイルス粒子の生産および放出を呈することを意味するが、これらの特徴の１以上はそれらが野生型ウイルスによって感染した同一細胞型で起こるので同一速度で起こる必要はなく、より速いまたはより遅い速度で起こり得る。組換えウイルスは、その細胞周期の一部として細胞を溶解するアデノウイルスのごときウイルスに由来する場合、細胞培養単層における細胞の少なくとも５ないし２５％が感染の５日後に死滅しているのが好ましい。好ましくは、複製−コンピテントウイルスは感染後５日までに単層の細胞の少なくとも２５ないし５０％、より好ましくは少なくとも７５％、最も好ましくは少なくとも９０％に感染し、それを溶解する。
【００３３】
組換えウイルスに適用される「複製−欠陥」は、該ウイルスが、補充複製−コンピテントウイルスの不存在下でいずれかの細胞型においてそのゲノムを複製することができない、または大いに損なわれることを意味する。この例外は、アデノウイルスＥ１ＡおよびＥ１Ｂ蛋白質を発現するように作成されている２９３細胞のごとき細胞系である。
【００３４】
本発明のベクターに適用される「複製−制限」は、該ベクターが、正常な非分裂細胞ともここではいう、新形成ではないおよび／または分裂しない同一タイプの細胞におけるよりも、分裂細胞、すなわち、新形成細胞もしくは非新形成分裂細胞において良好に複製することを意味する。好ましくは、複製−制限ウイルスは、感染後５日において細胞障害効果（ＣＰＥ）を示す細胞の数によって測定して、同一サイズの細胞培養単層における正常な非分裂細胞よりも少なくとも１０％多く新形成細胞を殺す。より好ましくは、正常細胞よりも２５％および５０％の間、より好ましくは５０％および７５％の間より多い新形成細胞が複製−制限ウイルスによって殺される。最も好ましくは、複製−制限アデノウイルスは、感染後５日までに、等しいサイズの単層において正常細胞よりも７５％および１００％の間より多い新形成細胞を殺す。
【００３５】
１つの具体例において、本発明は、新形成細胞において複製−コンピテントであって、ＡＤＰを過剰発現するベクターを提供する。本発明で有用なベクターは、限定されるものではないが、プラスミド−発現ベクター、多数の異なる細胞型に侵入し、そこで生存することができるＳａｌｍｏｎｅｌｌａ種のごとき細菌ベクター、ヒトおよび非ヒトアデノウイルス、アデノウイルス関連ウイルス（ＡＡＶ）、ポックスウイルス、ヘルペスウイルスのようなＤＮＡウイルスに由来するベクター、およびレトロウイルスおよびアルファウイルスのごときＲＮＡウイルスに由来するベクターを含む。好ましいベクターは、ＡＤＰを過剰発現するように作成された組換えウイルスを含む。組換えアデノウイルスは、ベクター、特にＡｄ１、Ａｄ２、Ａｄ５またはＡｄ６に由来するベクターとして用いるのに特に好ましい。
【００３６】
本発明によるベクターはＡＤＰを過剰発現する。組換えＡｄおよびＡＡＶベクターに適用されるごとく、用語「ＡＤＰを過剰発現する」は、同一タイプの分裂細胞においていずれかの以前に知られている組換えアデノウイルスベクターまたはＡＡＶによって発現されるよりも当該ベクターによって感染された分裂細胞に存在するウイルスゲノム当たりより多くのＡＤＰ分子が作成されることを意味する。他の非アデノウイルスベクターに適用されるごとく、「ＡＤＰを過剰発現する」は、当該ウイルスが、ベクターを含有する細胞を溶解するのに十分なＡＤＰを発現することを意味する。
【００３７】
ＡＤＰを過剰発現するベクターはルーチン的な方法を用いて調製することができる。例えば、Ａ Ｌａｂｏｒａｔｏｒｙ Ｃｌｏｎｉｎｇ Ｍａｎｕａｌ，２ｎｄ Ｅｄ．，ｖｏｌ．３，Ｓａｍｂｒｏｏｋら編、Ｃｏｌｄ Ｓｐｒｉｎｇ Ｈａｒｂｏｒ Ｌａｂｏｒａｔｏｒｙ Ｐｒｅｓｓ，１９８９参照。例えば、ＡＤＰをコードするポリヌクレオチドは、哺乳動物細胞において異種蛋白質を効果的に発現することが知られているプラスミド発現ベクターにクローンすることができる。該ポリヌクレオチドは適当な終止およびポリアデニル化シグナルも含むべきである。エンハンサーエレメントをプラスミドに添加して、ＡＤＰ発現の量を増加させることもできる。ＡＤＰを過剰発現するウイルスベクターは、同様の材料および技術を用いて調製することができる。
【００３８】
ウイルスが組換えアデノウイルスである場合、ＡＤＰの過剰発現は多くの方法で達成することができる。一般に、Ｅ３プレ−ｍＲＮＡ分子のより多くがＡＤＰに対するｍＲＮＡにプロセッシングされるので、Ｅ３ｍＲＮＡのいずれかに対するスプライス部位を除去するＥ３領域におけるいずれのタイプの欠失も、ＡＤＰに対するｍＲＮＡの過剰発現に導く。これは、その構築を後記するＫＤ１、ＫＤ３、ＧＺ１およびＧＺ３ベクター（配列番号：１−４）に例示されている。ＡｄベクターにおいてＡＤＰの過剰発現を達成する他の手段は、限定されるものではないが、プレ−ｍＲＮＡスプライシングおよび切断／ポリアデニル化シグナルの、ＡＤＰに対する遺伝子を近接にて挟む部位における挿入；Ａｄゲノム中の種々の部位に挿入されたもう１つのプロモーター、例えば、ヒト・サイトメガロウイルスプロモーターからのＡＤＰの発現；およびＡＤＰの翻訳の内部開始を可能とするＡＤＰ配列の５’側にある配列、例えば、Ａｄ三部リーダーまたはウイルス内部リボソーム開始配列と共に、もう１つのＡｄ ｍＲＮＡに対する遺伝子の背後へのＡＤＰに対する遺伝子の挿入を含む。
【００３９】
本発明によるベクターによって発現されたＡＤＰは、ベクターの複製されたコピーが感染細胞から放出されるように、ベクターを含有する細胞を溶解させる能力をＡＤＰを発現するベクターに付与する天然に生じる全長ＡＤＰアミノ酸配列またはその変種を含むいずれかのポリペプチドである。好ましい全長ＡＤＰはＡｄ１、Ａｄ２、Ａｄ５またはＡｄ６によってコードされるＡＤＰアミノ酸配列を含む。これらの天然に生じるＡＤＰ配列は、各々、配列番号：５−８に記載されている。ＡＤＰ変種は、天然に生じるアデノウイルス死滅蛋白質の断片および欠失突然変異体、ならびに保存的アミノ酸置換を含有する全長分子、断片および欠失突然変異体を含む。但し、そのような変種は、細胞内部でベクターによって発現されると、該細胞を溶解する能力を保有するものとする。
【００４０】
保存的アミノ酸置換とは、同様の側鎖を有する残基の相互交換性をいう。保存的に置換されたアミノ酸は、それらの側鎖の化学的特性に従ってグループ分けすることができる。例えば、アミノ酸の１つのグループ分けは、中性および疎水性側鎖を有するアミノ酸（Ａ、Ｖ、Ｌ、Ｉ、Ｐ、Ｗ、Ｆ、およびＭ）を含み；もう１つのグループ分けは中性および極性側鎖を有するアミノ酸（Ｇ、Ｓ、Ｔ、Ｙ、Ｃ、ＮおよびＱ）であり；もう１つのグループ分けは塩基性側鎖を有するアミノ酸（Ｋ、Ｒ、およびＨ）であり；もう１つのグループ分けは酸性側鎖を有するアミノ酸（ＤおよびＥ）であり；もう１つのグループ分けは脂肪族側鎖を有するアミノ酸（Ｇ、Ａ、Ｖ、ＬおよびＩ）であり；もう１つのグループ分けは脂肪族−ヒドロキシル側鎖を有するアミノ酸（ＳおよびＴ）であり；もう１つのグループ分けはアミン−含有側鎖を有するアミノ酸（Ｎ、Ｑ、Ｋ、Ｒ、およびＨ）であり；もう１つのグループ分けは芳香族側鎖を有するアミノ酸（Ｆ、Ｙ、およびＷ）であり；およびもう１つのグループ分けは硫黄−含有側鎖を有するアミノ酸（ＣおよびＭ）である。好ましい保存的アミノ酸置換グループはＲ−Ｋ；Ｅ−Ｄ，Ｙ−Ｆ，Ｌ−Ｍ；Ｖ−１，およびＱ−Ｈである。
【００４１】
本明細書で用いるごとく、ＡＤＰ変種は、１以上のアミノ酸が挿入され、欠失され、または異なるアミノ酸または修飾されたもしくは異常なアミノ酸で置換された天然に生じるＡＤＰの修飾、ならびに修飾された配列を含有するＡＤＰ変種が細胞溶解活性を保有する限り、１以上のアミノ酸のグリコシル化またはリン酸化のごとき修飾も含むことができる。
【００４２】
後記するごとく、本発明者らは、ここに、細胞死滅を促進するのに必要なＡＤＰ中の特定のドメインを規定するＡＤＰの構造−機能分析を行った。この情報を用い、既知の組換えＤＮＡおよびクローニング方法と組み合わせると、当業者であれば、天然に生じるアデノウイルス死滅蛋白質のＡＤＰ変種を容易に構築し、それらを細胞溶解活性につきテストすることができると考えられる。好ましいＡＤＰ欠失突然変異体は、そのＡＤＰ配列が、各々、配列番号：９−１２に記載された、欠失突然変異体ｄｌ７１６、ｄｌ７１５、ｄｌ７１４およびｄｌ７３７のいずれかからのＡＤＰアミノ酸配列を含む。
【００４３】
ベクターがウイルスに由来する場合、ウイルスは、感染細胞の免疫−媒介炎症および／またはアポトーシスのごとき宿主抗ウイルス防御の回避に関与する１以上のウイルス蛋白質の発現を欠くのが好ましい。例えば、アデノウイルスは、免疫系によるＡｄ−感染細胞の殺傷を防止する遺伝子のカセットを含有する（Ｗｏｌｄら，Ｓｅｍｉｎ．Ｖｉｒｏｌ．，１９９８（８：５１５−５２３，１９９８）。ＲＩＤαおよびＲＩＤβよりなる複合体である、Ｅ３−１４．７Ｋ蛋白質およびＥ３ ＲＩＤ（受容体内部化および分解）蛋白質は、活性化されたマクロファージ、ナチュラルキラー（ＮＫ）細胞、および細胞毒性リンパ球（ＣＴＬ）で発現される、またはそれらによって分泌される腫瘍壊死因子（ＴＮＦ）およびＦａｓリガンドによって誘導されたＡｄ−感染細胞のアポトーシスを阻害する（Ｔｏｌｌｅｆｓｏｎら，Ｎａｔｕｒｅ ３９２：７２７−７３０，１９９８）。Ｅ３−ｇｐ１９Ｋ蛋白質は、細胞表面へのＭＨＣクラスＩ抗原の輸送をブロックすることによって感染細胞のＣＴＬ−殺傷を阻害する（Ｗｏｌｄら，前掲）。かくして、かかるウイルスベクターによる腫瘍細胞の感染は炎症細胞およびリンパ球の腫瘍への侵潤を刺激し、免疫系の細胞溶解細胞によって誘導されるアポトーシスから、またはサイトカインを誘導するアポトーシスに対して感染腫瘍細胞を妨げないであろうと考えられる。例えば、マウスをＥ３ ｇｐ１９Ｋ、ＲＩＤおよび１４．７Ｋ蛋白質を欠くＡｄ突然変異体で感染させると、炎症細胞およびリンパ球の感染組織への侵潤の劇的な増加（Ｅ３−陽性Ａｄと比較して）があることが知られている（Ｓｐａｒｅｒら，Ｊ．Ｖｉｒｏｌ．７０：２４３１−２４３９，１９９６）。本発明のＡＤＰ−発現ウイルスベクターによって感染された腫瘍の同様の侵潤は、免疫系の攻撃をＡＤＰ−媒介殺傷活性に添加することによって、さらに腫瘍の破壊を促進すると期待されるであろう。例えば、ウイルス感染は、腫瘍細胞におけるのみならず転移したものにおいて新形成細胞を殺すことができる腫瘍−特異的ＣＴＬの形成を刺激するであろうと考えられる。加えて、また、もしベクターが腫瘍から正常細胞へと広がるならば、ベクター−感染細胞を攻撃できるベクター−特異的ＣＴＬが創製されるであろうと予測される。ＡＤＰを過剰発現するウイルスベクターは腫瘍を通じて迅速に広がるので、これらの免疫メカニズムはベクターの広がりに対してほとんど効果を有しないであろうと考えられる。
【００４４】
ベクターが組換えアデノウイルスである場合、アデノウイルスはＥ３ ｇｐ１９Ｋ、ＲＩＤおよび１４．７Ｋ蛋白質の各々の発現を欠くのが好ましい。蛋白質の「発現を欠く」および「発現を欠いている」とは、当該ウイルスゲノムが、機能的蛋白質、すなわち、野生型蛋白質の全ての機能を有するものの発現を不活化する１以上の突然変異を含有することを意味する。不活化突然変異体は、限定されるものではないが、機能的転写体の発現を防止する、あるいは非機能的翻訳産物をコードする転写体をもたらす、コーディング遺伝子中の１以上のヌクレオチドの置換または欠失を含む。Ａｄ Ｅ３ ｇｐ１９Ｋ、ＲＩＤおよび１４．７Ｋ蛋白質の発現を不活化するための特に好ましい方法は、これらの蛋白質をコードする遺伝子を含有するＥ３領域を欠失することによるものである。好ましくは、Ｅ３ ６．７Ｋおよび１２．５Ｋ蛋白質をコードするＥ３遺伝子の一方または双方もまた欠失させる。なぜならば、後記する実施例で議論するごとく、ＡＤＰ遺伝子以外のＥ３遺伝子のほとんどまたは全てが、主要後期プレ−ｍＲＮＡのスプライシングについての競合を低下させることによってＡＤＰ ｍＲＮＡの過剰発現を容易にすると考えられるからである。ＡＤＰを過剰発現するＥ３欠失を含有する好ましいＡｄベクターは、その構築および特性が後記実施例に記載されているＧＺ１（配列番号：３）およびＧＺ３（配列番号：４）である。
【００４５】
また、本発明は、その複製が分裂細胞に制限されるＡＤＰ−発現ベクターを提供する。そのような複製−制限表現型を供することが知られているいずれの手段も用いることができる。例えば、ＷＯ９６／４０２３８は腫瘍細胞に選択的に侵入する微生物ならびに腫瘍において選択的に活性化される細菌プロモーターを同定し単離するための方法を記載する。また、複製に必須の１以上のベクター蛋白質の発現は、その発現が新形成細胞で上昇調節されることが知られている細胞遺伝子のためのプロモーターの制御下に置くことができると考えられる。そのような遺伝子の例は、限定されるものではないが、乳癌マーカーママグロビン（Ｗａｔｓｏｎら，Ｏｎｃｏｇｅｎｅ １６：８１７−８２４，１９９８）；ＢＲＣＡ１（Ｎｏｒｒｉｓら，Ｊ．Ｂｉｏｌ．Ｃｈｅｍ．２７０：２２７７７−２２７８２，１９９５）ｈｅｒ２／ｎｅｕ（Ｓｃｏｔｔら，Ｊ．Ｂｉｏｌ．Ｃｈｅｍ．２６９：１９８４８−１９８５８，１９９４）；前立腺特異的抗原（米国特許第５，６９８，４４３号）；肺胞についてのサーファクタント蛋白質（surfactant protein）Ｂ（Ｙａｎら，Ｊ．Ｂｉｏｌ．Ｃｈｅｍ．２７０：２４８５２−２４８５７，１９９５）；肺についての第ＶＩＩ因子（Ｇｒｅｅｎｂｅｒｇら，Ｐｒｏｃ．Ｎａｔｌ．Ａｃａｄ．Ｓｃｉ．ＵＳＡ ９２：１２３４７−１２３５１，１９９５）；および一般に癌についてのスルビビン（Ｌｉら，Ｎａｔｕｒｅ ３９６：５８０−５８４）を含む。ベクターがアデノウイルスである場合、そのような腫瘍−特異的プロモーターをＥ４プロモーターに代えて置き換えることができると考えられるＥ４遺伝子産物はＡｄ複製に必須であるので、それらの発現を腫瘍−特異的プロモーターの制御下に置くことは、プロモーターが活性化される腫瘍細胞へのベクターの複製を制限するはずである。
【００４６】
ＡＤＰ−発現Ａｄベクターの複製を新形成細胞に制限するためのもう１つの戦略は、その構築および特性が後記実施例に記載された、ＫＤ１（配列番号：１）、ＫＤ２（配列番号：１３）およびＫＤ３（配列番号：２）ベクターによって例示される。この戦略は、癌細胞においてのみよく増殖することができる、ここではｄｌ０１／０７とも言うｄｌ１１０１／１１０７と命名された（Ｈｏｗｅら，Ｐｒｏｃ．Ｎａｔｌ．Ａｃａｄ．Ｓｃｉ．，８７：５８８３−５８８７，１９９０）、Ｅ１Ａ遺伝子中の予め存在するＡｄ５突然変異体を開発する。Ｅ１Ａの役割は、細胞周期のＧ_０およびＧ_１相からＳ−相へ細胞を駆動することにある。これは、２つのメカニズムによって達成され、１つはｐＲＢ（およびファミリーメンバー）に関与し、他方はｐ３００および関連蛋白質ＣＢＰに関与する（ＤｅＰｉｎｈｏ，Ｒ．Ａ．，Ｎａｔｕｒｅ，３９１：５３３−５３６，１９９８）。Ｅ１Ａにおける１つのドメインはｐＲＢファミリーのメンバーに結合する。ｐＲＢは、通常は、Ｓ−相において発現される細胞のプロモーター中のＥ２ＦないしＥ２Ｆ結合部位を介して連結した、転写因子Ｅ２Ｆ−１およびＥ２Ｆファミリーメンバー（Ｅ２Ｆ）との複合体として細胞に存在する。ここに、ｐＲＢは転写共リプレッサーとして働く。ｐＲＢへのＥ１Ａの結合はこの抑制を軽減し、ｐＲＢ／Ｅ２Ｆ複合体からのＥ２Ｆの放出を引き起こす。次いで、遊離Ｅ２Ｆは、Ｓ−相で発現される遺伝子、例えば、チミジンキナーゼ、リボヌクレオチドレダクターゼ等のプロモーターを活性化する。Ｅ１Ａにおけるもう１つのドメインはｐ３００／ＣＢＰ転写アダプター蛋白質複合体に結合する。ｐ３００／ＣＢＰは、多くの異なる転写因子に結合する転写共アクチベーターであり、従って、プロモーターに標的化される。ｐ３００ＣＢＰは固有のヒストンアセチルトランスフェラーゼ活性を有する。ｐ３００／ＣＢＰへのＥ１Ａの結合はこのヒストンアセチルトランスフェラーゼ活性を阻害すると考えられ、ヒストンのアセチル化および転写の抑制を行う（Ｃｈａｋｒａｖａｒｔｉら，Ｃｅｌｌ ９６：３９３−４０３，１９９９；Ｈａｍａｍｏｒｉら，Ｃｅｌｌ ９６：４０５−４１３，１９９９）。概念的には、ｐ３００／ＣＢＰと相互作用するＥ１Ａの結果として抑制される遺伝子のいくつかは細胞周期をブロックする役割を演じるが、これは知られていない。癌細胞は周期を進行させ、従って、それは遊離Ｅ２Ｆを有し、恐らくは、いくつかのｐ３００／ＣＢＰ−調節遺伝子は抑制される。この考え方と合致し、Ｅ１Ａはｐ３００／ＣＢＰおよびｐＲＢファミリー双方と結合して、初代細胞を構成的に周期を進行させる状態に変換するに違いない（Ｈｏｗｅら，前掲）。突然変異体ｄｌ０１／０７は、ｐ３００／ＣＢＰ−およびｐＲＢ−結合ドメイン双方を欠如し、予測されるごとく、非分裂「正常」細胞または血清飢餓癌細胞において非常に貧弱にしか複製しないが、増殖する癌細胞においてはよく複製する。後記するごとく、ｄｌ０１／０７ Ｅ１Ａ突然変異を含有するＫＤ１およびＫＤ３ベクターの増殖は、非分裂細胞と比較して分裂癌細胞においてかなり良好である。ｄｌ０１／０７突然変異体がラット細胞のオンコジーン形質転換で完全に欠けている（Ｈｏｗｅら，前掲）ので、このＥ１Ａ突然変異を含有する本発明によるベクターは、Ｅ１Ａ−依存性メカニズムを介する（ことができるので，離れて）ヒトにおいて癌を誘導することができない。
【００４７】
また本発明は、複製に必須の１以上の蛋白質の発現を、組織特異的プロモーターおよび／または腫瘍特異的プロモーターの制御下に置くことによって、その複製が特異的組織に制限されるＡＤＰを過剰発現するベクターを含む。多数の組織特異的および／または腫瘍特異的プロモーターが当該分野で記載されている。非限定的例は、内皮系の細胞において特異的に遺伝子発現を指令する、Ｂｒｅｉｔｍａｎらに対する米国特許第５，４６６，５９６号に記載されたＴＴＦＩ転写因子を含有する細胞（すなわち、ＩＩ型歯槽細胞（Ｙａｎら，前掲））においてのみ活性であるサーファクタント蛋白質Ｂプロモーター；前立腺細胞で発現される前立腺特異的抗原（Ｒｏｄｒｉｇｕｅｚら，前掲）；ヒト・テロメラーゼ蛋白質（ｈＴＥＲＴ）プロモーター（例えば、米国特許第６，０５４，５７５号参照）；乳癌細胞で発現されるヒトα−ラクトアルブミン遺伝子（Ａｎｄｅｒｓｏｎら，Ｇｅｎｅ Ｔｈｅｒａｐｙ ６：８５４−８６４，１９９９）を含む。多くの他の組織−特異的、腫瘍特異的または組織−好ましいエンハンサー／プロモーターが報告されている（ＭｉｌｌｅｒおよびＷｈｅｌａｎ，Ｈｕｍａｎ Ｇｅｎｅ Ｔｈｅｒａｐｙ ８：８０３−８１５，１９９７）。実施例６および１０においてサーファクタント蛋白質Ｂプロモーターで例示されているごとく、組織−特異的プロモーターを発現するベクターは、ウイルス複製、ウイルス拡大、細胞溶解および腫瘍抑制において組織特異性を示すと予測される。
【００４８】
本発明によるベクターの複製は、ベクター複製に必須の１以上の遺伝子を、金属、ホルモン、抗生物質および温度変化のごとき外因性誘導剤によって活性化されるプロモーターの制御下に置くことによって制御することができる。そのような誘導性プロモーターの例は、限定されるものではないが、メタロチオネインプロモーター、糖質コルチコイドプロモーター、テトラサイクリン応答プロモーター、ｈｓｐ６５および７０プロモーターのごとき熱ショック蛋白質（ｈｓｐ）プロモーターを含む。
【００４９】
また、本発明は、新形成細胞の死滅を促進する有効量のＡＤＰを過剰発現する組換えベクターを含む組成物、および治療上有効量のベクターを患者における新形成細胞に投与することを含む方法を提供する。本発明の組成物および方法はいずれの起源の新形成細胞を殺すのにも有用であり、腫瘍を含む新形成細胞ならびに転移性新形成細胞を含む。
【００５０】
また、ＡＤＰ−発現ウイルスベクターを、抗癌遺伝子産物を発現する複製−欠陥ウイルスと共に新形成細胞に投与することができると考えられる。例えば、癌療法で用いられる多くの複製−欠陥Ｅ１-Ａｄベクターはよく特徴付けられている。複製−欠陥ベクターの制限は、それが最初に感染し、それが他の細胞に拡大できない細胞において治療蛋白質を合成するに過ぎないことである。また、ゲノムは複製しないので、転写はインプットゲノムからのみ起こることができ、これは細胞当たり１コピーと低くすることができる。対照的に、複製−コンピテントＡｄベクターのゲノムは、最初に感染した細胞において約１０^４だけ増幅され、転写のためのより多くの鋳型を提供する。より多くの増幅は、ベクターが他の細胞に拡大するにつれて達成される。抗癌遺伝子産物を発現する複製−欠陥ウイルスベクターをここに記載する複製−コンピテントウイルスベクターと組み合わせることによって、鋳型が増幅され、双方のベクターが周囲の細胞に迅速に拡大される結果となると考えられる。例えば、Ａｄ−ベースのベクターでは、各ベクターについてのバーストサイズは大きい（〜１０^４ＰＦＵ／細胞）はずであり、従って、双方のベクターによる周囲細胞の共感染の確率は高いであろう。かくして、複製−コンピテントおよび複製−欠陥ベクター双方は腫瘍を通じて同時に広がり、より効果的な抗癌療法さえ提供する。
【００５１】
ＡＤＰ過剰発現Ａｄベクターと共に抗癌遺伝子産物を送達する別の方法として、抗癌遺伝子をここに記載したＡＤＰ過剰発現複製−コンピテントベクターのいずれかに入れて作成して、単一ベクター中にＡＤＰおよび抗癌機能双方を提供することができる。当業者が容易に測定することができるごとく、抗癌遺伝子をベクターのいずれかの適当な位置に作成することができる。例えば、抗癌遺伝子をＥ３領域に作成することができる。
【００５２】
複製−欠陥ベクターによってコードされた抗癌遺伝子産物の発現は構成的、誘導性または細胞型特異的プロモーターいずれかの制御下にあるようにできる。抗癌遺伝子産物は、新形成細胞の死滅を促進するいずれかの物質であり得る。本明細書中で用いる用語「遺伝子産物」とは、遺伝子の制御下で起こる生化学反応の結果として生じるいずれの生物学的産物または産物類をもいう。遺伝子産物は、例えば、遺伝子の初期産物、すなわち、代謝産物である酵素または他の分子の制御下で生じたＲＮＡ分子、ペプチド、蛋白質または産物であり得る。例えば、遺伝子は、まず、リボソームの作用によって、癌患者に投与された非毒性プロドラッグを細胞殺傷剤に変換するプロドラッグ変換酵素に翻訳されるＲＮＡ分子の合成を制御することができる；該酵素によって生じたＲＮＡ分子、酵素、および細胞殺傷剤は該用語がここに用いられるごとく全ての遺伝子産物である。抗癌遺伝子産物の例は、限定されるものではないが、アポトーシス−促進剤およびトキシン；プロドラッグ変換酵素；脈管形成阻害剤；および新形成細胞に対して免疫応答（液性および／または細胞性）を刺激することができる免疫調節分子および抗原等の細胞殺傷剤を含む。
【００５３】
アポトーシス−促進剤は、限定されるものではないが、ＢＡＸ、ＢＡＤ、ＢＩＤおよびＢＩＫのごときＢＣＬ−２ファミリーのプロ−アポトーシスメンバー、ならびに該ＢＣＬ−２ファミリーの抗アポトーシスメンバーの発現をブロックするアンチセンス分子を含む。免疫調節分子の例は腫瘍壊死因子、Ｆａｓ／Ａｐｏ１／ＣＤ９５リガンド、腫瘍壊死因子関連アポトーシス誘導リガンド、インターロイキン、マクロファージ活性化因子およびインターフェロンγのごときサイトカインである。脈管形成阻害剤は、限定されるものではないが、エンドスタチンおよびアンジオスタチンを含む。トキシンは、限定されるものではないが、腫瘍壊死因子、リンフォトキシン、動物細胞においてリシン受容体の欠如のためヒトに対して毒性でない植物トキシンリシン、および細菌トキシンの毒性サブユニットを含む。プロドラッグ変換酵素およびプロドラッグの組合せの例はＷＯ９６／４０２３８に記載されており、チミジンキナーゼおよびアシクロビールまたはガンシクロビーム；および細菌シトシンデアミナーゼおよび５−フルオロシトシンを含む。
【００５４】
例えば、本発明の治療もしくは医薬組成物は、例えば、腫瘍への直接的注入による、または静脈内、皮下、筋肉内、経皮、クモ膜下腔内および脳内のごとき他の注入経路によることを含めた、当該分野で知られたいずれかの適当な経路によって投与することができる。投与は、注射によるように迅速に、または遅延放出処方の遅延注入または投与によるような一定時間にわたるものとすることができる。中枢神経系中の組織を治療するには、投与は脳脊髄液（ＣＳＦ）への注射または注入によることができる。本発明の組換えベクターを中枢神経系の細胞に投与することを意図する場合、投与は、脳−血液関門を横切ってのベクターの浸透を促進することができる１以上の剤を用いて行うことができる。好ましくは、本発明のベクターは、標的化部位を含有するリポソームまたはポリマーのごとき担体と共に投与して、ベクターの送達を標的化細胞に限定する。標的化部位の例は、限定されるものではないが、特異的細胞表面分子に対する抗体、リガンドまたは受容体を含む。
【００５５】
本発明による組成物は医薬製剤の形態で使用することができる。そのような製剤は製薬分野でよく知られている方法で作成される。１つの好ましい製剤は生理食塩水のビヒクルを利用するが、生理学的濃度の他の毒性塩、５％水性グルコース溶液、滅菌水等のごとき他の医薬上許容される担体を用いることもできると考えられる。また、適当な緩衝液を組成物に存在させることも望ましい。そのような溶液は、所望ならば、容易な注射のための滅菌水の添加によって復元が容易な滅菌アンプル中に凍結乾燥し、貯蔵することができる。主な溶媒は水性であるか、あるいは非水性とすることができる。
【００５６】
また、担体は、ｐＨ、浸透圧、粘度、透明性、色、滅菌性、安定性、溶解速度、または処方の臭いを修飾しまたは維持するための他の医薬上許容される賦形剤を含有することもできる。同様に、担体は、脳−血液関門を横切る放出または吸収または浸透を修飾するかまたは維持するためにさらに他の医薬上許容される賦形剤を含有することができる。そのような賦形剤は、単位投与または多用量形態いずれかでの非経口投与のための、または連続的または中期的注入による脳脊髄液への直接的注入のための投与を処方するのに通常および慣用的に使用される物質である。
【００５７】
ＡＤＰ−発現ベクターを含有するある種の手法は経口投与されると考えられる。そのような処方は、好ましくは、個体投与形態にて適当な担体でカプセル化し処方される。適当な担体、賦形剤および希釈剤のいくつかの例はラクトース、デキストロース、スクロース、ソルビトール、マンニトール、澱粉、ガムアカシア、リン酸カルシウム、アルギネート、ケイ酸カルシウム、マイクロクリスタリンセルロース、ポリビニルピロリドン、セルロース、ゼラチン、シロップ、メチルセルロース、メチル−およびプロピルヒドロキシベンゾエート、タルク、マグネシウム、ステアリン酸塩、水、鉱油等を含む。該処方は、加えて、滑沢剤、湿潤剤、乳化剤および懸濁化剤、防腐剤、甘味剤または香味剤を含む。組成物は、当該分野で用いた手法を用いることによって、患者への投与後に有効成分の迅速、保持または遅延放出を供するように処方することができる。また、処方は、蛋白質分解を減少させ、例えば、界面活性剤のごとき吸収を促進する物質を含有することもできる。
【００５８】
特異的用量は、患者の近似的体重または体表面積または占めるべき身体スペースの容量に従って計算される。該用量は選択された特定の投与経路に応じても計算される。治療用の適当な投与量を決定するのに必要な計算のさらなる工夫は当業者がルーチン的になすものである。そのような計算は、当業者による過度な実験なくして行うことができる。正確な投与量は標準的な用量−応答実験と組み合わせて決定される。現実に投与される組成物の量は、治療すべき疾患または疾患類、投与すべき組成物の選択、個々の患者の年齢、体重および応答、患者の兆候のひどさ、および選択された投与の経路を含めた関連状況に徴して、実行者によって決定されるであろう。用量の投与が、投与処方の薬物動態学パラメーターおよび用いる投与経路に応じて反復することができる。
【００５９】
また、本発明では、ＡＤＰを過剰発現するウイルスベクターで治療された患者を受動的に免疫化することも考えられる。受動的免疫化は、ウイルスベクター、または抗血清から単離されたガンマ−グロブリンまたはベクター−特異的精製ポリクローナルもしくはモノクローナル抗体に対して生起した抗血清を患者に投与することを含むことができる。好ましくは、ウイルスベクターが、腫瘍中で複製し、それを通って広がるのに十分な時間の後に患者を受動的に免疫化する。
【００６０】
本発明の好ましい具体例は、以下の実施例に記載される。特許請求の範囲内にある他の具体例は、本明細書中に開示した本発明の仕様または実施を考慮して当業者に明らかである。実施例と共に、明細書は例示的なものであると意図され、本発明の範囲および精神は実施例に続く請求の範囲によって示される。
【００６１】
実施例１
本実施例はＫＤ１およびＫＤ３抗癌ベクターの構築および特徴付けを説明する。
【００６２】
ＫＤ１を構築するため、本発明者らは、ユニークなプラスミドの全Ｅ３領域を欠失させ、後にクローニング用のユニークなＰａｃＩ部位のみが残された。出発プラスミドはｐＣＲＩＩであり、これは、全てのＥ３遺伝子の欠失を有するＡｄ５ ＢａｍＨＩＡ断片を含有し、Ｉｎｖｉｔｒｏｇｅｎから購入し；Ｅ３欠失は、その配列が、各々、配列番号：１および配列番号：４に与えられるＫＤ１およびＧＺ３についてのそれと同一である。Ａｄ５からのＡＤＰ遺伝子をＰａｃＩ部位にクローンし、次いで、ｄｌ０１／０７と命名されたＡｄ５ Ｅ１Ａ突然変異体のゲノムのＥ３領域に組み立てた。これは、ｄｌ０１／０７から得られた重複するＥｃｏＲＩＡ制限断片と共にＡＤＰ遺伝子を含有する前記したＢａｍＨＩＡ断片をヒト胚腎臓２９３細胞に共トランスフェクトすることによって成された。完全なウイルスゲノムが、プラスミド中のＢａｍＨＩＭ断片でおよびＥｃｏＲＩＡ断片中のＡｄ配列間の重複組換えによって細胞内に形成される。１２．５Ｋ蛋白質に対するＥ３遺伝子が出発プラスミドに保持された以外は、ＫＤ３は同様に構築された。かろうじてＡＤＰを過剰発現するＫＤ２と命名されたベクターも調製した。各組換えＡｄのプラークを拾い、スクリーニングし、精製し、ＣｓＣｌ−バンデッドストックに増殖させ、配列決定し、力価測定し、特徴付けた。ＧＺ１およびＧＺ３は、ＧＺ１およびＧＺ３がＡＤ５またはＡｄ５突然変異体ｄｌ３０９に見出される野生型Ｅ１Ａ配列を有する以外は、ＫＤ１およびＫＤ３と同一であるＡｄベクターである。Ａｄ５のＥｃｏＲＩＡ断片をＧＺ１およびＧＺ３で用いた以外は、ＧＺ１およびＧＺ３はＫＤ１およびＫＤ３で記載したごとく構築した。
【００６３】
これらの組換えベクターの１つの高力価（１ｍｌ当たり１−８×１０^１０プラーク形成単位［ＰＦＵ］）ウイルスストックで、または対照ウイルスｄｌ０１／０７、ｄｌ３０９、ｄｌ３２７およびＡｄ５（野生型）の１つでヒトＡ５４９肺癌腫細胞系を感染させることによって、ＫＤ１およびＫＤ３を特徴付けた。細胞当たり５０ＰＦＵを各ウイルスで用いた。これらのウイルスならびにこれらの実施例で用いたいくつかの他のウイルスの記載は表１に掲げる。
【００６４】
【表１】

【００６５】
ポリメラーゼ鎖反応（ＰＣＲ）−ベースのプロトコルを用い、Ａｄ５突然変異体ｄｌ３０９のＥ３領域中のＥ３−ｇｐ１９Ｋ蛋白質に対する遺伝子にイン・フレーム停止コドンを導入した（Ｊｏｎｅｓ ａｎｄ Ｓｈｅｎｋ，Ｃｅｌｌ １７：６８３−６８９，１９７９）。ＳｕｎＩ−ＢｓｔＩ １０７Ｉ断片、Ａｄ５ゲノム中のヌクレオチド２８，３９０ないし２９，０１２を用い、突然変異誘発を行い、次いで、これをｄｌ３０９中の同等断片に代えて置き換えた。ｄｌ０１／０７はＫＤ１おおびＫＤ３に対して親である。今度は、ｄｌ３０９と命名されたＡｄ５突然変異体はｄｌ０１／０７の親であり、すなわち、ｄｌ３０９がＥ１Ａ突然変異体を有しない以外はｄｌ３０９はｄｌ０１／０７と同一である。ｄｌ０１／０７およびｄｌ３０９は共にＥ３ ＲＩＤα、ＲＩＤβおよび１４．７Ｋ蛋白質に対する遺伝子の欠失を有するが、ＡＤＰに対する遺伝子を保有する。Ａｄ５突然変異体ｄｌ３２７は野生型Ｅ１Ａを有し、それはＡＤＰに対する遺伝子を欠き、それは１２．５Ｋ蛋白質に対するものを除いて全ての他のＥ３遺伝子を欠く。
【００６６】
感染後２４および３６時間において、蛋白質をＡ５４９細胞から抽出し、ＡＤＰに対するウサギ抗血清を用いる免疫ブロットにおいてＡＤＰにつき分析した（Ｔｏｌｌｅｆｓｏｎら，Ｊ．Ｖｉｒｏｌ．６６：３６３３−３６４２，１９９２）。結果を図２に示す。より多くのＡＤＰが、ｄｌ０１／０７で感染した細胞におけるよりもＫＤ１−およびＫＤ３−感染細胞において感染後２４時間および３６時間に検出された。また、ｄｌ３０９または他のウイルスよりもＧＺ１およびＧＺ３によって、より多くのＡＤＰが合成された。最も重要には、ＫＤ１、ＫＤ３、ＧＺ１およびＧＺ３は、ｄｌ０１／０７またはｄｌ３０９よりも感染後２４時間においてかなり多くのＡＤＰを発現した（図２）。この結果は、ＫＤ１、ＫＤ３、ＧＺ１またはＧＺ３で感染した細胞がより速く溶解し、これらのウイルスがｄｌ０１／０７またはｄｌ３０９よりも速く細胞間に広がるという後に議論する観察と合致する。ＫＤ１、ＫＤ３、ＧＺ１およびＧＺ３がＡｄ５突然変異体ｄｌ１５２０よりも感染後２４および３６時間においてかなり多くのＡＤＰを発現するのは注目に値する（図２）；ｄｌ１５２０はＯＮＹＸ−０１５に与えられた元来の名称である（Ｈｅｉｓｅら，Ｎａｔｕｒｅ Ｍｅｄｉｃｉｎｅ ３：６３９−６４５，１９９７）。予測されるごとく、ｐｍ７３４．１で感染した細胞（図２）、ＡＤＰにおいてアミノ酸１ないし４８を欠く突然変異体（Ｔｏｌｌｅｆｓｏｎら，Ｊ．Ｖｉｒｏｌ．７０：２２９６−２３０６，１９９６）においてＡＤＰは検出されなかった。ｄｌ０１／０７、ＫＤ１、ＫＤ２およびＫＤ３によるＥ１Ａ蛋白質の発現はＡｄ５、ｄｌ３０９またはｄｌ３２７によるよりもわずかに低く、ｄｌ０１／０７欠失から予測されるごとく、蛋白質はより小さかった（図３Ａ）。ｄｌ３２７はｄｌ３２４と同質遺伝子であり（Ｔｈｉｍｍａｐｐａｙａら，１９８２ Ｃｅｌｌ ３１：５４３−５１，１９８３）、それはＡＤＰおよび１２．５Ｋ蛋白質以外の全ての他のＥ３蛋白質に対する遺伝子を欠く。
【００６７】
ＫＤ１およびＫＤ３感染細胞で検出されたＡＤＰの量は、ｄｌ３０９感染細胞で検出された量よりも有意に高い（図２）。もしＥ１Ａ突然変異を持つウイルスが、後期蛋白質の遅れた出現によって証明されるごとく幾分遅く複製するという事実を考慮するならば（図３Ｂ）、ＫＤ１およびＫＤ３はｄｌ３０９よりも細胞に存在するウイルスゲノム当たりかなり多くのＡＤＰを発現することは明瞭である。この知見は、Ａ５４９細胞をＥ１Ａ突然変異を含有するウイルス、およびＡＤＰを欠くが野生型Ｅ１Ａを有するｄｌ３２７で共感染させた場合、後期蛋白質のより早い出現によって示されるごとく、Ｅ１Ａ突然変異体ウイルスの複製速度はスピードアップされるという事実によって支持される（図３Ｂおよび３Ｄを比較されたし）。かくして、ｄｌ３２７はＥ１Ａ突然変異を補充する。結論として、これらの実験は、ＡＤＰがＫＤ１、ＫＤ３、ＧＺ１およびＧＺ３によって劇的に過剰発現されることを示す。ＡＤＰはかろうじてＫＤ２によって過剰発現される（示さず）。
【００６８】
実施例２
本実施例は、ＫＤ１およびＫＤ３が他のアデノウイルスよりも迅速に細胞を溶解させ、より速く細胞間に広がることを示す。
【００６９】
細胞を溶解させるＫＤ１およびＫＤ３の能力は、Ｔｏｌｌｅｆｓｏｎら（Ｊ．Ｖｉｒｏｌ．７０：２２９６−２３０６，１９９６）によって実質的に記載されているごとく行ったトリパンブルー排除細胞生存率アッセイによって調べた。簡単に述べれば、Ａ５４９細胞を２０ＰＦＵ／細胞のＫＤ１、ＫＤ３、ｄｌ０１／０７、ｄｌ３２７またはｄｌ３０９でモック感染させるか、または感染させた。種々の感染後日数において、生きた細胞の数をヘモサイトメーターを用いて測定し（６００ないし１０００の細胞を時点当たりカウントした）、結果を図４に示す。
【００７０】
ＫＤ１およびＫＤ３と同一のＥ１Ａ突然変異を有する、ｄｌ０１／０７で感染した細胞の４４％と比較して、ＫＤ１−感染細胞の２５％およびＫＤ３−感染細胞の９％のみが感染後５日において生存した。また、ＫＤ１およびＫＤ３ベクターは、野生型Ｅ１Ａ領域を有するｄｌ３０９よりも速く細胞を溶解させた。ｄｌ３２７（ＡＤＰ⁻、ＥＩＡ^＋）で感染させると、細胞の９４％が５日後に生存した。細胞溶解を乳酸デヒドロゲナーゼの放出によって見積もると、ＫＤ１およびＫＤ３はｄｌ０１／０７およびｄｌ３０９よりも速く細胞をもう一度溶解させ、ｄｌ３２７はほとんど細胞溶解を引き起こさなかった（データは示さず）。かくして、ＡＤＰは効果的な細胞溶解に必要であり、ＡＤＰの過剰発現は細胞溶解の速度を増加させる。
【００７１】
細胞溶解を測定し、癌細胞におけるウイルス複製を調べるためのもう１つの手段として、Ａ５４９細胞の別々の群を２０ＰＦＵ／細胞のＫＤ１、ＫＤ３、ｄｌ０１／０７またはｄｌ３０９で感染させ、Ａ５４９細胞でのプラークアッセイによって、細胞内および細胞外ウイルスの量を測定した。感染後２日において、各群で形成されたウイルスの全量は同様であり（２−４×１０^８ＰＦＵ／ｍｌ）、これは、全てのウイルスの複製が同様であることを示す。しかしながら、細胞内ウイルスに対する細胞外ウイルスの比率を計算すると、ＫＤ１およびＫＤ３に対する値はＡｄ５、ｄｌ３０９またはｄｌ０１／０７に対するよりも２−３ｌｏｇ高かった（データは示さず）。かくして、野生型量のＡＤＰを発現するウイルスよりも、ＡＤＰを過剰発現する、ＫＤ１およびＫＤ３で感染させた細胞からウイルスがかなり速く放出される。
【００７２】
細胞間に広がるＫＤ１およびＫＤ３の能力は「細胞広がり」アッセイで測定した。このアッセイにおいて、４８ウェル培養皿中のＡ５４９細胞の単層を１０^−３、１０^−２、１０^−１、１０^０または１０ＰＦＵ／細胞のｄｌ３２７、ｄｌ３０９、Ａｄ５、ｄｌ０１／０７、ＫＤ１またはＫＤ３でモック感染または感染させた。低いＰＦＵ／細胞において、ウイルスは２または３ラウンドの複製を通過して、単層の各細胞を感染しなければならない。１．０および１０ＰＦＵ／細胞において、単層は、最初に細胞を感染したウイルスによって破壊されるべきである。感染後７日までに単層での広がりの量を評価するために、生きた細胞を染めるが死んだ細胞を染めないクリスタルバイオレットを単層に添加した。結果を図５に示す。
【００７３】
顕著には、感染後７日において、単層は１０^−３ＰＦＵ／細胞においてＫＤ１およびＫＤ３によって実質的に排除され、他方、１．０ＰＦＵ／細胞がｄｌ０１／０７、ｄｌ３０９およびＡｄ５で必要であった。この結果は、細胞溶解およびＡ５４９細胞におけるウイルス拡大を媒介するにおけるＡＤＰの能力を阻止する。また、この細胞広がりアッセイで測定して、ＫＤ１およびＫＤ３は、他のタイプのヒト癌細胞系（ほとんどは、Ａｍｅｒｉｃａｎ Ｔｙｐｅ Ｃｕｌｔｕｒｅ Ｃｏｌｌｅｃｔｉｏｎ［ＡＴＣＣ］から購入した）を殺すにおいてｄｌ０１／０７よりも効果的である。１０^−２ＰＦＵ／細胞におけるＫＤ１および／またはＫＤ３で殺傷したＨｅＬａ（頸癌）、ＤＵ１４５（前立腺）、およびｐＣ３（前立腺）細胞、１０^−１ＰＦＵ／細胞におけるＭＥ−１８０（頸部）およびＨｅｐ３Ｂ（肝臓）、および１０ＰＦＵ／細胞におけるＵ１１８（神経膠芽細胞腫）およびＵ３７３（神経膠芽細胞腫）。これらの細胞を殺すのに１０ないし１００倍多くのｄｌ０１／０７が必要であった（データは示さず）。これらの結果は、ＫＤ１およびＫＤ３が多くのタイプの癌に対して効果的であり得ることを示す。
【００７４】
ＡＤＰ過剰発現ベクターが非常に低い多重度の感染において細胞を溶解するという知見の重要な態様は、ヒト腫瘍における感染の多重度が、ベクター注入の見地に対して末端側、または腫瘍へベクターを運ぶ血管に対して末端側にある部位において低いようであるということである。かくして、ＡＤＰ過剰発現ベクターは、ＡＤＰをより少量またはＡＤＰを全く発現しないベクターよりも優れた利点を有する。
【００７５】
実施例３
本実施例は、ＫＤ１およびＫＤ３が増殖しない非癌性細胞で貧弱にしか複製しないことを示す。ＫＤ１およびＫＤ３の複製表現型は、「正常」ＨＥＬ−２９９ヒト繊維芽細胞（１０％血清中で増殖するものまたは０．１％血清を用いて休止としたもの）を用いて評価した。全てのＡｄは増殖する細胞中でよく複製するはずであるが、ｄｌ０１／０７ Ｅ１Ａ突然変異を持つウイルスは休止細胞において貧弱にしか複製しない。何故ならば、Ｇ_０からそれを出すのにＥ１Ａが必要だからである。野生型Ｅ１Ａを有するｄｌ３０９は、増殖するおよび増殖阻止細胞双方においてよく複製するはずである。
【００７６】
細胞は１００ＰＦＵ／細胞のＫＤ１、ＫＤ３、ｄｌ０１／０７またはｄｌ３０９で感染させた。異なる感染後日数において、ウイルスを抽出し、力価測定した。１０％血清において、ＫＤ１、ＫＤ３およびｄｌ０１／０７はよく複製し、１０^６−１０^７ＰＦＵ／ｍｌの力価に到達し、これはｄｌ３０９よりもわずかに低いだけであった（図６）。しかしながら、休止細胞において、ＫＤ１、ＫＤ３およびｄｌ０１／０７の複製は増殖細胞におけるよりも１．５〜２ｌｏｇ低く、１０^４ないし２×１０^５ＰＦＵ／ｍｌの範囲であった。ｄｌ３０９の力価は増殖する細胞で達成されたレベル近くの１０^７ＰＦＵ／ｍｌに到達した。感染後１０日において、１００ＰＦＵ／細胞のＫＤ１、ＫＤ３またはｄｌ０１／０７で感染させた休止ＨＥＬ−２９９細胞単層は無傷であり、他方、野生型Ｅ１Ａを有するｄｌ３０９またはｄｌ３２７で感染させたものは、細胞死滅を示す強力な典型的Ａｄ細胞障害効果を示した（データは示さず）。かくして、ＫＤ１およびＫＤ３の複製は増殖する細胞系に厳格に制限される。
【００７７】
ｄｌ０１／０７ Ｅ１Ａ突然変異に関連した制限は、単層として増殖する初代ヒト細胞（Ｃｌｏｎｅｔｉｃｓから購入した）でテストした。気管支上皮細胞（図７）および小さな気道上皮細胞は感染後５日において１０ＰＦＵ／細胞のＫＤ１、ＫＤ３またはｄｌ０１／０７によって殺されず、他方、それらは１０ＰＦＵ／細胞のｄｌ３０９またはｄｌ３２７によって殺された（データは示さず）。肺内皮細胞は１０日後に１０ＰＦＵ／細胞のＫＤ１、ＫＤ３またはｄｌ０１／０７によって殺されなかったが、それらは１ＰＦＵ／細胞のｄｌ３０９によって殺された。最初に感染させると、これらの単層は密集下であり、次いで、密集するまで増殖した。ここでの刺激の結果は、これらの初代細胞は増殖しつつあったが、それらはこの時点のフレームにおいて複製を支持せず、ＫＤ１またはＫＤ３によって殺されなかったことである。かくして、これらのベクターは癌性細胞に制限され、身体中で正常に分裂する基底細胞のごとき細胞に対してほとんどまたは全く効果を有しないと考えられる。加えて、ＫＤ１およびＫＤ３は、そのような細胞はＡｄによって貧弱にしか感染されないので分裂する白血球に影響するようではない。
【００７８】
まとめると、前記実験は、ＫＤ１およびＫＤ３は癌細胞を溶解させ、細胞間に迅速に拡大し、休止および非癌性細胞において貧弱にしか複製しないことを示す。これらの特性はそれらを抗癌療法において有用なものとするはずである。
【００７９】
実施例４
本実施例は、ＫＤ１およびＫＤ３が動物モデルにおいてヒト腫瘍の増殖を阻害することを示す。
【００８０】
本発明者らは、正常なマウスまたはラットにおいてマウスまたはラットの腫瘍を評価することができなかった。何故ならば、それらは全体的に非許容性であるからである。ヌードマウスにおいて増殖しつつあるヒト癌細胞系は、Ｏｎｙｘ Ｐｈａｒｍａｃｅｕｔｉｃａｌｓ （Ｒｉｃｈｍｏｎｄ，ＣＡ）によって用いられて、ＯＮＹＸ−０１５、Ｅ１Ｂ ５５ｋＤａ蛋白質の発現を欠くＡｄベクターの有効性を評価した（Ｈｅｉｓｅら，Ｎａｔｕｒｅ Ｍｄｅ．３：６３９−６４５，１９９７）。本発明者らは、我々の細胞培養実験の多くで用いたＡ５４９細胞が、ヌードマウスに皮下注射した場合に、優れた、迅速に増殖する固体腫瘍を形成することを見い出した。平均腫瘍は４週間のうちに約５００μｌに到達し、カプセル化され、血管形成され、マウスの皮膚（通常）または筋肉に付着した。
【００８１】
ヌードマウスを２×１０^７Ａ５４９細胞で各後側腹部に接種した。１週間後、腫瘍が形成され、約２０μｌないし５０μｌのサイズ範囲であった。個々の腫瘍を、３×１０^８ＰＦＵの腫瘍当たりの合計ウイルス用量にて、５０μｌの緩衝液または５×１０^７ＰＦＵのｄｌ３０９、ｄｌ０１／０７、ＫＤ１、ＫＤ３またはｐｍ７３４．１を含有する５０μｌの緩衝液を、３日後に、および４週間引き続いての週に注入した（合計５つの注入）。突然変異体ｐｍ７３４．１はＡＤＰに対する遺伝子において２つのナンセンス突然変異のためＡＤＰ活性を欠くが、全ての他のＡｄ蛋白質は野生型レベルで合成されると予測される（Ｔｏｌｌｅｆｓｏｎら，Ｊ．Ｖｉｒｏｌ．７０：２２９６−２３０６，１９９６）。各ウイルス（または緩衝液）の効果を６つの腫瘍についてテストした。週間隔にて、Ｍｉｔｕｔｏｙｏデジタルカリパーを用い、腫瘍の長さ（Ｌ）および幅（Ｗ）を測定した。腫瘍の容量は、Ｌ×Ｗ×Ｗ／２を乗じることによって計算した。この値を初期ウイルス注入の時点における腫瘍容量で割り、腫瘍増殖の倍増加を計算し、６つの腫瘍についての平均をグラフ化した。
【００８２】
図８Ａに示すごとく、緩衝液を接種した腫瘍は増殖し続け、５週間までに約１４倍増加した。対照的に、正常な量のＡＤＰを発現し、Ｅ３ ＲＩＤおよび１４．７Ｋおよび蛋白質を欠くｄｌ３０９を注入した腫瘍は、５週間まで約２．５倍増殖したに過ぎなかった。ＡＤＰを欠くｐｍ７３４．１では、腫瘍ならびに緩衝液を摂取したものは増殖した。かくして、ｄｌ３０９は腫瘍の増殖速度を顕著に減少させ、ＡＤＰはこの減少に必要である。ｄｌ０１／０７を接種した腫瘍は５週間にわたって約８倍増殖した。ｄｌ０１／０７はＥ１Ａ突然変異を除いてｄｌ３０９と同一であるので、この結果は、Ｅ１Ａ突然変異が、腫瘍の増殖を妨げるＡｄの能力を有意に低下させることを示す。この効果は、恐らくは、より低いＡＤＰ発現をもたらす腫瘍におけるウイルス複製の低下によるものであるが、それは腫瘍細胞におけるＥ１Ａの他の特性、例えば、突然変異体Ｅ１Ａ蛋白質がアポトーシスを誘導できないことも反映できた。最も重要には、ＫＤ１またはＫＤ３を接種した腫瘍は約２．５倍増殖したに過ぎなかった。かくして、ＫＤ１およびＫＤ３によるＡＤＰの過剰発現は、ＫＤ１およびＫＤ３がｄｌ０１／０７（その親対照ウイルス）よりも顕著に遅い速度まで、およびｄｌ３０９のそれと同様の速度までさえ腫瘍の増殖を低下させるようにする。
【００８３】
ＫＤ１およびＫＤ３は癌細胞に制限されるが、野生型Ａｄはそのような制限を有しない故に、ＫＤ１およびＫＤ３はＡ５４９腫瘍増殖の速度を低下させるにおいて野生型Ａｄ（すなわち、ｄｌ３０９）と同程度効果的であるという知見は癌の治療の意味においてかなり有意義である。
【００８４】
ベクターの５回の注入を摂取したが、ベクターの１用量（この場合、５×１０^８の各ＫＤ３またはＧＺ３）を摂取したに過ぎない図８Ａにおける腫瘍は、Ａ５４９腫瘍増殖の速度を有意に低下させるのに十分である（図８Ｂ）。
【００８５】
本発明者らは、ＫＤ１およびＫＤ３がヒト肝臓癌細胞系、Ｈｅｐ３Ｂ細胞のヌードマウスにおける増殖速度を低下させることも見い出した。これらの細胞は、かなり血管形成される迅速に増殖する腫瘍を形成する。ヌードマウスに１×１０^７のＨｅｐ３Ｂ細胞を各後側腹部に接種した。腫瘍が約１００μｌに到達した後、それらを５０μｌの緩衝液または５×１０^７ＰＦＵのＫＤ１、ＫＤ３またはｄｌ３０９を３週間の間１週間当たり２回注入した。典型的には、テストウイルス当たり８〜１０の腫瘍があった。腫瘍のサイズを測定し、初期ウイルス注入後０ないし３．５におけるサイズの倍増加をＡ５４９腫瘍につき前記したごとくグラフ化した。緩衝液単独を摂取した腫瘍は３週間にわたって９倍増殖し、突出して３．５週間にわたって約１２倍増殖した（３週間後、マウスは犠牲にしなければならなかった。何故ならば腫瘍が余りにも大きくなりつつあったからである）（図９）。ＫＤ１またはＫＤ３を摂取した腫瘍は約４倍増殖し、ＫＤ１およびＫＤ３がヌードマウスにおいてＨｅｐ３Ｂ腫瘍の増殖を低下させることが確立された。ｄｌ３０９を注入した腫瘍は２倍増殖した（図９）。ＫＤ１およびＫＤ３がｄｌ３０９よりも幾分効果的でないという知見は、培養における細胞広がりアッセイにおいて示されるごとく（データは示さず）、恐らくは、それら、ならびにＨｅｐ３Ｂ細胞においてｄｌ３０９が増殖しないという事実による。いずれの場合においても、重要な点は、ＫＤ１およびＫＤ２がＨｅｐ３Ｂ腫瘍に対して効果的であり、それらがそれらの複製を癌細胞に制限するＥ１Ａ突然変異を含有することである。
【００８６】
これらの結果は、Ａｄベクターにおいて発現される場合、抗腫瘍剤としてのＡＤＰの能力を示す。ＫＤ１およびＫＤ３は、ヒトで増殖する腫瘍を感染させるのに用いた場合にかなりの臨床的利点を高い確率で提供するであろう。
【００８７】
実施例５
本実施例は、ＫＤ１またはＫＤ３と組み合わせた複製−血管Ａｄベクターの使用を説明する。
【００８８】
複製−コンピテント（ＲＣ）ウイルスが複製−血管（ＲＤ）突然変異体を補充することはよく確立されている。すなわち、同一細胞を感染させた場合、コンピテントウイルスは突然変異体ゲノムから作成することができない蛋白質を供給し、両者のウイルスは増殖するであろう。ＲＤウイルスを補充するＫＤ１およびＫＤ３の能力をテストするために、β−ガラクトシダーゼを発現する２つのＲＤベクターを構築した。Ａｄ−β−ｇａｌと命名された最初のものは、欠失したＥ１領域に代えて置き換えられたラウス肉腫ウイルスプロモーターの制御下にあるβ−ｇａｌをコードするｃＤＮＡを有する。Ａｄ−β−ｇａｌはＡＤＰに対する遺伝子を含めた、欠失されたＥ３領域を有する。Ａｄ−β−ｇａｌ／ＦａｓＬと命名された第２のものは、それがヒト・サイトメガロウイルスプロモーター／エンハンサーからのネズミＦａｓＬを発現する以外はＡｄ−β−ｇａｌと同一である。これらのベクターは、Ａｄ Ｅ１ＡおよびＥ１Ｂ遺伝子を構成的に発現し、Ｅ１−マイナスベクターの複製を補充するヒト２９３細胞における重複組換えによって構築した。
【００８９】
これらのＲＤベクターはＡ５４９細胞においてβ−ｇａｌを感染させ、それを発現するはずであるが、複製しないはずである。何故ならば、Ｅ１Ａ蛋白質が欠けているからである。しかしながら、細胞をＲＣ Ａｄで共感染させた場合には該ベクターは複製するはずである。これを証明するために、Ａ５４９細胞を、１０ＰＦＵ／細胞のＡｄ−β−ｇａｌ単独で、または１０ＰＦＵ／細胞のＡｄ−β−ｇａｌ＋１０ＰＦＵ／細胞のＫＤ１、ＫＤ３、ｄｌ０１／０７、ｄｌ３０９またはｄｌ３２７で感染させた。感染後２日において、ウイルスを抽出し、Ａ５４９細胞におけるβ−ｇａｌ発現によってＡｄ−β−ｇａｌ力価を測定した。収率は以下の表２に示す。
【００９０】
【表２】

【００９１】
表２におけるベータは、補充ウイルスがＡｄ−β−ｇａｌの収率を１０^３だけ増加させたことを示す。
【００９２】
ＫＤ１およびＫＤ３の鍵となる特徴は、それらが他のＡｄよりも速く細胞間に広がることである。従って、それらはＡｄ−β−ｇａｌの広がりを補充するはずである。これをテストするために、感染中心アッセイを行った。Ａ５４９細胞をＡｄ−β−ｇａｌ＋ＫＤ１、ＫＤ３またはｄｌ０１／０７で感染させた。２時間後、細胞を収集し、希釈し、新鮮なＡ５４９細胞の単層に接種した。４日後、細胞をＸ−ｇａｌで染色し、結果を図１０に示す。
【００９３】
Ａｄ−β−ｇａｌ単独では、元来感染された細胞（接種前）のみが染色されるはずであり、ベクターは接種した単層上の他の細胞まで広がるはずがない。これは事実当てはまった。Ａ５４９を接種した単層において、Ａｄ−β−ｇａｌ単独で感染した細胞（図１０Ａの頂部左側に示す皿）は、多数の個々の青色細胞（印刷中に見えない）を含有した；その例を拡大した図１０Ｂに示す。しかしながら、該単層にＡｄ−β−ｇａｌおよびＫＤ１またはＫＤ３を共感染したＡ５４９細胞を接種した場合、青色細胞の多数の「コメット」があった（図１０Ａ）。各コメットは、１つの最初に−感染された細胞から広がったＡｄ−β−ｇａｌを表す。コメット内の細胞のほとんどはＸ−ｇａｌで染色された（図１０Ｃ）。また、ｄｌ０１／０７でコメットが観察されたが、ＫＤ１およびＫＤ３の程度までではなかった（図１０Ａ）。ｄｌ３２７（ＡＤＰ⁻）では、元来感染した細胞からの広がりはほとんどなかった（データは示さず）。要約すると、ＫＤ１およびＫＤ３はＡｄ−β−ｇａｌの複製を補充するのみならず、それらはその迅速な広がりを増強する。
【００９４】
ＫＤ１およびＫＤ３は抗癌治療遺伝子産物を発現するＲＤベクターの広がりを補充し、それを増強すると予測され、この予測は、複製および前記した感染中心アッセイでＡｄ−β−ｇａｌ／ＦａｓＬを用いて容易に証明することができる。
【００９５】
ＫＤ１およびＫＤ３は細胞培養においてＲＤベクターの複製を補充するのみならず、それらはヌードマウスの後側腹部で増殖するＨｅｐ３Ｂ腫瘍においてもそうする。使用したＲＤベクターはＡｄＬｕｃ（Ｅ１およびＥ３領域を欠くＡｄ）であり、ホタル・ルシフェラーゼ遺伝子がラウス肉腫ウイルスプロモーターから発現される発現カセットをＥ１領域に挿入する（Ｈａｒｒｏｄら，Ｈｕｍａｎ Ｇｅｎｅ Ｔｈｅｒａｐｙ ９：１８８５−１８９８，１９９８）。Ｈｅｐ３Ｂ腫瘍に１×１０^７ＰＦＵのＡｄＬｕｃ＋緩衝液、または１×１０^７ＰＦＵのＡｄＬｕｃ＋５×１０^７ＰＦＵのＫＤ１、ＫＤ３、ｄｌ０１／０７またはｄｌ３０９を注射した。２週間後、マウスを犠牲にし、腫瘍を切り出した。蛋白質を腫瘍から抽出し、ルミノメーターを用いてルシフェラーゼ活性を測定した。腫瘍当たりのルシフェラーゼカウントはＡｄＬｕｃ＋緩衝液では６，８００であり、ＫＤ１では１１３，５００であり、ＫＤ３では１４６，９００であった（図１１）。かくして、ＫＤ３およびＫＤ１は、各々、ルシフェラーゼ活性の２２倍および１７倍増加を引き起こした。この増加は、最初に共感染されたＡｄＬｕｃおよびＫＤ１またはＫＤ３である細胞におけるルシフェラーゼの上昇した合成によるものであり、それはＫＤ１またはＫＤ３によって媒介される腫瘍における細胞間のＡｄＬｕｃの広がりのためであった。
【００９６】
まとめると、抗癌遺伝子産物を発現するＲＤベクターと共に本発明による複製−コンピテントＡＤＰ−過剰発現ベクターでの腫瘍の感染は、腫瘍で合成される抗癌蛋白質の量を大いに増加させるはずであり、それにより、腫瘍の破壊を促進する複製−血管ベクターの能力を増加させる。
【００９７】
実施例６
本実施例は、癌性タイプＩＩ肺胞細胞に複製−制限された本発明による組換えＡｄベクターの構築および特徴付けを説明する。
【００９８】
前記で示したごとく、ＫＤ１およびＫＤ３におけるｄｌ０１／０７突然変異がこれらのベクターの増殖を癌細胞に制限する。その複製表現型をさらに制限するために、各ウイルスにおけるＥ４プロモーターを欠失し、サーファクタント蛋白質Ｂ（ＳＰＢ）プロモーターによって置き換えて、ＫＤ１−ＳＰＢ（配列番号：１４）、ＫＤ３−ＳＰＢ（配列番号：１５）およびｄｌ０１／０７−ＳＰＢ（配列番号：１６）と命名されたベクターを得た。これらのＳＰＢプロモーターは、かくしてヒト肺のＩＩ型肺胞細胞で主として見い出されているＴＴＦ１転写因子を含有する細胞でのみ活性である（Ｌａｚｚａｒｏら，Ｄｅｖｅｌｏｐｍｅｎｔ １１３：１０９３−１１０４，１９９１）。かくして、ＫＤ１−ＳＰＢ、ＫＤ３−ＳＰＢおよびｄｌ０１／０７−ＳＰＢは、ヒト肺の癌性ＩＩ型肺胞細胞にひどく制限されるべきである。多くの肺癌はこのタイプのものである。
【００９９】
ＫＤ１−ＳＰＢおよびＫＤ３−ＳＰＢベクターは以下のごとく調製した。Ｅ４プロモーターはＡｄゲノムの右側端部に位置する（図１）。ＢａｍＨＩ部位（５９マップ単位）からゲノムの右側端部のＡｄ５ ＤＮＡ配列を含有するｐＣＲＩＩ−ベースのプラスミド（Ｉｎｖｉｔｒｏｇｅｎ）を用い、かつＰＣＲ−ベースのプロトコルを用い、ほとんど全ての転写因子結合部位をＥ４プロモーターＡｄ５塩基対３５，６２３ないし３５，７７５から欠失し、ＳＰＢプロモーターを含有する５００塩基対断片で置き換えた（Ｙａｎら，Ｊ．Ｂｉｏｌ．Ｃｈｅｍ．２７０：２４８５２−２４８５７，１９９５）。最終プラスミドは、ウイルスｄｌ０１／０７−ＳＰＢ、ＫＤ１−ＳＰＢ、およびＫＤ３−ＳＰＢにつき、Ｅ４領域およびＥ３領域のｄｌ０１／０７、ＫＤ１またはＫＤ３バージョンにＥ４−ＳＰＢ置換を含む。これらのプラスミドを、ｄｌ０１／０７のゲノムの左側部分を含有する断片で２９３細胞に共トランスフェクトし、プラークを生成させた。プラークを予測される特徴につきスクリーニングし、精製し、次いで、増殖させてストックした。
【０１００】
Ａ５４９−ＴＴＦ１細胞系を発生させて、ｄｌ０１／０７−ＳＰＢ、ＫＤ１−ＳＰＢおよびＫＤ３−ＳＰＢの複製がＴＴＦ１転写因子を発現する癌性細胞に制限されるであろうという予測をテストした。これらの細胞を２つのプラスミドで共トランスフェクトした（１つは、ＴＴＦ１がＣＭＶプロモーターから発現されるものであり、ネオマイシン耐性クローンに対する抵抗性につきコードするもう１つは単離され、サーファクタント蛋白質Ｃプロモーターを要求するＴＴＦ１からのクロラムフェニコールアセチルトランスフェラーゼを発現するプラスミドでの一過性トランスフェクションによって判断してＴＴＦ１活性を発現することが示されている）。
【０１０１】
ＫＤ１−ＳＰＢおよびＫＤ１を、Ａ５４９−ＴＴＦ１細胞および親Ａ５４９細胞についての標準的なプラーク発生アッセイに付した。結果を図１２に示す。Ａ５４９細胞上のＫＤ１−ＳＰＢでは、プラークは８日後には目に見えず、１０日後にはプラークの最終数の約４％のみが観察され、１２日後には最終プラークの約５０％が観察された。Ａ５４９−ＴＴＦ１細胞上のＫＤ１−ＳＰＢでは、プラークは６日後に目に見え、１０日後にはプラークの約６０％が観察された。かくして、予測されるごとく、ＫＤ１−ＳＰＢは、ＴＴＦ１を含有する細胞でかなり速く増殖した。ＫＤ１はＡ５４９およびＡ５４９−ＴＴＦ１細胞双方でＫＤ１−ＳＰＢよりも迅速にプラークを形成し、これは、Ｅ４プロモーター−ＳＰＢ置換がＡｄ複製を誘導するにおいて野生型Ｅ４プロモーターと同程度には効果的でないことを示す。しかしながら、Ａ５４９−ＴＴＦ１細胞上のＫＤ１−ＳＰＢおよびＫＤ１の間のこの差異は許容され、ＫＤ１−ＳＰＢは約１日だけ遅延する。奇妙なことには、１６日までに全てのウイルスストックにつき得られた最終力価は同様であり、Ａ５４９細胞は非常に少量の内因性ＴＴＦ１活性を含有できることを示す。ＫＤ３−ＳＰＢおよびｄｌ０１／０７−ＳＰＢは、Ａ５４９−ＴＴＦ１細胞およびＡ５４９細胞で増殖させるとＫＤ１−ＳＰＢと同様に挙動するであろうと予測される。
【０１０２】
ＫＤ１−ＳＰＢのＴＴＦ１を含有する細胞への制限を、さらに、Ｈ４４１細胞、ＴＴＦ１−発現ヒト肺腺癌細胞系（Ｙａｎら，前掲）、およびＨｅｐ３Ｂ細胞、ＴＴＦ１を発現すると予測されない肺癌細胞系を用いて細胞拡大アッセイで調べた。Ｈ４４１またはＨｅｐ３Ｂ細胞を含有する培養皿ウェルを、１０ないし１０^−４ＰＦＵ／細胞の範囲の多重度にてＫＤ１−ＳＰＢまたはＫＤ１で感染させた。Ｈ４４１およびＨｅｐ３Ｂ細胞を、各々、感染後５日および８日においてクリスタルバイオレットで染色した。ＫＤ１−ＳＰＢおよびＫＤ１はＨ４４１細胞上で等しくよく増殖し、広がり、細胞当たり１０^−１ＰＦＵにおいて単層の破壊を引き起こした（図１３）。（Ｈ４４１単層のいくらかは、細胞当たり１０^−２ＰＦＵにおいてＫＤ１−ＳＰＢを含むウェルにおいて、および細胞当たり１０^−４ＰＦＵのＫＤ１およびＫＤ１−ＳＰＢを含むウェルにおいてでよくはがれた；これは、場合によって、細胞広がりアッセイで起こり、それはウイルス感染を反映しない）。Ｈｅｐ３Ｂ細胞では、ＫＤ１はＫＤ１−ＳＰＢよりもかなり良好に増殖し、広がり、ＫＤ１の細胞当たり１０^−２ＰＦＵでは、ＫＤ１−ＳＰＢの細胞当たり１．０ＰＦＵとして単層のより多い破壊を引き起こす（図１３）。
【０１０３】
要約すると、本実施例は、適当な転写因子を発現する細胞上でよく複製する複製−コンピテントＡｄが、Ｅ４プロモーターの代わりに置き換えられた組織−特異的プロモーターで構築することができるのを示す。この方法は多くの他の組織特異的および細胞型特異的プロモーターに適用できるはずである。１つの可能性は肝臓−特異的プロモーターであろう。プロモーターは遊離Ｅ２Ｆを有する癌細胞のごとき細胞でのみ活性である故に、もう１つの可能性はＥ２Ｆプロモーター、またはＥ２Ｆ部位を持つもう１つのプロモーターを使用することであろう。第３の可能性は調節可能なプロモーター、合成テトラサイクリン応答プロモーター（Ｍａｓｓｉｅら，Ｊ．Ｖｉｒｏｌ．７２：２２８９−２２９６，１９９８）を用いることであり、ここに、プロモーターの活性は患者におけるテトラサイクリンまたはテトラサイクリンアナログのレベルによって制御される。
【０１０４】
実施例７
本実施例は、ＡＤＰを過剰発現し、複製制限されないベクターの構築および特徴づけを説明する。
【０１０５】
前記したごとく、ＫＤ１およびＫＤ３におけるｄｌ０１／０７ Ｅ１Ａ突然変異は減衰し、非分裂および分裂初代ヒト上皮および内皮細胞において増殖を阻害する。この突然変異を持つＡｄは分裂癌細胞においてよく複製することができる。しかしながら、そのようなＥ１Ａ突然変異体の複製は、例えば、野生型Ｅ１Ａ遺伝子を有するｄｌ３０９と同程度には効果的ではない。例えば、プラークが発生する速度によって測定して、ｄｌ０１／０７の複製の速度は、ｄｌ０１／０７プラークがｄｌ３０９のものよりも１日遅く出現するように低下する（データは示さず）。この遅延は、部分的にはＡｄ後期遺伝子の発現における遅延による（図１３参照）。ｄｌ０１／０７突然変異がＡ５４９細胞において複製の速度を遅延させるという考えは、図８Ａ中のデータによってさらに支持され、ここに、ｄｌ０１／０７は腫瘍増殖をほとんど阻害せず、同様にｄｌ３０９もそうであった。ｄｌ０１／０７ Ｅ１Ａ突然変異のこの負の効果にかかわらず、議論したごとく、ＫＤ１およびＫＤ３ベクターにこの突然変異を有する理論的および実践的態様がある。それにもかかわらず、容易にシナリオ（例えば末期癌を持つ患者）を容易に描くことができ、ここに腫瘍を破壊するＡｄベクターの能力は、ベクターが腫瘍細胞に全く制限されるという要件に取って代わる。そのような場合、野生型Ｅ１Ａ遺伝子を持つ以外はＫＤ１およびＫＤ３と同様のベクターを有するのが有利であろう。そのようなベクターがその遺伝子を発現し、細胞を溶解し、細胞間に広がる速度はＫＤ１およびＫＤ３のそれよりも高いはずである。そのようなベクターは非癌性細胞および組織に対するいくらかの損傷を引き起こすが、これは、外科手術、化学療法および放射線照射療法のごとき抗癌治療の他の様式でも当てはまる。
【０１０６】
これらの考慮に徴すると、野生型Ｅ１Ａ領域を有する以外は、各々、ＫＤ１およびＫＤ３と同一であるＧＺ１およびおよびＧＺ３と命名されたベクターが構築された。これらのベクターは、Ａ５４９細胞において重複組換えによって構築された。左側の断片はＡｄ５の野生型Ｅ１Ａ領域を含有し、右側端部断片はＫＤ１またはＫＤ３のＥ３修飾を含有した。プラークを拾い、予測される遺伝子型について分析し、プラーク精製し、増殖させてＣｓＣｌ−バンデットストックとした。Ａ５４９細胞上のこれらのストックの力価はＧＺ１では２．９×１０^１０ＰＦＵ／ｍｌであり、ＧＺ３では１．６×１０^１１ＰＦＵ／ｍｌであった。かくして、これらのベクターは、野生型Ａｄに匹敵する高力価ストックに増殖させることができる。ＧＺ１およびＧＺ３プラークはより大きく、ｄｌ３０９についてのプラークよりもかなり早く出現する。大きな迅速に出現するプラークは、細胞を溶解し、細胞間に広がるＡｄの能力を反映し（Ｔｏｌｌｅｆｓｏｎら，Ｊ．Ｖｉｒｏｌ．７０：２２９６−２３０６，１９９６；Ｔｏｌｌｅｆｓｏｎら，Ｖｉｒｏｌｏｇｙ ２２０：１５２−１６２，１９９６）、議論したこの特性はＡＤＰの機能によるものである。
【０１０７】
プラーク出現の率はプラーク発生アッセイで定量することができる（Ｔｏｌｌｅｆｓｏｎら，前掲）。ここに、典型的なプラークアッセイを行い、アッセイの翌日に観察されたプラークを、プラークアッセイの最後に観察されたプラークの数のパーセンテージとして計算する。図１４に示されるごとく、Ａ５４９細胞でのプラークアッセイの４日後に、ＧＺ１およびＧＺ３はプラークの最終数の、各々、４８％および３４％を有し、他方、ｄｌ３０９は１％を有したに過ぎなかった。ただ４日後に出現するのはプラークについてのＡ５４９細胞でのＡｄプラークアッセイでは非常に異常である。これらの大きなプラークはＡＤＰの過剰発現を反映する。これらのＧＺ１およびＧＺ３プラークはＫＤ１およびＫＤ３のものよりも早く出現する（データは示さず）。何故ならば、疑いなく、ＧＺ１およびＧＺ３は野生型Ｅ１Ａ領域を有するのでより速く複製するからである。
【０１０８】
ＧＺ１およびＧＺ３は細胞を溶解させ、ｄｌ３０９よりもかなり効果的に細胞間に広がる。Ａ５４９細胞の感染後６日において、細胞当たり１０^−１ＰＦＵにおいてｄｌ３０９で観察されたのとほぼ同様に多くの単層破壊が細胞当たり１０^−３ＰＦＵにおいてＧＺ１およびＧＺ３で観察された（図１５、頂部パネル）。この結果は、さらに、ＡＤＰの過剰発現が細胞溶解およびウイルス広がりを促進するという結論を過小評価する。
【０１０９】
理論的には、ＧＺ１およびＧＺ３は腫瘍細胞のみならず正常細胞において複製することができるはずである。それらは正常細胞で複製できるが、ＧＺ１およびＧＺ３は抗癌ベクターとして有用である可能性が高い。まず、ＧＺ１およびＧＺ３は腫瘍に直接注入することができた。多くの腫瘍は血液供給を除いて自己含有性である（カプセル化されている）。腫瘍の物理的障害はウイルスの他の組織への蒔種を最小化できる。第２に、Ａｄは一般にかなり良性である。Ａｄ５のほとんどの感染は幼児におけるものであり、その結果、穏やかなまたは無兆候病気となり、強力な液性および細胞性免疫によってチェックされる。抗Ａｄ免疫性は生涯続くようである。ＧＺ１およびＧＺ３は無傷免疫系を有し、恐らくは予め存在する抗Ａｄ免疫性をも持つ患者においてのみ用いることができる。さらに、ガンマ−グロブリンまたは特異的精製抗Ａｄ中和抗体を用い、患者をＡｄに対して受動的に免疫化することができる。第３に、Ａｄ５が、特異的Ａｄ５受容体（ＣＡＲと命名）ならびに特異的インテグリン（例えば、ａ_ｖｂ５）を呈する肺上皮細胞に最も効果的に感染する呼吸器系ウイルスであることを考慮し、Ａｄ５に由来する複製−コンピテントベクターは身体の多くの非癌組織で効果的に広がることができない。加えて、腫瘍−特異的、組織−特異的、細胞−特異的、または合成プロモーターで置換されたＥ４プロモーターを有するＧＺ１およびＧＺ３のバージョンを構築することができると考えられる。そのようなベクターは野生型Ｅ１ＡおよびＡＤＰに関連する陽性特徴を有するが、腫瘍組織および／または特定の細胞型に複製が制限される。
【０１１０】
実施例８
本実施例は、ＫＤ１、ＫＤ３、ＧＺ１またはＧＺ３と放射線照射との組合せが、ベクター単独または放射線照射単独よりも、培養で増殖する、またはヌードマウスにおいて腫瘍として増殖するＡ５４９細胞を破壊するにおいてより効果的であることを説明する。
【０１１１】
これは細胞広がりアッセイで示された。３つの４８ウェル培養皿中で増殖するＡ５４９細胞を、図１５に示されるごとく、細胞当たり１０ないし１０^−４ＰＦＵの範囲の感染の多重度にて異なるウイルスでモック感染または感染させた。１つの皿は照射しなかった。第２の皿は感染後２４時間において６００セントリグレイ（ｃＧｙ）を摂取し、第３の皿は同時に２０００ｃＧｙの放射線照射を摂取した。全ての皿を感染後６日においてクリスタルバイオレットで染色した。照射されなかった細胞では（図１５において頂部パネル）、ＫＤ１およびＫＤ３はそれらの親対照ｄｌ０１／０７よりもより低い感染の多重度において単層破壊を引き起こした。これは、それらの親対照ｄｌ３０９と比較してＧＺ１およびＧＺ３についての当てはまる。（細胞当たり１０^−４ＰＦＵにおいてＧＺ１またはＧＺ３で感染させた細胞における細胞の不足は実験的な人工物であり、ＧＺ１またはＧＺ３による感染によって引き起こされない）。これらのＫＤ１、ＫＤ３、ＧＺ１およびＧＺ３の結果は初期の結果と合致し、ＡＤＰの過剰発現は増大した細胞溶解およびウイルス広がりに至ることを示す。
【０１１２】
感染させ、次いで、６００ｃＧｙで照射した皿では、非照射細胞と比較して顕著に増大した細胞殺傷およびウイルス拡大があった（図１５の底部パネルを頂部パネルと比較されたし）。例えば、ＫＤ１、ＫＤ３、ＧＺ１およびＧＺ３では、細胞当たり１０^−２ＰＦＵにおける非照射ウェル中におけるように、細胞当たり１０^−４ＰＦＵにおいて照射ウェルでほぼ同一量の細胞破壊があった。同様の結果が、２０００ｃＧｙの放射線照射を受けた皿で観察され（データは示さず）、および感染に２４時間先立って６００または２０００ｃＧｙの放射線照射を受けた皿でも観察された（データは示さず）。
【０１１３】
細胞破壊の量は、細胞からのクリスタルバイオレットを３３％酢酸で抽出し、次いで、４９０ｎｍにおける吸光度を測定することによって定量した（データは示さず）。非照射モック感染細胞での吸光度は１００％細胞生存率に設定した。６００ｃＧｙを受容したモック感染細胞では、生存率において１５％喪失があった（すなわち、１５％低いクリスタルバイオレットが抽出された）。細胞当たり１０^−３ＰＦＵにおけるＫＤ１では、非照射細胞は８０％生存であり、他方、６００ｃＧｙの照射を受容した細胞は約３０％生存に過ぎなかった。照射および非照射細胞の間の生存率の同様の差がＫＤ３、ＧＺ１およびＧＺ３で観察された。これらの結果は、放射線照射＋ベクターの組合せが、相加的効果よりはむしろ、細胞溶解およびベクター広がりに対して相乗的な効果を有することを議論する。もし効果が相加的に過ぎなければ、細胞当たり１０^−３ＰＦＵにおけるＫＤ１試料では、細胞生存率は６５％であったはずである（照射単独により生存率の１５％低下、ＫＤ１単独により２０％低下）。事実、細胞生存率は６５％よりはむしろ３０％であった。
【０１１４】
前記したごとく、２０００ｃＧｙとほぼ同程度に多量の細胞溶解およびウイルス広がりが６００ｃＧｙで観察された。ベクターと相乗する照射の最適用量を決定するために、前記したのと同様の実験をモック−、ｄｌ０１／０７−、ＫＤ１−、ＫＤ３−、ｄｌ３０９、ＧＺ１−、またはＧＺ３−感染Ａ５４９細胞で行った。４８ウェルプレートには、感染後２４時間において０、１５０、３００または６００ｃＧｙの照射を受容させた。細胞をクリスタルバイオレットで染色した。０対６００ｃＧｙの照射を受容した細胞での結果は図１５におけるものと同様であった。クリスタルバイオレットは、相違ウイルスの細胞当たり１０^−３ＰＦＵで感染させた細胞から抽出した。クリスタルバイオレットの吸光度を測定し、１００％細胞生存率として非照射モック感染細胞の吸光度を用いてパーセント細胞生存率をグラフ化した。図１６に示すごとく、全てのウェルにおける細胞生存率のほぼ直線的減少が増大する照射用量で観察されたが、直線の傾きはモック、ｄｌ０１／０７、またはｄｌ３０９におけるよりもＫＤ１、ＫＤ３、ＧＺ１またはＧＺ３でより負であった。ＫＤ１、ＫＤ３、ＧＺ１およびＧＺ３では、それらの親対照ウイルスでかなり多い細胞溶解およびベクター広がりがあり、ベクターおよび照射の間に相乗性があった。例えば、モック感染細胞では、６００ｃＧｙは約３０％だけ細胞生存率を低下させた（細胞の７０％が生存した）。照射なくしてもＫＤ１は約２３％だけ細胞生存率を低下させた。６００ｃＧｙ照射＋ＫＤ１の組合せは細胞生存率を約８５％まで低下させ、その５３％を超えるものは、照射単独およびＫＤ１単独の総和である。図１５および１６中のデータを一緒に考えると、約６００ｃＧｙの用量が細胞培養実験のこのタイプで最適である。
【０１１５】
また、ＫＤ３またはＧＺ３と照射との組合せをＡ５４９腫瘍−ヌードマウスモデルで調べた（実施例４参照）。Ａ５４９細胞をヌードマウスの後側腹部に注射し、腫瘍を形成させた。腫瘍がほぼ５０μｌに到達すれば、それらを緩衝液と共に、または５×１０^８ＰＦＵのＫＤ３またはＧＺ３と共に注射した。８ないし１０の腫瘍をテスト条件当たり注射した。感染後１日において、マウスの半分に６００ｃＧｙの全身照射を受容させた。腫瘍のサイズを経時的に測定し、（実施例４に記載されているごとく）腫瘍サイズ対感染後日数の倍増加としてプロットした。図１７に示すごとく、非照射緩衝液注射腫瘍はＫＤ３またはＧＺ３を注射したものよりも速く増殖した。ＫＤ３および照射の組合せを受容した腫瘍は増殖せず、ＧＺ３および照射の組合せを受容したものは１４日後にサイズが縮んだ。これらの結果は、ＫＤ３＋照射またはＧＺ３＋照射の組合せが、ヌードマウスにおいてＡ５４９腫瘍増殖の速度を低下させるにおいて、ベクター単独または照射単独いずれかよりも効果的であることを示す。照射は、ＫＤ１およびＤＺ１、または事実いずれかの他の複製−コンピテントまたは複製−欠陥Ａｄベクターの腫瘍を治療するにおける効果を増加させるようである。
【０１１６】
照射がＡＤＰ過剰発現ベクターが細胞を溶解させ、細胞間でより効果的に広がるようにするメカニズムは理解されていない。照射は細胞ＤＮＡ修復メカニズムを誘導すると予測され、それはＡｄ ＤＮＡのより効果的な合成を可能とし得る。照射はＡＤＰの機能を増強することができる。ＡＤＰは、１以上の細胞蛋白質と相互作用することによって恐らくは機能し、照射は、ＡＤＰがより効果的に機能するようにこの蛋白質（類）に影響し得る。
【０１１７】
ＫＤ１、ＫＤ３、ＧＺ１またはＧＺ３あるいはいずらかの他の複製−コンピテントＡｄベクターは、照射と組み合わせて用いると、癌を持つ患者に臨床的利益を与えるにおいて、ベクター単独または照射単独よりも効果的であろうと考えられる。該ベクターは、与えられた量の照射でのより大きな腫瘍破壊を可能とするはずである。もう１つの方法を述べると、照射は与えられた量のベクターでのより大きな腫瘍破壊を引き起こすはずである。また、これらのベクターは、放射線照射腫瘍学者が、より少量の照射を用いて同一量の腫瘍破壊を達成するのを可能とする。より少量の照射は照射の副作用を低下させるであろう。
【０１１８】
また、照射と組み合わせて用いると、ベクターのカクテルはカクテル単独または照射単独よりも効果的であろう。該カクテルは、ＡＤＰ生産ベクター＋抗癌治療蛋白質を発現する１以上の複製欠陥ベクターよりなることができる（実施例５参照）。
【０１１９】
実施例９
本実施例はアデノウイルス死滅蛋白質の構造−機能分析を説明する。
【０１２０】
ＡＤＰは内部核膜（ＮＭ）に局所化される１１．６ｋＤａのＮ結合Ｏ結合一体化膜糖蛋白質である（Ｓｃａｒｉａら，Ｖｉｒｏｌｏｇｙ １９１：７４３−７５３）。図１８に示すごとく、Ａｄ２−コードＡＤＰ（配列番号：６）は１０１アミノ酸よりなり；ａａ１−４０（配列番号：１７）はルーメンであり、ａａ４１−５９（配列番号：１８）は膜貫通シグナルアンカー（ＳＡ）ドメインを構成し、ａａ６３−７０（配列番号：１９）は核質（ＮＰ）ドメイン内の塩基性プロリン（ＢＰ）ドメインを構成し、これはａａ６１−１０１（配列番号：２０）を構成する。ＡＤＰ中のいずれのドメインが細胞死滅を促進するのに必要かを決定するために、ＡＤＰ遺伝子の種々の一部を欠く多数のｒｅｃ７００の欠失突然変異体を調製し、ＮＭに局所化され、死滅を促進するＡＤＰの能力につき調べた。ｒｅｃ７００ウイルスはＡｄ５−Ａｄ−Ａｄ５組換え体であり、これは他の文献に記載されている（Ｗｏｌｄら，Ｖｉｒｏｌｏｇｙ １４８：１６８−１８０，１９８６）。
【０１２１】
ｒｅｃ７００および各欠失突然変異体中のＡＤＰの構造は図１８に模式的に示す。各欠失突然変異体におけるＡＤＰ遺伝子が、ＰＣＲ方法を用いて配列決定して、突然変異が正しいことを保証した。欠失突然変異体におけるＡＤＰの構造および活性は、Ａ５４９細胞を感染させ、続いて、ＡＤＰ突然変異体蛋白質の免疫ブロット分析によってテストし、ならびに細胞を溶解する能力をテストした。全ての欠失突然変異体はｐｍ７３４．１を除いて安定なＡＤＰ蛋白質を発現した（Δ１−４８、すなわち、ａａ１−４８は欠失されている）。Ｓｅｒに突然変異されたＡｓｎ_１４を有するｐｍ７３４．７（Ｎ_１４）ＡＤＰはＯ−グリコシル化されているがＮ−グリコシル化されていない。何故ならば、Ａｓｎ_１４は唯一のＮ−グリコシル化部位であるからである（データは示さず）。ｄｌ７３５（Δ４−１１）ＡＤＰはＮ−グリコシル化されているがＯ−グリコシル化されていない。何故ならば、Ｏ−グリコシル化についての部位は欠失されているからである（データは示さず）。Ｓｅｒに突然変異されたＳＡドメイン中にＭｅｔ_５６を有するｐｍ７３４．４（Ｍ５６）ＡＤＰは、専らＮ結合高マンノースオリゴ糖を含有する（データは示さず）；Ｍｅｔ_５６突然変異は小胞体（ＥＲ）からのＡＤＰの脱出を排除するのでこれが起こる。シグナルアンカードメインにおいてａａ４６−６０を欠くｄｌ７３８ＡＤＰは細胞質において不溶性凝集体を形成し；従って、ａａ４１−５９は、事実、シグナルアンカードメインを含む。ＳＡドメインのＮ−末端にあるＭｅｔ_４１で開始するｐｍ７３４（Δ１−４０）ＡＤＰは、蛋白質分解プロセッシングによって生じたより低い群のバンドと共に移動した（データは示さず）。これは、蛋白質分解部位がＭｅｔ_４１近くで起こることを示す。これに合致して、蛋白質分解生成物はｄｌ７３７（Δ２９−４５）で観察されなかった（データは示さず）。また、生成物のサイズはａａ４１−１０１内に欠失を持つ全ての突然変異体（ｄｌ７１５．１、ｄｌ７１５、ｄｌ７１４、ｄｌ７１６）において減少した（データは示さず）。
【０１２２】
細胞死滅を促進するこれらの突然変異体の能力は、トリパンブルー排除、プラーク発生、および乳酸デヒドロゲナーゼ放出アッセイによってモニターした（Ｔｏｌｌｅｆｓｏｎら，Ｊ．Ｖｉｒｏｌ．７０：２２９６−２３０６，１９９６）。図１５Ａにおけるトリパンブルーの結果は、ＡＤＰの死滅促進機能がａａ１−４０（ｐｍ７３４）、ａａ１１−２６（ｄｌ７３６．１）、ａａ１８−２２（ｄｌ７３５．１）、またはａａ４−１１（ｄｌ７３５）の欠失によってなくなることを示す。Ａｓｎ_１４におけるＮ−グリコシル化部位の突然変異（ｐｍ７３４．７）は死滅促進活性をｒｅｃ７００（ＷＴ）の約５０％まで低下させた。ｄｌ７３７（Δ２９−４５）は細胞死滅を促進するにおいてｒｅｃ７００として効果的であった；これは、蛋白質分解プロセッシング産物が細胞死滅を促進するのに必要でなくてもよいことを示す。何故ならば、それらはｄｌ７３７で形成されないからである。ｄｌ７３８（Δ４６−６０）およびｐｍ７３４．４（Ｍ５６）は完全に欠失しているので、ＳＡドメインは死滅に必須である（図１９）。ｄｌ７１５．１はほとんど完全に欠陥であり、これはＢＰドメインが極端に重要であることを示す。驚くべきことに、ａａ７１−９４（ｄｌ７１４）、７６−８９（ｄｌ７１５）、および７９−１０１（ｄｌ７１６）は、ＡＤＰの死滅促進活性に影響することなく欠失できた（図１９）。他方、ａａ８１−８８の欠失（ｄｌ７１７）はＡＤＰの活性をほとんど完全に無くした（図１９）；これは、恐らくは、ＡＤＰの異常ソーティングの結果である（後記参照）。同様の結果が、細胞死滅を促進するこれらのＡＤＰ突然変異体の能力を標準的なプラーク発生、ＬＤＨ−放出およびＭＴＴアッセイで調べた場合に得られた。
【０１２３】
ＡＤＰの細胞内局所化に対するこれらの突然変異の効果は極端に興味深い。感染後３３時間において免疫蛍光（ＩＦ）によって調べると（データは示さず）、ｒｅｃ７００（ＷＴ）からのＡＤＰはＮＰに明瞭に局所化された；また、ゴルジ体への局所化も明らかであった。ｄｌ７１４（Δ７１−９４）およびｄｌ７１５（Δ７６−８９）では、ＡＤＰは全ての膜、すなわち、ＥＲ、ゴルジ体、原形質膜およびＮＭに局所化された。これは感染後４５時間においてさえ、より明らかであった（データは示さず）。かくして、ａａ７１−９４は、ＡＤＰを特異的にＮＭに向けるシグナルを含むようである。ＡＤＰはトランス−ゴルジ体ネットワーク（ＴＧＮ）からＮＭに集められるようであり、従って、ＡＤＰにおけるこの推定シグナルは、恐らくは、このソーティング経路で機能する。ｄｌ７１７（Δ８１−８８）からのＡＤＰは興味深い；それはＮＭおよびゴルジ体に局所化されるが、多くの細胞では、「ドット」および円状構造が観察された。再度、これらの構造が支配的な特徴である場合、これは感染後４５時間においてより明らかであった。ｄｌ７１７−感染細胞は感染後４５時間において死滅し始めず、従って、これらの構造は細胞の残物ではない。興味深い可能性は、これらの構造物は、ＴＧＮから出されたが、ＮＭに標的化しおよび／またはそれと融合するのに欠陥がある膜小胞であるということである。
【０１２４】
ｄｌ７３８（ＳＡドメインにおいてΔ４６−６０）では、ＡＤＰは細胞質に凝集した。これは、再度、ａａ４６−６０がＳＡ配列を含むことを示す。ｐｍ７３４．４（Ｍ５６）では、ＡＤＰは主としてＮＭに局所化した。前記したごとく、ｐｍ７３４．４ＡＤＰは専ら高マンノースＮ結合オリゴ糖を有し、これは、それが決してＥＲを去らないことを示す。恐らく、ｐｍ７３４．４ＡＤＰのＣ−末端領域における推定ＮＭ−局所化シグナルが、（外側および内側ＮＭと連続する）ＥＲからの横方向拡散によってＡＤＰをＮＭに標的化する。
【０１２５】
ｄｌ７３７（Δ２９−４５）では、ＡＤＰはＮＭに局所化した。ｐｍ７３４（Δ１−４０）、ｐｍ７３４．７（Ｎ１４）（Ｎ結合グリコシル化は起こり得ない）、およびｄｌ７３５（Δ４−１１；Ｏ−グリコシル化部位は欠失されている）からのＡＤＰはＮＭよりもかなりより支配的にゴルジ体に局所化した。（ｄｌ７３５．１（Δ１８−２２）およびｄｌ７３６．１（Δ１１−２６）からのＡＤＰもまた、ＮＭよりもゴルジ体にかなり強力に局所化した。かくして、残基１−２６および／またはグリコシル化は、ゴルジ体／ＴＧＮからＮＭへのＡＤＰの効果的な輸送に必要なようである。
【０１２６】
まとめると、ａａ４１−５９はＳＡドメインを含み、該ＳＡドメイン中のＭｅｔ_５６はＥＲから出るのに必要であり、ａａ１−２６はゴルジ体から効果的に出るのに必要であり、およびａａ７６−９４はＡＤＰを特異的にＮＭに標的化するのに必要である。細胞死滅を促進するに関しては、必須の領域はａａ１−２６、ＳＡドメイン（ＡＤＰは膜に侵入しない）、ＳＡドメイン中のＭｅｔ_５６、およびＢＰドメイン（ａａ６３−７０）である。ｐｍ７３４（Δ１−４０），ｄｌ７３５（Δ４−１１）、ｄｌ７３５．１（Δ１８−２２）、ｄｌ７３６．１（Δ１１−２６）およびｐｍ７３４．７（Ｎ１４）の欠陥死滅促進表現型が、死滅を促進する配列（またはオリゴ糖）の欠如のためであるか否か、あるいはＡＤＰがゴルジ体からＮＭへかなり遅く出ることによるか否かは明瞭でない。ｄｌ７１４（Δ７１−９４）およびｄｌ７１５（Δ７６−８９）は、それらがＮＭへ特異的に局所化するにおいて欠陥があるにもかかわらず、死滅を促進するための野生型表現型を発現する；これは、恐らくは、十分なＡＤＰがＮＭに依然として侵入して死滅を促進するからである。ｄｌ７１７（Δ８１−８８）中の欠失はｄｌ７１５（Δ７６−８９）およびｄｌ７１４（Δ７１−９４）における欠失内にあるが、ｄｌ７１７ＡＤＰは、死滅を促進するにおいて、ｒｅｃ７００（ＷＴ）、ｄｌ７１５およびｄｌ７１４の約１５％効果的であるに過ぎない。これは、ｄｌ７１７ＡＤＰがＮＭに対して局所化されるよりもむしろ小胞に止まる傾向があるからであろう。考え合わすと、これらのデータは、細胞死滅を促進するためにはＡＤＰはＮＭに局所化されなければならないことを示す。
【０１２７】
実施例１０
本実施例は、実施例６に記載された組織特異的Ａｄベクターをさらに特徴づける。そこで議論したごとく、Ａｄ Ｅ４プロモーターは欠失され、これらのベクターにおいてサーファクタント蛋白質Ｂ（ＳＰＢ）に代えて該プロモーターで置き換えられる（図２４）。
【０１２８】
材料および方法
本実施例においては、やはり、実施例６に記載された細胞、ベクターおよび方法を用いた。実施例６で用いたヒト癌細胞系Ａ５４９（ヒト肺癌腫）、Ｈｅｐ ３Ｂ（ヒト肝細胞癌腫）、およびＨ４４１（乳頭状肺腺癌）に加えて、（Ｍｉｃｒｏｂｉｘ（Ｔｏｒｏｎｔｏ，ＯＮ）から得られた）ＨＥＫ２９３細胞およびＶＫ１０−９細胞を用いた。ＶＫ１０−９細胞は、Ｅ１に加えて、Ｅ４およびｐＩＸを含有しそれを発現する２９３細胞である。これらの細胞を２９３−Ｅ４細胞と言う。
【０１２９】
Ｈｅｐ３ＢおよびＨ４４１細胞の位相差顕微鏡を使用する実験は以下のごとく行った。Ｈｅｐ３ＢまたはＨ４４１細胞の単層を、５ｍｌのＤＭＥＭ（１０％ＦＢＳ）を含む６０ｍｍ皿中で増殖させ、細胞当たり１０プラーク形成単位（ＰＦＵ）の感染多重度にてＫＤ１またはＫＤ１−ＳＰＢでモック感染または感染させた。単層の位相差写真は感染後４および７日において取った。
【０１３０】
Ｈ４４１またはＨｅｐ３Ｂ細胞のウエスタンブロットを使用する実験は以下のごとく行った。（６０ｍｍ皿中の）Ｈ４４１またはＨｅｐ３Ｂ細胞を１０ＰＦＵ／細胞のＫＤ１またはＫＤ１−ＳＰＢで感染させた。感染後２４時間において、細胞をＰＢＳで３回洗浄し、掻き取ることによって収穫した。ＲＩＰＡ緩衝液によって細胞を溶解させた。ＢＩＯ−ＲＡＤ ＤＣ Ｐｒｏｔｅｉｎ Ａｓｓａｙ Ｋｉｔ（ＢＩＯ−ＲＡＤ Ｌａｂｏｒａｔｏｒｉｅｓ，Ｈｅｒｃｕｌｅｓ，ＣＡ）によって蛋白質濃度を測定し、１０μｇの各試料を１５％ドデシル硫酸ナトリウムポリアクリルアミドゲル（ＳＤＳ−ＰＡＧＥ）上で電気泳動に付した。ゲルをＰＶＤＦ膜（Ｉｍｍｏｂｉｌｏｎ，Ｍｉｌｌｉｐｏｒｅ，Ｂｅｄｆｏｒｄ，ＭＡ）上で電気ブロットした。１０％乾燥乳（Ｃａｒｎａｔｉｏｎ）を含有するＴＢＳＴ（５０ｍＭトリス−Ｃｌ、ｐＨ７．６、１５０ｍＭ ＮａＣｌ、０．２％Ｔｗｅｅｎ２０）中で膜を４℃にて一晩ブロックした。ブロッキングの後、膜を、Ｅ４ＯＲＦ３（Ｇａｒｙ Ｋｅｔｎｅｒの贈物）またはＡＤＰ（Ｔｏｌｌｅｆｓｏｎら，Ｊ．Ｖｉｒｏｌ．６６：３６３３−３６４２，１９９２）に対するウサギ・ポリクローナル抗血清と共に、またはＭ７３、Ｅ１Ａに対するモノクローナル抗体（Ｈａｒｌｏｗら，Ｊ．Ｖｉｒｏｌ．５５：５３３−５４６，１９８５）と共にインキュベートした。二次抗体はヤギ抗ウサギＩｇＧ−ＨＲＰまたはヤギ抗マウスＩｇＧ−ＨＲＰであった。ＥＬＣプロトコル（Ａｍｅｒｓｈａｍ Ｐｈａｒｍａｃｉａ，Ａｒｌｉｎｇｔｏｎ Ｈｅｉｇｈｔｓ，ＩＬ）を用いてブロットを発生させた。
【０１３１】
細胞溶解のために乳酸デヒドロゲナーゼ放出アッセイ（Ｔｏｌｌｅｆｓｏｎら，Ｊ．Ｖｉｒｏｌ．７０：２２９６−２３０６）を使用する実験は以下のごとく行った。Ｈ４４１細胞（３５ｍｍ皿当たり７．７×１０^５細胞）およびＨｅｐ ３Ｂ細胞（３５ｍｍ皿当たり９．０×１０^５細胞）を１ｍｌの無血清ＤＭＥＭ中で２０ＰＦＵ／細胞にて感染させた。１時間の吸着時間の後、３ｍｌのＤＭＥＭ（１０％ＦＢＳ）を添加した（７．５％の最終ＦＢＳ濃度）。細胞を３７℃にて６％ＣＯ_２でインキュベートした。日間隔で、上清を集め、ミクロ遠心に付して浮遊細胞を除去し、無細胞上清をアッセイするまで−７０℃で凍結した。Ｃｙｔｏ Ｔｏｘ９６キット（Ｐｒｏｍｅｇａ，Ｍａｄｉｓｏｎ，ＷＩ）に含まれた１０×溶解緩衝液の添加によって、全溶解試料を調製した。全ての試料を収集した後、ＬＤＨアッセイキットＣｙｔｏ Ｔｏｘ９６を用いて２０μｌの試料を三連にてアッセイし、４９０ｎｍにおいてＥＬ３６０マイクロプレートリーダー（ＢｉｏＴｅｃＴＭ Ｉｎｓｔｒｕｍｅｎｔｓ，Ｉｎｃ．）で読み取った。
【０１３２】
Ｈ４４１およびＨｅｐ ３Ｂ細胞の免疫蛍光評価を使用する実験は以下のごとく行った。Ｈ４４１およびＨｅｐ ３Ｂ細胞を３５ｍｍ皿中のＣｏｒｎｉｎｇ＃１カバーグラス上で平板培養した。Ｈ４４１（１．５×１０^６細胞／ｍｍ皿）およびＨｅｐ ３Ｂ（９．０×１０^５細胞／ｍｍ皿）を、１ｍｌの無血清ＤＭＥＭ中の２０ＰＦＵ／細胞の示されたウイルスで感染させた。１時間後、１ｍｌのＤＭＥＭ／２０％ＦＢＳを添加した（１０％ＦＢＳの最終濃度）。示された時間（感染後４８時間または６日）において、細胞をＰＢＳ中の３．７％パラホルムアルデヒドで１０分間固定し、次いで、メタノール（−２０℃）中で６分間浸透させ、ＰＢＳ中で再水和させた。カバーグラスを、Ａｄ Ｅ２Ａ−コーデッドＤＮＡ結合蛋白質（ＤＢＰ）（１：４００希釈；Ｍａｕｒｉｃｅ Ｇｒｅｅｎの贈物）に対するウサギ抗ペプチド抗血清および繊維（１：４００希釈；Ｊｅｆｆ Ｅｎｇｌｅｒの贈物）に対するマウスモノクローナル抗体で染色し、あるいはＥ４ＯＲＦ３（１：２５０希釈；Ｇａｒｙ Ｋｅｔｎｅｒの贈物）に対するウサギ抗血清で染色した。二次抗体（Ｃａｐｐｅｌ／ＩＣＮ）は１：５０希釈で用いた。全ての抗体は、１％ＢＳＡおよび０．１％アジ化ナトリウムを含有するＰＢＳ中で希釈した。１００×ＰｌａｎａｐｏレンズおよびＴｍａｘ４００フィルム（Ｋｏｄａｋ）を用いて、Ｎｉｋｏｎエピ蛍光顕微鏡で写真を取った。Ｄｉａｆｉｎｅ現像液でフィルムを現像した。
【０１３３】
サザーンハイブリダイゼーションによるウイルスＤＮＡ複製の分析は以下のごとく行った。１０％ＦＢＳを補足したＤＭＥＭにて６０ｍｍ皿中で、Ｈ４４１およびＨｅｐ３Ｂ細胞を増殖させた。細胞を１０ＰＦＵ／細胞のＫＤ１またはＫＤ１−ＳＰＢで７０％密集において感染させた。皿を３７℃の湿潤化５％ＣＯ_２雰囲気中でインキュベートした。全ゲノムＤＮＡを感染後５、２４、４８、７２および９６時間に単離した。等量の全ゲノムＤＮＡをＨｉｎｄＩＩＩで消化し、膜への移動に先立って１％アガロースゲルで分解した。ランダムプライマー^３２Ｐ−標識ｐＢＨＧ１０プラスミドプローブ（Ｂｅｔｔら，Ｐｒｏｃ．Ｎａｔｌ．Ａｃａｄ．Ｓｃｉ．ＵＳＡ ９１：８８０２−８８０６，１９９４）をハイブリダイゼーションのために用い、ブロットをオートラジオグラフィーに付した。ＤＮＡ断片をＭｏｌｅｃｕｌａｒ Ｄｙｎａｍｉｃｓ ＰｈｏｓｐｈｏｒＩｍａｇｅｒで定量した。
【０１３４】
ウイルスの収率は以下のごとく測定した。３５ｍｍ皿にて単層として増殖させたＨｅｐ ３Ｂ細胞またはＨ４４１細胞を１０ＰＦＵ／細胞のＫＤ１またはＫＤ１−ＳＰＢで感染させた。感染後０ないし４日（Ｈ４４１につき）または０ないし９日（Ｈｅｐ ３Ｂにつき）において、細胞および培養培地を−７０℃で凍結させた。試料を３回凍結させ解凍させて細胞からウイルスを放出させ、全ウイルス収率はＡ５４９単層でのプラークアッセイによって測定した。
【０１３５】
Ｈ４４１およびＨｅｐ ３Ｂ腫瘍に対するＫＤ１−ＳＰＢおよびＫＤ１の効果は、ヌードマウスモデル（Ｄｏｒｏｎｉｎら，Ｊ．Ｖｉｒｏｌ．７４：６１４７−６１５５，２０００）で調べた。腫瘍細胞（Ｈ４４１細胞では２００μｌのＢＭＥＭ、５０％Ｍａｔｒｉｇｅｌ［Ｂｅｃｔｏｎ Ｄｉｃｋｉｎｓｏｎ Ｌａｂｗａｒｅ，Ｂｅｄｆｏｒｄ，ＭＡ］中の１０^７細胞、またはＨｅｐ ３Ｂ細胞では２００μｌのＤＭＥＭ＋１０％Ｍａｔｒｉｇｅｌ中の１０^７細胞）を５〜６週齢無胸腺ヌードマウスの側腹部に注入し、約１００μｌ（Ｈ４４１）または１５０μｌ（Ｈｅｐ ３Ｂ）容量まで３週間増殖させた。予め確立された腫瘍（ｎ＝１０）に、５０μｌのＤＭＥＭまたはＤＭＥＭ中の５×１０^７ＰＦＵの示されたウイルスを注入した。ウイルスの注入は、腫瘍当たり３．０×１０^８ＰＦＵの合計用量になるまで３週間の間毎週２回反復した。腫瘍のサイズの測定は、Ｓｙｌｖａｃデジタルカリパーを用い、Ｈ４４１細胞では一週間当たり２回、またはＨｅｐ ３Ｂ細胞では毎週行った。腫瘍の用量は式：長さ×幅^２／２に従って計算した。データは初期注入における腫瘍サイズに対する腫瘍サイズの増加の平均として表す。
【０１３６】
結果
種々の細胞型におけるＫＤ１−ＳＰＢの特性をその「親」ＫＤ１のものと比較した。図２５は、２９３−Ｅ４、２９３、およびＡ５４９細胞についてのこれらのベクターのプラーク発生特性を示す。データは、アッセイの最後（すなわち、新しいプラークが出現するのが止む時）に観察されたプラークの数のパーセンテージとして、プラークアッセイのいずれかの日に観察されたプラークの数としてプロットする（Ｔｏｌｌｅｆｓｏｎら、Ｊ．Ｖｉｒｏｌ．７０：２２９６−２３０６，１９６６）。このアッセイはプラークのサイズのインジケーターである。ＫＤ１は２９３−Ｅ４および２９３細胞で等しくよくプラークを形成した（図２５Ａ）。ＫＤ１−ＳＰＢでは、プラークは、２９３細胞と比較して２９３−Ｅ４では約３ないし４日早く観察された（図２Ａ）。Ａ５４９細胞では、ＫＤ１は、ＫＤ１−ＳＰＢよりも４ないし６日早くプラークを形成した（図２５Ｂ）。
【０１３７】
ＫＤ１−ＳＰＢ対ＫＤ１の特性をＨ４４１細胞、ＴＴＦ１転写因子を発現することが知られており、ＳＰＢプロモーターがその中で活性であるヒト乳頭状肺腺癌細胞系において詳細に特徴付けた（Ｙａｎら，Ｊ．Ｂｉｏｌ．Ｃｈｅｍ．２７０：２４８５２−２４８５７，１９９５）。その中でＳＰＢプロモーターが活性ではないはずであるＨｅｐ ３Ｂ細胞、ヒト肝細胞癌腫を陰性対照として用いた。Ｈ４４１およびＨｅｐ ３Ｂ単層を１０ＰＦＵ／細胞のＫＤ１またはＫＤ１−ＳＰＢで感染させ、感染後４および７日において写真を取った。モック感染Ｈｅｐ ３Ｂ細胞は比較的均一な単層を形成したが、Ｈ４４１細胞はシンシチウムに似た構造を形成する傾向がある（図２６Ａ、Ｂ）。予測されるごとく、ＫＤ１は、感染後４および７日において双方の細胞系で細胞障害効果（ＣＰＥ）を生じた（図２６Ａ、Ｂ）。また、予測されるごとく、ＫＤ１−ＳＢＰはＨ４４１細胞でＣＰＥを引き起こしたが、Ｈｅｐ ３Ｂ細胞では引き起こさなかった。Ａｄ−感染細胞におけるＣＰＥは、通常、ウイルス増殖のインジケーターであるので、これらの結果は、ＫＤ１−ＳＰＢがＨ４４１で増殖するが、Ｈｅｐ３Ｂ細胞では増殖しないことを示唆する。
【０１３８】
ウイルスＤＮＡ複製を調べるために、Ｈ４４１およびＨｅｐ ３Ｂ細胞を１０ＰＦＵ／細胞のＫＤ１またはＫＤ１−ＳＰＢで感染させ、次いで、ＤＮＡブロットによってウイルスＤＮＡの蓄積を測定した。Ｈ４４１細胞では、ＫＤ１およびＫＤ１−ＳＰＢのＤＮＡは、感染後４８−９６時間において、同様レベルで容易に検出できた（図２７Ａ）。Ｈｅｐ ３Ｂ細胞では、ＫＤ１ ＤＮＡレベルはＨ４４１細胞におけるものと同様であるが、ＫＤ１−ＳＰＢのＤＮＡはほとんど検出されなかった。これは、ＤＮＡバンドのＰｈｏｓｐｈｏｒＩｍａｇｅｒ分析によって確認した（図２７Ｂ）。
【０１３９】
Ｈ４４１およびＨｅｐ ３Ｂ細胞におけるＫＤ１−ＳＰＢおよびＫＤ１の増殖は単一工程増殖アッセイによって測定した。細胞を１０ＰＦＵ／細胞のベクターで感染させ、次いで、全ベクター収率をプラークアッセイによって測定した。両方のベクターの全収率はＨ４４１細胞で同様であり、２日後にプラトーに到達した（図２８Ａ）。ＫＤ１収率は感染後２ないし４日後にＨｅｐ ３Ｂ細胞でプラトーに達した（図２８Ｂ）。しかしながら、ＫＤ１−ＳＰＢレベルは、２ないし４日後に、Ｈｅｐ ３Ｂ細胞において約５ｌｏｇ低く、９日までさえ、それらはＫＤ１のレベルを達成しなかった。本発明者らは、ＫＤ１−ＳＰＢは、Ｈ４４１対Ｈｅｐ ３Ｂ細胞に対する有意な特異性をもって増殖すると結論する。さらに、ＫＤ１−ＳＰＢはＨ４４１細胞でのＫＤ１と同程度によく増殖し、これは、それ自体によるＥ４プロモーター欠失が有意にベクターを損なわず、Ｅ４プロモーターが複製−コンピテントベクターにおいて組織−特異的プロモーターによって置き換えることができるのを示す。
【０１４０】
Ｈ４４１およびＨｅｐ ３Ｂ細胞におけるＫＤ１−ＳＰＢ対ＫＤ１の複製についてさらなる詳細を得るために、ＫＤ１−ＳＰＢおよびＫＤ１による代表的なＡｄ蛋白質の発現を調べた。Ｈ４４１またはＨｅｐ ３Ｂ細胞を１０ＰＦＵ／ｍｌのＫＤ１またはＫＤ１−ＳＰＢでモック感染または感染させ、次いで、感染後２４時間において、蛋白質を抽出し、Ｅ１Ａ、Ｅ４ＯＲＦ３、およびＡＤＰ蛋白質をイムノブロットによって調べた。Ｅ４ＯＲＦ３はＥ４転写単位によってコードされた６つの蛋白質のうちの１つである（Ｌｅｐｐａｒｄ，Ｊ．Ｇｅｎ．Ｖｉｒｏｌ．７８：２１３１−２１３８，１９９７）。予測されるごとく、ＫＤ１−ＳＰＢはＨ４４１細胞においてＥ４ＯＲＦ３をよく発現したが、Ｈｅｐ ３Ｂ細胞においては痕跡レベルにおけるに過ぎなかった（図２９）。ＫＤ１−ＳＰＢはＨｅｐ ３Ｂ細胞においてＥ１Ａ蛋白質を発現した。Ｈｅｐ ３Ｂ細胞におけるＫＤ１−ＳＰＢによるＥ１Ａ蛋白質の合成が予測される。何故ならば、Ｅ１Ａ発現はＥ４蛋白質を必要としないからである；それは、また、ＫＤ１−ＳＰＢでの感染に対するブロックがＥ１Ａの下流であることを示す。ＫＤ１は双方の細胞系においてＥ１Ａを発現したが、その量はＨｅｐ ３Ｂ細胞においてＫＤ１−ＳＰＢで得られたものよりも低かった（図２９）。ＫＤ１−ＳＰＢで観察された増大したＥ１Ａレベルは、感染の後期相に入るその貧弱な能力を反映し得る（考察参照）。ＫＤ１−ＳＰＢはＨ４４１細胞におけるＫＤ１と同程度によくＡＤＰを発現したが、それはＨｅｐ ３Ｂ細胞において検出可能なＡＤＰを作成しなかった。ＡＤＰは主として後期蛋白質であり、従って、この結果は、Ｈｅｐ ３Ｂ細胞におけるＥ４蛋白質発現、ＤＮＡ複製およびＫＤ１−ＳＰＢの増殖の相対的欠如と一致する。
【０１４１】
個々の細胞で起こる複製事象に対する洞察を得るために、Ｅ４ＯＲＦ３、Ｅ２Ａ−ＤＢＰおよび繊維後期蛋白質の発現を免疫蛍光によって調べた。Ｈ４４１またはＨｅｐ ３Ｂ細胞を２０ＰＦＵ／細胞で感染させた。感染後４８時間または６日後に、細胞を固定し、免疫染色した。Ｅ４ＯＲＦ３は、ＫＤ１、ＫＤ１−ＳＰＢまたはｄｌ３０９では、感染後４８時間においてＨ４４１細胞の核で検出された（図３０Ａ）。（ｄｌ３０９は野生型Ｅ１Ａを有し、Ａｄ５レベルのＡＤＰを発現し、かつＥ３−ＲＩＤおよびＥ３−１４．７Ｋ遺伝子を欠くＡｄ５突然変異体である）。Ｅ４ＯＲＦ３は、感染後６日においてさえ、ＫＤ１−ＳＰＢ（図３０Ａ）で感染させたＨｅｐ ３Ｂ細胞のほとんど大部分で検出できなかった（図３０Ｂ）。かくして、ＫＤ１−ＳＰＢはＨ４４１においてＥ４ＯＲＦ３をよく発現するが、Ｈｅｐ ３Ｂ細胞においては発現しない。
【０１４２】
図３１Ａは、ＫＤ１またはＫＤ１−ＳＰＢでは、感染後４８時間において同一のＨｅｐ ３Ｂ細胞でＤＢＰおよび繊維の二重標識免疫蛍光を示す。ＫＤ１では、感染後４８時間においてＤＢＰに典型的な核における強力な斑点染色パターンがあった（図３１Ａ、頂部左側パネル）。これらの同一の細胞を通じて繊維の強力な染色があった（図３１Ａ、頂部右側パネル）。細胞質および核の染色が予測される。何故ならば、繊維は細胞質で合成され、次いで、ビリオンが組み立てられる核に移動するからである。感染後４８時間におけるＫＤ１−ＳＰＢでは、細胞の約２５％がＤＢＰについての斑点染色を示し、進行した斑点パターンを持つ１つの細胞（合計の７％）のみが繊維でも染色された（図３１Ａ、底部２つのパネル）。感染後６日においてさえ、細胞の約３０％のみがＤＢＰにつき染色を示し、約２０％のみが繊維につき示した（図３１Ｂ）。かくして、ＫＤ１−ＳＰＢで感染した顕著により少ないＨｅｐ ３Ｂ細胞が、ＫＤ１と比較して、ＤＢＰおよび特に繊維を発現した。これらの結果は、ＫＤ１−ＳＰＢがＨ４４１細胞においてＫＤ１と同程度よく複製することを示す。何故ならば、疑いなく、ＳＰＢプロモーターはＨ４４１細胞で活性だからである（Ｙａｎら，Ｊ．Ｂｉｏｌ．Ｃｈｅｍ．２７０：２４８５２−２４８５７，１９９５）。恐らくは、ＳＰＢプロモーターはこれらの細胞において最小に活性である故に、ＫＤ１−ＳＰＢはＨｅｐ ３Ｂ細胞でほとんど複製しない。
【０１４３】
複製の最高点において、Ａｄ−感染細胞が溶解され、ウイルスは他の細胞に広がる；このプロセスはＡＤＰによって大部分が媒介される（Ｔｏｌｌｅｆｓｏｎら，Ｖｉｒｏｌｏｇｙ ２２０：１５２−１６２，１９９６；Ｔｏｌｌｅｆｓｏｎら，Ｊ．Ｖｉｒｏｌ．７０：２２９６−２３０６，１９９６）。ベクター誘導細胞溶解を調べるために、Ｈ４４１およびＨｅｐ ３Ｂ細胞を２０ＰＦＵ／細胞のＫＤ１、ＫＤ１−ＳＰＢまたはｄｌ３０９でモック感染させるか、感染させ、乳酸デヒドロゲナーゼの放出によって細胞溶解を測定した（Ｔｏｌｌｅｆｓｏｎら，Ｊ．Ｖｉｒｏｌ．７０：２２９６−２３０６，１９９６）。全てのベクターは、感染後２ないし３日においてはじまり、Ｈ４４１細胞を溶解させた（図３２Ａ）。ＫＤ１およびｄｌ３０９もまた同一期間でＨｅｐ ３Ｂ細胞を溶解させた；しかしながら、ＫＤ１−ＳＰＢは最小の細胞溶解を引き起こしたに過ぎなかった（図９Ｂ）。かくして、実施例６および図１３における細胞広がりデータと共にこれらのデータは、ＫＤ１−ＳＰＢが、Ｈ４４１において細胞を溶解させ、細胞間に効果的に広がるが、Ｈｅｐ ３Ｂ細胞ではそうならないことを示す。
【０１４４】
ヌードマウスにおいてＫＤ１−ＳＰＢまたはＫＤ１がＨ４４１腫瘍を抑制するか否かを決定するために実験を行った。Ｈ４４１細胞を各後側腹部に注入した。腫瘍が約１００μｌ（Ｈ４４１）または１５０μｌ（Ｈｅｐ ３Ｂ）まで増殖すれば、それらに、ＤＭＥＭ（モック）または５０μｌのＤＭＥＭ中の５×１０^７ＰＦＵのテストウイルス（３．０×１０^８合計ＰＦＵ）を３週間の間毎週２回注入した。１０腫瘍（５匹）を各ウイルスで用いた。Ｈ４４１腫瘍の増殖はＫＤ１−ＳＰＢおよびＫＤ１によって同様に抑制された（図３３Ａ）。ＫＤ１はＨｅｐ ３Ｂ腫瘍の増殖を抑制し、他方、ＫＤ１−ＳＰＢは最小抑制のみを引き起こした（図３３Ｂ）。これらの結果は、ＳＰＢプロモーターが活性である場合、ＫＤ１−ＳＰＢが腫瘍を抑制するにおいてＫＤ１と同程度効果的であることを示す。さらに、イン・ビトロにてＫＤ１−ＳＰＢで観察された細胞型特異性はイン・ビボで維持される。
【０１４５】
考察
腫瘍の特異性は、癌遺伝子療法が直面する最大の攻撃の１つであり、すなわち、治療遺伝子を有することは癌細胞において特異的に発現される。特異性はＲＣウイルスで非常に重要である。理論的には、特異性：形質導入標的化および転写標的化を付与する２つの主な戦略が記載されている。標的細胞上の特異的細胞表面受容体にベクターの特異性を向けることが種々の方法を介して試みられてきた。このアプローチは理論的には魅力的ではあるが、それは、作成蛋白質のビリオンへの取り込みの欠如（Ｓｃａｒｉａら，Ｖｉｒｏｌｏｇｙ １９１：７４３−７５３，１９９２）または標的化受容体を通じる感染性の欠如（Ｃｏｓｓｅｔら，Ｊ．Ｖｉｒｏｌ．６９：６３１４−６３２２，１９９５）のごとき複数の障害に遭遇し得る。転写標的化は腫瘍および組織特異的プロモーターを利用する。複製−欠陥ベクターにおいて、これらの調節配列は細胞毒性遺伝子の発現を特異的組織に制限する。複製−コンピテントベクターにおいて、調節の付加された層として、ベクターの複製それ自体を腫瘍または組織特異的プロモーター／エンハンサー配列の制御下に置くことができる。複製−コンピテントＡｄにおいて、組織または腫瘍特異的プロモーター／エンハンサーのＥ１Ａプロモーター／エンハンサー領域への挿入が専ら用いられてきた（Ｈａｌｌｅｎｂｅｃｋら，Ｈｕｍ．Ｇｅｎｅ Ｔｈｅｒ．１０：１７２１−１７３３，１９９９；Ｒｏｄｒｉｇｕｅｚら，Ｃａｎｃｅｒ Ｒｅｓ．５７：２５５９−２４６３，１９９７；Ｙｕら，Ｃａｎｃｅｒ Ｒｅｓ．５９，４２００−４２０３，１９９９，Ｙｕら，Ｃａｎｃｅｒ Ｒｅｓ．５９：１４９８−１５０４，１９９９）。これらのベクターの背後にある合理性はＥ１Ａの発現、従って、全Ａｄ転写プログラムがこれらの組織または腫瘍特異的プロモーターに依存するであろうことである。しかしながら、上位概念的アプローチとして、困難性があろう。Ｅ１Ａエンハンサー／プロモーターは非常に複雑である。エンハンサーはＥ１ＡプロモーターのみならずＥ４プロモーターのごとき区別されるプロモーターも制御する（Ｓｈｅｎｋ，Ｔ．ｐｐ．２１１１−２１４８ Ｉｎ Ｂ．Ｎ．Ｆｉｅｌｄｓ，Ｄ．Ｍ．Ｋｎｉｐｅ，およびＰ．Ｍ．Ｈｏｗｌｅｙ（編），Ｆｉｅｌｄｓ Ｖｉｒｏｌｏｇｙ，Ｌｉｐｐｉｎｃｏｔｔ−Ｒａｖｅｎ，Ｐｈｉｌａｄｅｌｐｈｉａ，１９９６）。加えて、逆転末端反復領域におけるＥ１Ａエンハンサーが細胞プロモーターの組織特異性を変化させることが示されている（Ｓｈｉら，Ｈｕｍ．Ｇｅｎｅ Ｔｈｅｒ．８：４０３−４１０，１９９７）。また、Ｅ１Ａエンハンサー／プロモーターは、Ａｄゲノムをビリオンにパッケージするのに必要なシグナル内に部分的に埋もれており、ウイルス生産を損なうことなく全てのＥ１Ａエンハンサーエレメントを除去するのは問題であろう。従って、本発明者らは、Ｅ４プロモーターを組織特異的プロモーターで置き換えることを選択した。Ｅ４遺伝子はＡｄ複製に必須であり、従って、本発明者らは、組換えウイルスの複製が組織特異的調節エレメントに依存するであろうと予測した。
【０１４６】
ＫＤ１−ＳＰＢを構築するために、約３００ｂｐのＥ４プロモーターを欠失し、ＳＰＢプロモーターのＢ−５００バージョン（約５００ｂｐ）を挿入した（Ｙａｎら，前掲）（図２４Ｃ、Ｄ）。本発明者らは、その厳格な組織特異性のためＳＰＢプロモーターを選択した：それは肺のタイプＩＩ肺胞細胞および気管支上皮細胞で専ら活性である（Ｂｏｈｉｎｓｋｉら，１９９４，Ｍｏｌ．Ｃｅｌｌ．Ｂｉｏｌ．１４：５６７１−５６８１，１９９４）。親ウイルスＫＤ１は、ウイルス複製を腫瘍細胞に制限する２つのＥ１Ａ突然変異を含有しそれを発現する（Ｄｏｒｏｎｉｎら，前掲）ので、本発明者らは、該ウイルスは肺腫瘍に由来する細胞において選択的に複製するであろうと予測した。かくして、Ｈ４４１細胞、乳頭状肺癌腫細胞系を用いて、ＫＤ１−ＳＰＢの複製、遺伝子発現、および機能プロフィールを特徴付けた。
【０１４７】
ＫＤ１−ＳＰＢは、２９３細胞上よりも、Ｅ４蛋白質を発現する２９３−Ｅ４細胞上で３ないし４日早くプラークを形成し、他方、ＫＤ１は双方の細胞系で同一のキメティックスにてプラークを形成した。これらのデータは、Ｅ４プロモーターが、２９３細胞で活性であり、ＳＰＢプロモーターが２９３細胞において非常に低い活性を呈することを示す。何故ＫＤ１−ＳＰＢが２９３細胞でプラークを形成するかは明らかでない；これらの細胞はヒト胚腎臓に由来し、ＳＰＢプロモーター（Ｂｏｈｉｎｓｋｉら，前掲）を調節する転写因子の少なくとも１つ、肝細胞核因子３が胚腎臓で発現される。また、ＴＴＦ１、ＳＰＢ発現のマスター調節因子は２９３細胞で最小に活性である可能性がある。
【０１４８】
ＫＤ１はＨ４４１およびＨｅｐ ３Ｂ細胞において等しく高い力価まで増殖した（図２８Ａ、Ｂ）。対照的に、ＫＤ１−ＳＰＢは、その中でＳＰＢプロモーターが活性である（Ｙａｎら，前掲）（図２８Ａ）Ｈ４４１細胞においてＫＤ１と同程度に効果的に複製するが、Ｈｅｐ ３Ｂ細胞においては貧弱にしか複製しない。これは、ＳＰＢプロモーターが不活性であるからであろう（図２８Ｂ）。この選択性は、２つの細胞系においてウイルスＤＮＡ生産を測定することによって確認されている。ＫＤ１−ＳＰＢ ＤＮＡ複製は、Ｈ４４１においてキネティックス的にかつ定量的にＫＤ１ ＤＮＡ複製に似ているが、しかしながら、Ｈｅｐ ３Ｂ細胞においては、ＫＤ１−ＳＰＢ ＤＮＡはほとんど検出できなかった（図２７Ａ，Ｂ）。細胞障害効果、Ａｄ複製の代理マーカーは同様の特異性を示した（図２６）。
【０１４９】
観察された組織特異性の分子的基礎についての我々の予測をさらに確認するために、我々はウイルス蛋白質の発現をモニターした。細胞をＫＤ１−ＳＰＢで感染させると、Ｅ１Ａを除いて全てのウイルス蛋白質（初期または後期）は組織特異的に発現された（Ｈ４４１では高発現、Ｈｅｐ ３Ｂでは検出できない発現と低い）（図２９−３１）。我々はＥ４プロモーター活性（Ｅ４ＯＲＦ３発現）およびＥ２Ａ−ＤＢＰ、ＡＤＰ、および繊維蛋白質の発現のレベルの間に良好な相関を見い出した。かくして、ＳＰＢプロモーターはＡｄゲノムにおいてその組織特異性を保持し、それは、テストした細胞系におけるＡｄ遺伝子発現の限定的因子であるらしい。予測されるごとく、Ｅ１Ａの発現は組織特異的ではない。かくして、組織−特異的Ａｄ ＤＮＡ複製の調節工程はＥ１Ａの下流にある。Ｈｅｐ ３Ｂ細胞において、ＫＤ１−ＳＰＢはＫＤ１よりも高レベルでＥ１Ａを発現し（図２９）、これは、Ｈｅｐ３Ｂ細胞のほとんどにおけるＫＤ１−ＳＰＢ複製が初期段階に止まっていることを強く示唆する。
【０１５０】
ＫＤ１−ＳＰＢの細胞溶解効果は組織−特異的プロフィール（図３２；実施例６の図１３）、すなわち、Ｈｅｐ ３Ｂ細胞よりもＨ４４１細胞の優先的溶解、ＤＮＡ複製のレベルで観察された特異性に類似のパターン（図２７）およびウイルス蛋白質合成（図２９−３１）を示した。この細胞型特異性は、これらの細胞がヌードマウスにおいて腫瘍として増殖しつつある場合にも観察された。Ｈ４４１腫瘍の増殖は、同様の効率にて、ＫＤ１−ＳＰＢおよびＫＤ１によって抑制された（図３３Ａ）。対照的に、ＫＤ１とは異なってＫＤ１−ＳＰＢはＨｅｐ ３Ｂ腫瘍の増殖に対して最小効果を有したに過ぎない（図３３Ｂ）。
【０１５１】
まとめると、Ｅ４プロモーターの組織特異的プロモーターとの置き換えは、Ａｄベクターの高度に組織特異的な複製を可能とし、標的組織においては、それは親ウイルスの複製と同程度に効果的である。ＫＤ１−ＳＰＢはＡＤＰを除いて全てのＥ３遺伝子を欠く。Ｅ３ ｇｐ１９Ｋ、ＲＩＤおよび１４．７Ｋは、細胞特性リンパ球ならびに腫瘍壊死因子およびＦａｓリガンドのごときアポトーシス−誘導サイトカインによる攻撃からＡｄ−感染細胞を保護することが示されている（Ｗｏｌｄら，ｐｐ．２００−２３２ Ｉｎ Ａ．Ｊ．Ｃａｎｎ（編）、ＤＮＡ Ｖｉｒｕｓ Ｒｅｐｌｉｃａｔｉｏｎ：Ｆｒｏｎｔｉｅｒｓ ｉｎ Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ Ｂｉｏｌｏｇｙ，Ｏｘｆｏｒｄ Ｕｎｉｖｅｒｓｉｔｙ Ｐｒｅｓｓ，Ｏｘｆｏｒｄ，２０００；Ｗｏｌｄら，Ｃｕｒｒ．Ｏｐｉｎ．Ｉｍｍｕｎｏｌ．１１：３８０−３８６，１９９９）。
【０１５２】
ＫＤ１−ＳＰＢの治療指標（Ｈｅｐ ３Ｂ細胞と比較したＨ４４１細胞で生産されたウイルス）は最初の４ないし５日間は１０^４〜１０^５である（図２８）。これらのデータを、それらの前立腺特異的ウイルスについてのＣａｌｙｄｏｎによって報告されているデータ（１０^４−１０^５）（Ｒｏｄｒｉｇｕｅｚら，前掲、Ｙｕら，Ｃａｎｃｅｒ Ｒｅｓ．５９，４２００−４２０３，１９９９；Ｙｕら，Ｃａｎｃｅｒ Ｒｅｓ．５９：１４９８−１５０４，１９９９）と比較する。我々は、ＫＤ１−ＳＰＢは、複製を癌細胞に制限するＥ１Ａの突然変異体形態をコードする故に、他の研究所によって報告されたベクターよりもいくらか付加された利点を有するということを示唆する（Ｄｏｒｏｎｉｎら，前掲）。
【０１５３】
肺は合衆国において男性および女性双方につき第２に高い癌部位としてランク付けされているが（Ｒｅｉｓら，Ｃａｎｃｅｒ Ｒｅｓ．８８：２３９８−２４２４，２０００）、肺癌は癌ベクター遺伝子治療の主な標的ではなかった。というのは、ウイルスの腫瘍内注入は一般に肺では可能でないからである。しかしながら、複製−欠陥Ａｄベクターの肺腫瘍への腫瘍内注入の最近の報告があり、そのようなアプローチはＫＤ１−ＳＰＢで試みることができた。また、ＫＤ１−ＳＰＢを肺において全身投与することもできる。
【０１５４】
前記を考慮すれば、本発明のいくつかの利点が達成され、他の有利な結果が得られることが理解されよう。
【０１５５】
本発明の精神を逸脱することなく種々の変形を前記方法および組成物でなすことができ、前記記載に含まれ、添付の図面に示された全ての事項は例示的なものであって限定的な意味ではないと解釈されるべきである。
【０１５６】
特許および特許出願を含めた本明細書中で引用した全ての文献は、出典明示によって本明細書の一部と見なす。本明細書中における文献の考察は、単に、その著者によってなされた主張をまとめる意図であり、いずれの文献も先行技術を構成することを許容するものではない。出願人は、引用した文献の正確性および関連性を攻撃する権利を保有する。
【図面の簡単な説明】
【図１】 図１はＡｄ５（図１Ａ）および本発明の好ましい具体例（図１Ｂ）であるＫＤ３における遺伝子発現の模式図であり、ここに、各ゲノムは斑点をつけた棒線によって表され、転写単位は棒線の上方および下方の矢印によって表され、Ｅ３蛋白質は、Ｅ３転写単位、および示された後期ｍＲＮＡのＬ１ないしＬ５ファミリーについての矢印の上方にリストされる。
【図２】 図２は、ＫＤ１、ＫＤ３、ＧＺ１およびＧＺ３によるＡＤＰの過剰発現を説明し、示されたウイルスで感染させ、抗ＡＤＰ抗体でプローブされたヒトＡ５４９細胞から単離された蛋白質の免疫ブロットを示し、ＡＤＰは、異なってグリコシル化され、蛋白質分解的に処理されたＡＤＰの形態を示す。
【図３】 図３は、図面中および以後ｄｌ０１／０７というＥ１Ａ ｄｌ１１０１／１１０７突然変異体が後期蛋白質の発現を遅らせることを説明し、野生型Ｅ１Ａ領域を有し、および１２．５Ｋ蛋白質をコードする遺伝子を除いて全てのＥ３遺伝子の欠失を有する、ｄｌ３２７の不存在下（図３Ａおよび３Ｂ）または存在下（図３Ｃおよび３Ｄ）で示されたウイルスで感染させたＡ５４９細胞におけるＥ１Ａ蛋白質および後期蛋白質の免疫ブロットを示す（図３Ｃおよび３Ｄ）。Ｅ１Ａ蛋白質に特異的な抗血清を図３Ａおよび３Ｃで用いた。Ａｄ５ビリオンに対して生起した抗血清を図３Ｂおよび３Ｄで用いた。
【図４】 図４はＡＤＰを少量しかまたは全く発現しない対照ウイルスよりも効果的にＫＤ１およびＫＤ３が細胞を殺すことを説明し、トリパンブルー排除によって測定して、感染後示された日において生存した示されたウイルスで感染させたＡ５４９細胞のパーセントのグラフを示す。
【図５】 図５は、ＡＤＰの過剰発現がウイルスの細胞間広がりを増強することを説明する細胞広がりアッセイであり、生きた細胞を染色するが死滅した細胞を染色しないクリスタルバイオレットで感染後７日において処理した示されたＰＦＵ／細胞での示された細胞で感染させた単層を示す。
【図６】 図６は、増殖する細胞においてＫＤ１およびＫＤ３がよく複製するが、増殖阻止細胞においてはそうではないことを説明し、１００ＰＦＵ／ｍｌの以下のウイルス：ｄｌ３０９（図６Ａ）、ｄｌ０１／０７（図６Ｂ）、ＫＤ１（図６Ｃ）およびＫＤ３（図６Ｄ）での感染に続いて種々の回数、増殖するまたは増殖阻止ＨＥＬ−２２９細胞から抽出されたウイルス力価を示す。
【図７】 図７は初代ヒト気管支上皮細胞を殺すにおいてＫＤ１およびＫＤ３が効果的であることを説明し、１０ＰＦＵ／ｍｌの示されたウイルスで３０％密集において感染させ、ニュートラルレッドで感染後５日において染色したこれらの細胞単層を示す。
【図８】 図８は、ＫＤ１およびＫＤ３がヌードマウスにおいて増殖するヒトＡ５４９細胞腫瘍の増殖速度を低下させることを説明し、図８Ｂにおいては、週間隔にて緩衝液または示されたウイルスの５×１０^７ＰＦＵでの腫瘍の感染に続く週の数に対してプロットした腫瘍サイズの平均倍増加のグラフを示し、図８Ｂにおいては、５×１０^８ＰＦＵのＫＤ３またはＧＺ３で一回注射した腫瘍の同様のグラフを示す。
【図９】 図９は、ＫＤ１およびＫＤ３がヌードマウスで増殖するヒトＨｅｐ ３Ｂ細胞腫瘍の増殖速度を低下させることを説明し、毎週２回の間隔での緩衝液または示されたウイルス（ｄｌ３０９、ＫＤ１またはＫＤ３）の５×１０^７ＰＦＵでの腫瘍の注射に続く週の数に対してプロットした腫瘍サイズの平均倍増加のグラフを示す。
【図１０】 図１０は、感染性中心アッセイを用い、β−ガラクトシダーゼを発現するＡｄ−β−ｇａｌ、複製−欠陥ベクターの複製および広がりをＫＤ１およびＫＤ３が補充することを説明し、図１０Ａでは、Ａｄ−β−ｇａｌ単独または示されたウイルスで感染させたＡ５４９細胞を接種したＡ５４９細胞単層の図を示し、図１０Ｂおよび１０Ｃでは、図１０Ａの単層の２つのクローズアップ図を示す。
【図１１】 図１１は、腫瘍に示された組合せのウイルスが注入され、次いで、感染後２週間において抽出し、ルシフェラーゼ活性につきアッセイするアッセイを用い、ヌードマウスで増殖するヒトＨｅｐ ３Ｂ細胞腫瘍においてＫＤ１およびＫＤ３がルシフェラーゼの発現を増加させることを示す棒グラフである。括弧に入れた数は、Ａｄｌｕｃベクター＋緩衝液のそれと比較したルシフェラーゼ活性の倍増加を示した。
【図１２】 図１２は、ＴＴＦ１転写因子を発現するように作成されたＡ５４９細胞（Ａ５４９／ＴＴＦ１）および親５４９細胞に対するＫＤ１およびＫＤ１−ＳＰＢについての標準的プラーク発生アッセイの結果を示すグラフであり、ここに、データは、アッセイにおける特定の日に観察されたプラークの数をそのウイルスで観察されたプラークの最終数で割り、１００を掛けたものとしてプロットする。
【図１３】 図１３はＨ４４１およびＨｅｐ ３Ｂ細胞についてのＫＤ１およびＫＤ１−ＳＰＢについての細胞広がりアッセイであり、ここに、細胞はＫＤ１またはＫＤ１−ＳＰＢの示された量で感染させ、Ｈ４４１およびＨｅｐ ３Ｂ細胞は、各々、感染後５日においておよび感染後８日においてクリスタルバイオレットで染色した。
【図１４】 図１４は、ｂｌ３０９および本発明の２つの好ましい実施例、ＧＺ１およびＧＺ３についての標準的プラーク発生アッセイの結果を示すグラフであり、ここに、データは、アッセイにおける特定の日に観察されたプラークの数をそのウイルスで観察されたプラークの最終数で割り、１００を掛けたものとしてプロットする。
【図１５】 図１５は、ＫＤ１、ＫＤ３、ＧＺ１またはＧＺ３とＸ線照射の組合せが、ウイルスベクター単独または照射単独よりもＡ５４９細胞単層を破壊するにおいてより効果的であることを示す細胞広がりアッセイであり、ここに、細胞は示された量の示されたウイルスで感染させ、６００センチグレイ（ｃＧｙ）のｘ−照射で照射し（底部パネル）、またはモック照射し（頂部パネル）、次いで感染後６日においてクリスタルバイオレットで染色した。
【図１６】 図１６は、１５０、３００または６００センチグレイの照射と組み合わせて用いた１０^−３ＰＦＵのＫＤ１、ＫＤ３、ＧＺ１またはＧＺ３が、ウイルスベクター単独または照射単独よりもＡ５４９細胞単層を破壊するにおいてより効果的であることを説明する細胞広がりアッセイのグラフである。細胞生存率は、モック感染非照射ウェルを１００％生存率として用い、培養ウェルから抽出したクリスタルバイオレットの量に基づく。
【図１７】 図１７は、ＫＤ３またはＧＺ３＋ｘ線照射の組み合わせが、ＫＤ３単独またはＧＺ３単独よりもヌードマウスで増殖するＡ５４９細胞腫瘍の増殖を低下させるにおいて効果的であることを説明する。
【図１８】 図１８はＡＤＰの構造−機能分析を説明し、図１８Ａにおいて、種々の推定ドメインおよび標識されたグリコシル化部位を持つ、Ａｄ２によってコードされたアデノウイルス死滅蛋白質のアミノ酸配列を示し、図１８Ｂにおいて、ｒｅｃ７００および示された欠失突然変異体におけるＡＤＰ遺伝子の模式図を示し、右欄は野生型表現型のパーセンテージとしての種々の突然変異体の死滅促進表現型をまとめる。
【図１９】 図１９Ａおよび１９Ｂは示されたＡＤＰ突然変異体の細胞生存率アッセイを説明し、感染後の時間（図１９Ａ）または日数（図１９Ｂ）に対してプロットしたトリパンブルー排除によって測定された生存率のグラフを示す。
【図２０】 図２０は、Ａｄ１、Ａｄ２、Ａｄ５およびＡｄ６（配列番号：５−８）のＡＤＰ蛋白質についての、Ａｄ２ ＡＤＰ突然変異体ｄｌ７１６、ｄｌ７１５、ｄｌ７１４およびｄｌ７３７（配列番号：９−１２）についての、および推定ルーメンドメイン（配列番号：１７）、膜貫通ドメイン（配列番号：１８）、サイトゾル塩基性−プロリンドメイン（配列番号：１９）、およびＡｄ２のＡＤＰ蛋白質のサイトゾルドメインの残り（配列番号：２０）についての、単一文字暗号で示したアミノ酸配列を示す。
【図２１】 図２１はＡｄ５のゲノムの完全なヌクレオチド配列を表す。
【図２２】 図２２はＫＤ１のゲノムの完全なヌクレオチド配列（配列番号：１）を表す。
【図２３】 図２３はＫＤ３のゲノムの完全なヌクレオチド配列（配列番号：２）を表す。
【図２４】 図２４は以下のベクターの模式図である：Ａ．Ａｄ５。斑点を入れた棒線は３６ｋｂｐのＤＮＡゲノムを示す。塗り潰ぶしていない矢印は即時型Ｅ１Ａ転写ユニットを示し、黒色矢印は遅延した初期Ｅ１Ｂ、Ｅ２、Ｅ３およびＥ４転写ユニットである。ハッチングを施した矢印は主な後期ｍＲＮＡの５つのファミリー、および主な後期転写ユニットの一部として合成されるＡＤＰ ｍＲＮＡを示す。各主要後期ｍＲＮＡはその５’末端にスプライスされた三部リーダー（リーダー１、２および３）を有する。Ｂ．ｄｌ３０９。ｄｌ３０９はそれが欠失されたＥ３−ＲＩＤおよびＥ３−１４．７Ｋ遺伝子を有する以外はＡｄ５と同一である。ｄｌ３０９はＡｄ５と同様なレベルでＡＤＰを発現する。Ｃ．ＫＤ１。ＫＤ１は、Ｅ１Ａ蛋白質のｐＲＢまたはｐ３００／ＣＢＰへの結合をなくするＥ１Ａ遺伝子中の２つの小さな欠失（「Ｘ」マークで示す）を有する。それはａｄｐ以外の全てのＥ３遺伝子を欠く。ＡＤＰは、Ａｄ５またはｄｌ３０９からのＡＤＰよりも感染において初期に、かつより豊富に発現される。Ｄｏｒｏｎｉｎら，Ｊ．ｖｉｒｏｌ．７４：６１４７−６１５５。Ｄ．ＫＤ１−ＳＰＢ。ＫＤ１−ＳＰＢは、それがサーファクタント蛋白質Ｂ（ＳＰＢ−Ｐ）に代えてプロモーターによって置き換えられたＥ４プロモーターを有する以外はＫＤ１と同一である。
【図２５】 図２５は、ＫＤ１−ＳＰＢがＨ４４１肺癌腫細胞においてＫＤ１と同程度よく増殖するが、Ｈｅｐ ３Ｂ肝臓腫瘍細胞においてはＫＤ１よりもかなり貧弱にしか増殖しないことを示すグラフを表す。ＫＤ１−ＳＰＢおよびＫＤ１のＣｓＣｌ−バンデッドストックは標準的な方法を用い（Ｔｏｌｌｅｆｓｏｎら，Ｐ．１−９ Ｉｎ Ｗ．Ｓ．Ｍ．Ｗｏｌｄ（編）、Ａｄｅｎｏｖｉｒｕｓ Ｍｅｔｈｏｄｓ およびＰｒｏｔｏｃｏｌｓ．Ｈｕｍａｎ Ｐｒｅｓｓ，Ｉｎｃ．，Ｔｏｔｏｗａ，ＮＪ，１９９８）、２９３Ｅ４または２９３−細胞（Ａ）につき、またはＡ５４９細胞（Ｂ）につき力価測定した。データは、アッセイの最終日に観察されたプラークの数のパーセンテージとしてのプラークアッセイのいずれかの日に観察されたプラークの数としてプロットする（Ｔｏｌｌｅｆｓｏｎら，Ｖｉｒｏｌｏｇｙ ２２０：１５２−１６２，１９９６）。
【図２６】 図２６は、ＫＤ１−ＳＰＢがＨ４４１細胞においてＣＰＥを誘導するが、Ｈｅｐ ３Ｂ細胞では誘導しないことを示す顕微鏡写真を表す。Ｈ４４１およびＨｅｐ ３Ｂ単層をモック感染させ、または１０ＰＦＵ／細胞のＫＤ１またはＫＤ１−ＳＰＢで感染させ、次いで、感染後４または７日において位相差下で写真を取った。
【図２７】 図２７は、ＫＤ１−ＳＰＢ ＤＮＡがＨ４４１細胞では効果的に合成されるが、Ｈｅｐ ３Ｂ細胞ではそうではないことを説明するサザーンハイブリダイゼーションおよびグラフを示す。Ｈ４４１またはＨｅｐ ３Ｂ細胞を１０ＰＦＵ／細胞のＫＤ１またはＫＤ１−ＳＰＢで感染させた。全ゲノムＤＮＡを感染後０、５、２４、４８、７２および９６時間において単離し、ＨｉｎｄＩＩＩで消化し、アガロースゲル電気泳動によって分解し、ブロットし、^３２Ｐ−標識Ａｄ ＤＮＡとハイブリダイズさせた。Ａ．オートラジオグラム。Ｂ．パネルＡにおけるＤＮＡバンドのＰｈｏｓｐｈｏｒＩｍａｇｅｒ定量。
【図２８】 図２８は単一工程増殖曲線を示すグラフを表し、ＫＤ１−ＳＰＢがＨ４４１でよく増殖するが、Ｈｅｐ ３Ｂ細胞では増殖しないことを示す。細胞は１０ＰＦＵ／細胞のＫＤ１またはＫＤ１−ＳＰＢで感染させた。ベクターは感染後示された日に抽出し、力価はプラークアッセイによって測定した。
【図２９】 図２９は、ＫＤ１−ＳＰＢがＨ４４１においてＥ４ＯＲＦ３およびＡＤＰを発現するが、Ｈｅｐ ３Ｂ細胞では発現しないことを示す免疫ブロットを表す。細胞は１０ＰＦＵ／細胞のＫＤ１またはＫＤ１−ＳＰＢで感染させた。感染後２４時間において、蛋白質抽出物を、特異的抗血清を用いてＥ１Ａ、Ｅ４ＯＲＦ３およびＡＤＰにつき分析した。Ｅ１Ａ蛋白質は複数バンドとして出現する。ＡＤＰは２つのバンドとして出現する；上方バンドはグリコシル化されており、下方バンドは蛋白質分解により切断された種である（Ｓｃａｒｉａら，Ｖｉｒｏｌｏｇｙ １９１：７４３−７５３，１９９２；Ｔｏｌｌｅｆｓｏｎら，Ｊ．Ｖｉｒｏｌ．６６：３６３３−３６４２）。
【図３０】 図３０は、ＫＤ１−ＳＰＢがＨ４４１ではＥ４ＯＲＦ３を発現するが、Ｈｅｐ ３Ｂ細胞では発現しないことを示す免疫蛍光顕微鏡写真を示す。カバーグラス上で増殖する細胞を２０ＰＦＵ／細胞のＫＤ１、ＫＤ１−ＳＰＢまたはｄｌ３０９（野生型）で感染させた。４８時間（パネルＡ）または６日（パネルＢ）において、細胞を固定し、Ｅ４ＯＲＦ３に対するウサギ・ポリクローナル抗ペプチド抗血清で染色した。写真は１００×Ｐｌａｎａｐｏレンズを用いて取った。各パネルは約８つの核を示す。この図面は図３１に示した同一実験の一部である。
【図３１】 図３１は、ＫＤ１−ＳＰＢがＨｅｐ ３Ｂ細胞においてＥ２−ＤＢＰまたは繊維を効果的に発現しないことを示す免疫蛍光顕微鏡写真を表す。Ｈｅｐ ３Ｂ細胞は２０ＰＦＵ／細胞のＫＤ１−ＳＰＢまたはＫＤ１で感染させた。感染後４８時間（Ａ）または６日（Ｂ）において、細胞を固定し、ＤＢＰに対するウサギ・ポリクローナル抗血清および繊維に対するマウス・モノクローナル抗体を用いて二重染色した。同一視野をＤＢＰおよび繊維につき示す。この図面は図３０に示した同一実験の一部である。
【図３２】 図３２は、ＫＤ１−ＳＰＢがＫＤ１と同程度に効果的にＨ４４１を溶解するが、Ｈｅｐ ３Ｂを溶解しないことを説明するグラフを表す。Ｈ４４１またはＨｅｐ ３Ｂ細胞をモック感染し、あるいは２０ＰＦＵ／細胞のＫＤ１またはＫＤ１−ＳＰＢで感染させた。細胞溶解は、細胞から培地への乳酸デヒドロゲナーゼの放出によって測定した。
【図３３】 図３３はＫＤ１−ＳＰＢがＫＤ１と同程度よくヌードマウスにおいてＨ４４１腫瘍の増殖を抑制することを説明するグラフを表す。腫瘍細胞はヌードマウスの側腹部に注射し、約１００μｌ（Ｈ４４１）または１５０μｌ（Ｈｅｐ ３Ｂ）容量まで増殖させた。腫瘍（ｎ＝１０）はＤＭＥＭ（モック）を、または５×１０^７ＰＦＵのＫＤ１またはＫＤ１−ＳＰＢを注入した。ウイルスの注射は、腫瘍当たり３．０×１０^８ＰＦＵの合計用量まで３週間の間毎週２回反復した。腫瘍を測定し、腫瘍サイズの平均倍増加を計算した。
【配列表】

Claims (3)

1. アデノウィルス死滅蛋白質を過剰発現し、且つ新形成細胞において複製可能である組換えアデノウィルスであって、前記組換えアデノウィルスが、配列番号：１または配列番号：２から選択されることを特徴とする組換えアデノウィルス。
2. 前記組換えアデノウィルスが配列番号：１である、請求項１に記載の組換えアデノウィルス。
3. 前記組換えアデノウィルスが配列番号：２である、請求項１に記載の組換えアデノウィルス。

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