WO2008136213A1

WO2008136213A1 - 放射線増感増強剤

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Publication number: WO2008136213A1
Application number: PCT/JP2008/054564
Authority: WO
Inventors: Toshiyoshi Fujiwara; Noriaki Tanaka; Toshiya Fujiwara; Yasuo Urata
Original assignee: Oncolys Biopharma Inc.
Priority date: 2007-04-27
Filing date: 2008-03-06
Publication date: 2008-11-13
Also published as: JPWO2008136213A1; JP5580043B2

Abstract

本発明は、放射線増感増強剤の提供を目的とする。本発明は、ヒトテロメラーゼのプロモーター、E1A遺伝子、IRES配列及びE1B遺伝子をこの順に含む複製カセットがウイルスゲノムのE1領域に組み込まれた組換えウイルスを含む、放射線増感増強剤に関する。

Description

明細書放射線増感増強剤技術分野

本発明は、ヒトテロメラーゼのプロモーター、 E1A遺伝子、 IRES配列及び E1B 遺伝子がゲノムに組み込まれた組換えウィルスを含む、放射線増感増強剤に関する。背景技術

癌は、診断方法及び臨床管理の進歩にもかかわらず、依然として世界における主な死亡原因である（Parkin DM et al. CA Cancer J Clin. 2005;55:74-108、 JemalA, et al. Cancer. 2004 l;101:3-27)。進行癌に対する現在の治療法としては、外科的切除、放射線治療、及び細胞障害性の化学療法が挙げられ、これらの方法を併用することにより、癌患者の生存率を改善することができる。しかしながら、多くの癌患者は、これらの治療法に対してしばしば内因性または獲得性の抵抗性を有するため、病気の進行を余儀なくされる（Vokes EE, et al. Clin Cancer Res. 2005;ll:5045s-5050s、 Milas L, et al. Head Neck. 2003;25:152-67)。

放射線治療及び化学療法は、癌細胞のみを標的とすることができないことが問題となっている。従って、腫瘍細胞のみを選択的に傷害するが、正常細胞は傷害しなぃ抗癌剤が必要とされる。

このような状況において、腫瘍細胞特異的に選択的に増殖するウィルスは、新しい癌の治療法をもたらす。このウイルスは、腫瘍組織のみにおいて選択的に増殖後、腫瘍細胞の融解を誘導するように設計される（Kirn D, et al. Nat. Med., 7: 781-787, 2001、 Hawkins LK, et al. Lancet Oncol. 2002;3:17-26)。癌細胞を効果的に標的にするためには、.多様な癌において発現するが、正常細胞においては発現しない、組織または細胞特異的なプロモータを必要とする。

テロメラーゼは、染色体末端を完全に複製するために関与するリボヌクレオ夕ンパク質複合体である（Blackburn EH. Nature (Lond.) 1991； 350： 569-573)。テロメラ一ゼは、ヒ卜の癌の 85%以上において活性を示す（Kim NW, et al. Science 1994； 266： 2011-2015) が、正常体細胞では増殖細胞のみで活性を示す（Shay JW, et al Curr Opin Oncol 1996； 8： 66-71) ₀ テロメラ一ゼの活性化は、発癌における重要なステップであると考えられ、その活性は、ヒトテロメラーゼ逆転写酵素 (hTERT)の発現と密接に関連している（Nakayama J, et al. Nat Genet 1998； 18: 65-68)。

hTERTプロモー夕一は、テロメラ一ゼ活性を有する腫瘍細胞のみで活性化することから、腫瘍細胞においてその下流にあるウィルス遺伝子の選択的発現を可能とし、選択的ウィルス増殖を導く。

本発明者らは、 hTERTプロモーター配列が、内部リボソーム結合部位 (IRES) と連結した E1A及び E1B遺伝子の発現を駆動する、弱毒アデノウィルス 5型べクタ一（OBP-301又はテロメライシンという）を構築した（Kawashima T, et al. Clin Cancer Res 2004; 10: 285-292)。テロメラィシンは、ヒト癌細胞において効率的に増殖し、ヒト癌細胞株の顕著な細胞障害を誘導した。一方、テロメラーゼ活性を有しない正常ヒト細胞においては、細胞障害だけではなく、増殖も強く抑制された。

OBP-301の単独療法は、前臨床試験における優れた結果に基づいて臨床開発が進められているが、良好な治療結果を得るためには、 in vivoにおいて抗腫瘍効果を促進するための集学的治療が重要である。実際に、腫瘍融解ウィルスについての臨床試験の多くは、化学療法又は放射線治療との組み合わせで実施されている (Khuri FR, et al. Nat Med 2000; 6： 879-885, Reid T, et al. Cancer Res 2002; 62： 6070-6079、 Hecht JR, et al. Clin Cancer Res 2003； 9: 555-561、 Galanis E, et al. Gene Ther 2005; 12: 437-445)。

電離放射線は、主に DNA分子を標的とし、二本鎖切断（DSB)を誘導する（Kim CH, et al. J Pharmacol Exp Ther. 2002;303:753-9)。二本鎖切断は、非相同末端結合（NHEJ)、相同組換えなどの通常の分子プロセスによって修復され得る (CahiU D, et al. Front Biosci. 2006 ;11:1958-76)。

DNA依存性プロテインキナーゼ（DNA-PK) は、セリン/スレオニンキナーゼ活性を有する核夕ンパク質であり、 NHEJ経路に必須の構成成分である。 DNA PK は、触媒サブュニットである DNA-PKcs及び調節サブュニットである Ku自己抗原（Ku70/80) を含む（Gottlieb TM, et al. Cell. 1993;72:131-42、 Jeggo PA. Mutat Res. 1997;384:1-14)。 DSBの誘導に対する細胞の生存率は、 NHEJによる DNA 修復に大きく依存する（Wang H, et al. Nucleic Acids Res. 2001;29:1653-60)。

DNA力修復されない場合は、 DNA損傷により染色体消失及び細胞死が起こりうる（Dikomey E, et al. Int J Radiat Biol. 1998;73:269-78)。従って、 DNA PKは、ヒ卜の腫瘍が放射線治療及び遺伝毒性の化学療法に対して抵抗性を獲得する上で重要である可能性がある。実際に、 DNA-PKcs又は Kuのいずれかの発現が欠損した腫瘍細胞は、顕著な放射線感受性を示し（Lees-Miller SP， et al. Science. 1995;267:1183-5)、 DNA-PKの標的阻害は、薬剤抵抗性の癌細胞の感受性を高め、細胞障害を促進する（Kim CH, et al. J Pharmacol Exp Ther. 2002;303:753-9)。さらに、 Ku70/80は、核へ移行し、 DSBの修復の間、 DNA-PKcsと物理的に相互作用する（Koike M, et al. J Cell Sci. 1999;112:4031-9、 Koike M， et al. Oncogene. 1999;18:7495-505、 Koike M， et al. Biochem Biophys Res Commun. 2000;276:1105-11)。発明の開示

本発明は、腫瘍の有効な放射線療法を可能とする放射線増感増強剤を提供することを目的とする。

本発明者は、上記課題を解決するため鋭意研究を行った結果、 hTERT プロモー夕一、 IRES、 E1A及び E1B 遺伝子を含む弱毒アデノウイルス 5 型ベクター (OBP-301又はテロメライシンという）力癌の放射線に対する感受性を増加させること、及び放射線の治療効果を増強することを見出し、本発明を完成するに至つた。

すなわち、本発明は以下の通りである。

( 1 ) ヒトテロメラーゼのプロモーター、 E1A遺伝子、 IRES配列及び E1B遺伝子をこの順に含む複製カセッ卜がウィルスゲノムの E1領域に組み込まれた組換えウィルスを含む、放射線増感増強剤。

( 2 ) ヒトテロメラーゼのプロモーター， E1A遺伝子、 IRES配列及び E1B遺伝子をこの順に含む複製カセッ卜がウィルスゲノムの E1領域に組み込まれ、かつ、標識タンパク質をコードする遺伝子及び該遺伝子の発現を制御しうるプロモー夕一を含む標識カセッ卜がウィルスゲノムの E3領域に組み込まれた組換えウィルスを含む、放射線増感増強剤。

( 3 )放射線照射前、照射後及び照射中の時期から選ばれる少なくとも 1つの時期に投与されることを特徴とする、ヒトテロメラーゼのプロモーター、 E1A遺伝子、

IRES配列及び E1B遺伝子をこの順に含む複製カセッ卜がウィルスゲノムの E1 領域に組み込まれた組換えウィルスを含む、放射線併用用抗腫瘍剤。

( 4 )放射線照射前、照射後及び照射中の時期から選ばれる少なくとも 1つの時期に投与されることを特徴とする、ヒトテロメラーゼのプロモーター、 E1A遺伝子、 IRES配列及び E1B遺伝子をこの順に含む複製カセッ卜がウィルスゲノムの E1 領域に組み込まれ、かつ、標識タンパク質をコードする遺伝子及び該遺伝子の発現を制御しうるプロモーターを含む標識カセッ卜がウィルスゲノムの E3領域に組み込まれた組換えウィルスを含む、放射線併用用抗腫瘍剤。

( 5 )前記放射線増感増強剤又は放射線併用用抗腫瘍剤の製造における、ヒトテロメラ一ゼのプロモーター、 E1A遺伝子、 IRES配列及び E1B遺伝子をこの順に含む複製カセットがウィルスゲノムの E 1領域に組み込まれた組換えウィルスの使用。

( 6 )前記放射線増感増強剤又は放射線併用用抗腫瘍剤の製造における、ヒトテロメラ一ゼのプロモーター、 E1A遺伝子、 IRES配列及び E1B遺伝子をこの順に含む複製カセットがウィルスゲノムの E1領域に組み込まれ、かつ、標識タンパク質をコードする遺伝子及び該遺伝子の発現を制御しうるプロモーターを含む標識力セッ卜がウィルスゲノムの E3領域に組み込まれた組換えウィルスの使用。

( 7 ) 前記組換えウィルスを含む、放射線耐性腫瘍に対する治療剤。本発明において、上記増感増強剤又は抗腫瘍剤は、腫瘍又は癌の放射線に対する感受性を高めることができる。ヒトテロメラ一ゼのプロモー夕一としては、例えば hTERTプロモーターが挙げられ、標識タンパク質をコードする遺伝子の発現を制御しうるプロモー夕一としては、例えばサイ卜メガロウィルスプロモーター又は hTERTプロモーター、あるいは発癌及び発癌抑制因子プロモーターが挙げられる。また、標識夕ンパク質としては例えば GFP (Green Fluorescence Protein)を挙げることができる。ウィルスは、アデノウイルスであることが好ましい。

本発明により、癌の放射線療法において腫瘍又は癌細胞に OBP-301などの本発明の組換えウィルスを感染させておくと、該ウィルスは、腫瘍細胞の放射線に対する感受性を増加させることができる。また、あらかじめ腫瘍又は癌細胞を放射線照射した後に OBP-301などの本発明の組換えウィルスを感染させると、該ウィルスは、腫瘍細胞を効果的に殺傷することができる。さらに、本発明の組換えウィルスは、放射線ゃ抗癌剤に耐性を示す腫瘍又は癌細胞を効果的に殺傷することができる。従って、本発明に使用されるウィルスは、放射線の感受性を高めることによって顕著な抗腫瘍効果を示すことができ、放射線との併用療法に極めて有用である。図面の簡単な説明

図 1 Aは、ヒト癌細胞におけるテロメラ一ゼ特異的腫瘍融解アデノウイルスと放射線との併用による in vitroでの抗腫瘍効果を示す図である。 OBP-301感染及び電離放射線の用量又は線量依存的に細胞障害活性が示される。

図 1 Bは、ヒト癌細胞におけるテロメラーゼ特異的腫瘍融解アデノウイルスと放射線との併用による in vitro での抗腫瘍効果を示す図である。ヒト癌細胞への OBP-301の感染により放射線増感増強効果が示される。

図 1 Cは、ヒト癌細胞におけるテロメラーゼ特異的腫瘍融解アデノウイルスと放射線の併用による in vitroでの抗腫瘍効果を示す図である。図は、 OBP-301及び/ 又は放射線処置後のヒト癌細胞の位相差画像（倍率 xlOO) を示す。

図 1 Dは、ヒト癌細胞におけるテロメラ一ゼ特異的腫瘍融解アデノウイルスと放射線との併用による in vitroでの抗腫瘍効果を示す図である。図は、ヒト癌細胞におけるウィルスの in vitro増殖及び拡散（倍率 xlOO) を示す。

図 2 Aは、放射線照射したヒ卜癌細胞における腫瘍融解アデノウイルスの増殖に関する評価を示す図である。ヒト癌細胞における CAR発現のフローサイトメトリ一分析結果が示されている。

図 2 Bは、放射線照射したヒト癌細胞における腫瘍融解アデノウイルスの増殖に関する評価を示す図である。放射線照射したヒト癌細胞における OBP-301感染後のアデノウィルス E1A夕ンパク質の発現が示されている。上パネル： 45 kD アデノウィルス E1Aタンパク質、下パネル：ローディングコントロールとしての 42 kDァクチン。

図 2 Cは、放射線照射したヒト癌細胞における腫瘍融解アデノウイルスの増殖に関する評価を示す図である。放射線照射したヒト癌細胞における OBP-301の増殖効率が示されている。

図 3 Aは、ヒト癌細胞におけるアデノウイルスの感染性に対する電離放射線の効果を示す。放射線照射したヒト癌細胞において、非増殖性 GFP発現アデノウィルスベクター（Ad-GFP) を感染させた後の GFP蛍光発現が示されている。

明視野での顕微鏡観察（上パネル)、及び処置から 48時間後の G.FP発現（下パネル）（倍率 x200)。

図 3 Bは、ヒト癌細胞におけるアデノウイルスの感染性に対する電離放射線の効果を示す図である。放射線照射した A431及び A549細胞における Ad-GFP感染後の GFP発現レベルのフローサイトメトリー分析結果が示されている。

図 3 Cは、ヒト癌細胞におけるアデノウイルスの感染性に対する電離放射線の効果を示す図である。 A431、 A549及び TE8細胞における OBP-301の感染効率の比較分析結果が示されている。

図 4 Aは、ヒト癌細胞における DNA-PKタンパク質複合体の発現及び局在性に対する OBP-301の感染の効果を示す図である。 OBP-301感染後の A549細胞における DNA-PKcsの発現が示されている。

上パネル： 350 kDアデノウィルス E1Aタンパク質、下パネル：ローディングコントロールとしての 42 kDァクチン。

図 4 Bは、ヒト癌細胞における DNA-PKタンパク質複合体の発現及び局在性に対する OBP-301の感染の効果を示す図である。 OBP-301を感染させた A549細胞における Kuタンパク質の細胞内局在が示されている。

Ku夕ンパク質は緑で示し PI染色 DNAは赤で示す（倍率 xl000)。

図 5 Aは、 nu/nuマウスの側腹に、樹立した A549 を異種移植したときの腫瘍に対する OBP-301の腫瘍内注射及び局所放射線照射の抗腫瘍効果を示す図である。 * p <0.05、 ** p <0.01 (Student's t検定）。

図 5 Bは、 nu/nu マウスの側腹に、樹立した A549 を異種移植したときの腫瘍に対する OBP-301の腫瘍内注射及び局所放射線照射の抗腫瘍効果を示す図である。処置から 37日後の腫瘍の代表的な肉眼的所見を示す。

図 5 Cは、 nu/nuマウスの側腹に、樹立した A549 を異種移植したときの腫瘍に対する OBP-301の腫瘍内注射及び局所放射線照射の抗腫瘍効果を示す図である。腫瘍のパラフィルム切片のへマトキシリン-ェォシン染色結果を示す（倍率 X200 (上パネル）、 400 (下パネル））。

図 6は、放射線耐性株の作製手順の概略を示す図である。

図 7は、親株と放射線耐性株における CD133陽性細胞の割合をフ口一サイトメトリ一によって解析した結果を示す図である。

a：親株と放射線耐性株における CD133陽性細胞の存在を CD133-APC抗体を用いてフローサイトメトリーによって解析した結果を示す図である。

b：親株及び放射線耐性株における CD133陽性細胞の割合を示すグラフである。図 8は、放射線耐性株における CD133陽性細胞及び CD133陰性細胞を FACS によりソートした後に、ソートした細胞群の純度をフローサイトメトリ一によって解析した結果を示す図である。

図 9 は、 CD133 陽性細胞及び CD133 陰性細胞の自己複製能力 (repopulation/self-renewal ability)をフ口一サイトメトリ一によつて解析した結果を示す図である。

図 1 0は、白血病抑制因子（Leukemia inhibitory factor) の存在下における CD133陽性細胞及び CD133陰性細胞の自己複製能力をフローサイトメトリーによって解析した結果を示す図である。

図 1 1は、 CD133陽性細胞の未分化スフエア形成を示す図である。

図 1 2は、スフエアに含まれる CD133陽性細胞及び CD133陰性細胞の割合を、フローサイトメトリ一によって解析した結果を示す図である。

図 1 3は、 CD133陽性細胞及び CD133陰性細胞の抗癌剤（5-FU) 耐性を XTT アツセィにより解析した結果を示す図である。統計的有意差（p<0.05) は、ァス夕リスクで示す。

図 1 4は、 CD133陽性細胞及び CD133陰性細胞の抗癌剤（シスブラチン）耐性を XTTアツセィにより解析した結果を示す図である。統計的有意差（p<0.05) は、アスタリスクで示す。

図 1 5は、 CD133陽性細胞及び CD133陰性細胞の抗癌剤（パクリ夕キセル）耐性を XTTアツセィにより解析した結果を示す図である。統計的有意差 (p<0.05) は、アスタリスクで示す。

図 1 6は、 CD133陽性細胞及び CD133陰性細胞の放射線耐性を XTTァッセィにより解析した結果を示す図である。統計的有意差（p<0.05) は、アスタリスクで示す。

図 1 7は、テロメラィシンの CD133陽性細胞及び CD133陰性細胞に対する抗腫瘍効果を XTTアツセィにより解析した結果を示す図である。

図 1 8は、 CD133陽性細胞及び CD133陰性細胞における hTERT発現量の比較を示す図である。発明を実施するための最良の形態

以下、本発明を詳細に説明する。以下の実施の形態は、本発明を説明するための例示であり、本発明をこの実施の形態のみに限定する趣旨ではない。本発明は、その要旨を逸脱しない限り、様々な形態で実施をすることができる。

なお、本明細書において引用した全ての文献、および公開公報、特許公報その他の特許文献は、参照として本明細書に組み込むものとする。また、本明細書は、 2007 年 4月 27 日に出願された本願優先権主張の基礎となる日本国特許出願（特願 2007-119858号）の明細書及びに記載の内容を包含する。

1 . 概要

腫瘍融解アデノウイルスは、標準的な癌治療とは異なるメカニズム、及び一般的な治療方法との相乗的な相互作用により腫瘍細胞を殺傷することがこれまで説明されてきた。しかしながら、併用療法の相乗効果の背景にある分子メカニズムは十分に明らかとなっていない。

そこで本発明者らは、ウィルス増殖を調節することが可能なヒトテロメラーゼ逆転写酵素（hTERT) プロモーターを有する、テロメラーゼ特異的増殖アデノウィルス（OBP-301又はテロメライシンという）を構築し、併用療法の相乗効果について検討した。

本発明の一態様として、実施例に示すように、 OBP-301感染と電離放射線照射併用による抗腫瘍効果は、 XTTアツセィにより in vitroで評価した。アデノウィルスの感染性及び細胞内増殖は、定量的リアルタイム PCRにより評価した。 DNA プロティンキナーゼ（PK)触媒サブュニット（DNA-PKcs)の発現および Ku70/80 の核移行に対する OBP-301の効果は、それぞれウエスタンプロッティング及び免疫蛍光染色により検討した。また、 nu/nuマウスに移植されたヒトの皮下腫瘍の増殖に対する治療効果を、肉眼的観察及び組織化学的染色により比較した。

その結果、放射線照射後に OBP-301を感染させると顕著な in vitro細胞障害を誘導した。放射線照射は、 OBP-301 の細胞内増殖速度には影響しなかったが、 OBP-301による細胞障害性を促進した。また、放射線照射後に OBP-301 を感染した場合は、ヒト肺癌細胞である A549 において DNA-PKcs発現が減少した。 Ku70/80 タンパク質は、電離放射線照射後は A549 細胞の核に蓄積したが、 OBP-301の感染後は細胞質に蓄積した。 OBP-301の細胞内注射と局所放射線照射とを併用した場合は、 A549腫瘍を異種移植した nu/nuマウスにおいて相乗的に有意に治療効果を示し、それぞれ単独で処置した場合よりも効果はさらに高いものであった。

以上のことから、本発明者らは、電離放射線照射及び OBP-301の感染を併用した場合、電離放射線照射によりウィルスの感染性が増加するとともに、 OBP-301 の感染により DNA修復を阻害し、その結果、両者が互いに腫瘍細胞の感受性を増加させることを見出した。この併用療法は、 in vitroおよび in vivoの両方において抗腫瘍効果を促進した。 - さらに、本発明者らは、腫瘍の悪性化や放射線耐性などをもたらす癌幹細胞の特異的なマーカ一である CD133に着目して鋭意検討を行った結果、本発明のウィルスが、放射線耐性及び抗癌剤耐性を有する CD133陽性細胞に対して抗腫瘍効果を有することを見出した。

2 . 本発明の組換えウィルス

本発明の組換えウィルスは、ヒトテロメラーゼのプロモー夕一、 E1A遺伝子、 IRES配列及び E1B遺伝子をこの順に含むポリヌクレオチドがゲノムに組み込まれたウィルスをいう。用いられるウィルスは特に限定されないが、安全性等の点からアデノウイルスが好ましい。また、アデノウイルスの中でも、使用の簡便さ等の点からタイプ 5のアデノウィルス力に好ましい。

本発明に使用される組換えウィルスは、ヒトテロメラーゼのプロモーターにより、 E1A遺伝子、 IRES配列及び E1B遺伝子が駆動される。腫瘍細胞では正常細胞と比較してテロメラーゼの発現が極めて高いため、テロメラーゼが含まれる腫瘍細胞においてはテロメラーゼプロモ一夕一力活性化し、これにより本発明に含まれる組換えウィルスが増殖する。このように、本発明の医薬組成物に含まれる組換えウイルスは、正常細胞では増殖せず、腫瘍細胞でしか増殖しないので、癌細胞特異的及びテロメラーゼ特異的に増殖及び複製されることになる。その結果、腫瘍細胞内では、ウィルス増殖による細胞障害が起こり、これにより、本発明に使用される組換えウィルスは腫瘍細胞を特異的に死滅させることができる。このような組換えウイルスを、本発明において放射線増感増強剤又は放射線併用用抗腫瘍剤として使用することができる。

「テロメラ一ゼのプロモーター」は、テロメラーゼの転写開始部位を決定し、その頻度を直接的に調節する。テロメラーゼとは、真核生物染色体の複製時の短縮に拮抗して、テロメァ長を維持する酵素である。このようなテロメラ一ゼのプロモー夕一の種類は、目的とする遺伝子の発現に用いるウィルスに対応しうる、適切なプ口モーターであればいかなるものでもよく、特に限定されるものではないが、例えば、ヒ卜テロメラーゼ逆転写酵素（hTERT) のプロモーターが好ましい。 hTERT は、その 5'末端の上流 1.4kbpの領域で、多くの転写因子結合配列が確認されており、その領域が hTERTプロモーターと考えられる力中でも、翻訳開始部位の上流 181bpの配列が下流の遺伝子発現に重要なコア領域である。本発明において、このコア領域を含むものであれば、限定されずに使用することができるが、このコァ領域を完全に含む上流 378bp程度の配列を hTERTプロモー夕一として使用するのが好ましい。この 378bp程度の配列は、 181bpのコア領域単独の場合と比べて、その遺伝子発現効率が同等であることが確認されている。 455bp の長さの hTERTプロモーターの塩基配列を配列番号 1に示す。また、 181bpのコア領域の塩基配列を配列番号 5に示す。

hTERTプロモー夕一は、配列番号 1に示される塩基配列又はそのコア領域の塩基配列（配列番号 5) のほか、配列番号 1又はコア領域の塩基配列からなる DNA に対し相補的な塩基配列よりなる DNA とストリンジェン卜な条件でハイブリダィズし、かつ hTERTプロモー夕一としての活性を有するヌクレオチドの塩基配列も含まれる。このようなヌクレオチドは、配列番号 1で表される塩基配列又はコア領域の塩基配列からなるポリヌクレオチド、又はその断片をプローブとして、コロ二一ハイブリダィゼーシヨン、プラークハイブリダィゼーシヨン、サザンブロット等の公知のハイブリダイゼーシヨン法により、 cDNAライブラリ一及びゲノムライブラリーから得ることができる。 cDNA ライブラリーの作製方法については、「Molecular Cloning, A Laboratory Manual 2nd ed.J (Cold Spring Harbor Press (1989)) を参照することができる。また、市販の cDNA ライブラリー及びゲノムライブラリーを用いてもよい。上記ハイブリダィゼーシヨンにおいてストリンジェントな条件としては、たとえば、 lxSSC〜2 xSSC、 0.1%〜0.5%SDS及び 42 〜68 の条件が挙げられ、より詳細には、 60〜68でで 30分以上プレハイプリダイゼ一シヨンを行った後、 2xSSC、 0.1%SDS中、室温で 5〜： 15分の洗浄を 4〜6回行う条件が挙げられる。ハイブリダィゼ一シヨン法の詳細な手順については、「Molecular Cloning, A Laboratory Manual 2nd ed.J (Cold Spring Harbor Press (1989);特に Section9.47-9.58)等を参照することができる。また、配列番号 1に示す塩基配列又はコア領域の塩基配列と 50%以上、 60%以上、 70%以上、 80%以上、 90%以上、 95%以上、 98%以上又は 99%以上の相同性を有し、かつ hTERTプロモーターとしての活性を有するヌクレオチドの塩基配列も、用いることができる。本発明において、 E1A遺伝子、 IRES配列及び E1B遺伝子をこの順に含むこととしたのは、 IRES配列を E1A遺伝子と E1B遺伝子との間に挿入したものを使用すると、ウィルス力宿主細胞に感染した際に、増殖能が高くなるためである。 E1A 遺伝子及び E1B遺伝子は、 E1遺伝子に含まれる遺伝子であるが、この E1遺伝子とは、ウィルスの有する DNA複製に関する初期遺伝子（early:E) と後期遺伝子 (late:L) のうちの初期遺伝子の一つをいい、ウィルスゲノムの転写の制御に係わるタンパク質をコードしている。 E1A遺伝子によりコードされる E1Aタンパク質は、感染可能なウィルス産生に必要な遺伝子群（E1B、 E2、 E4等）の転写を活性化する。 E1B遺伝子でコードされる E1Bタンパク質は、後期遺伝子（L遺伝子）の mRNAが、感染した宿主細胞の細胞質へ蓄積するのを助け、宿主細胞のタンパク質合成を阻害することで、ウィルスの複製を促進する。 E1A遺伝子、 E1B遺伝子の塩基配列を、それぞれ配列番号 2及び配列番号 3に示す。

E1A及び E1Bは、それぞれ配列番号 2及び配列番号 3に示される塩基配列のほか、配列番号 2及び配列番号 3からなる DNA に対し相補的な塩基配列よりなる DNAとストリンジェントな条件でハイブリダィズし、かつ各々 E1A及び E1Bとしての活性を有するタンパク質をコードする塩基配列も含まれる。このような塩基配列は、それぞれ配列番号 2及び配列番号 3で表される塩基配列からなるポリヌクレオチド、又はその断片をプローブとして、コロニーハイブリダィゼーシヨン、プラークハイブリダィゼーション、サザンブロット等の公知のハイブリダィゼ一ション法により、 cDNAライブラリ一及びゲノムライブラリ一から得ることができる。 cDNAライブラリ一の作製方法及びス卜リンジェン卜な条件は前記と同様である。また、配列番号 2又は 3に示す塩基配列と 50%以上、 60%以上、 70%以上、 80% 以上、 90%以上、 95%以上、 98%以上又は 99%以上の相同性を有し、かつ E1A 及び E1Bとしての活性を有するヌクレオチドの塩基配列も用いることができる。

IRESdnternal Ribosome Entry Site)とは、ピコルナウィルス科に特異的な夕ンパク質合成開始シグナルであり、 18Sリボソーム RNAの 3'末端と相補的な配列があるためリボソーム結合部位としての役割を果たすと考えられている。ピコルナゥィルス科のウィルス由来 mRNAはこの配列を介して翻訳されることが知られている。 IRES配列からの翻訳効率は高く、 mRNAの途中からでもキヤップ構造非依存的にタンパク質合成が行われる。したがって、本ウィルスでは、ヒトテロメラーゼのプロモーターにより E 1 A遺伝子と IRES配列の下流にある E 1B遺伝子の両方が独立に翻訳される。 IRESを使用すると、テロメラ一ゼのプロモーターの発現制御が E1A遺伝子、 E1B遺伝子に独立して及ぶために、 E1A遺伝子あるいは E1B 遺伝子のいずれか一方をテロメラーゼのプロモーターで制御する場合に比べて、ゥィルスの増殖をより厳格にテロメラーゼ活性を有する細胞に限定することができる。 IRES配列を配列番号 4に示す。また、 IRES は、配列番号 4に示される塩基配列のほか、配列番号 4からなる DNAに対し相補的な塩基配列よりなる DNAとストリンジェン卜な条件でハイブリダイズし、かつ IRESとしての活性を有するタンパク質をコードする塩基配列も含まれる。このような塩基配列は、配列番号 4で表される塩基配列からなるポリヌクレオチド、又はその断片をプローブとして、コロニーハイブリダィゼ一シヨン、プラークハイブリダィゼーション、サザンブロット等の公知のハイブリダィゼーション法により、 cDNAライブラリ一及びゲノムライブラリ一から得ることができる。 cDNAライブラリ一の作製方法及びストリンジェン卜な条件は、前記と同様である。また、配列番号 4に示す塩基配列と 50%以上、 60%以上、 70%以上、 80%以上、 90%以上、 95%以上、 98%以上又は 99%以上の相同性を有し、かつ IRESとしての活性を有するヌクレオチドの塩基配列も用いることができる。

また、本発明において、ヒトテロメラーゼのプロモーターは、 E1遺伝子の上流に位置する。テロメラ一ゼ活性を有する細胞内で増殖を促進することができるからである。

本発明の組換えウィルスに含まれる遺伝子は、通常の遺伝子工学的手法により得ることができる。例えば、遺伝子工学的手法として一般的に用いられている DNA 合成装置を用いた核酸合成法を使用することができる。また、铸型となる遺伝子配列を単離又は合成した後に、それぞれの遺伝子に特異的なプライマーを設計し、 PCR装置を用いてその遺伝子配列を増幅する PCR法（Current Protocols in Molecular Biology, John Wiley & Sons (1987) Section 6.1-6.4) 又はク口一二ングベクターを用いた遺伝子増幅法を用いることができる。上記方法は、 Moleculer cloning 2nd Edt. Cold Spring Harbor Laboratory Press (1989)等に従い、当業者ならば容易に行うことができる。得られた PCR産物の精製には公知の方法を用いることができる。たとえば、ェチジゥムブロマイドを用いる方法、 SYBR Greenl (Molecular probes 社）を用いる方法、 GENECLEAN (フナコシ）、 QIAGEN (QIAGEN社）等によるァガロースゲルを用いる方法、 DEAE-セルロース濾紙を用いる方法、フリーズ &スクイーズ法、透析チューブを用いる方法等がある。ァガロースゲルを用いる場合には、ァガロースゲル電気泳動し、 DNA断片をァガロースゲルより切り出して精製する。必要に応じて、慣用の配列決定法により期待された遺伝子が得られていることを確認することができる。例えば、ジデォキシヌクレォチドチェーン夕一ミネーション法（Sanger et al. (1977) Proc. Natl. Acad. Sci. USA 74： 5463) 等により行うことができる。また、適当な DNAシークェンサ一 (例えば、 ABI PRISM (アプライドバイオシステムズ社)）を利用して配列を解析することも可能である。

その後、上記のようにして得られた各々の遺伝子を所定の順序となるように連結させる。まず、上記各々の遺伝子を公知の制限酵素等で切断し、切断した当該遺伝子の DNA断片を公知のベクターに公知の方法に従って挿入し、連結する。公知のベクタ一としては、脳心筋炎ウィルス（ECMV) の IRES (mRNA内部のリポソーム結合部位）力含まれていて、 1種類の mRNAから 2箇所のオープンリーディングフレーム（ORF) を翻訳することが可能な pIRESベクターのほか、大腸菌由来のプラスミド（pCR4、 pCR2、 pCR2.1、 pBR322、 pBR325、 pUCl2、 pUC13 など）、枯草菌由来のプラスミド（pUB110、 pTP5、 pC194など）、酵母由来ブラスミド（pSH19、 pSH15など）、 λファージなどのバクテリオファージ、レトロゥィルス、ワクシニアウィルス、バキュロウィルスなどの動物ウィルスなどが用いられ、この他、 pAl-ll、 pXTl、 pRc/CMV, pRc/RSV、 pcDNAI/Neoなども用いられる。本発明の場合は、 pIRES ベクタ一を用いると、マルチクローニングサイトに、順次必要な遺伝子を挿入することにより、「ヒトテロメラーゼのプロモー夕一、 E1A遺伝子、 IRES配列及び E1B遺伝子」をこの順に含む組み換え遺伝子を作製することができるため、好ましい。 DNAの連結には、 DNA リガーゼを用いることができる。上記組換え遺伝子のウィルスへの組み込みは、例えばエレクトロボレーシヨン法、リボソーム法、スフエロプラスト法、酢酸リチウム法等を用いることができる。

本発明において、ヒトテロメラーゼとして hTERTを用いる場合について以下に具体的に説明する。

293細胞等の E1 遺伝子を発現している細胞から E1A-S、 E1A-AS, E1B-S、 EIB AS等のプライマーを用いて、 RT-PCR及び Z又は DNA-PCRを行うことにより E1A遺伝子及び E1B遺伝子を増幅し、必要に応じて TAクローニング等の公知の方法を用いて配列を確認した後、公知の制限酵素で E1A及び E1Bの DNA断片を切り出すことができる。

次に、本発明に使用される hTER ElA-IRES-ElBからなる遺伝子は、公知のベクター（例えば pIRES等）に『E1A-IRES-E1B』の順になるように各遺伝子を、マルチクローニングサイト等を利用して挿入することにより作製することができる。次いで、 Mlul、 Bgllll等の制限酵素で切り出した hTERTプロモーター配列を、 E1Aの上流に挿入することができる。

必要に応じて、 pShuttle などの公知ベクターに含まれるサイトメガロウィルス (CMV)プロモー夕一を Mfel、 Nhel等の適当な制限酵素により取り除き、その部位に phTERT-ElA-IRES-ΕΙΒから制限酵素 Nhelおよび Notlで切り出した配列を挿入することができる。このように、本発明に使用される hTERTElA IRES-ElBからなるカセットを組込んだアデノウイルスを、特に「テロメライシン」（「Telomelysin」）又は「ΟΒΡ·301」という。 hTERTプロモーターの制御下にアデノウイルスの増殖に必要な E1遺伝子を発現させることによって、ウィルスを癌細胞特異的に増殖させることができる。

組換えウィルスを細胞に感染させるには、例えば、以下の方法で感染させることができる。まず、ヒト大腸癌細胞 SW620、ヒト肺癌細胞 A549、 H1299等の細胞を適当な培養液が入った培養プレートに播き、炭酸ガス存在下で、 37でで培養する。培養液は、動物細胞培養に一般的に使用される DMEM、 MEM, RPMI 1640 などが採用され、必要に応じて血清、抗生物質、ビタミン等を添加することができる。培養した細胞に一定量の本ウィルス、例えば、 0.1〜： L0 MOI (multiplicity of infection) , 好ましくは、 0.1〜1 ΜΟΙを接種することにより感染させる。 ΜΟΙとは、一定量の培養細胞に一定量のウィルス粒子を感染させる場合のウィルス量（感染単位）と細胞数の比をいい、ウィルスを細胞に感染させる際の指標として用いられる。

ウィルス増殖を確認するには、ウィルス感染細胞を回収し、 DNAを抽出し、本ウィルスが有する適当な遺伝子を標的とするプライマーを用いてリアルタイム PCRを行うことで定量的に解析することができる。

3 . テロメライシン- GFP 本発明は、ヒトテロメラーゼのプロモー夕一、 E1A遺伝子、 IRES配列及び E1B 遺伝子をこの順に含む複製カセッ卜がウィルスゲノムの E1領域に組み込まれ、かつ、標識タンパク質をコードする遺伝子及び該遺伝子の発現を制御しうるプロモー夕一を含む標識カセッ卜がウィルスゲノムの E3領域に組み込まれた組換えウィルスを、放射線増感増強剤又は放射線併用用抗腫瘍剤として提供する。標識カセットは、プロモーター及び標識タンパク質をコードする遺伝子を含むものであり、プロモーターとしては、例えば CMV (サイトメガロウィルス）プロモー夕一（配列番号 6 )、 hTERT プロモーター（配列番号 1 )などが挙げられる。あるいは、発癌及び発癌抑制因子プロモーターを使用することも可能である。「発癌及び発癌抑制因子プロモーター」とは、癌細胞で発現が増強あるいは減弱している因子のプロモー夕一を意味し、例えば pl6プロモーター及び DR5プロモーターが挙げられる。これらのプロモーターにより標識タンパク質をコードする遺伝子力駆動される。本発明においては、標識タンパク質をコードする遺伝子として GFP(Green fluorescence protein)を使用した組み換えウィルスを「テロメライシン- GFP」という。

テロメライシン- GFPの標識カセッ卜に含まれる組換え遺伝子は、通常の遺伝子工学的手法により得ることができる。例えば、遺伝子工学的手法として一般的に用いられている DNA合成装置を用いた核酸合成法を使用することができる。また、铸型となる遺伝子配列を単離又は合成した後に、それぞれの遺伝子に特異的なブライマ一を設計し、 PCR装置を用いてその遺伝子配列を増幅する PCR法 (Current Protocols in Molecular Biology, John Wiley & Sons (1987) Section 6.1-6.4)又はクローニングベクターを用いた遺伝子増幅法を用いることができる。上記方法は、 Moleculer cloning 2^nd Edt. Cold Spring Harbor Laboratory Press (1989)等に従レ当業者であれば容易に行うことができる。得られた PCR産物の精製には公知の方法を用いることができる。たとえば、ェチジゥムブロマイドを用いる方法、 SYBR Greenl (Molecular probesネ±)を用いる方法、 GENECLEAN (フナコシ)、 QIAGEN(QIAGENネ： h)等によるァガロースゲルを用いる方法、 DEAE-セルロース濾紙を用いる方法、フリーズ &スクイ一ズ法、透析チューブを用いる方法等がある。ァガロースゲルを用いる場合には、ァガロースゲル電気泳動し、 DNA断片をァガロースゲルより切り出して精製する。必要に応じて、慣用の配列決定法により期待された遺伝子が得られていることを確認することができる。例えば、ジデォキシヌクレオチドチェーン夕一ミネ一シヨン法 (Sanger et al. (1977) Proc. Natl. Acad. Sci. USA 74： 5463)等により行うことができる。また、適当な DNAシークェンサ一（例えば、 ABI PRISM (ァプライドバイォシステムズネ±)) を利用して配列を解析することも可能である。その後、上記のようにして得られた遺伝子を公知の制限酵素等で切断し、切断した当該遺伝子の DNA断片を、上記標識タンパク質をコ一ドする遺伝子断片の上流に、当該遺伝子を駆動させうるように上記プロモーターをコードする遺伝子断片を配置するように組換え遺伝子を設計する。このとき、ブラスミドとして、シャトルプラスミド pHMllなどを用いることができる。そして、 DNAリガーゼを用いて両遺伝子を連結させ、ベクタ一に挿入し、標識カセット組換え遺伝子を作製する。

公知のべク夕一としては、 pShuttleベクタ一、大腸菌由来のプラスミド（pCR4、 pCR2、 pCR2.1、 pBR322、 pBR325、 pUC12、 pUCl3など）、枯草菌由来のプラスミド（pUB110、 pTP5、 pC194など）、酵母由来プラスミド（pSH19、 pSH15 など）、 λ ファージなどのバクテリオファージ、レトロウイルス、ワクシニアウイルス、バキュロウィルスなどの動物ウイルスなどの他、 pAl-11, pXTl、 pRc CMV, pRc/RSV, pcDNAI/Neoなどが用いられる。

その後、上記複製カセット及び標識カセットを含む組換え遺伝子を、適当な制限酵素を用いて切り出し、適当なウィルス発現ベクター挿入することにより、組換えウィルスを作製することができる。ウィルス発現ベクターには、アデノウイルス、レトロウイルス、ワクシニアウィルス、バキュロウィルスなど力挙げられえる力上記したように、アデノウイルス、特にタイプ 5のアデノウイルスが好ましい。力セッ卜のウィルスへの組み込みは、例えばエレクト口ポレーシヨン法、リボソーム法、スフエロプラスト法、齚酸リチウム法等を用いることができる。

本発明では、具体的には、シャトルプラスミド pHMll に pEGFP-Nl(CLONTECH)由来の CMV-EGFP-SV40P(A)を挿入し、このプラスミドの Csp45I断片を、 phTER'FElA-IRES ElBを組み込んだ pShuttleべク夕一の Clal 部位に挿入することによってテロメライシン- GFP組換え遺伝子を得ることができる。

本発明では、具体的には、上記のように作製した組換え遺伝子から、公知の制限酵素により必要な部分の配列を切り出し、 Adeno-X Expression System (CLONTECH) 等の市販のキットを用いて Adeno-X Viral DNA等のウィルスの DNAに挿入することができる（得られたものを「AdenoX-hAIB」という。）。

そして、この AdenoX-hAIBを公知の制限酵素により線状化した後、 293細胞等の培養細胞にトランスフエクシヨンすることで、感染性のある組換えウィルスを作製することができる。 4 . 放射線増感増強剤

本明細書において、放射線増感増強とは、放射線治療の効果を増強すること、及び放射線照射を併用したときに腫瘍を効果的に殺傷できるように腫瘍の放射線に対する感受性を高めることのいずれか一方又は両者を意味する。従って、本発明の放射線増感増強剤の使用態様は、放射線照射前に腫瘍に投与する形態、放射線照射中に腫瘍に投与する形態、放射線照射後に腫瘍に投与する形態、及び放射線耐性となつた腫瘍に投与する形態のいずれをも含むものであり、これらの形態の組合せも含む。このような薬剤として、本発明ではテ口メライシン又はテロメライシン- GFP 力使用される。「放射線」としては、電離放射線、粒子線及び放射性同位体から生じる放射線、例えば X線、ァ線、 α線、）3線、電子線、陽子線、及び中性子線などが挙げられるが、好ましくはァ線である。処置の対象となる生物としては、例えば、ヒト、マウス、ラット、ハムスター、モルモット、ゥサギ、ネコ、ィヌ、ブ夕、ゥシ、ゥマ、ャギ、サルなどの哺乳動物又はそれらの一部が挙げられるが、これらに限定されない。

本発明において、放射線増感の対象となる腫瘍としては、あらゆる種類の腫瘍を用いることができる。例えば、頭頸部、胃、大腸、肺、肝、前立腺、陴、食道、膀胱、胆嚢，胆管、乳房、子宮、甲状腺、卵巣等における固形癌、あるいは白血病、リンパ腫、肉腫、間葉系腫瘍等に有効である。また、皮膚の基底細胞癌や癌幹細胞などにも有効である。ヒ卜の組織由来の腫瘍細胞及び癌幹細胞のほとんどはテロメラーゼ活性の上昇を示しており、本発明の組み換えウィルスはそのようなテロメラ —ゼ活性により増殖力活発になった腫瘍細胞に全般的に作用しうる。

近年の研究により、いくつかの種類の腫瘍には、癌幹細胞と呼ばれる細胞が存在することが明らかになつている。癌幹細胞は、腫瘍再形成能を有し腫瘍を悪性化し、放射線や抗癌剤耐性をもたらすことが知られている。また、癌幹細胞は、特異的なマ一力一である CD133をその細胞表面に発現することが知られており、他の腫瘍細胞と識別できることが明らかになつている。

本発明において、放射線増感の対象となる腫瘍細胞には、放射線耐性又は抗癌剤耐性を有するものも含まれる。

上記のように、腫瘍細胞では正常細胞と比較してテロメラーゼの発現が極めて高レ従って、本発明の組換えウィルスは、正常細胞では増殖せず、腫瘍細胞のみで増殖するため、結果として腫瘍細胞を特異的に死滅させることができる。そして、ウィルスの感染によって腫瘍細胞の放射線に対する感受性が高まることから、より効果的に腫瘍を殺傷することができる。

放射線を照射するときの照射量は、一般的には 60〜70Gyが標準的照射量と考えられている力照射部位によって適宜変更することができる。また、これらの上限及び下限の照射量の範囲から適宜線量の範囲を選択することが可能である。本発明の組換えウィルスは腫瘍の放射線に対する感受性を高めるため、癌の一般的放射線療法で使用される線量よりも少なくて済む。 5 . 医薬組成物

本発明の組み換えウィルスを含む医薬組成物は、上記放射線増感増強剤のほか、放射線照射と併用するための抗腫瘍剤として、あるいは放射線に耐性となった腫瘍に対する治療剤として使用することができる。

これは、テロメライシン力腫瘍細胞に及ぼす細胞死の作用機序が、従来の杭がん剤によるアポトーシスの作用機序とは異なること、さらに、テロメライシンは、抗腫瘍作用を有する物質で腫瘍細胞が処理された場合でも、何らその影響を受けずに、その細胞内での増殖複製を行うことができるといった、テロメラィシンの性質により達成されたものである。

本発明の医薬組成物は、そのまま患部に適用することもできるし、あらゆる公知の方法、例えば、静脈、筋肉、腹腔内又は皮下等の注射、あるいは鼻腔、口腔又は肺からの吸入、経口投与、カテーテルなどを用いた血管内投与等により生体（対象となる細胞や臓器）に導入することもできる。さらに、本発明の医薬組成物に含まれる組換えウィルスは、他の抗腫瘍作用を有する物質（他の抗腫瘍剤）を併用することも可能である。この場合、組換えウィルスと他の抗腫瘍剤とを同時に投与することもできるし、一方を投与後、一定時間経過後に他方を投与する方法により生体に導入することもできる。

また、例えば凍結などの方法により扱いやすくした後、そのまま用いてもよく、あるいは賦形剤、増量剤、結合剤、滑沢剤等公知の薬学的に許容される担体、公知の添加剤（緩衝剤、等張化剤、キレート剤、着色剤、保存剤、香料、風味剤、甘味剤等が含まれる。）などと混合することができる。

本発明の医薬組成物は、錠剤、カプセル剤、散剤、顆粒剤、丸剤、液剤、シロップ剤等の経口投与剤、注射剤、外用剤、坐剤、点眼剤等の非経口投与剤などの形態に応じて、経口投与又は非経口投与することができる。好ましくは、筋肉、腹腔等への局部注射（特に腫瘍内注射)、静脈への注射等が例示される。

投与量は、有効成分の種類、投与経路、投与対象、患者の年齢、体重、性別、症状その他の条件により適宜選択されるが、腫瘍の放射線に対する感受性が高まるため、ウィルスの一日投与量としては、 10⁶〜： LOUPFU (plaque forming units) 程度、好ましくは 10⁹〜： LOiiPFU程度とするのがよく、 1日 1回投与することもでき、数回に分けて投与することもできる。また、本発明のウィルスを使用する際には、公知の免疫抑制剤等を用いることにより、生体の免疫を抑制し、ウィルスが感染し易くすることもできる。

ここで、本発明において、「併用」とは、本発明の組換えウィルス（医薬組成物）の投与と放射線照射との組合せを意味するが、本発明のウィルスの投与時期は放射線照射の時期を問わず、放射線照射前であっても照射後であっても照射中であってもよく、さらに、これらの時期を任意に組み合わせることが可能である。放射線照射後に投与する場合は、その投与時期は照射直後〜 48時間以内、好ましくは直後〜24時間以内である。但し、放射線照射によって治療効果が得られない患者（例えば放射線照射に対し耐性である腫瘍を有する患者）に対しても、本発明の医薬組成物を投与することができる。その場合の本発明の組換えウイルスの投与時期は不問であり、以前の放射線照射の時期から相当程度時間又は日数が経過しても投与することができる。また、放射線照射前に投与する場合は、その投与時期は照射前

24〜96時間前、好ましくは 48〜72時間前である。さらに、放射線照射と医薬組成物投与の処置間隔および処置回数は、腫瘍の大きさや患者の臨床症状に応じて適宜設定することができる。例えば、放射線を総線量を調節しながら週 2〜 7日間 (好ましくは 5日間）連日照射し、その照射期間中に医薬組成物を数回投与することが可能である。

本発明の医薬組成物は、以下の理由で副作用が生じる可能性は極めて低いと考えられ、非常に安全な製剤であるということができる。

( 1 ) 正常の体細胞ではテロメラーゼ活性がほとんどなく、また、造血細胞等の浮遊細胞では本発明のウイルスは感染しにくレ。

( 2 )本発明のウィルスは増殖能を有するので、通常の遺伝子治療で用いられている非増殖性ウィルスよりも低い濃度で使用することができる。

( 3 )本発明のウィルスが過剰に投与された場合であっても、生体内の通常の免疫作用によって抗ウィルス作用が働く。

( 4 ) 放射線照射の感受性を高めることができるため、放射線量及び/又は本発明のウィルス量を少なくしても抗腫瘍効果を得ることができる。以下、本発明を実施例によりさらに具体的に説明する。但し、本発明はこれら実施例に限定されるものではない。実施例 1

本発明者らは、腫瘍融解アデノウイルスをヒト癌細胞に感染させたときの当該ヒト癌細胞における DNA-PKcsの発現及び Ku70/80の細胞内局在に対する放射線増感効果を検討した。また、本発明者らは、電離放射線により、標的細胞におけるァデノウィルスの取り込みが変化するか否かを検討した。さらに、放射線治療を併用した場合の腫瘍融解ウイルス療法の治療効果を、 in vitro及び in vivoの両方で検討した。 1 . 材料及び方法

( 1 ) 細胞株及び細胞培養

ヒト非小細胞肺癌 (NSCLC) 細胞株である A549及びヒト類表皮癌細胞株である A431は、 10%牛胎児血清（FCS) 添加 Nutrient Mixture (Ham's F-12) 含有ダルべッコ改変ィ一グル培地（DMEM) で培養した。別のヒト NSCLC細胞株である H1299及びヒト食道癌細胞株である TE8は、 10% FCS、 25 mM Ν·2·ヒド口キシェチルピペラジン- Ν'-エタンスルホン酸（HEPES)、 100 units/mlぺニシリン、及び 100 g/mlストレプトマイシンを添加した RPMI 1640培地で単層培養により通常の方法で増殖させた。

( 2 ) 組換えアデノウイルス

腫瘍特異的に選択的に増殖する組換えアデノウイルスベクターである OBP-301 (テロメライシン）は、以前構築され、特徴付けられている（Kawashima T, et al. Clin Cancer Res 2004； 10: 285.292、 Taki M, et al. Oncogene. 2005;24:3130-40、 Umeoka T, et al. Cancer Res. 2004;64:6259-65、 Watanabe T， et al. Exp Cell Res. 2006;312:256-65)。本実施例においては、サイトメガロウィルスプロモーターの制御下に緑色蛍光タンパク質（GFP) をコードする cDNA を含む、選択的増殖性 OBP-401 (Fujiwara T, et al. Int J Cancer. 2006;119:432-40、 Kishimoto H, et al. Nature Med (in press), 2006.)、及び GFPをコードする cDNAを含む非増殖性の E1 欠失アデノウイルスベクター（Ad-GFP) (Umeoka T， et al. Cancer Res. 2004;64:6259-65) も使用した。これらのウィルスは、 CsCl₂段階勾配超遠心分離により精製後、 CsCl₂直線的勾配超遠心分離により精製した。ウィルス力価及び感染カ価は、 293細胞を用いてプラークアツセィにより測定した。

( 3 ) 細胞生存率測定

96ゥエルプレートに、 1000細胞/ゥエルでヒト腫瘍細胞を播種し、 12時間後に放射線に曝露した。その後、 XTT (3'- [1- (フエニルァミノカルボニル） -3,4-テトラゾリウム] -ビス（4-メトキシ -6-ニトロ）ベンゼンスルホン酸ナトリウム水和物）アツセィを行った。細胞は、 MBR-1520R (Hitachi Medical Co., 東京、日本）を用いて、所定の線量のァ線 (0〜25 Gy) を単回照射した。放射線照射直後に、細胞に所定の MOI (multiplicity of infection) の OBP-301を感染させた。細胞生存率は、 Cell Proliferation Kit II (Roche Molecular Biochemicals, indianapolis, IN) を用いて製造業者により提供されたプロトコ一ルに従って処置し、 5日後に測定した。

( 4 ) 蛍光顕微鏡観察

Ad GFP又は OBP-401を感染させた後、ヒ卜癌細胞における GFP遺伝子の発現は、 Eclipse TS- 100蛍光顕微鏡（Nikon、東京）を用いて評価し、写真を撮影した（倍率： x200)。

( δ ) フローサイトメトリ一

フローサイトメトリーによる分析では、 2X10⁵細胞を抗コクサツキ一アデノウィルス受容体（CAR) マウスモノクローナル抗体（RmcB; Upstate Biotechnology, Lake Placid, NY) を用いて、 4°Cで 30分間標識し、フルォレセインイソチオシァネート（FITC)結合ゥサギ抗マウス IgG二次抗体 (Zymed Laboratories Inc., San Francisco, CA) を加えてインキュベートし、 FACScallibur フローサイトメ一夕一 (Becton Dickinson, Mountain View, CA) 及び CELL Questソフトウェアを用いて分析した。画面上のウインドウでは死細胞及び残渣を排除するようセットした。 GFP遺伝子のみの発現も FACScalliburで評価した。

( 6 ) 定量的リアルタイム PCRアツセィ

細胞は、 25 cm²フラスコに 5 X 10⁴の細胞数で播種し、 48時間後に放射線照射した。細胞は、 mock又は所定の線量のァ線に曝露し、その後 1.0 MOIの OBP-301 を 2時間感染させた。ウィルスを除去後、細胞を 37°Cでインキュベ卜し、 2、 24、 48、及び 72時間後にそれぞれトリプシンで処理して回収し細胞内増殖分析に供した。

DNAは、 QIAamp DNA Mini Kit (Qiagen Inc., Valencia, CA) を用いて抽出し、 E1A 遺伝子について LightCycler instrument ( Roche Molecular Biochemicals) を用いて定量的リアルタイム PCRアツセィを実施した。 E1Aに用いた特異的プライマーの配列は以下の通りである。

センス： 5'-CCT GTG TCT AGA GAA TGC ΑΑ·3' (配列番号 7 )

ァンチセンス： 5'-ACA GCT CAA GTC CAAAGG TT-3' (配列番号 8 ) PCRによる増幅では、 95°C、 600秒の変性ステップ後、 95°C、 10秒の変性、 58°C、 15秒のアニーリング、及び 72°C、 8秒の伸長反応を 1サイクルとしてこれを 40サイクル行った。データは、 LightCyclerソフトウェア（Roche Molecular Biochemicals)を用いて分析した。未処置の細胞の値で割ることにより標準化した値をそれぞれのサンプルについて示した。

( 7 ) ウエスタンプロット分析

本実施例では、 E1Aに対する一次抗体（PharMingen International, San Diego, CA)、 DNA-PKcsに対する一次抗体 (BD Transduction Laboratories, Lexington, KY)、及びペルォキシダーゼ結合二次抗体（Amersham, Arlington Heights, IL) を使用した。細胞は、冷リン酸緩衝生理食塩水（PBS) で 2 回洗浄した後、回収し、プロティナーゼ阻害剤 (0.1 mM フッ化フエ二ルメチルスルホニル、 0.5 mM Na₃V0₄)含有溶解バッファー [10 mM Tris (pH 7.5)、 150 mM NaCl、 50 mM NaF、 1 mMエチレンジァミン四酢酸（EDTA)、 10% グリセロール、 0.5% NP40] に溶解した。細胞溶解液は、氷上で 20分静置後、 4°C、 10分間、 14,000 rpmで遠心分離した。その上清は、全細胞抽出物として用いた。夕ンパク質濃度は、 Bio-Rad method (Bio-Rad, Richmond, CA) を用いて測定した。等量のタンパク質（50 g) を 5分間煮沸し、 6-12.5% (w/v) のポリアクリルアミドゲルを用い、還元条件下で電気泳動を行った。タンパク質は、 Hybond-ポリフッ化ビニリデン（PVDF) 早 z与膜 (Amersham Life Science, Buckinghamshire, UK; に fe与し、一次抗体とともにィンキュベートした後、ペルォキシダーゼ結合二次抗体を加えてさらにィン千ュべ一トし/こ。 Amersham ECL chemuuminescence system (Amersham, 東京）を用いて、結合した抗体のペルォキシダーゼ活性を検出した。

( 8 ) 免疫蛍光染色

組織培養チヤンバースライド（Nunc, Inc., Naperville, IL) 上でセミコンフルェントになった細胞に所定の処理を行い、次にアセトンで固定し、 PBSで 3回洗浄した。次に、スライドを Ku70/80に対する一次抗体（BD PharMingen, San Jose, CA) とともに 37 °Cで 1時間インキュベートした。スライドは、 PBSで 3回洗浄した後、二次抗体である FITC結合ャギ抗マウス抗体 (Immunotech, Co., Marseille: France) とともに 37°Cで 20分間インキュベートした。さらに、スライドを PBS で 3回洗浄した後、ョゥ化プロピジゥム（PI)で染色し（Molecular Probes, Eugene, OR) , 緩衝グリセロール溶液をマウントして蛍光顕微鏡観察に用いた。

( 9 ) in vivo ヒト腫瘍モデル

ヒト NSCLC細胞である A549(2xl0⁶細胞/マウス）を、 5-6週齢雌 BALB/c nu/nu マウスの側腹部に皮下注射し、直径約 5 mmになるまで増殖させた。その時点において、マウスを 4つのグループに無作為に割り当て、各マウスに 3 Gy/腫瘍の線量で 1日目力、ら 2日ごとに放射線を照射した。放射線照射直後に、 50 1の OBP-301 含有溶液（1投与量： lxlO⁸ PFU/個体）又は PBSを腫瘍に注射した。各腫瘍の垂直方向直径を 3日ごとに測定し、腫瘍体積は、以下の計算式を用いて計算した。腫瘍体積 (mm³) =axb²x0.5

式中、 a は最長径、 b は最短径であり、 0.5は楕円形の体積を計算するための定数である。実験プロトコ一ルは、岡山大学動物実験倫理審査委員会により承認された。

( 1 0 ) 統計分析

全てのデータは、平均土 SDで示した。グループ間の差については、 Student's t 検定を用いて統計学的有意差を検討した。 0.05未満の P値が統計学的有意差を意味する。乙 - $α术

( 1 ) ヒト癌細胞株に対する OBP-301と放射線の併用による in vitroでの抗腫瘍効果

本発明者らは、 in vitro において OBP-301と電離放射線が相互作用する可能性を検討するため、まず初めに、異なる臓器由来の 4種類のヒト癌細胞株 (肺 [A549、 H1299]、食道 [TE8]、及び表皮 [A431] ) に対し、各種用量又は線量の効果を評価した。細胞には、ァ線の単回照射を行った後、 mock又は OBP-301のいずれかを感染させ、処置から 5日後に細胞生存率を XTTアツセィにより評価した。実験条件を最適化するため、 OBP-301を単独で用いた場合に 0〜100%の細胞障害をもたらす OBP-301の濃度を選択した。

代表的な用量又は線量反応曲線を図 1Aに示す。放射線を併用することにより、 OBP-301の細胞障害活性は、実験に用いた全ての細胞株において用量又は線量依存的に増加した。図 1 Aにおいて、データは、 mockを処置した細胞に対する生存細胞の比率として示し、 3重（triplicate) 試験の平均土 SDとして示す。

A431及び A549細胞の細胞生存率を、処置から 5日後に評価した。 A431細胞においては、 10 MOIの OBP-301の感染により、電離放射線の細胞障害性が 5.7 倍に増加した（mock、 OBP-301感染細胞において、それぞれ LD₅₀ = 4.0、 0.7 Gy)。 A549細胞においては、 1MOIの OBP-301の感染により、電離放射線の細胞障害性が 4倍に増加した（mock、 OBP-301感染細胞において、それぞれ LD₅₀ =2.4、 0.6 Gy) (図 1B)。対照的に、非増殖性 Ad-GFPを感染させても、放射線治療に対する効果は認められなかった。図 1 Bにおいて、放射線の線量反応曲線は mockを処置した細胞に対する比率として示し、 3重試験の平均土 SDとして示す。 3種の独立した実験の代表的な結果を示す。

A431及び TE8細胞に対し、 l Gy放射線照射、 10 MOIの OBP-301の感染、又は両者の併用（放射線照射後の OBP-301感染）を実施し、細胞の形態は、処置から 5日後に評価した。位相差顕微鏡観察の場合、 1 Gyの放射線の単回照射のみを行ったときは、 A431細胞及び TE8細胞は 5日目にサブコンフルェントになるまで増殖することが示された。一方、放射線を 10 MOIの OBP-301感染と組み合わせた場合は、膨張した細胞、及び浮遊細胞を特徴とする、広範な細胞死による細胞生存率の迅速な低下が認められた（図 1C)。 OBP-301の感染単独でも効果を示したが、電離放射線は明らかに OBP-301の細胞障害効果を促進し、 OBP-301感染とァ線照射の併用は、 A431及び TE8両者において顕著な細胞障害効果を誘導した。

本発明者らは、腫瘍融解ウィルス療法と放射線治療の併用後のウィルスの増殖及び拡散を、視覚的にも確認した。 OBP-401は、ウィルス分布を GFP蛍光によってモニタすることができる点で有利である。 A549細胞に 2 Gyで放射線照射後、 0.1 MOIで OBP-401を感染させ、処置から 5日後に蛍光顕微鏡により観察した。ほとんどの細胞は細胞死に至ったが、 GFP発現は強力かつ持続的であり、このことは、ウィルス増殖および周囲の腫瘍細胞への拡散を示している。 GFP発現は、ァ線照射と併用した場合にも OBP-401を感染させた A549細胞において検出された (図 1D)。これらの結果は、腫瘍融解ウィルス療法と放射線治療の併用が抗腫瘍効果を in vitroにおいて促進することを示すものである。

( 2 ) ヒト癌細胞における OBP-301のウィルス増殖に対する放射線の効果本発明者らは、フローサイトメトリーを用いて細胞表面における CAR (抗コクサッキーアデノウイルス受容体）の発現に対する放射線の効果を測定した。 A431 及び A549細胞に 1又は 10 Gyの線量で放射線照射し、 24時間後にフローサイトメトリーにより分析した。細胞は、抗 CARモノクローナル抗体とともにインキュペートし、次に FITC標識ャギ抗マウス IgG二次抗体で検出した。 FITC結合アイソ夕ィプ適合（matched) 正常マウス IgGlを全ての実験においてコントロールとして用いた。 CAR陽性細胞の比率は、 A431細胞においては 100%、 A549細胞においては 99%であり、これらの発現レベルは、低線量（l Gy)及び高線量（10 Gy) の了線照射後においても維持された（図 2A)。

本発明者らは、ウエスタンブロッ卜分析により OBP-301のウィルス増殖に対する放射線の効果を検討した。具体的には、 A431及び A549細胞に、 mockを処置或いは 1又は 2 Gyの放射線を照射し、 10又は 1 MOI の OBP-301を感染させ、所定の時点で回収した。また、 293細胞は、陽性対照として用いた。全細胞溶解液は、ゲル電気泳動、 PVDF膜への転写、及び E1Aタンパク質のウエスタンブロッ卜に供した。

ウエスタンブロット分析を行った結果、 r線照射後であっても、 A431及び A549 細胞において、 OBP-301の感染が容易に検出可能なレベルの E1Aタンパク質の発現を誘導することが示された（図 2B)。これらの結果は、 hTERTプロモーターが、放射線照射された腫瘍細胞において転写的に活性を有することを示した。

さらに本発明者らは、子ウイルスの増殖に対する電離放射線の効果を定量的リァル夕ィム PCR分析により検討した。 A431、 TE8、及び A549細胞に lGy (A431、 TE8) 又は 2 Gy (A549) の線量で放射線照射し、次に 1.0 MOIの OBP-301を 2 時間感染させた。細胞は、感染から 72時間にわたり所定の時点で回収し、抽出した DNAをアツセィした。 OBP-301の細胞内ウィルスコピー数は、ァ線を照射した場合と照射していない場合において、時間経過とともに 4〜6桁増加した（図 2C)。感染から約 48 時間後にプラトーに達した。これらの結果は、電離放射線は OBP-301の増殖を妨害しないことを示している。

( 3 ) ヒト癌細胞におけるアデノウイルスの感染に対する放射線の効果

アデノウィルス剤の感染効率は、アデノウィルスが複雑な細胞侵入過程を有するため、外部刺激のみならず細胞種に依存して大きく異なる。従って、本発明者らは、放射線照射によってアデノウイルスのヒト癌細胞株への感染性を改善することができるか否かを、 GFP 遺伝子を発現する非増殖性アデノウイルスベクター (Ad GFP) を用いて検討した。

ヒト癌細胞である A431及び A549に、異なる放射線量（1〜： 10 Gy) の放射線照射を行い、次にそれぞれ 50 MOI、 10 MOIの Ad-GFPを感染させた。 48時間後、 GFP発現を蛍光顕微鏡観察により評価した。 GFP発現は、放射線を照射していない A431及び A549細胞の一部において認められる力 γ線に曝露した A431及び Α549細胞では、より高レベルの GFP発現が認められ、蛍光強度は線量依存的に増加した（図 3Α)。また、 A431及び Α549細胞の両者において、放射線量の増加に伴い GFPの発現レベルが増大することが示された（図 3Β)。具体的には、上記の通り処置した細胞の平均蛍光強度（MFI) を、フローサイトメトリーにより分析した。非照射 Ad-GFP感染細胞の MFI値を 1.0 とし、放射線照射細胞の相対的 MFI値を非照射細胞の MFI値に対する比率として計算した。 r線照射後の相対的 MFI値における増加が線量依存的であることは注目に値する。このことは、ヒト癌細胞におけるアデノウイルスの取り込みが電離放射線によって増大することを示している。

放射線が OBP-301の感染性を増大させるか否かを評価するため、 1 Gy (A431 及び TE8) 又は 2 Gy (A549) の線量でァ線を照射後、 A431、 A549、及び TE8 細胞に 1.0 MOIの OBP-301を感染させた。感染から 2時間後に抽出した DNAを用いて行った定量的リアルタイム PCR分析により、放射線照射した細胞における OBP-301感染後の E1Aの DNA量は、放射線を照射していない細胞よりも 1.8〜 2.5倍高いことが示された（図 3C)。従って、 OBP-301感染前の電離放射線照射により、ウィルス取り込みを増大させて腫瘍融解活性を高めることが示された。 ( 4 ) ヒト癌細胞における放射線誘発 DNA損傷の修復に対する OBP-301感染の効果

電離放射線誘発 DNADSBの修復に対する OBP-301感染の効果を検討するために、本発明者らは、放射線を照射した OBP-301感染 A549細胞及び照射していない OBP-301感染 A549細胞を用いて、 DNA修復タンパク質である DNA-PKcsの発現をウエスタンブロット分析により検討した。具体的には、 A549細胞に、 mock を処置又は 2 Gyの放射線を照射し、 mockを感染又は 1 MOIの OBP-301を感染させ、処置から 12 時間後に細胞を回収した。全細胞溶解液は、電気泳動し、 DNA PKcsについてウエスタンブロットを行った。 DNA-PKcsタンパク質発現は、 NIH イメージソフトウェアを用いた濃度測定スキヤニング（densitometric scanning) により定量し、ァクチンのシグナルを用いて標準化した。その結果、 DNA PKcsの発現は、 1.0 MOIの OBP-301の感染によって、 12時間後に 10倍以上減少した。 OBP-301の感染後に 2 Gyの電離放射線に曝露しても、 DNA-PKcs の発現レベルの減少に影響しなかった（図 4A)。同様の結果は、 A431細胞においても認められた。このことは、 OBP-301の感染によって DNA損傷の修復が阻害されることを示すものである。

Ku夕ンパク質は、 DNA-PKcs依存性 DSB修復において重要な役割を果たしており、また、アンチセンスによる Kuタンパク質の機能抑制は、電離放射線に対する腫瘍の感受性を高める可能性がある（Li GC, et al. Cancer Res. 2003;63:3268-74·)。また、 Kuタンパク質複合体（Ku70及び Ku80から構成される）は、独立して細胞質から核へと移行することが報告されている（Koike M， et al. J Cell Sci. 1999;112:4031-9、 Koike M, et al. Oncogene. 1999;18:7495-505、 Koike M, et al. Biochem Biophys Res Commun. 2000;276:1105-11)。

そこで本発明者らは、 OBP-301の感染が A549細胞における Ku70/80の細胞内局在に影響するか否かを検討した。具体的には、 A549細胞に、 mockを処置又は 2 Gyの放射線を照射し、 mockを感染又は 1 MOIの OBP-301を感染させ、次に処置から 12時間後に固定し、抗 Ku70/Ku80抗体 (Ku70及び Ku 80のサブュニットの双方を検出する抗体）を用いて染色した。細胞は PIでも染色した。抗 Ku70/Ku80抗体を用いた間接免疫蛍光染色により、無刺激の条件で核及び細胞質における強く広範な染色が示された。 2 Gyの線量の放射線を照射すると、核において Kuの染色が強く誘導され、反対に、細胞質の Ku発現の減少に関与した。対照的に、 OBP-301を感染させると、細胞質の Kuの染色が増加した。このことは、 OBP-301の感染が Kuタンパク質の核移行をブロックすることを示すものである。さらに、電離放射線を照射する前に OBP-301を感染させても、 Kuの核への移行がブロックされ、 Ku発現は細胞質に維持された（図 4B)。

( 5 ) ヒト腫瘍異種移植片における OBP-301の腫瘍内注射と放射線照射の併用による抗癌活性

本発明者らは、 OBP-301 と放射線との併用によるヒト細胞 A549 に対する in vivoにおける治療効果を評価した。 A549細胞（2X10⁶細胞/投与）を、異種移植片として nu/nuマウスの後側腹（hind flank) に移植した。触知可能な直径 7-12 mm の A549腫瘍を有するマウスに 3 Gyの局所放射線照射を行った後、 10⁸ PFUの OBP-301又は PBSのいずれかを、 1日目から 2日ごとに 3サイクルで腫瘍内注射した。 PBSをコントロールとして用レ 6匹のマウスを 1グループとして用いた。アデノウイルス DNAの損傷を防止するため、放射線照射は、 OBP-301の注射の前に行った。 OBP-301の腫瘍内投与又は放射線照射のいずれか一方でも、処置の開始から 42日後に mockを処置した腫瘍と比較すると有意に腫瘍増殖は抑制された（p <0.05)。 OBP-301と放射線とを併用すると、いずれか一方の方法により処置したマウス（p <0.05) 及び mockを処置した腫瘍 (p <0.01) と比較した場合、より顕著で有意に腫瘍増殖が阻害された（図 5A)。図 5Aにおいて、腫瘍の増殖は、腫瘍の平均体積土 SEMによって示した。

OBP-301と局所放射線照射を併用処置した腫瘍は、処置から 37日後の他のコホ一卜のマウスの腫瘍と比較して、肉眼的にも明らかに小さく、併用処置が極めて有効であることが示された（図 5B)。これに対し、非増殖性アデノウイルスを腫瘍内注射した場合は、放射線照射の併用にかかわらず、 A549腫瘍の増殖に対する効果が認められなかった。局所放射線照射又は OBP-301感染のいずれかを 3サイクル行い、 10 日後に切除された腫瘍の切片を用いて病理組織学的分析を行った。その結果、 OBP-301 を感染させた場合は、組織が明らかに退縮し、未処置の腫瘍と比較して腫瘍細胞密度の減少を示した。 OBP-301の注射と放射線照射とを併用処置すると、広範な組織破壊が生じ、腫瘍細胞密度がさらに減少した。さらに、併用療法によって誘導される細胞融解の変化（cytolytic changes) においては、硝子化した無細胞性の間質（hyalinized aceUular stroma)への置換が認められた（図 5C)。また、腫瘍における広範なウィルス分布を、アデノウイルスへクソン（hexon) 夕ンパク質の免疫組織化学染色により確認した。

( 6 ) 考察

本発明者らは、 OBP-301の感染と電離放射線の相互の増感増強効果を検討し、 in vitro及び in vivoにおける併用による抗癌効果を見出した。

腫瘍融解ウィルス療法は、ヒ卜の癌の分子的側面の理解及びウィルスゲノムの遺伝子改変に関する技術開発に基づいて、今後さらに成長する可能性のある分野である。し力しな力、腫瘍融解ウィルス療法それ自体によっては、標的腫瘍において高いウィルス力価が持続するにもかかわらず、前臨床動物モデル又は臨床研究ではめったに腫瘍を死滅させることができない。

ウィルスは、現在の治療方法によるものとは異なるメカニズムにより腫瘍融解を弓 Iき起こす。従って、本発明の腫瘍融解ウィルス療法は、相乗的な作用機序により、有用な集学的臨床アプローチをもたらすものである。テロメラーゼ特異的腫瘍融解アデノウイルスである OBP-301は、大部分のヒトの癌におけるテロメラーゼの発現活性により、多様なヒト癌細胞を効率的に殺傷するこ'とができる新規の生物剤である。

ヒトアデノウイルス血清型 5に由来するアデノウイルス剤の感染効率は、 CAR の発現に依存して大きく異なる（Wickham TJ, et al. Cell. 1993;73:309-19)。実際に、本発明者らは、低レベルの CAR しか発現しない一部の腫瘍に対しては OBP-301が効果を示さないこと（Taki M, et al. Oncogene. 2005;24:3130-40)、及びヒストンデァセチラーゼ（HDAC) 阻害剤である FR901228を処置した腫瘍細胞における CARのアップレギユレーションカ細胞内ウィルス増殖量を増大させ、これにより、相乗的な抗腫瘍効果を促進すること（Watanabe T, et al. Exp Cell Res. 2006;312:256-65) を以前に示した。 HDAC阻害剤とは対照的に、本発明者らは、放射線照射は試験に用いた標的細胞株全てにおいて CARの発現を有意に増加しないことを見出した。また、放射線治療は、 in vivoにおいて ElB 55 kDa欠失腫瘍融解アデノウイルスである ONYX-015の感染との併用効果を示すにもかかわらず、 in vitroにおいて悪性ダリオ一マ細胞において CAR発現を変化させなかったこと (Geoerger B, et al. Br J Cancer. 2003;89:577-84) が報告されている。しかしながら、興味深いことに、アデノウイルスの感染性が電離放射線の照射後に増加することカ^ OBP-301そのものだけでなく非増殖性 Ad-GFPでも確認された。 OBP-301 の感染から 2時間経過直後のウィルス DNAのレベルは、未処置の細胞よりも放射線照射した細胞において明らかに高い値を示した。

これらの結果は、ウィルス感染前に放射線照射を行っても OBP-301による CAR 非依存性の細胞侵入を可能にし、それにより、アデノウイルス感染の CAR依存性による制限を克服しうることを示す。

OBP-301は、腫瘍細胞に放射線照射することにより効率よく取り込まれるが、増殖量は、放射線照射の有無に関係なく 3種類の細胞株において変化しなかった。このことは、感染前に放射線照射しても基本的なウィルス増殖サイクルは変化しないことを示している。

本発明者らのデータは、 OBP-301の感染後の DNA-PKcs夕ンパク質の発現において有意なダウンレギュレーションを示した。以前報告されたように、考えられる説明の一つは、アデノウイルス E4産物が、 DNA-PKとの物理的な複合体を形成することによって、 DNA-PK依存性 DSB修復を阻害するというものである（Boyer J, et al. Virology. 1999;263:307-12)。

DNA DSBは、 Ku複合体と DNA-PKの相互作用を促進し、 DNA損傷のより効率的な修復を確実にするため、 Kuタンパク質は電離放射線への応答において核へ移行する。本発明者らは、 OBP-301の感染がこの核移行を阻害し、細胞質における Ku発現の増加を引き起こすことを見出した。従って、 OBP-301を感染させた腫瘍細胞は、電離放射線への感受性をより高めると言える。

本発明者らの in vitroにおける研究は、 OBP-301感染及び電離放射線が互いにヒト腫瘍細胞の感受性を高め、これにより併用療法の効果を増加し得ることを示す。電離放射線は、迅速な DNADSBを引き起こし、ウィルスの取り込みを促進する。一方、 OBP-301の感染は、ウィルスが増殖し、その細胞障害効果を誘導し、細胞の放射線への感受性を高めるために時間を必要とする。従って、実際の臨床応用においては、外部放射線治療（external-beam radiotherapy) 後に OBP-301の腫瘍内注射を行うこと力併用効果を最大にする治療計画として適切であろう。

患者は多くの場合、月曜日から金曜日まで一日毎に放射線治療を受けることから、 OBP-301は、腫瘍内投与により、次の放射線治療までの間に腫瘍病巣において増殖し、拡散すること力^能となる。本発明者らの in vitroにおける実験は、相対的に低用量の OBP-301 (1〜： L0 MOI) 力種々のヒト腫瘍細胞株において電離放射線の細胞障害活性を有意に促進することを示した。さらに、 GFP発現腫瘍融解ゥィルス（OBP-401) の感染及び増殖は、蛍光顕微鏡で観察した場合に、単回治療後に生き残った腫瘍細胞において認められた。このことは、反復治療が、ウィルス感染により予め放射線に増感した腫瘍細胞を殺傷する上でより効果的であることを示している。この推測は、 in vivo異種移植モデルにおいて確認することができた。

OBP-301の腫瘍内注射と局所放射線照射とを組み合わせて交互に一日間隔で 3 サイクル行うことにより、長期間にわたり、異種移植した A549腫瘍の増殖が明らかに阻害された。また、組織学的分析は、 OBP-301 と放射線の併用が、それぞれの方法を単独で行うよりも腫瘍破壊においてより大きな効果をもたらすことを示した。

本発明者らの実験で示された in vivoにおける優れた抗腫瘍活性については、いくつか説明をすることができる。第一に、上述したように、放射線治療とウィルス療法の反復サイクルは、腫瘍細胞の両治療法に対する感受性を高め、それにより、相乗的な抗腫瘍活性を得ることができる。第二に、 OBP-301は、高いテロメラゼ活性を伴って、放射線照射した腫瘍において増殖の促進を示す内皮細胞を殺傷することにより血管供給を阻害する（Tsai JH， et al. Cancer Biol Ther. 2005;4:1395-1400)。また、局所放射線照射それ自身は、腫瘍部位における血管内皮細胞を攻撃し得るが、一方で局所注射した OBP-301の血流への移動を防止する。実際に、電離放射線は内皮細胞の増殖、管形成、遊走、及びクローン原性細胞の生存 ( clonogenic survival ) を阻舎 9 る ( Abdollahi A, et al. Cancer Res. 2003;63:8890-8.)。

また、ウィルス療法及び放射線治療は、明確なメカニズムにより、腫瘍の異なる部分における腫瘍細胞を標的とすること力と考えられる。例えば、腫瘍を低酸素状態にすると、腫瘍細胞は電離放射線に対してより抵抗性となり（Hockel M， et al. J Natl Cancer Inst. 2001;93:266-76.)、腫瘍領域に局在する細胞は、低酸素条件下において生存し増殖し得る。このため、電離放射線に抵抗性を有する低酸素条件下の腫瘍細胞をいかにして殺傷するかが臨床上の課題となっている。

一方、低酸素状態は、低酸素誘導因子 l a (HIF-l a ) によって hTERT遺伝子プロモーターの転写活性を誘導すること（Nishi H, et al. Mol Cell Biol. 2004;24:6076-83、 Anderson CJ, et al. Oncogene. 2006;25:61-9) から、 OBP-301 は、低酸素条件下であっても増殖し、腫瘍細胞を効率的に殺傷すると推測し得る。従って、 hTERT特異的腫瘍融解ウィルス療法は、局所放射線治療後に生存している腫瘍細胞を死滅させるために効果的である。

この併用療法の別の利点としては、これらの治療法が異なる細胞障害メカニズムによって機能することから、交差耐性の可能性が低いことが挙げられる。

要約すると、本発明者らのデータは、 OBP-301の感染と電離放射線とが互いにそれぞれの生物学的効果を改善し、それにより互いに増強し、 in vivoの前臨床モデルにおける抗腫瘍活性を大きく促進することを示す。実施例 2

近年の研究により、いくつかの種類の腫瘍には、癌幹細胞と呼ばれる細胞が存在することが明らかになつている。癌幹細胞とは、正常幹細胞の自己複製様式に類似した特徴を有する腫瘍細胞であり、腫瘍再形成能を有し腫瘍を悪性化する。そして、放射線耐性や抗癌剤耐性をもたらすことが知られている。

従って、腫瘍の放射線療法及び化学療法を効果的に実施するためには、放射線耐性や抗癌剤耐性を有する癌幹細胞を殺傷することが求められる。

また、癌幹細胞は、特異的なマ一カーである CD133をその細胞表面に発現する。そこで、本発明者らは、放射線耐性及び抗癌剤耐性を有する癌幹細胞が CD133 陽性であることに着目し、本発明のウィルスが、放射線耐性株の細胞群から単離した CD133陽性細胞に対して抗腫瘍効果を示すか否かについて検討を行った。 1 . 細胞株の準備

ヒト胃癌細胞（MKN45) (以下「親株」ともいう）を 37t、 5% C02の条件下で 7日間 RPMI1640培地（SIGMA社）で培養した後、 2Gyの電離放射線を照射し、その後 14日間の回復期間（細胞集団が再成長する期間）を設けた。電離放射線の照射と回復期間の設定は 3回繰り返して行った（計 6 Gyの照射)。その結果、電離放射線耐性株（MKN45 R3) を得た（図 6 )。

得られた放射線耐性株 (MKN45 R3) 及び親株 (MKN45) における CD133陽性細胞の割合を、それぞれ CD133-APC 抗体（MiltenyiBiotec 社）及び FACS (Becton-Dicknson社）を用いてフローサイトメトリーによって解析した。

その結果、親株の細胞群における CD133陽性細胞の割合は平均約 2%であり、放射線耐性株の細胞群における CD133陽性細胞の割合は平均約 22%であった。この結果から、 CD133陽性細胞の割合は放射線耐性株の細胞群において著しく上昇することがわかった（図 7 )。

前記放射線耐性株の細胞群から CD133陰性細胞（CD133 - ) および CD133陽性細胞（CD133+) を、 FACS を用いてそれぞれソートした。その結果、 CD133 陰性細胞は、 97.5%の純度でソートすることが可能であり、 CD133 陽性細胞は 76.5%の純度でソートすることが可能であった（図 8 )。

ソート後の CD133陰性細胞および CD133陽性細胞は、その後の実験に用いた。

2 . CD133陽性細胞の自己複製能力

上記 1 . で得られたソート後の CD133陰性細胞及び CD133陽性細胞の自己複製能力（repopulation/self-renewal ability) を、フローサイトメトリーによって検討した。

具体的には、放射性耐性株の細胞群を FACSでソートした直後の、 CD133陰性細胞が大多数を占める CD133陰性細胞群、及び CD133陽性細胞が大多数を占める CD133 陽性細胞群を、それぞれ分化促進因子であるゥシ血清 10%を加えた RPMI1640培地（SIGMA社）中、 37で、 5% C02の条件下で 2週間培養した。この過程において、ソート直後の細胞、培養 1週間後の細胞、及び培養 2週間後の細胞に含まれる CD133陰性細胞及び CD133陽性細胞を FACSを用いて定量した（図 9 )。

その結果、 CD133陽性細胞が大多数を占める CD133陽性細胞群に含まれる細胞は、 CD133陽性細胞と CD133陰性細胞に分化増殖したが、 CD133陰性細胞が大多数を占める CD133陰性細胞群に含まれる細胞は、主に CD133陰性細胞として増殖した。次に、分化抑制因子である白血病抑制因子（Leukemia inhibitory factor) の存在下における CD133陽性細胞の自己複製能力を、フローサイトメトリーで検討した。

具体的には、放射性耐性株の細胞群を FACSでソートした直後の、 CD133陰性細胞が大多数を占める CD133陰性細胞群、及び CD133陽性細胞が大多数を占める CD133陽性細胞群を、それぞれ分化促進因子であるゥシ血清 10%及び分化抑制因子である白血病抑制因子 (10ng/ml)を加えた RPMI1640培地中、 37 ：、 5% C02 の条件下で 1週間培養した。その結果、ソート直後の、 CD133陽性細胞が大多数を占める CD133陽性細胞群において、 CD133陽性細胞から CD133陰性細胞への分化は抑制され、 CD133陽性細胞群に占める CD133陽性細胞の割合は、白血病抑制因子を添加しなかった場合と比較して上昇した（図 1 0 )。

3 . CD133陽性細胞の未分化スフエア形成

スフエアとは、幹細胞が無血清培地で接着せず浮遊している状態で、未分化なまま増殖する際に形成する細胞のコロニーであると言われている。そこで、本節では、ソ一卜後の CD133陽性細胞が大多数を占める CD133陽性細胞群がスフエアを形成するか否かについて検討を行い、さらにスフエアに含まれる細胞について検討を行った。

CD133陽性細胞及び CD133陰性細胞を、 FACSによりソート、分離した後、.ゥシ血清を含まず、上皮増殖因子（Invitrogen 社）と塩基性線維芽細胞増殖因子 (Invitrogen社）を含む RPMI1640培地（SIGMA社）中、 37で、 5% C02の条件下で 2週間増殖させた。その結果、 CD133陽性細胞が大多数を占める CD133 陽性細胞群は容易にスフエアを形成したが、 CD133 陰性細胞が大多数を占める CD133陰性細胞群は線維芽細胞様の増殖を示し、スフエアをほとんど形成しなかつた（図 1 1 )。 ,

また、 CD133 抗体を用いてスフエアをフローサイトメトリーで分析すると、 CD133陽性細胞が大多数を占める CD133陽性細胞群から培養して得られたスフエアの細胞は、 CD133陽性細胞と CD133陰性細胞の両方を含んでいた（図 1 2 右パネル)。これに対し、 CD133陰性細胞が大多数を占める CD133陰性細胞群から培養した細胞は、 CD133陰性細胞のみを含んでいた（図 1 2左パネル)。この結果は、 CD133陽性細胞が自己複製能力を有していることを示すものである。

4. CD133陽性細胞と CD133陰性細胞の抗癌剤耐性、放射線耐性についての検討、並びにテロメライシン（OBP-301) の抗腫瘍効果の検討

FACSによりソートした CD133陽性細胞群と CD133陰性細胞群を、 96·ゥエル培養プレートに 1ゥエルあたり 5 X 10²個の細胞数で播種し、 37 、 5% C02の条件下で 24時間培養した。

以下に示すとおり、化学抗癌剤の投与、電離放射線の照射、テロメライシン感染のいずれかを行い、 7日後に XTTアツセィで細胞の生存率を測定した。

( 1 ) CD133陽性細胞と CD133陰性細胞の抗癌剤耐性についての検討上記培養細胞に、 5-FU、シスブラチン（CDDP)、パクリ夕キセルをそれぞれ異なる濃度で処理し、 7日後に XTTアツセィで生存率を測定した。薬剤耐性は次式で計算した。

(薬剤投与群の吸光度） / (未処理の群の吸光度） X 100%

CD133陽性細胞と CD133陰性細胞を 5-FU、シスブラチン（CDDP)、パクリタキセルで処理した結果をそれぞれ、図 1 3、図 1 4、図 1 5に示す。実験は 3度繰り返して行い、同様の結果が得られた。統計的有意差（pぐ 0.05) はァス夕リスクで示した。

実験の結果、 CD133陽性細胞は化学抗癌剤に対して高い薬剤耐性を示した。

( 2 ) CD133陽性細胞と CD133陰性細胞の放射線耐性についての検討上記培養細胞に 3〜1 O Gyの放射線を照射し、 7日後に XTTアツセィで生存率を測定した。電離放射線耐性は次式で計算した。

(放射線照射後の細胞の吸光度） / (未処理の細胞の吸光度） X 100%

結果を図 1 6に示した。 CD133陽性細胞は、電離放射線に対して高い耐性を示した。

実験は 3回繰り返し行い、同様の結果を得た。統計学的有意差 ( 0.05)はァス夕リスクで示した。

( 3 ) 癌幹細胞に対するテロメライシンの抗腫瘍効果

上記放射線耐性の癌幹細胞に 3 MOI〜4 0 MOI のテロメライシンを投与し、 7 日後、 XTTアツセィで細胞の生存率を調べた。

耐性は次式で計算した。

(テロメライシン投与群の吸光度 Z未処理の群の吸光度） X 100

テロメライシンの抗腫瘍効果の結果を図 1 7に示した。テロメライシンは、 CD133陽性細胞及び CD133陰性細胞の両細胞を効果的に投与量依存的に殺傷することがわかった。

5. hTERT活性の比較

癌幹細胞は自己再生能、コロニー形成能、多分化能、腫瘍形成能などの特徴を有する。自己再生能や多分化能の特徴から、癌幹細胞は高いテロメラーゼ活性を示す可能性があり、テロメライシンの抗腫瘍効果が発揮できると期待される。

CD133陽性細胞及び CD133陰性細胞でテロメラーゼ発現が異なる可能性を検討するため、ヒトテロメラーゼ逆転写酵素（hTERT)の mRNAレベル、テロメラ —ゼ触媒性サブュニッ卜、テロメラーゼ活性の limiting factorを測定し、比較した。 CD133陽性細胞及び CD133陰性細胞を培養し、それぞれの全 RNAを RNeasy Micro kit (キアゲン）を用いて抽出した。抽出した全 RNAは DNaseによって処理し、引き続き、ランダムへキサマーと MuLV逆転写酵素（アプライドバイオシステムズ）によって逆転写した。 SYBR Green Real-Time Core Reagents (ァプライドバイオシステムズ) .を用いてリアルタイム PCRを行った。 18 1の PCR反応液につき、 2 1の希釈した cDNA (全 RNAlOOngをテンプレートとして得られたもの）を加えた。発現レベルはハウスキーピング遺伝子の h-PBGD (ロシュ）によって正規化した。

その結果、図 1 8に示すとおり、 CD133陽性細胞での hTERT発現量は、 CD133 陰性細胞よりも高かった。本実施例により、テロメライシン（OBP-301) を放射線照射後の腫瘍細胞に感染させることにより、放射線耐性を有する腫瘍細胞を殺傷できることが明らかとなつた。これは、本発明の薬剤が放射線治療の効果を著しく増強することを示すものであり、また、本発明の薬剤が放射線と併用するための抗腫瘍剤として顕著な効果を有することを示すものである。産業上の利用可能性

本発明により、癌の放射線療法において腫瘍又は癌細胞に OBP-301を感染させておくと、腫瘍細胞の放射線に対する感受性を増加させることができる。また、あらかじめ腫瘍又は癌細胞を放射線照射した後に OBP-301を感染させると、腫瘍細胞を効果的に殺傷することができる。さらに、本発明により、放射線ゃ抗癌剤に耐性を示す腫瘍又は癌細胞を効果的に殺傷することができる。従って、本発明に使用されるウィルスは、放射線の感受性を高めることによつて顕著な抗腫瘍効果を示すことができ、放射線との併用療法に極めて有用である。配列表フリーテキスト

配列番号 7 ：合成 DNA

配列番号 8 ：合成 DNA

Claims

請求の範囲

1 . ヒトテロメラーゼのプロモーター、 E1A遺伝子、 IRES配列及び E1B遺伝子をこの順に含む複製カセッ卜がウィルスゲノムの E1領域に組み込まれた組換えウィルスを含む、放射線増感増強剤。

2 . ヒトテロメラ一ゼのプロモーター、 E1A遺伝子、 IRES配列及び E1B遺伝子をこの順に含む複製カセッ卜がウィルスゲノムの E1領域に組み込まれ、かつ、標識タンパク質をコードする遺伝子及び該遺伝子の発現を制御しうるプロモ —夕一を含む標識カセットがウィルスゲノムの E3領域に組み込まれた組換えゥィルスを含む、放射線増感増強剤。

3 . 腫瘍又は癌の放射線に対する感受性を高めることができる請求項 1又は 2に記載の放射線増感増強剤。

4. ヒトテロメラーゼのプロモーターが hTERTプロモーターである、請求項 1又は 2に記載の放射線増感増強剤。

5 . 標識夕ンパク質が GFPである、請求項 2に記載の放射線増感増強剤。

6 . 標識タンパク質をコードする遺伝子の発現を制御しうるプロモーターがサイトメガロウィルスプロモー夕一又は hTERTプロモーターである、請求項 2 に記載の放射線増感増強剤。

7 . ウィルスがアデノウイルスである、請求項 1又は 2に記載の放射線増感増強剤。

8 . 標識タンパク質をコードする遺伝子の発現を制御しうるプロモーターが発癌及び発癌抑制因子プロモーターである、請求項 2に記載の放射線増感増強剤。

9 . 放射線照射前、照射後及び照射中の時期から選ばれる少なくとも 1つの時期に投与されることを特徴とする、ヒトテロメラ一ゼのプロモー夕一、 E1A遺伝子、 IRES配列及び E1B遺伝子をこの順に含む複製カセッ卜がウィルスゲノムの E1領域に組み込まれた組換えウィルスを含む、放射線併用用抗腫瘍剤。

1 0 . 放射線照射前、照射後及び照射中の時期から選ばれる少なくとも 1つの時期に投与されることを特徴とする、ヒトテロメラーゼのプロモー夕一、 E1A遺伝子、 IRES配列及び E1B遺伝子をこの順に含む複製カセッ卜がウィルスゲノムの El領域に組み込まれ、かつ、標識タンパク質をコードする遺伝子及び該遺伝子の発現を制御しうるプロモーターを含む標識力セットがウイルスゲノムの E3領域に組み込まれた組換えウィルスを含む、放射線併用用抗腫瘍剤。

1 1 . 腫瘍又は癌の放射線に対する感受性を高めることができる請求項 9又は 1 0に記載の抗腫瘍剤。

1 2 . ヒトテロメラーゼのプロモーターが hTERTプロモーターである、請求項 9又は 1 0に記載の抗腫瘍剤。

1 3 . 標識タンパク質が GFPである、請求項 1 0に記載の抗腫瘍剤。

1 4. 標識タンパク質をコードする遺伝子の発現を制御しうるプロモー夕一がサイトメガロウィルスプロモーター又は hTERTプロモー夕一である、請求項 1

0に記載の抗腫瘍剤。

1 5. ウィルスがアデノウイルスである、請求項 9又は 1 0に記載の抗腫瘍剤。

1 6. 標識タンパク質をコードする遺伝子の発現を制御しうるプロモー夕一が発癌及び発癌抑制因子プロモーターである、請求項 1 0に記載の抗腫瘍剤。

1 7 . 請求項 1〜1 6に記載の剤の製造における、ヒトテロメラーゼのプロモーター、 E1A遺伝子、 IRES配列及び E1B遺伝子をこの順に含む複製カセットがウィルスゲノムの E1領域に組み込まれた組換えウィルスの使用。

1 8. 請求項 1〜1 6に記載の剤の製造における、ヒトテロメラ一ゼのプロモー夕一、 E1A遺伝子、 IRES配列及び E1B遺伝子をこの順に含む複製カセットがウィルスゲノムの E1領域に組み込まれ、かつ、標識タンパク質をコードする遺伝子及び該遺伝子の発現を制御しうるプロモーターを含む標識力セットがウイルスゲノムの E3領域に組み込まれた組換えウイルスの使用。

1 9 . ヒトテロメラーゼのプロモーターが hTERTプロモーターである、請求項 1 7又は 1 8に記載の使用。

2 0. 標識タンパク質が GFPである、請求項 1 8に記載の使用。

2 1 . 標識タンパク質をコードする遺伝子の発現を制御しうるプロモーターがサイ卜メガロウィルスプロモーター又は hTERTプロモーターである、請求項 1 8に記載の使用。

2 2 . ウィルスがアデノウイルスである、請求項 1 7又は 1 8に記載の使用。

3. 標識タンパク質をコードする遺伝子の発現を制御しうるプロモーターが発癌及び発癌抑制因子プロモーターである、請求項 18に記載の使用。