KR20220097382A

KR20220097382A - 유전자 변형된 엔테로바이러스 벡터

Info

Publication number: KR20220097382A
Application number: KR1020227007354A
Authority: KR
Inventors: 훙린 뤄; 윌리엄 웨이-궈 자; 후이타오 류; 이스마엘 사무디오
Original assignee: 바이로진 바이오테크 캐나다 리미티드
Priority date: 2019-08-05
Filing date: 2020-08-05
Publication date: 2022-07-07
Also published as: CN114514323A; AU2020326774A1; EP4009996A4; WO2021026275A1; JP2022543610A; EP4009996A1; US20220267799A1; CA3150053A1

Abstract

변형된 엔테로바이러스 게놈 (예컨대, 폴리오바이러스, 콕사키바이러스 또는 에코바이러스 게놈)을 갖는 복제 종양용해성 바이러스 벡터이며, 여기서 변형된 엔테로바이러스 게놈은 엔테로바이러스 게놈의 비번역 영역 (UTR)에 작동가능하게 연결된 하나 이상의 miRNA 표적 서열의 하나 이상의 카피를 갖는 것인, 복제 종양용해성 바이러스 벡터를 제공한다. 암 (예를 들어, 폐암 포함) 치료를 위한 조성물 및 방법 또한 제공한다.

Description

유전자 변형된 엔테로바이러스 벡터

관련 출원에 대한 상호 참조

본 특허 출원은 35 U.S.C. § 119(e)하에 2019년 8월 5일 출원된 미국 특허 가출원 번호 62/883,055의 이익을 주장하고, 상기 출원은 그 전문이 모든 목적을 위해 본원에서 참조로 포함된다.

본 발명의 기술분야

본 발명은 일반적으로 정상 조직에서 감소된 독성을 갖는 유전자 변형된 종양용해성 엔테로바이러스 벡터, 및 그의 용도에 관한 것이다.

서열 목록, 표 또는 컴퓨터 프로그램에 대한 참조

작성일이 2019년 8월 4일이고, 크기가 2.20 KB인 파일명이 "VIRO412_ST25.txt"인 서열 목록의 공식 사본은 EFS-Web을 통해 ASCII 포맷된 텍스트 파일로서 본 명세서와 공동으로 제출된다. EFS-Web을 통해 제출된 서열 목록은 본 명세서의 일부이며, 이는 그 전문이 본원에서 참조로 포함된다.

암은 신체의 다른 조직으로 확산되거나, 또는 침입하여 초기에 신체 기능의 변화 (암 유형에 따라 다름)를 초래하고, 결국에는 사망에 이르게 하는, 비제어된 또는 비정상적인 세포 성장을 포함하는 매우 다양한 질환을 포함한다. 매년 약 1,410만 건의 새로운 암 사례가 발생한다 (흑색종 이외의 피부암 제외).

많은 서방 세계에서, 폐암은 남성 및 여성에서 각각 3번째 및 2번째로 가장 흔한 암이며, 남녀 모두에서 암 관련 사망의 주요 원인이다. 비-소세포 폐암 ("NSCLC")은 폐암 사례의 ~85%를 구성한다. 그 중 선암종은 가장 흔한 유형의 폐암이며, 전체 폐암의 거의 절반을 차지한다. 유전자 돌연변이는 NSCLC의 발생에서 중요한 역할을 한다. 잘 확인된 발암성 드라이버 돌연변이로는 표피 성장 인자 수용체 ("EGFR") 및 커스틴(Kirsten) 래트 육종 바이러스 온코진 호몰로그 ("KRAS")를 포함하며, 이는 각각 폐 선암종의 ~15% 및 ~30%에서 발생한다.^.EGFR 돌연변이는 임상적으로 표적화될 수 있지만, KRAS 돌연변이는 현재 치료하기가 매우 어렵고, 불량한 예후와 연관이 있다. 소세포 폐암 ("SCLC")은 모든 폐암의 ~15%를 차지한다. SCLC 사례 중 60% 내지 90%는 종양 단백질 p53 및/또는 망막모세포종 단백질 (Rb)을 코딩하는 유전자의 돌연변이를 특징으로 한다. SCLC에 대한 표적화된 요법도 없다.

예를 들어, 방사선 요법, 화학요법, 암의 외과적 제거, 또는 이들 요법의 일부 조합을 비롯한 다수의 요법이 암을 치료하기 위해 개발되어 왔다. 진전을 보인 요법의 새로운 영역 중 하나는, 조성물 및 방법을 사용하여 ('정상' 세포가 아닌) 종양 세포를 특이적으로 표적화하고, 사멸시키는 것인 '표적화된 요법'이다.

표적화된 요법의 한 예는 종양용해성 바이러스이다. 간략하면, 종양용해성 바이러스는 그의 자가 복제 프로세스를 통해, 바람직하게는, 정상 조직에는 실질적인 손상을 일으키지 않으면서, 종양 세포의 용해를 유도할 수 있는 것으로 정의된다. 다른 암 요법에 비해 종양용해성 바이러스의 가장 큰 장점은 후보 바이러스가 특정 암 유형에 대한 그의 효능을 증가시키기 위해 유전자 조작될 수 있다는 점이다.

2015년, FDA는 흑색종 치료용으로 최초의 유전자 변형된 단순 헤르페스 바이러스 1 (탈리모겐 라허파렙벡(Talimogene laherparepvec) 또는 "T-VEC")을 승인하였다. 지난 수십 년 동안, 레트로바이러스, 백시니아 바이러스, 아데노바이러스, 홍역 바이러스 및 뉴캐슬병 바이러스를 비롯한 여러 상이한 종양용해성 바이러스 모두 암 치료용으로서 임상 시험에서 시험되고 있다. 그러나, 전반적인 항암 효능 및 특이성은 여전히 낮고, FDA 승인을 받은 폐암 바이러스요법은 아직 없다.

따라서, 건강한 형질전환되지 않은 세포에는 실질적인 손상을 일으키지 않으면서, 형질전환된 세포를 용해 및 파괴시키고, 선행 기술과 연관된 결점들 중 하나 이상의 것을 극복하는, 암, 예컨대, 폐암을 위한 개선된 표적화된 치료가 여전히 요구되고 있다.

배경기술 섹션에서 논의된 주제가 모두 반드시 선행 기술이어야 할 필요는 없으며, 단지 배경기술 섹션에서의 논의의 결과로서 그가 선행 기술인 것으로 간주되지 않아야 한다. 이러한 맥락에서, 배경기술 섹션에서 논의되거나, 또는 상기 주제와 연관된 선행 기술의 문제에 대한 인식은 선행 기술에 관하여 명확하게 언급되지 않는 한, 선행 기술로서 취급되지 않아야 한다. 대신, 배경기술 섹션에서의 주제에 대한 논의는 그 자체로도 창의적일 수 있는, 특정 문제에 대한 본 발명자의 접근법의 일부로 취급되어야 한다.

간단히 말하면, 본 발명은 종양-특이성을 추가로 증진시키기 위해 엔테로바이러스 게놈 (예컨대, 콕사키바이러스(Coxsackievirus), 예컨대, B3)을 변형시키는 마이크로-RNA ("miRNA") 기반 접근법에 관한 것이다.

한 측면에서, 본 발명은 변형된 엔테로바이러스 게놈 (예컨대, 폴리오바이러스, 콕사키바이러스 또는 에코바이러스 게놈)을 갖는 복제 종양용해성 바이러스 벡터 (즉, 재조합 벡터)를 제공하며, 여기서 변형된 엔테로바이러스 게놈 (예컨대, 폴리오바이러스, 콕사키바이러스 또는 에코바이러스 게놈)은 하나 이상의 miRNA 표적 서열의 하나 이상의 카피를 포함한다. 바람직한 실시양태 내에서, miRNA 표적 서열은 엔테로바이러스 게놈 (예컨대, 폴리오바이러스, 콕사키바이러스 또는 에코바이러스 게놈)의 비번역 영역 (UTR)에 작동가능하게 연결된다. 일부 실시양태에서, 콕사키바이러스는 콕사키바이러스 A 또는 콕사키바이러스 B이다. 특정 실시양태 내에서, 엔테로바이러스는 콕사키바이러스 B3이다. 다른 실시양태에서, 비번역 영역 (UTR)은 5' UTR, 및/또는 3' UTR이다.

일부 실시양태에서, 하나 이상의 miRNA 표적 서열의 하나 이상의 카피는 2개 이상의 상이한 miRNA 표적 서열의 하나 이상의 카피를 포함한다. 다른 실시양태에서, 2개 이상의 상이한 miRNA 표적 서열은 miR-1, miR-7, miR-30c, miR-124, miR-124*, miR-127, miR-128, miR-129, miR-129*, miR-133, miR-135b, miR-136, miR-136*, miR-137, miR-139-5p, miR-143, miR-154, miR-184, miR-188, miR-204, miR-208, miR-216, miR-217, miR-299, miR-300-3p, miR-300-5p, miR-323, miR-329, miR-337, miR-335, miR-341, miR-369-3p, miR-369-5p, miR-375, miR-376a, miR-376a*, miR-376b-3p, miR-376b-5p, miR-376c, miR-377, miR-379, miR-379*, miR-382, miR-382*, miR-409-5p, miR-410, miR-411, miR-431, miR-433, miR-434, miR-451, miR-466b, miR-485, miR-495, miR-499, miR-539, miR-541, miR-543*, miR-551b, miR-758, 및 miR-873으로 이루어진 군으로부터 선택되는 miRNA를 인식한다. 통상, 최종 생성물인 것으로 더욱 빈번하게 발견되는 가닥은 miRNA로 지칭되고, 더 드물게 발견되는 파트너는 miRNA*로 지칭된다. 다른 실시양태에서, 2개 이상의 상이한 miRNA 표적 서열은 miR-145 및 miR-143에 대한 표적 서열을 포함한다. 추가의 다른 실시양태에서, 2개 이상의 상이한 miRNA 표적 서열은 miR-145에 대한 표적 서열의 카피 4개 및 miR-143에 대한 표적 서열의 카피 2개를 포함한다. 다른 실시양태에서, 하나 이상의 miRNA 표적 서열의 하나 이상의 카피는 정방향 배향으로 존재하고/거나, 하나 이상의 miRNA 표적 서열의 하나 이상의 카피는 역방향 배향으로 존재한다. 일부 실시양태에서, 재조합 벡터는 면역자극 인자, 항체, 및 체크포인트 차단 펩티드로 이루어진 군으로부터 선택되는 비-바이러스성 단백질을 코딩하는 적어도 하나의 핵산을 추가로 포함하고, 여기서 적어도 하나의 핵산은 적합한 종양-특이적 조절 영역에 작동가능하게 연결된다. 다른 실시양태에서, 비-바이러스성 단백질은 IL12, IL15, IL15 수용체 알파 서브유닛, OX40L, 및 PD-L1 차단제로 이루어진 군으로부터 선택된다.

또 다른 측면에서, 본 발명은 종양 세포에 유효량의 상기 실시양태 중 임의의 것의 복제 종양용해성 바이러스 벡터를 제공하는 단계를 포함하는, 종양 세포를 용해시키는 방법을 제공한다. 일부 실시양태에서, 종양 세포는 폐암 세포를 포함한다. 다른 실시양태에서, 종양 세포는 췌장 세포를 포함한다.

다른 측면에서, 본 발명은 본 발명은 상기 실시양태 중 임의의 것의 적어도 하나의 복제 종양용해성 바이러스 벡터 및 제약상 허용되는 담체를 포함하는 치료 조성물을 제공한다.

다른 측면에서, 본 발명은 치료 유효량의 상기 실시양태 중 임의의 것의 조성물을 포함하는 제1 조성물을 투여하는 단계를 포함하는, 암을 앓고 있는 대상체에서 암을 치료하는 방법을 제공한다. 일부 실시양태에서, 암은 비-소세포 폐암 (NSCLC) 또는 소세포 폐암 (SCLC)이다. 다른 실시양태에서, 투여는 정맥내 (IV) 투여, 복강내 (IP) 투여, 또는 종양내 (IT) 투여이다.

본 간단한 요약은 하기 상세한 설명에서 더 자세히 설명되는 특정 개념을 단순화된 형태로 소개하기 위해 제공되다. 달리 명확하게 언급되는 경우를 제외하면, 본 간단한 요약은 청구된 주제의 핵심 또는 필수 특징을 확인하고자 하는 것이 아니며, 청구된 주제의 범주를 제한하고자 하는 것도 아니다.

하나 이상의 실시양태의 세부 사항은 하기 설명에서 기술된다. 한 예시적인 실시양태와 관련하여 예시되거나, 또는 기술되는 특징은 다른 실시양태의 특징과 조합될 수 있다. 따라서, 본원에 기술된 다양한 실시양태 중 임의의 것은 조합되어 추가 실시양태를 제공할 수 있다. 실시양태의 측면은 필요한 경우 본원에서 확인된 바와 같은 다양한 특허, 출원 및 공개문헌의 개념을 사용하기 위해 변형될 수 있고, 이에 따라 추가의 또 다른 실시양태를 제공할 수 있다. 다른 특징, 목적 및 이점은 설명, 도면, 및 청구범위로부터 자명해질 것이다.

본 개시내용의 예시적인 특징, 그의 성질 및 다양한 이점은 첨부된 도면 및 다양한 실시양태의 하기의 상세한 설명으로부터 자명해질 것이다. 비-제한적이고 비-포괄적인 실시양태가 첨부된 도면을 참조로 하여 기술되고, 여기서 유사한 라벨 또는 참조 번호는 달리 명시되지 않는 한, 다양한 뷰에서 전체적으로 유사한 부분을 지칭한다. 도면 중 요소의 크기 및 상대적 위치는 반드시 일정 비율로 그려진 것은 아니다. 예를 들어, 도면의 가독성을 향상시키기 위해 다양한 요소의 형상이 선택, 확대 및 배치된다. 도면으로 작성된 요소의 특정 형상은 도면에서 쉽게 알아볼 수 있도록 하기 위해 선택되었다. 하나 이상의 실시양태가 이하 첨부된 도면을 참조로 하여 기술되며, 여기서,
도 1a 및 1b는 miRNA의 상대적인 발현 수준을 나타내는 히스토그램 그래프이다.
도 2는 변형된 종양용해성 콕사키바이러스 B3 ("CVB3") 게놈의 한 실시양태의 구축을 도시한 개략도이다.
도 3a, 3b 및 3c는 종양용해성 CVB3 바이러스로 감염된 세포주에서의 바이러스 역가 및 RNA 카피를 보여주는 그래프이다.
도 4a, 4b, 4c 및 4d는 종양용해성 CVB3 바이러스로 감염된 세포주로부터의 데이터를 나타내는 사진 및 그래프이다.
도 5a, 5b 및 5c는 종양용해성 CVB3 바이러스로 감염된 세포주로부터의 데이터를 나타내는 사진 및 그래프이다.
도 6a, 6b, 6c 및 6d는 종양용해성 CVB3 바이러스로 감염된 세포주로부터의 데이터를 나타내는 사진 및 그래프이다.
도 7a, 7b, 7c, 7d, 7e 및 7f는 종양용해성 CVB3 바이러스로 처리된 마우스 모델 시스템 (SCID 마우스)으로부터의 데이터를 나타내는 생존율 플롯, 조직학적 사진 및 그래프이다.
도 8a, 8b, 8c, 8d, 8e, 8f 및 8g는 종양용해성 CVB3 바이러스로 처리된 마우스 모델 시스템으로부터의 데이터를 나타내는 생존율 플롯, 조직학적 사진, 및 그래프이다.
도 9a, 9b, 9c, 및 9d는 3개의 추가 miRNA 변형된 CVB3의 구축, 및 상기 종양용해성 CVB3 바이러스로 처리된 마우스 모델 시스템 (C57BL/6 마우스)으로부터의 체중 변화, 생존율 및 조직학적 사진을 도시한 개략도이다.
도 10a-10z, 10aa-10zz 및 10aaa-10sss는 종양내 마이크로RNA의 선택된 목록이며, 이들은 모두 그 전문이 참조로 포함된다.
도 11a 및 11b는 종양용해성 CVB3 바이러스로 감염된 세포주로부터의 데이터를 나타내는 사진 및 세포 생존율 플롯이다.
도 12a, 12b, 12c, 12d, 12e, 및 12f는 본 신규한 종양용해성 CVB3 바이러스로 처리된 면역적격 마우스 모델 시스템으로부터의 조직학적 사진, 데이터를 나타내는 그래프, 종양용해성 CVB3 바이러스의 개략도, 및 생존율 플롯이다. .
도 13a 및 13b는 다양한 종양용해성 CVB3 바이러스를 주사한 C57BL/6 마우스로부터의 조직학적 사진 및 바이러스 RNA 카피수를 나타내는 그래프이다.
도 14a 및 14b는 다양한 종양용해성 CVB3 바이러스로 감염된 세포주의 세포 생존율 및 사진을 도시한 그래프이다.
도 15a, 15b, 15c, 및 15d는 다양한 암 세포주에 대한 설명, 다양한 종양용해성 CVB3 바이러스로 감염된 상기 세포주의 사진, 새로운 종양용해성 CVB3 바이러스의 개략도, 및 상기 새로운 종양용해성 CVB3 바이러스로 감염된 세포주의 사진이다.

본 발명은 하기 본 발명의 바람직한 실시양태에 관한 상세한 설명 및 본원에 포함된 실시예를 참조함으로써 더욱 쉽게 이해될 수 있다.

그러나, 본 발명을 더욱 상세하게 설명하기 전에, 하기에서 사용되는 특정 용어의 정의를 먼저 설명하는 것이 본 발명을 이해하는 데 도움이 될 수 있다.

본원에서 사용되는 바, "마이크로RNA" 또는 "miRNA"라는 용어는 동물 및 식물 둘 모두를 비롯한, 매우 다양한 유기체에서 발현되는 짧은 (전형적으로, 21-25 뉴클레오티드), 내인성, 단일 가닥 RNA 패밀리를 지칭한다. 1,000개를 초과하는 고유한 miRNA가 인간에서 발현된다. miRNA는 메신저 RNA (mRNA)에서 발견되는 특이적 표적 서열에 결합한다. mRNA 분자 중의 상보적 또는 부분적으로 상보적인 서열 (표적 서열)에 결합하게 되면, mRNA의 절단에 의해 유전자 발현은 하향조절되고, 그의 폴리A 테일의 단축으로 분해는 증가되고, 번역은 직접적으로 억제된다. 종양 중에서 선택된 마이크로RNA 목록이 (연관된 참조 기호와 함께) 도 9a - 9z, 9aa - 9zz, 및 9aaa - 9sss에 제공되어 있고, 목록 및 연관된 참조 기호는 그 전문이 본원에서 참조로 포함된다.

"마이크로RNA 표적 서열(들)," "miRNA 표적 서열(들)" 및 "miRNA 결합 서열(들)"은 예컨대, 도 10에 개시된 것과 같은 miRNA 서열에 상보적이거나, 또는 그에 결합하는 서열을 지칭한다 (즉, 100% 상보적일 필요는 없다).

용어 "종양용해성 엔테로바이러스"는 종양 세포에서 복제할 수 있고, 종양 세포를 사멸시킬 수 있는 엔테로바이러스를 지칭한다. 간략하면, 엔테로바이러스는 분변-구강 경로를 통해 전파되는 포유동물 질환과 가장 일반적으로 연관된 단일 가닥 (+) 센스 RNA 바이러스의 속이다. 엔테로바이러스의 일반적인 예로는 폴리오바이러스, 콕사키바이러스 및 에코바이러스를 포함한다.

용어 "종양용해성 콕사키바이러스" 또는 "CSV"는 일반적으로 종양 세포에서 복제할 수 있고, 종양 세포를 사멸시킬 수 있는 콕사키바이러스를 지칭한다. 특정 실시양태 내에서, 바이러스는 종양 세포를 더욱 선택적으로 표적화하고/거나, 인간 숙주에서 CSV의 면역 매개 중화를 감소시키기 위해 재조합적으로 (또는 '유전자') 조작될 수 있다. 콕사키바이러스 B3 (CVB3)은 5' 및 3' 비번역 영역 (UTR)이 플랭킹된 단일 오픈 리딩 프레임을 인코딩하는 (+) RNA 게놈을 포함하는, 소형 외피 비보유 바이러스이다.

본원에서 사용되는 바, "치료하다" 또는 "치료하는" 또는 "치료"란, 임상 결과를 비롯한, 유익한 또는 원하는 결과를 얻기 위한 접근법을 의미한다. 유익한 또는 원하는 임상 결과는 검출가능 여부와 상관없이, 하나 이상의 증상 또는 병태의 경감 또는 호전, 질환 정도 감소, 질환 상태 안정화 (즉, 비악화), 질환 확산 방지, 질환 진행 지연 또는 저속화, 질환 상태 호전 또는 완화, 질환 재발 감소, 및 (부분적이든 또는 완전하든) 관해를 포함할 수 있지만, 이에 제한되지 않는다. "치료하는" 및 "치료"라는 용어는 또한 치료를 받지 않았을 때 예상되는 생존과 비교하여 생존 연장도 의미할 수 있다.

용어 "암"은 대상체에서 세포의 비제어된, 또는 비정상적인 성장에 의해 유발되는 질환 상태를 지칭한다. 대표적인 암 형태로는 암종, 백혈병, 림프종, 골수종 및 육종을 포함한다. 추가 예로는 담관암, 뇌암 (예컨대, 교모세포종), 유방암, 자궁경부암, 결장직장암, CNS 암 (예컨대, 청신경종, 성상세포종, 두개인두종, 상의세포종, 교모세포종, 혈관모세포종, 수모세포종, 수막종, 신경모세포종, 희소돌기교종, 송과체종 및 망막모세포종), 자궁내막암, 조혈 세포 암 (예컨대, 백혈병 및 림프종), 신장암, 후두암, 폐암, 간암, 구강암, 난소암, 췌장암, 전립선암, 피부암 (예컨대, 흑색종 및 편평 세포 암종) 및 갑상선암을 포함하나, 이에 제한되지 않는다. 암은 고형 종양 (예컨대, 육종, 예컨대, 섬유육종, 점액육종, 지방육종, 연골육종 및 골육종), 미만성 (예컨대, 백혈병), 또는 이들의 일부 조합 (예컨대, 고형 종양 및 파종성 또는 미만성 암 세포 둘 모두를 갖는 전이성 암)을 포함할 수 있다. 암은 또한 종래 치료 (예컨대, 종래 화학요법 및/또는 방사선 요법)에 대해 내성을 나타낼 수 있다.

양성 종양 및 원치않는 세포 증식인 다른 병태 또한 치료될 수 있다.

본원의 다양한 실시양태의 이해를 증진시키기 위해, 다양한 실시양태를 기술하는 하기 섹션을 제공한다: A. 종양용해성 엔테로바이러스; B. 마이크로RNA; D. 치료 조성물, 및 E. 투여.

A. 종양용해성 엔테로바이러스

상기에서 언급된 바와 같이, 엔테로바이러스는 분변-구강 경로를 통해 전파되는 포유동물 질환과 가장 일반적으로 연관된 단일 가닥 (+) 센스 RNA 바이러스의 속이다. 엔테로바이러스의 일반적인 예로는 폴리오바이러스, 콕사키바이러스 및 에코바이러스를 포함한다.

콕사키바이러스는, 폴리오바이러스 및 에코바이러스 또한 포함하는, 외피 비보유, 선형, (+) 센스 단일 가닥 RNA 바이러스 과인, 피코르나비리다에 과(Picornaviridae) 및 엔테로바이러스 속에 속하는 바이러스이다. 엔테로바이러스는 가장 흔하고 중요한 인간 병원체 중 하나이며, 일반적으로 그 구성원은 분변-구강 경로를 통해 전파된다. 콕사키바이러스는 무균 수막염의 주요 원인 중 하나이다 (의심되는 다른 일반 원인체는 에코바이러스 및 볼거리 바이러스이다). 콕사키바이러스는 폴리오바이러스와 많은 특징을 공유한다. 전세계 많은 지역에서 폴리오바이러스 감염이 통제됨에 따라 예컨대, 콕사키바이러스와 같은 비폴리오 엔테로바이러스를 이해하는 데 더 많은 관심이 집중되고 있다. (Sean P, Semler BL. Coxsackievirus B RNA replication: lessons from poliovirus. Curr Top Microbiol Immunol 2008; 323: 89-121).

콕사키바이러스 B3 (CVB3)은 5' 및 3' 비번역 영역 (UTR)이 플랭킹된 단일 오픈 리딩 프레임을 인코딩하는 (+) RNA 게놈을 포함한다. CVB3은 라이프사이클이 짧은 바, 전형적으로는 빠른 세포 사멸과 자손 바이러스의 방출에 이르게 된다. 수용체에의 바이러스 부착 후, 바이러스 RNA는 세포 내로 방출되어 바이러스 폴리단백질 번역 및 바이러스 게놈 복제를 위한 주형으로 작용한다.

B. 마이크로RNA ( miRNA )

상기 언급된 바와 같이, 본 발명은 엔테로바이러스 게놈의 종양 특이성을 추가로 증진시키기 위해 엔테로바이러스 게놈 (예컨대, 폴리오바이러스, 콕사키바이러스 또는 에코바이러스 게놈)을 변형시키는 miRNA 기반 접근법을 제공한다. miRNA는 진화적으로 보존되고, 표적화된 mRNA의 UTR에 결합하여 광범위한 기본 세포 기능에서 핵심 조절자 역할을 하는 내인성의 소형 비코딩 RNA의 한 부류이다. 이어서, 이는 mRNA 분해 또는 유전자 발현 억제를 촉진시킨다. 최근 증거는 miRNA 또한 종양형성에서 중요한 역할을 한다는 것을 제안한다. miRNA는 일반적으로 다른 암 조직에서 하향조절되는 것으로 관찰된다. 이러한 고유한 특징은 miRNA에 감수성인 종양 특이적 종양용해성 바이러스를 개발하는 데 이용될 수 있다. miRNA-145 (miR-145) 및 miR-143은 종양 억제 miRNA로 확인되었으며, 폐암 조직에서 유의하게 하향조절된다.

개별 miRNA 및 miRNA들의 군은 특정 조직 유형에서 배타적으로 또는 차별적으로 발현될 수 있다. 예시적인 miRNA로는 miR-1, miR-7, miR-30c, miR-124, miR-124*, miR-127, miR-128, miR-129, miR-129*, miR-132, miR-135b, miR-136, miR-136*, miR-137, miR-139-5p, miR-143, miR-154, miR-184, miR-188, miR-204, miR-208, miR-216, miR-217, miR-299, miR-300-3p, miR-300-5p, miR-323, miR-329, miR-337, miR-335, miR-341, miR-369-3p, miR-369-5p, miR-375, miR-376a, miR-376a*, miR-376b-3p, miR-376b-5p, miR-376c, miR-377, miR-379, miR-379*, miR-382, miR-382*, miR-409-5p, miR-410, miR-411, miR-431, miR-433, miR-434, miR-451, miR-466b, miR-485, miR-495, miR-499, miR-539, miR-541, miR-543*, miR-551b, miR-758, 및 miR-873을 포함한다. 통상, 최종 생성물인 것으로 더욱 빈번하게 발견되는 가닥은 miRNA로 지칭되고, 더 드물게 발견되는 파트너는 miRNA*로 지칭된다.

본 발명의 특정 실시양태 내에서, miRNA 표적 서열은 콕사키바이러스 B3 게놈의 5'UTR 또는 3'UTR에 삽입될 수 있다. 특정 실시양태 내에서, 적어도 1, 2, 3, 4, 5, 또는 6개의 miRNA 표적 서열이 직렬로 삽입될 수 있다. 추가의 실시양태 내에서, 적어도 10개의 표적 서열이 직렬로 삽입될 수 있다. 다른 실시양태 내에서, 10, 15, 20, 50, 또는 100개 미만의 표적 서열이 존재한다. 표적 서열의 최적 개수는 CSVB3의 발현 수준을 검정함으로써 결정될 수 있다. 정상 세포에서 CSVB3이 비존재 내지 저수준인 것이 바람직한다. 다중 miRNA 표적 서열이 모두 동일한 miRNA에 결합할 수 있거나, 또는 상이한 miRNA에 결합할 수 있다. 표적 서열은 예를 들어, 제1 miRNA에 결합하는 적어도 2개의 표적 서열이 직렬로 존재하고, 이어서, 제2 miRNA에 결합하는 적어도 2개의 표적 서열이 직렬로 존재하고, 이어서, 임의적으로, 제3 miRNA에 결합하는 적어도 2개의 표적 서열이 직렬로 존재하는 것인 클러스터로 존재할 수 있다 (예컨대, 도 2). 대안적으로, 상이한 miRNA에 결합하는 다중 miRNA 표적 서열은 특정한 순서 없이 존재할 수 있다. 또한, 각 miRNA 표적 서열이 유일의 단일 카피로 존재할 수 있다. 일부 실시양태에서, 2-4개의 상이한 miRNA 표적이 존재한다. 다른 실시양태에서, 각 표적 서열의 카피가 2-4개 존재한다. 다른 실시양태에서, 2-4개의 상이한 miRNA 표적이 존재하고, 이들 각 표적 서열의 카피 2-4개가 클러스터로 존재한다. miRNA 표적 서열은 임의 배향으로 또는 배향의 조합으로 삽입될 수 있다. 예시적인 구축물에 대해서는 도 2를 참조한다.

다중 miRNA 표적 서열은 개입 뉴클레오티드 없이 인접해 있을 수 있거나, 또는 1 내지 약 25, 또는 1 내지 약 20, 또는 1 내지 약 15, 또는 1 내지 약 10, 또는 1 내지 약 5, 또는 3 내지 약 10, 또는 5 내지 약 10개의 개입 뉴클레오티드를 가질 수 있다. 개입 뉴클레오티드는 5' UTR과 유사한 G+C 함량을 갖도록 선택될 수 있고, 바람직하게는 폴리아데닐화 신호 서열을 함유하지 않는다.

C. 치료 조성물

질환, 예컨대, 예를 들어, 암의 영향을 예방, 치료, 또는 호전시키는 데 사용될 수 있는 치료 조성물을 제공한다. 더욱 특히, 본원에 기술된 바와 같은 적어도 하나의 종양용해성 바이러스를 포함하는 치료 조성물을 제공한다.

특정 실시양태에서, 조성물은 제약상 허용되는 담체를 추가로 포함할 것이다. "제약상 허용되는 담체"라는 어구는 종양용해성 바이러스의 생물학적 활성의 효과를 방해하지 않고, 그를 투여받는 대상체에게 독성을 나타내지 않는 임의의 담체, 희석제, 또는 부형제를 포함하는 것으로 의미된다 (일반적으로 문헌 [Remington: The Science and Practice of Pharmacy, Lippincott Williams & Wilkins; 21st ed. (May 1, 2005 and in The United States PharmacopE1A: The National Formulary (USP 40 - NF 35 and Supplements] 참조).

본원에 기술된 바와 같은 종양용해성 바이러스의 경우, 적합한 제약 담체의 비제한적인 예로는 포스페이트 완충처리된 염수 용액, 물, 에멀젼 (예컨대, 유/수 에멀젼), 각종 유형의 습윤화제, 멸균 용액 등을 포함한다. 추가 제약상 허용되는 담체로는 겔, 생체흡수성 매트릭스 물질, 종양용해성 바이러스를 함유하는 이식 요소, 또는 임의의 다른 적합한 비히클, 전달 또는 분배 수단 또는 물질(들)을 포함한다. 상기 담체는 종래 방법에 의해 제제화될 수 있고, 대상체에게 유효 용량으로 투여될 수 있다. 추가 제약상 허용되는 부형제로는 물, 염수, 폴리에틸렌 글리콜, 히알루론산 및 에탄올을 포함하나, 이에 제한되지 않는다. 예컨대, 무기산 염 (예컨대, 히드로클로라이드, 히드로브로마이드, 포스페이트, 술페이트 등) 및 유기산 염 (예컨대, 아세테이트, 프로피오네이트, 말로네이트, 벤조에이트 등)과 같이, 제약상 허용되는 염 또한 그에 포함될 수 있다. 종양용해성 바이러스를 암 세포로 전달하는 데 사용될 수 있는 상기 제약상 허용되는 (제약 등급) 담체, 희석제 및 부형제는 바람직하게는 조성물을 받은 개체 (대상체)에서 면역 반응을 유도하지 않을 것이다 (그리고, 바람직하게는 과도한 독성 없이 투여될 것이다).

본원에서 제공되는 조성물은 다양한 농도로 제공될 수 있다. 예를 들어, 종양용해성 바이러스는 약 10⁶내지 약 10¹¹ pfu 범위의 투여량으로 제공될 수 있다. 추가 실시양태 범위 내에서, 투여량은 약 10⁶내지 약 10¹⁰ pfu/ml 범위일 수 있고, 치료 매 2-3주마다, 큰 병변 (예컨대, >5 cm)을 갖는 환자에게는 최대 4 ml가 주사되고, 작은 병변 (예컨대, < 0.5 cm)을 갖는 환자에서는 더 작은 양 (예컨대, 최대 0.1 ml)이 주사될 수 있다.

본 발명의 특정 실시양태 범위 내에서, 표준보다 더 낮은 투여량으로 사용될 수 있다. 그러므로, 특정 실시양태 범위 내에서, 약 10⁶ pfu/ml 미만 (최대 4 ml가 매 2-3주마다 환자 내로 주사)이 환자에게 투여될 수 있다.

조성물은 안정한 저장 수명에 도움이 되고, 실온 (약 20℃), 4℃, -20℃, -80℃를 포함하는 온도에서 및 액상 N2에서 보관될 수 있다. 생체내 사용을 위한 조성물은 일반적으로 보존제를 포함하지 않는 바, 보관은 일반적으로 더 차가운 냉온에서 이루어질 것이다. 조성물은 건식으로 (예컨대, 동결건조) 또는 액상 형태로 보관될 수 있다.

E. 투여

본원에 기술된 조성물 이외에도, 대상체에게 본원에 기술된 바와 같은 변형된 콕사키바이러스를 유효 용량 또는 유효량으로 투여하는 단계를 포함하는, 질환 (예컨대, 암)을 치료 또는 호전시키기 위해 상기 조성물을 사용하는 다양한 방법들을 제공한다.

"유효 용량" 및 "유효량"이라는 용어는 표적화된 암을 치료하는 데 충분한 종양용해성 바이러스의 양, 예컨대, 표적화된 종양 크기 또는 로드를 축소시키는 데, 또는 다르게는 표적화된 종양 세포의 성장률을 방해하는 데 효과적인 양을 지칭한다. 더욱 특히, 상기 용어는 필요한 투여량 및 치료 기간 하에 원하는 결과를 달성하는 데 효과적인 종양용해성 바이러스의 양을 지칭한다. 예를 들어, 암 치료와 관련하여, 본원에 기술된 조성물의 유효량은 관해를 유도하고/거나, 종양 부하를 감소시키고/거나, 종양 확산 또는 암 성장을 막는 양이다. 유효량은 예컨대, 대상체의 질환 상태, 연령, 성별, 및 체중 뿐만 아니라, 제약 제제, 투여 경로 등에 따라 달라질 수 있지만, 그럼에도 불구하고, 통상적으로는 관련 기술분야의 통상의 기술자에 의해 결정될 수 있다.

치료 조성물은 암 진단을 받은 대상체, 또는 암을 앓는 것으로 의심되는 대상체에게 투여된다. 대상체는 인간 또는 비-인간 동물일 수 있다.

본원에 기술된 바와 같은 OV (예컨대, 콕사키바이러스)는 예컨대, 정맥내, 종양내, 또는 복강내인 경로에 의해 제공될 수 있다. 특정 실시양태 범위 내에서, 종양용해성 바이러스는 캐뉼라에 의해, 카테터에 의해, 또는 직접 주사에 의해 전달될 수 있다. 투여 부위는 종양내 또는 종양으로부터 떨어져 있는 원위부일 수 있다. 투여 경로는 대개 표적화된 암 유형에 의존할 것이다. 본원에 기술된 바와 같은 OV (예컨대, CSV)는 특히 정맥내 (IV) 투여에 적합하다.

종양용해성 바이러스의 최적 또는 적절한 투여량 요법은 관련 기술분야 범위 내에서 환자 데이터, 환자 관찰결과, 및 예를 들어, 대상체의 크기, 체표면적, 연령, 성별, 및 투여되는 특정 종양용해성 바이러스, 투여 시간 및 경로, 치료되는 암 유형, 환자의 건강 상태, 및 환자가 받고 있는 다른 약물 요법을 비롯한 다양한 임상 인자에 기초하여 주치의에 의해 쉽게 결정될 수 있다. 특정 실시양태에 따라, 본원에 기술된 종양용해성 바이러스를 사용하여 대상체를 치료하는 것은 추가 유형의 요법, 예컨대, 화학요법제, 예컨대, 에토포시드, 이포스파미드, 아드리아마이신, 빈크리스틴, 독시사이클린 등을 이용하는 화학요법과 함께 조합될 수 있다.

OV (예컨대, CSV)는 임상용 의약 및 제약 조성물로 제제화될 수 있고, 제약상 허용되는 담체, 희석제, 부형제 또는 애주번트와 함께 조합될 수 있다. 제제는 적어도 부분적으로는 투여 경로에 의존하게 될 것이다. 적합한 제제는 멸균 매질 중 바이러스 및 억제제를 포함할 수 있다. 제제는 유체, 겔, 페이스트, 고체 형태일 수 있다. 제제는 대상체 또는 전문 의료진에게 제공될 수 있다.

바람직하게 치료 유효량이 투여된다. 이는 대상체에게 유익한 도움을 주는 데 충분한 양이다. 실제 투여량 및 투여 시간 경로는 적어도 부분적으로는 암의 성질, 대상체의 병태, 전달 부위, 및 다른 인자에 의존하게 될 것이다.

본 발명의 추가의 다른 실시양태 범위 내에서, 종양용해성 바이러스는 다양한 방법에 의해, 예컨대, 종양내로, 복강내, 정맥내로, 또는 종양의 외과적 수술 후에 투여될 수 있다.

하기 내용은 본 개시내용의 추가의 예시적인 실시양태이다:

1. 변형된 엔테로바이러스 게놈을 포함하는 복제 종양용해성 바이러스 벡터이며, 여기서 변형된 엔테로바이러스 게놈은 엔테로바이러스 게놈의 비번역 영역 (UTR)에 작동가능하게 연결된 하나 이상의 miRNA 표적 서열의 하나 이상의 카피를 포함하는 것인, 복제 종양용해성 바이러스 벡터. 관련된 실시양태 내에서, 제공되는 복제 종양용해성 바이러스 벡터는 변형된 엔테로바이러스 게놈을 포함하고, 여기서 변형된 엔테로바이러스 게놈은 엔테로바이러스 게놈의 비번역 영역 (UTR)에 작동가능하게 연결된 복수의 하나 이상의 miRNA 표적 서열을 포함한다. 다양한 실시양태 내에서, 엔테로바이러스는 폴리오바이러스, 콕사키바이러스, 또는 에코바이러스일 수 있다.

2. 실시양태 1에 있어서, 상기 엔테로바이러스가 콕사키바이러스인 복제 종양용해성 바이러스 벡터.

3. 실시양태 2에 있어서, 콕사키바이러스가 콕사키바이러스 A 또는 B인 복제 종양용해성 바이러스 벡터.

4. 실시양태 1, 2 또는 3 중 어느 한 실시양태에 있어서, 비번역 영역 (UTR)이 5' UTR인 복제 종양용해성 바이러스 벡터. 다른 실시양태 내에서, UTR은 3' UTR이다. 본 발명의 추가의 또 다른 실시양태 내에서, 하나 이상의 miRNA 표적 서열은 3' UTR에 작동가능하게 연결될 수 있고, 하나 이상의 miRNA 표적 서열은 5' UTR에 작동가능하게 연결될 수 있다.

5. 실시양태 1, 2, 3 또는 4 중 어느 한 실시양태에 있어서, 하나 이상의 miRNA 표적 서열의 하나 이상의 카피가 2개 이상의 상이한 miRNA 표적 서열의 하나 이상의 카피를 포함하는 것인 복제 종양용해성 바이러스 벡터.

6. 실시양태 1, 2, 3, 4 또는 5 중 어느 한 실시양태에 있어서, 크기가 2 내지 50 염기쌍 ("bp")인 스페이서가 하나 이상의 miRNA 표적 서열 사이에 삽입되는 것인 복제 종양용해성 바이러스 벡터. 다양한 실시양태 내에서, 스페이서는 2-10 bp, 10-20 bp 크기, 20-30 bp 크기, 30-40 bp 크기, 또는 40-50 bp 크기일 수 있다.

7. 실시양태 1에 있어서, 하나 이상의 miRNA 표적 서열의 하나 이상의 카피가 심장 또는 췌장 특이적 miRNA를 인식하는 것인 복제 종양용해성 바이러스 벡터. 심장 특이적 miRNA의 대표적인 예로는 miR-1, miR133a/b, miR-208a/b 및 miR-499를 포함한다. 췌장 특이적 miRNA의 대표적인 예로는 miR-7, miR-204, miR-216, miR-217, 및 miR-375를 포함한다.

8. 실시양태 1, 2, 3, 4, 5, 6, 또는 7 중 어느 한 실시양태에 있어서, 하나 이상의 상이한 miRNA 표적 서열이 miR1, miR-7, miR-30c, miR-124, miR-124*, miR-127, miR-128, miR-129, miR-129*, miR-133, miR-135b, miR-136, miR-136*, miR-137, miR-139-5p, miR-143, miR-154, miR-184, miR-188, miR-204, miR-208, miR216, miR217, miR-299, miR-300-3p, miR-300-5p, miR-323, miR-329, miR-337, miR-335, miR-341, miR-369-3p, miR-369-5p, miR-375, miR-376a, miR-376a*, miR-376b-3p, miR-376b-5p, miR-376c, miR-377, miR-379, miR-379*, miR-382, miR-382*, miR-409-5p, miR-410, miR-411, miR-431, miR-433, miR-434, miR-451, miR-466b, miR-485, miR-495, miR-499, miR-539, miR-541, miR-543*, miR-551b, miR-758, 및 miR-873으로 이루어진 군으로부터 선택되는 miRNA를 인식하는 것인 복제 종양용해성 바이러스 벡터. 통상, 최종 생성물인 것으로 더욱 빈번하게 발견되는 가닥은 miRNA로 지칭되고, 더 드물게 발견되는 파트너는 miRNA*로 지칭된다. 다양한 실시양태 내에서, 복제 종양용해성 바이러스는 (+) 가닥 miRNA의 하나 이상의 카피 및/또는 (-) 가닥 miRNA의 하나 이상의 카피를 함유할 수 있다.

9. 실시양태 1, 2, 3, 4, 5, 6, 7, 또는 8 중 어느 한 실시양태에 있어서, 2개 이상의 (또는 복수의) 상이한 miRNA 표적 서열이 miR1, miR133, miR216, miR145 및 miR143에 대한 표적 서열을 포함하는 것인 복제 종양용해성 바이러스 벡터.

10. 실시양태 9에 있어서, miR1, miR133, miR216, miR145 및 miR143에 대한 표적 서열의 카피 2, 3, 4, 5, 또는 6개를 포함하는 복제 종양용해성 바이러스 벡터.

11. 실시양태 1, 2, 3, 4, 5, 6, 7, 8, 9, 또는 10 중 어느 한 실시양태에 있어서, 하나 이상의 miRNA 표적 서열의 하나 이상의 카피가 정방향 배향으로 존재하고, 하나 이상의 miRNA 표적 서열의 하나 이상의 카피가 역방향 배향으로 존재하는 것인 복제 종양용해성 바이러스 벡터.

12. 실시양태 1, 2, 3, 4, 5, 6, 7, 8, 9, 10, 또는 11 중 어느 한 실시양태에 있어서, 변형된 엔테로바이러스 게놈이 면역자극 인자, 항체 (예를 들어, 이중특이적 항체 포함), 및 체크포인트 차단 펩티드 (이는 또한 "체크포인트 억제제" 또는 "체크포인트 조정제"로도 지칭)로 이루어진 군으로부터 선택되는 비-바이러스성 단백질을 코딩하는 적어도 하나의 핵산을 포함하고, 여기서 적어도 하나의 핵산은 적합한 종양-특이적 조절 영역에 작동가능하게 연결된 것인 복제 종양용해성 바이러스 벡터. 본 발명의 다양한 실시양태 내에서, 이중특이적 항체는 종양 항원을 인식하는 제1 항원-결합 도메인 뿐만 아니라, 이펙터 세포 상의 세포 표면 분자를 인식하는 제2 항원-결합 도메인을 포함한다. 본 발명의 다른 실시양태 내에서, 체크포인트 조정제는 펩티드 리간드, 천연 수용체의 가용성 도메인, RNAi, 안티센스 분자 또는 항체이다. 본 발명의 추가의 실시양태 내에서, 면역 조정제는 적어도 부분적으로 억제성 면역 체크포인트(들), 예컨대, 예를 들어, PD-1, PD-L1, PD-L2, LAG 3, Tim3, BTLA 및/또는 CTLA4의 활성을 길항시킨다.

13. 실시양태 12에 있어서, 비-바이러스성 단백질이 IL12, IL15, IL15 수용체 알파 서브유닛, OX40L, CD73, 및 체크포인트 억제제로 이루어진 군으로부터 선택되는 것인 복제 종양용해성 바이러스 벡터. 본 발명의 추가의 실시양태 내에서, 실시양태 1, 2, 3, 4, 5, 6, 7, 8, 9, 10, 11, 또는 12 중 어느 한 실시양태에서 기술된, 상기 언급된 복제 종양용해성 바이러스는 종양 세포를 감염 및 용해시킬 수 있는 그의 능력을 유지하지만, 동일한 계통의 비변형된 야생형 바이러스와 비교하여 시험관내에서 및/또는 생체내에서 감소된 독성을 갖는다 (예컨대, miR-변형된 콕사키바이러스는 동일한 계통의 비변형된 야생형 콕사키바이러스와 비교하여 시험관내에서 및/또는 생체내에서 5%, 10%, 25%, 50%, 75%, 80%, 또는 90% 초과로 감소된 독성을 갖는다). 특정 실시양태 내에서, 감소된 독성은 심근세포에, 및/또는 정상 췌장 세포에 존재한다.

14. 종양 세포에 유효량의 실시양태 1, 2, 3, 4, 5, 6, 7, 8, 9, 10, 11, 12, 또는 13 중 어느 한 실시양태의 복제 종양용해성 바이러스 벡터를 제공하는 단계를 포함하는, 종양 세포를 용해시키는 방법. 종양 세포는 예를 들어, 생체내 본원에 기술된 암 내에서 발견될 수 있다.

15. 실시양태 14에 있어서, 종양 세포가 폐암 세포를 포함하는 것인 방법.

16. 실시양태 14에 있어서, 종양 세포가 췌장암 세포를 포함하는 것인 방법.

17. 상기 실시양태 1, 2, 3, 4, 5, 6, 7, 8, 9, 10, 11, 12, 또는 13 중 어느 한 실시양태의 적어도 하나의 복제 종양용해성 바이러스 벡터, 및 제약상 허용되는 담체를 포함하는 치료 조성물.

18. 치료 유효량의 실시양태 17의 조성물을 포함하는 조성물을 투여하는 단계를 포함하는, 암을 앓고 있는 대상체에서 암을 치료하는 방법. 암의 대표적인 예는 본원에 기술된 것을 포함한다. 특히 바람직한 암은 폐암, 췌장암, 간암 및 유방암을 포함한다.

19. 실시양태 18에 있어서, 상기 암이 폐암, 췌장암, 간암 및 유방암으로 이루어진 군으로부터 선택되는 것인 방법.

20. 실시양태 18에 있어서, 암이 KRAS 돌연변이와 연관된 비-소세포 폐암 (NSCLC), 일반적으로 TP53 및 Rb 돌연변이와 연관된 소세포 폐암 (SCLC), 또는 췌장암인 방법.

21. 실시양태 18, 19, 또는 20에 있어서, 투여가 정맥내 (IV) 투여, 복강내 (IP) 투여, 또는 종양내 (IT) 투여인 방법.

하기 실시예는 제한하는 것이 아니라, 예시로서 제공된다.

실시예

실시예 1

miR-145 및 miR-143은 폐암 세포에서 하향조절된다.

본 실시예는 폐 및 심근세포 세포에서의 miR-145 및 miR-143의 발현을 조사하는 실험을 기술한다. 하기 스템-루프 프라이머로 수행된 역전사 반응에 의해 miRNA 수준을 검출하였다: miR-145: CTCAACTGGTGTCGTGGAGTCGGCAATTCAGTTGAGAGGGATTC (서열식별번호(SEQ ID NO:) 1); miR-143: GTCGTATCCAGTGCTGGGTCCGAGTGATTCGCACTGGATACGACTGAGCTACA (서열식별번호 2); 및 miR93: CTCAACGGTGTCGTGGAGTCGGCAATTCAGTTGAGCTACCTGC (서열식별번호 3). 이들 프라이머를 사용하여 세포 miR-145, miR-143 및 miR-93 (내부 대조군)을 상응하는 상보적인 DNA로 전환시켰다. 간략하면, 다양한 폐 세포 및 심근세포로부터의 1 ㎍ 총 RNA를 15 ㎕ 뉴클레아제 무함유 물에서 각 miRNA에 대한 50 nM RT 프라이머를 포함하는 2 ㎕ RT 프라이머 믹스와 혼합하였다. 반응물을 65℃에서 5 min 동안, 이어서, 얼음 상에서 2 min 동안 인큐베이션시켜 줄기 루프를 형성하였다. 이어서, 혼합물을 역전사를 위해 iScript cDNA 합성 키트(iScript cDNA Synthesis kit) (바이오래드(Biorad), 1708890)를 사용하여 25℃에서 5 min, 42℃에서 30 min, 및 85℃에서 5 min 동안 4 ul 5X iScript 반응 믹스 및 1 ㎕ 역전사효소와 혼합함으로써 사용하였다. 이어서, 혼합물을 80 ㎕의 뉴클레아제 무함유 물로 희석하였다. qPCR을 위해, 3개의 프라이머 쌍을 사용하여 miR-145 및 miR-143의 상대적인 발현 수준을 결정하였다: miR-145 (정방향: CGGCGGGTCCAGTTTTCCCAGG (서열식별번호 4); 역방향: CTGGTGTCGTGGAGTCGGCAATTC (서열식별번호 5)), miR-143 (정방향: CCTGGCCTGAGATGAAGCAC (서열식별번호 6); 역방향: CAGTGCTGGGTCCGAGTGA (서열식별번호 7)), miR-93 (정방향: CGGCGGCAAAGTGCTGTTCGTG (서열식별번호 8); 역방향: CTGGTGTCGTGGAGTCGGCAATTC (서열식별번호 9)). 간략하면, 루나(Luna) 범용 qPCR 마스터 믹스 (Neb, M3003)를 사용하여 제조사가 권장하는 프라이머 농도에서 10 ㎕ 반응 혼합물에 1 ㎕ cDNA 생성물을 첨가하였다. 하기와 같이 반응을 사이클링하였다: 95℃에서 1 min 동안, 45회 사이클의 95℃에서 10 s 동안, 65℃에서 30 s 동안, 및 이어서, 용융 곡선을 ViiA 7 실시간 PCR 시스템(ViiA 7 Real-Time PCR System) (어플라이드 바이오시스템즈(Applied Biosystems))에서 세팅하였다. 샘플을 삼중으로 실행하고, 대조군 샘플과의 비교 CT (2-ΔΔCT) 방법을 사용하여 분석하고, 상대적인 정량 (RQ)으로 제시하였다.

결과는 도 1a (miR-145의 발현 수준) 및 도 1b (miR-143의 발현 수준)에 제시되어 있다. 상기 상대적인 정량화 결과는 miR-145 및 miR-143 둘 모두 정상 폐 상피 세포 및 심근세포와 비교하여 KRAS 돌연변이를 갖는 폐 선암종 세포주 (H2030, H23, A549)에서 및 TP53 돌연변이를 갖는 SCLC 세포주 (H524, H526)에서도 또한 유의하게 하향조절된다는 것을 나타낸다.

실시예 2

miRNA 변형된 CVB3 구축

정상 조직에 대한 바이러스 독성이 감소된 재조합 CVB3 벡터를 생성하기 위해, miRNA 조작된 CVB3을 도 2에 제시된 바와 같이 구축하였다. miR-145의 표적 서열의 카피 4개 및 miR-143의 표적 서열의 카피 2개를 5'UTR과 VP4의 출발 코돈 사이의 위치에 삽입하여 miR-CVB3으로 표시되는 miRNA 변형된 CVB3을 구축하였다. CVB3 (칸돌프(Kandolf) 균주)의 무손상 게놈을 함유하는 플라스미드 pCVB3/T7을 백본으로 사용하여 miR-CVB3을 생성하였다. 간략하면, XbaI에 의해 pCVB3/T7을 분해시켜 5'UTR-VP4 영역은 보존하면서, BamHI 부위는 제거하였다. 이어서, 생성된 플라스미드를 5'UTR과 VP4의 출발 코돈 사이에 BamHI 부위 및 코작(Kozak) 컨센서스 서열을 보유하는 서열 GTTGATACTTGAGCTCCCATTTTGCTGTATGGATCCTTTGCTGTATTCAACTTAACAATG (서열식별번호 10)을 갖는 프라이머로 돌연변이화시켰다. 프라이머 쌍 (정방향: AATGGATCCTTAATTAACGAAGGGATTCCTGG (서열식별번호 11); 역방향: AATGGATCCTTAATTAAATCGATAGCGTCCAGTTTTC (서열식별번호 12))을 사용하여 플라스미드 pCMV-ICP27-145T로부터 증폭된 ClaI 부위 및 4-카피 miR-145 표적 서열을 포함하는 BamHI 분해 PCR 생성물을 삽입하여 돌연변이체 백본을 추가로 변형시켰다. 이어서, BglII-SalI 단편을 pCVB3/T7에서 상응하는 단편으로 대체하여 생성된 플라스미드의 CVB3 게놈을 수복시켜 pCVB3-miR145를 구축하였다. 마지막으로, miR-143 표적 서열의 카피 2개를 포함하는 어닐링된 올리고 쌍 (정방향: CGTGAGCTACAGTGCTTCATCTCACGATTGAGCTACAGTGCTTCATCTCATCTAGAAT (서열식별번호 13); 역방향: CGATTCTAGATGAGATGAAGCACTGTAGCTCAATCGTGAGATGAAGCACTGTAGCTCA (서열식별번호 14))의 ClaI 부위 삽입에 의해 플라스미드 pCVB3-miR145-miR143을 생성하였다. 여기서 사용된 모든 제한 효소는 써모 피셔 사이언티픽(Thermo Fisher Scientific)으로부터 입수한 것이었다.

miR-CVB3 및 WT-CVB3 스톡을 제조하기 위해, 하이스크라이브™ T7 고속 고수율 RNA 합성 키트(HiScribe™ T7 Quick High Yield RNA Synthesis Kit) (#E2050S, 뉴 잉글랜드 바이오랩스(New England Biolabs))를 사용하여 각각 SalI 분해에 의해 선형화된 pCVB3-miR145-miR143 및 pCVB3/T7로부터 바이러스 게놈을 합성하였다. 이어서, 바이러스 RNA를 HeLa 세포로 형질감염시키고, 세포변성 효과가 가장 두드러지는 경우의 형질감염 후 ~72시간째에 상청액을 수집하였다. 바이러스 역가가 보관에 바람직한 수준에 도달할 때까지 바이러스 함유 상청액을 HeLa 세포에서 추가로 증식시켰다.

실시예 3

심근세포에서의 miR-CVB3 RNA 수준, 바이러스 역가 및 세포독성 감소

miRNA 변형된 CVB3이 miRNA 의존성 하향조절에 영향을 받기 쉬운 경우, miR-145 및 miR-143 발현이 풍부한 세포는 WT-CVB3 성장에는 영향을 주지 않지만, miR-CVB3의 바이러스 성장 또는 복제는 선택적으로 억제시킬 것으로 예측된다. 이러한 예측을 시험하기 위해, 세포주 패널을 0.1의 MOI로 miR-CVB3 또는 WT-CVB3으로 처리하고, 감염 후 36 hr째에 상청액 중의 바이러스 입자의 적정을 수행하였다. 도 3a에 제시된 바와 같이, miR-145 및 miR-143이 고도로 발현되는 HL-1 마우스 심근세포에서 miR-CVB3의 역가가 WT-CVB3과 비교하여 유의하게 감소되었다. 대조적으로, miR-CVB3의 역가는 miRNA 수준이 하향조절된 NSCLC 세포주, SCLC 세포주 및 HeLa 세포에서 WT-CVB3과 비교하여 유의하게 감소되지 않았다.

심근세포 HL-1 및 폐암 KRAS ^mut H2030 및 TP53 ^mut H526 세포주에서 바이러스 게놈 카피수 (도 3b) 및 바이러스 역가 (도 3c)를 측정함으로써 두 바이러스의 세포내 복제 및 1단계 성장 곡선도 평가하고, 세포 수준에 따라 정규화하였다. WT-CVB3과 비교하여 miR-CVB3의 성장 패턴에서 HL-1 세포주와 2개의 폐암 세포주 사이에 유의한 차이가 확인되었다. 특히, HL-1 세포에서 miR-CVB3의 복제는 바이러스 RNA 카피 수준 및 바이러스 역가에 반영된 바와 같이 엄격하게 억제된 반면, WT-CVB3 게놈 및 바이러스 역가는 계속 증폭되었다. 대조적으로, H2030 및 H526 세포 모두에서 두 바이러스의 복제는 거의 동일한 수준으로 계속 증폭되었다.

WT-CVB3과 비교하여 miR-CVB3의 독성을 폐암 세포와 비교하여 상대적으로 높은 수준의 miR-145 및 miR-143을 발현하는 마우스 심근세포 HL-1 세포주에서 시험하였다. 도 4a-c에 제시된 바와 같이, 0.01 내지 100의 초기 바이러스 감염 MOI에서 바이러스 감염 후 72 hr째에 miR-CVB3의 유의하게 감소된 독성이 관찰되었다. WT-CVB3이 0.01 내지 0.1의 MOI에서 HL-1 세포 손상을 일으키는 반면, HL-1 세포에서 세포변성 효과를 확실히 유도하기 위해서는 훨씬 더 많은 용량의 miR-CVB3 (MOI 10 내지 100)가 필요하였다. 형태 검정 (도 4a)의 결과는 또한 WT-CVB3 처리된 세포에서 빈 웰을 입증한 크리스탈 바이올렛 염색 시험 (도 4b) 뿐만 아니라, 차등 세포 생존율 값에 의한 세포 생존율 검정 (도 4c)에서 반영되었다. HL-1 세포주는 종양 세포로부터 유래된 것이기 때문에, 인간 iPSC 유도 심근세포 (iCM)를 사용하여 세포 생존율 검정을 검증하였고, 그 결과는 HL-1 세포주에서 시험한 결과와 일치하였다 (도 4d).

실시예 4

miR-CVB3은 KRAS ^mut 폐암 세포를 용해시키는 능력을 유지한다.

miRNA 변형이 KRAS ^mut 선암종 세포에 대한 miR-CVB3의 용해 능력을 손상시키는지 여부를 결정하기 위해, 돌연변이체 KRAS를 갖는 3개의 전형적인 세포주 H2030 (G12C), H23 (G12C) 및 A549 (G12S)를 평가에 사용하였다. 도 5a 및 5b에 제시된 바와 같이, miR-CVB3은 WT-CVB3에서 관찰된 것과 유사한 세포 용해 패턴으로 3개의 세포주에 대한 용해 능력을 유지한다. 또한, miR-CVB3은 0.1의 낮은 MOI에서 종양 세포 생존율을 억제하는 능력에서 WT-CVB3보다 약한 것으로 관찰되었다 (도 5c). CVB3의 인공 miRNA 변형은 정상 세포와 암 세포 모두에서 miRNA 변형된 CVB3에 대한 선천 면역 또는 항바이러스 능력을 선택적으로 증가시켜 WT-CVB3과 비교하여 암 세포에서 관찰되는 miR-CVB3의 용해 능력이 약간 감소된 것을 설명한다고 추측할 수 있다. 심근세포에서 miR-145와 miR-143의 존재비는 암 세포에서보다 훨씬 높기 때문에, 심근세포는 더 큰 항-miR-CVB3 능력을 획득해야 할 것으로 예측된다.

실시예 5

WT- 및 miR-CVB3 모두 소세포 폐암 (SCLC) 세포를 사멸시키는 반면, 인간 정상 폐 상피 세포는 WT- 및 miR-CVB3 모두에 대해 허용되지 않는다.

폐 선암종과 비교하여, SCLC는 흡연과 더 밀접한 상관관계가 있다. 1) CVB3이 TP53 ^mut SCLC를 치료할 수 있는 잠재능이 있는지 여부, 및 2) miR-CVB3이 SCLC 세포주의 성장을 억제시킬 수 있는 등가의 능력을 보유하는지 여부에 관한 조사를 시작하기 위해 원래 2명의 흡연자 환자로부터 기증된 2개의 현탁 SCLC 세포주인 H524 및 H526을 시딩하였다. 도 6a에 제시된 바와 같이, WT-CVB3 및 miR-CVB3으로 처리된 세포 모두 "모의" 웰에서 비처리 대조군 세포와 비교하여 비정상적인 세포 형태 (예컨대, 크기 축소)를 보였다. 이러한 관찰결과는 세포 생존율 검정 결과 (도 6b)에도 또한 반영되는 바이러스 유도 세포독성을 반영한다. 정상 폐 상피 세포주인 BEAS2B 또한 본 실험에서 시험하였다. 도 6c 및 6d에 제시된 바와 같이, BEAS2B는 100 정도로 높은 MOI에서도 WT-CVB3 및 miR-CVB3 모두에 대해 허용되지 않거나, 또는 내성을 갖는다.

실시예 6

마우스 모델에서의 miR-CVB3의 생체내 시험

바이러스 주사 후 14일째를 종점으로 하여 면역손상된 NOD-SCID 마우스에서 WT-CVB3과 비교하여 miR-CVB3의 안전성 시험을 수행하였다. 6주령된 마우스에 WT-CVB3 (마우스 4마리) 또는 miR-CVB3 (마우스 5마리)을 1x10⁸ PFU의 단일 용량으로 복강내로 투여하였다. 이어서, 처리된 마우스를 체중 변화, 외모, 거동 및 종양 세포 주사 부위의 임의의 감염 징후에 대해 매일 모니터링하였다. 마우스를 종점 14일째까지 케이지에 보관한 후, 이어서, 안락사시켰다. H&E 및 바이러스 캡시드 단백질 VP1 염색 뿐만 아니라, 바이러스 플라크 검정을 위해 심장, 췌장, 폐, 간, 신장 및 비장을 수집하였다. 도 7a에 제시된 바와 같이, WT-CVB3으로 처리된 NOD-SCID 마우스는 심각한 독성을 보였고, 전 시간 과정 동안에 걸쳐 단 1마리의 마우스만 생존한 반면 (25% 생존율), miR-CVB3으로 처리된 모든 마우스는 실험 종료시에도 생존하였다 (100% 생존율). 도 7b에 제시된 H&E 염색 슬라이드로부터 보면, 주요 장기 중 폐, 췌장, 간 및 비장에서는 두 군의 마우스 간에 유의한 병리학적 차이가 관찰되지 않았으며, 조직은 병리학적 점수에 기초하면 정상인 것으로 보였다 (도 7c). 그럼에도 불구하고, WT-CVB3으로 처리된 마우스로부터의 심장 슬라이드에서 보라색 영역으로 표시된 심각한 괴사 또는 조직 손상이 관찰되었으며, 이는 miR-CVB3으로 처리된 마우스로부터의 조직 슬라이드에는 존재하지 않았다. 병리학적 점수 평가 (도 7c)에서, miR-CVB3으로 처리된 마우스가 아닌, WT-CVB3으로 처리된 마우스의 심장에서 높은 점수의 조직 손상이 관찰되었다. miR-CVB3으로 처리된 마우스에서는 심장독성이 거의 없어진 것으로 추측된다. VP1 면역염색에 의한 바이러스 정량화 (도 7d 및 7e)는 WT-CVB3 마우스와 비교하여 바이러스 단백질 VP1 발현의 유의한 감소를 보여주었으며 (miR-CVB3으로 처리된 마우스의 심장에서는 거의 검출불가능), 이는 miR-CVB3 마우스에서의 심장 손상 감소가 주로 바이러스 복제 감소에 기인한다는 것을 나타낸다. 또한, VP1 발현은 miR-CVB3으로 처리된 마우스의 췌장에서 거의 검출불가능한 것으로 관찰되었다. 도 7f에 제시된 바와 같이, 두 군으로부터의 마우스의 심장, 폐 및 췌장에서 살아있는 바이러스도 측정하였고, miR-CVB3의 역가는 심장에서 WT-CVB3의 역가와 비교하여 유의하게 감소하였지만, 췌장 및 폐에서는 유의하지 않았다. miR-CVB3에 의한 유의한 심혈관독성은 없었고: 비록 낮은 수준이기는 하였지만, 심장에는 여전히 살아있는 miR-CVB3이 존재하였다.

miR-CVB3 종양용해성 바이러스의 효능 시험을 위해, TP53 ^mut SCLC 세포주 H526을 사용하여 이종이식 마우스 모델을 확립하였다. 간략하면, H526 세포 (1x10⁷개의 세포)를 8주령된 수컷 NOD-SCID 마우스의 왼쪽 및 오른쪽 옆구리에 피하 주사하였다. 종양 크기가 약 100 ㎣에 도달했을 때 (약 10일째), 마우스에 PBS (마우스 8마리), WT-CVB3 (마우스 5마리) 또는 miR-CVB3 (마우스 8마리)를 단일 용량 (1x10⁸ PFU)으로 복강내로 주사하였다. 마우스를 일반 외모, 거동, 체중, 및 종양 세포 주사 부위의 임의의 감염 징후에 대해 매일 모니터링하였다. 종양 크기를 주 2회 측정하고, 종양 부피는 길이 x 너비 x 너비/2로 계산하였다. 마우스가 CVB3 주사와 관련된 심각한 증상을 보일 때, 또는 종양 직경이 2.0 cm를 초과하지 않는다면, 종료일 25일째까지 마우스를 안락사시켰다. 생존율 (도 8a)이 나타내는 바와 같이, 종점 25일째까지 miR-CVB3으로 처리된 마우스 8마리 모두 정상인 것으로 보인 반면, PBS로 처리된 모의 마우스 8마리 중 6마리는 종양 크기가 너무 크기 때문에 안락사시켰고; WT-CVB3으로 처리된 마우스 5마리는 모두 14일째 이환으로 인해 사망하거나, 안락사되었다. 종양 성장 곡선 (도 8b)에 제시된 바와 같이, PBS로 처리된 마우스의 종양은 종료일 25일째까지 계속 성장한 반면, 두 바이러스로 처리된 마우스 군 모두의 종양은 계속 줄어들거나, 또는 종양 성장이 낮은 수준으로 유지되었다. 예상대로, WT-CVB3으로 처리된 마우스는 14일째 이후에는 생존하지 못했다. 이식된 종양 및 다양한 기관을 25일째에 수확하였다. 종양 중량 (평균 +/- SD) (도 8c) 및 바이러스 역가 (평균 +/- SD) (도 8d)를 측정하고, H&E 염색 (도 8e)을 수행하였다. PBS 모의 대조군 대비 #p < 0.01. PBS로 처리된 마우스의 심장, 췌장, 폐, 간, 비장, 신장, 장, 뇌 및 H526 유래 종양에서 qRT-PCR에 의해 miR-145 (도 8f) 및 miR-143 (도 8g)의 발현 수준을 정량화하였다. 결과는 평균 +/- SD (n=3)로 제시되어 있다. 상이한 마우스 조직과 H526 이식된 종양 사이의 miRNA 수준을 비교하기 위해 독립 스튜던츠 t-검정을 수행하였다. 이식된 종양 대비 *, p<0.05; #, p<0.01. 이들 데이터는 miR-145 및 miR-143의 수준이 정상 마우스 조직과 비교하여 이식된 SCLC에서 유의하게 더 낮다는 것을 나타낸다. 요약하면, 상기 결과는 miR-CVB3이 실질적으로 감소된 심장독성하에 마우스 이종이식 모델에서 종양 성장을 억제하는 능력을 유지함을 나타낸다.

실시예 7

추가의 miRNA 변형된 CVB3 구축 및 면역적격 마우스 모델에서의 생체내 시험

miR145의 표적 서열 카피 4개, 및 miR-143, miR-1, miR-133, 또는 miR-216의 표적 서열 카피 2 내지 4개를 CVB3 게놈의 5' UTR로 삽입하여, miR-CVB3-A, miR-CVB3-B, 및 miR-CVB3-C로 표시된 3개의 추가적인 재조합 miRNA 조작된 CVB3 벡터를 구축하였다 (도 9a 참조).

14일 동안 ~4주령된 수컷 C57BL/6 마우스에 1회 용량의 WT-CVB3 (n=3), miR-CVB3 (n=3), miR-CVB3-A (n=3), miR-CVB3-B (n=3), 또는 miR-CVB3-C (n=3)를 1x10⁸ PFU로 복강내로 접종하거나, 또는 PBS (n=3)로 모의 감염시켰다. WT-CVB3 및 miR-CVB3을 접종받은 마우스에서 체중 감소가 관찰된 반면, miR-CVB3-A, miR-CVB3-B, 또는 miR-CVB3-C를 접종받은 마우스에서는 PBS 대조군을 접종받은 마우스와 유사한 속도로 계속해서 체중이 증가하였다 (도 9b 참조). 흥미롭게도, miR 변형된 CVB3 벡터 중 임의의 것으로 처리된 마우스는 14일 후 어떤 독성 징후도 보이지 않았으며, 이는 12일에 인도적 종점에 도달하였고, 안락사시켜야 했던, WT-CVB3으로 처리된 마우스와는 극명한 대조를 이루었다 (도 9c 참조). H&E 염색을 위해 마우스 기관을 수확하였고, 각 동물의 심장, 폐, 췌장, 간 및 비장으로부터 단리된 조직에 병리학적 점수를 부여하였으며, 췌장에서 가장 높은 병리학적 점수가 관찰되었다 (도 9d 참조).

실시예 8

다중 miRNA 조절된 CVB3 변이체의 시험관내 심장독성

miR-145 표적화된 서열의 카피 4개가 단독으로 (그의 정방향 또는 역방향 배향으로) 또는 miR-143 표적 서열의 카피 2개와 함께 조합되어 CVB3 게놈의 5' UTR 또는 3' UTR에 삽입된 여러 miRNA 변형된 CVB3을 생성하였다. 마우스 HL-1 심근세포를 72시간 동안 모의 감염시키거나, 또는 명시된 바와 같은 상이한 MOI로 WT-CVB3 또는 다양한 변형된 CVB3을 접종하였다. 도 11a에 제시된 바와 같이, 세포독성을 크리스탈 바이올렛 염색으로 평가하였다. 도 11b에 제시된 바와 같이, 세포 생존율을 알라마르블루(alamarBlue) 검정에 의해 측정하였다 (평균 +/- SD, n=3). miR-145 표적 서열의 카피 4개 및 miR-143 표적 서열의 카피 2개가 CVB3 게놈의 5' UTR 또는 3' UTR에 삽입된 miRNA 조절된 CVB3은 시험관내에서 가장 적은 심장독성을 보였다. 상기 결과에 기반하여, miR-145/143(5' UTR)-CVB3 (본원에서 miR-CVB3으로 표시)을 추가 연구를 위해 선택하였다.

실시예 9

추가 miRNA-표적화 서열에 의한 CVB3의 변형이 면역적격 마우스에서 WT-CVB3-유도 심장독성 및 췌장독성을 모두 추가로 감소시킨다.

본 실험에서, ~4주령된 수컷 C57Bl/6 마우스에 1회 용량의 PBS (모의, n=5), WT-CVB3 (1x10⁸ PFU, n=5), 또는 miR145/143-CVB3 (1x10⁸ PFU, n=5)을 복강내로 접종하였다. H&E 염색을 위해 12일째에 마우스 기관을 수확하였다 (도 12a). 상이한 마우스 기관에서 및 인간 SCLC H526 세포 유래 종양에서 miR-1 및 miR216의 수준을 RT-PCR에 의해 측정하였다 (도 12b). 도 12c에 도시된 바와 같이 신규 miR-CVB3을 구축하였다. miR-145 및 miR-143은 종양 억제성인 반면, miR-1은 근육 조직에 풍부하고, miR-216은 췌장에서 특이적으로 발현된다. 이들 서열은 마우스와 인간 사이에서 100%의 상동성을 보여준다. C57BL/6 마우스에 상기 기술된 바와 같이 miR145/143/1/216-CVB3 (n=3)을 주사하고, H&E 염색을 위해 처리 후 14일째에 기관을 수집하였다 (도 12d). 도 12a 및 12d에 도시된 H&E 염색의 병리학적 스코어링은 도 12e에 제시되어 있다. WT-CVB3 군 대비 *,p<0.05; #, p<0.01. 생존율의 카플란 마이어(Kaplan Meier) 플롯은 도 12f에 제시되어 있다.

C57BL/6 마우스에 상기 기술된 바와 같이 다양한 유형의 CVB3을 주사하고, 바이러스 단백질 VP1의 IHC 염색 (도 13a) 및 상이한 기관 또는 혈액에서의 바이러스 RNA의 RT-PCR 분석 (도 13b)을 위해 처리 후 13-14일째에 기관을 수집하였다.

실시예 10

miRNA145/143/1/216-CVB3은 WT-CVB3에 필적하는 수준으로 SCLC 세포를 강력하게 사멸시킨다.

TP53 ^mut /Rb1 ^mut SCLC 세포주 (H524 및 H526)를 72시간 동안 모의 처리하거나, 또는 명시된 바와 같은 상이한 MOI로 WT 또는 miR145/143/1/216-CVB3으로 감염시켰다. 알라마르블루 검정법을 통해 세포 생존율을 평가하였다 (평균 +/- SD, n=3). WT-CVB3 대비 *, p<0.05 (도 14a). 트랜스제닉 마우스로부터 단리된 마우스 TP53 ^-/- / Rb1 ^-/- / PTEN ^-/- SCLC 세포를 상기 기술된 바와 같이 처리하고, 크리스탈 바이올렛 염색에 의해 세포독성을 평가하였다 (도 14b).

실시예 11

miRNA 변형된 CVB3은 다양한 마우스 종양 세포를 효율적으로 사멸시킨다.

본 실험에서 사용된 다양한 마우스 종양 세포주, 암 유형 및 숙주 정보는 도 15a에 기술되어 있다. 세포주를 72시간 동안 모의 감염시키거나, 또는 상이한 MOI로 miR145/143-CVB3으로 감염시킨 후, 크리스탈 블루 염색을 수행하였다 (도 15b). 도 15c에 도시된 바와 같이 3개의 miR-CVB3을 구축하였다 (miR-145/143-CVB3 (도 9a에서 "miR-CVB3"으로 명명), miR-145/143/133/216-CVB3 (도 9a에서 "miR-CVB3-C"로 명명), miR-145/143/1/216-CVB3 (도 9a에서 "miR-CVB3-B"로 명명), 및 miR-145/143/216-CVB3 (도 9a에서 "miR-CVB3-A"로 명명)).

인간 KRAS ^mut H23 세포 및 상기 기술된 다양한 마우스 종양 세포주를 72시간 동안 모의 감염시키거나, 또는 MOI로 0.1, 1, 또는 10으로 상이한 miR-CVB3으로 감염시킨 후, 크리스탈 바이올렛 염색을 수행하였다 (도 15d).

본 발명은 본원에서 광범위하게 및 일반적으로 기술되었다. 일반 개시내용 에 포함되는 하위 종 및 하위속 그룹들도 각각 본 발명의 일부를 형성한다. 이는 삭제되는 물질이 본원에서 구체적으로 언급되었는지 그 여부와 상관없이, 임의의 대상 물질을 속으로부터 제거한다는 것을 조건부로 또는 그러한 부정적 한정하에서 본 발명의 일반적인 설명을 포함한다.

본원에서 및 첨부된 청구범위에서 사용되는 바, "하나"라는 단수 형태는 문맥상 달리 명확하게 지시되지 않는 한, 복수의 언급 대상을 포함하고, "X 및/또는 Y"는 "X" 또는 "Y", 또는 그 둘 모두 "X" 및 "Y"를 의미하고, 명사 다음의 문자 "들"은 상기 명사의 복수 형태 및 단수 형태, 그 둘 모두를 지정한다는 것 또한 이해하여야 한다. 추가로, 본 발명의 특징 또는 측면이 마쿠쉬 그룹으로 기술될 때, 본 발명은 마쿠쉬 그룹의 임의의 개별 구성원 및 구성원의 임의의 서브군을 포함하고, 또한 이에 따라 그에 의해 기술되는 것으로 의도되고, 관련 기술분야의 통상의 기술자는 상기 내용을 인지할 것이며, 출원인은 출원 또는 청구범위를 수정하여 마쿠쉬 그룹의 임의의 개별 구성원 또는 구성원의 임의의 서브군을 구체적으로 지칭할 수 있는 권리를 갖는다.

본원에서 사용된 용어는 단지 특정 실시양태를 기술하기 위한 것이며, 제한하는 것으로 의도되지 않음을 이해하여야 한다. 본원에서 구체적으로 정의되지 않는 한, 본원에서 사용된 용어는 관련 기술분야에 공지된 바와 같은 그의 통상적인 의미를 제공하는 것임을 추가로 이해하여야 한다.

본 명세서 전역에 걸쳐 "한 실시양태" 또는 "실시양태" 및 그의 변형의 것을 언급하는 것은 실시양태와 관련하여 설명된 특정 특징, 구조 또는 특성이 적어도 하나의 실시양태에 포함된다는 것을 의미한다. 따라서, 본 명세서 전역에 걸쳐 다양한 곳에서 "한 실시양태에서" 또는 "실시양태에서"라는 어구의 출현은 반드시 모두 동일한 실시양태를 지칭하는 것은 아니다. 추가로, 특정 특징, 구조 또는 특성은 하나 이상의 실시양태에서 임의의 적합한 방식으로 조합될 수 있다.

본 명세서 및 첨부된 청구범위에서 사용되는 바, "하나"라는 단수 형태는 내용상 및 문맥상 달리 명확하게 지시되지 않는 한, 복수의 언급 대상, 즉, 하나 이상의 것을 포함한다. "및" 및 "또는"이라는 접속어는 일반적으로 내용상 및 문맥상 경우에 따라 포괄적으로 또는 배타적으로 명확하게 지시되지 않는 한, "및/또는"을 포함하는 것으로 가장 광범위한 의미로 사용된다는 점에도 주의하여야 한다. 따라서, 대안 (예컨대, "또는")의 사용은 대안 중 하나, 그 둘 모두, 또는 그의 임의 조합을 의미하는 것으로 이해되어야 한다. 추가로, 본원에서 "및/또는"으로 언급될 때, "및" 및 "또는"의 구성은 연관된 항목 또는 아이디어 모두를 포함하는 실시양태 및 전체 연관된 항목 또는 아이디어보다는 더 적게 포함하는 하나 이상의 다른 대안적 실시양태를 포함하는 것으로 의도된다.

문맥상 달리 요구되지 않는 한, 본 명세서 전역 및 하기 청구범위에서, "포함하다(comprise)"라는 단어 및 예컨대, "갖는다" 및 "포함하다(include)"와 같은 동의어 및 그의 변이형 뿐만 아니라, 예컨대, "포함하다(comprises)" 및 "포함하는(comprising)"과 같은, 상기 단어의 어미 변형은 예컨대, "~을 포함하나, 이에 제한되지 않는"과 같은, 개방식의 포괄적인 의미로 해석되어야 한다. "본질적으로 ~으로 이루어진"이라는 용어는 청구범위의 범주를 언급된 물질 또는 단계로, 또는 청구된 발명의 기본적이고, 신규한 특징에 실질적으로 영향을 주지 않는 것으로 제한한다.

본 명세서 내에서 사용된 임의의 표제는 단지 독자의 검토를 촉진하기 위해서만 사용되며, 어떤 방식으로든 본 발명 또는 청구범위를 제한하는 것으로 해석되지 않아야 한다. 따라서, 본원에 제공된 본 개시내용의 표제 및 요약서는 단지 편의를 위한 것일 뿐이며, 실시양태의 범주 또는 의미를 해석하지 않는다.

본원에서 값의 범위가 제공되는 경우, 문맥상 달리 명확하게 명시하지 않는 한, 그 범위 및 언급된 그 범위 내의 임의의 다른 언급된 또는 개재 값의 상한 및 하한 사이의 각각의 개재하는 값은 하한 단위의 1/10까지도 본 발명 내에 포함되는 것으로 이해된다. 이들 더 작은 범위의 상한 및 하한은 독립적으로 더 작은 범위에 포함될 수 있으며, 언급된 범위에서 구체적으로 배제된 제한에 따라 본 발명에 포함된다. 언급된 범위가 한계 중 하나 또는 둘 모두를 포함하는 경우, 포함된 한계 중 하나 또는 둘 모두를 제외한 범위도 본 발명에 포함된다.

예를 들어, 본원에 제공된 임의의 농도 범위, 백분율 범위, 비 범위 또는 정수 범위는 달리 명시되지 않는 한, 언급된 범위 내의 임의의 정수 값, 및 적절한 경우, 그의 분수 (예컨대, 정수의 1/10 및 1/100)를 포함하는 것으로 이해되어야 한다. 또한, 예컨대, 중합체 서브 유닛, 크기 또는 두께와 같은 임의의 물리적 특징과 관련하여 본원에 언급된 임의의 수치 범위는 달리 명시되지 않는 한, 언급된 범위 내의 임의의 정수를 포함하는 것으로 이해되어야 한다. 본원에서 사용되는 바, "약"이라는 용어는 달리 명시되지 않는 한, 명시된 범위, 값 또는 구조의 ± 20%를 의미한다.

본 명세서에서 언급되고/거나, 출원 정보 요약서(Application Data Sheet)에 열거된 미국 특허, 미국 특허 출원 공개, 미국 특허 출원, 외국 특허, 외국 특허 출원 및 비-특허 공개문헌은 그 전문이 본원에서 참조로 포함된다. 상기 문헌은 예를 들어, 기술된 본 발명과 관련하여 사용될 수 있는, 공개문헌에 기술된 물질 및 방법론을 기술하고, 공개할 목적으로 참조로 포함될 수 있다. 상기 및 본 명세서 전역에 걸쳐 논의된 공개문헌은 본 출원의 출원일 이전의 그의 개시내용에 대해서만 제공된다. 본원의 어느 것도 본 발명자들이 선행 발명에 의해 임의의 참조된 공개문헌을 선행할 자격이 없다는 것을 인정하는 것으로 해석되어서는 안된다.

본원에서 참조 또는 언급된 모든 특허, 공개문헌, 과학 논문, 웹 사이트, 및 다른 문헌들은 본 발명과 관련된 관련 기술분야의 통상의 기술자의 기술 수준을 나타내며, 상기 참조된 각각의 문헌 및 자료는, 마치 그 전문이 개별적으로 참조로 포함되거나, 또는 그 전문이 본원에 기술된 것과 같은 정도로 본원에서 참조로 포함된다. 출원인은 임의의 상기 특허, 공개문헌, 과학 논문, 웹 사이트, 전자적으로 이용가능한 정보 및 다른 참조된 자료 또는 문헌으로부터의 임의의 모든 자료 및 정보를 본 명세서에 물리적으로 포함시킬 수 있는 권리를 갖는다.

일반적으로, 하기 청구범위에서 사용되는 용어는 본 명세서 및 청구범위에 개시되는 특정 실시양태로 청구범위를 제한하는 것으로 해석되지 않아야 하고, 상기 청구범위의 자격이 있는 전 범주의 등가물과 함께 모든 가능한 실시양태를 포함하는 것으로 해석되어야 한다. 따라서, 청구범위는 본 개시내용에 의해 제한되지 않는다.

추가로, 본 특허의 서면으로 작성된 설명 부분은 모든 청구범위를 포함한다. 추가로, 모든 원본 청구범위 뿐만 아니라, 임의의 모든 우선권 문헌으로부터의 모든 청구범위를 비롯한, 모든 청구범위는 그 전문이 본원에서 참조로 본 명세서의 서면으로 작성된 설명 부분으로 포함되고, 출원인은 임의의 모든 상기 청구범위를 본 출원의 서면으로 작성된 설명 부분 또는 임의의 다른 부분으로 물리적으로 포함시킬 수 있는 권리를 갖는다. 따라서, 예를 들어, 어떠한 경우에도 본 특허는 본 특허의 서면으로 작성된 설명 부분의 이 말에서 청구범위의 정확한 표현이 기술되지 않았다는 주장으로, 이른바, 청구범위에 대해 서면으로 작성된 설명이 제공되지 않은 것으로 해석될 수 없다.

청구범위는 법에 따라 해석될 것이다. 그러나, 임의의 청구범위 또는 그의 일부를 해석하는 것이 용이하거나 어렵다고 주장되거나 인식된 경우에도 불구하고, 어떠한 경우에도 이러한 특허로 이어지는 출원 또는 출원들을 심사하는 동안 청구범위 또는 그의 임의의 일부를 조정 또는 수정하는 것이 선행 기술의 일부를 형성하지 않는 그의 임의의 모든 등가물에 대한 임의의 권리를 상실하는 것으로 해석될 수 없다.

다른 비제한적인 실시양태도 하기 청구범위 내에 있다. 특허는 본원에서 구체적으로 및/또는 명확하게 개시된 특정 예 또는 비제한적인 실시양태 또는 방법으로 제한되는 것으로 해석되지 않을 수 있다. 특허청(Patent and Trademark Office)의 임의의 심사관 또는 임의의 다른 공무원 또는 직원의 진술이 구체적으로, 및 무조건부로 또는 유보 없이 명확하게 출원인에 의해 답변서에서 채택되지 않았다면, 어떠한 경우에도 상기 진술에 의해 특허가 제한되는 것으로 해석될 수 없다.

SEQUENCE LISTING <110> Virogin Biotech Canada Ltd <120> Genetically Modified Enterovirus Vectors <130> VIRO.412P1 <150> US 62/883,055 <150> 2019-08-05 <160> 14 <170> PatentIn version 3.5 <210> 1 <211> 44 <212> DNA <213> Homo sapiens <400> 1 ctcaactggt gtcgtggagt cggcaattca gttgagaggg attc 44 <210> 2 <211> 53 <212> DNA <213> Homo sapiens <400> 2 gtcgtatcca gtgctgggtc cgagtgattc gcactggata cgactgagct aca 53 <210> 3 <211> 43 <212> DNA <213> Homo sapiens <400> 3 ctcaacggtg tcgtggagtc ggcaattcag ttgagctacc tgc 43 <210> 4 <211> 22 <212> DNA <213> Homo sapiens <400> 4 cggcgggtcc agttttccca gg 22 <210> 5 <211> 24 <212> DNA <213> Homo sapiens <400> 5 ctggtgtcgt ggagtcggca attc 24 <210> 6 <211> 20 <212> DNA <213> Homo sapiens <400> 6 cctggcctga gatgaagcac 20 <210> 7 <211> 19 <212> DNA <213> Homo sapiens <400> 7 cagtgctggg tccgagtga 19 <210> 8 <211> 22 <212> DNA <213> Homo sapiens <400> 8 cggcggcaaa gtgctgttcg tg 22 <210> 9 <211> 24 <212> DNA <213> Homo sapiens <400> 9 ctggtgtcgt ggagtcggca attc 24 <210> 10 <211> 60 <212> DNA <213> Coxsackievirus B <400> 10 gttgatactt gagctcccat tttgctgtat ggatcctttg ctgtattcaa cttaacaatg 60 <210> 11 <211> 32 <212> DNA <213> Homo sapiens <400> 11 aatggatcct taattaacga agggattcct gg 32 <210> 12 <211> 37 <212> DNA <213> Homo sapiens <400> 12 aatggatcct taattaaatc gatagcgtcc agttttc 37 <210> 13 <211> 58 <212> DNA <213> Homo sapiens <400> 13 cgtgagctac agtgcttcat ctcacgattg agctacagtg cttcatctca tctagaat 58 <210> 14 <211> 58 <212> DNA <213> Homo sapiens <400> 14 cgattctaga tgagatgaag cactgtagct caatcgtgag atgaagcact gtagctca 58

Claims

변형된 엔테로바이러스 게놈을 포함하는 복제 종양용해성 바이러스 벡터이며, 여기서 변형된 엔테로바이러스 게놈은 엔테로바이러스 게놈의 비번역 영역 (UTR)에 작동가능하게 연결된 하나 이상의 miRNA 표적 서열의 하나 이상의 카피를 포함하는 것인, 복제 종양용해성 바이러스 벡터.
제1항에 있어서, 상기 엔테로바이러스가 콕사키바이러스인 복제 종양용해성 바이러스 벡터.
제2항에 있어서, 콕사키바이러스가 콕사키바이러스 A 또는 B인 복제 종양용해성 바이러스 벡터.
제1항에 있어서, 비번역 영역 (UTR)이 5' UTR 또는 3' UTR인 복제 종양용해성 바이러스 벡터.
제1항에 있어서, 하나 이상의 miRNA 표적 서열의 하나 이상의 카피가 2개 이상의 상이한 miRNA 표적 서열의 하나 이상의 카피를 포함하는 것인 복제 종양용해성 바이러스 벡터.
제1항에 있어서, 크기가 2 내지 50 염기쌍인 스페이서가 하나 이상의 miRNA 표적 서열 사이에 삽입되는 것인 복제 종양용해성 바이러스 벡터.
제1항에 있어서, 하나 이상의 miRNA 표적 서열의 하나 이상의 카피가 심장 또는 췌장 특이적 miRNA를 인식하는 것인 복제 종양용해성 바이러스 벡터.
제1항에 있어서, 하나 이상의 상이한 miRNA 표적 서열이 miR1, miR-7, miR-30c, miR-124, miR-124*, miR-127, miR-128, miR-129, miR-129*, miR-133, miR-135b, miR-136, miR-136*, miR-137, miR-139-5p, miR-143, miR-154, miR-184, miR-188, miR-204, miR-208, miR216, miR217, miR-299, miR-300-3p, miR-300-5p, miR-323, miR-329, miR-337, miR-335, miR-341, miR-369-3p, miR-369-5p, miR-375, miR-376a, miR-376a*, miR-376b-3p, miR-376b-5p, miR-376c, miR-377, miR-379, miR-379*, miR-382, miR-382*, miR-409-5p, miR-410, miR-411, miR-431, miR-433, miR-434, miR-451, miR-466b, miR-485, miR-495, miR-499, miR-539, miR-541, miR-543*, miR-551b, miR-758, 및 miR-873으로 이루어진 군으로부터 선택되는 miRNA를 인식하는 것인 복제 종양용해성 바이러스 벡터.
제8항에 있어서, 2개 이상의 상이한 miRNA 표적 서열이 miR1, miR133, miR216, miR145 및 miR143에 대한 표적 서열을 포함하는 것인 복제 종양용해성 바이러스 벡터.
제9항에 있어서, miR1, miR133, miR216, miR145 및 miR143에 대한 표적 서열의 카피 2, 3, 4, 5, 또는 6개를 포함하는 복제 종양용해성 바이러스 벡터.
제1항에 있어서, 하나 이상의 miRNA 표적 서열의 하나 이상의 카피가 정방향 배향으로 존재하고, 하나 이상의 miRNA 표적 서열의 하나 이상의 카피가 역방향 배향으로 존재하는 것인 복제 종양용해성 바이러스 벡터.
제1항에 있어서, 변형된 엔테로바이러스 게놈이 면역자극 인자, 항체, 및 체크포인트 차단 펩티드로 이루어진 군으로부터 선택되는 비-바이러스성 단백질을 코딩하는 적어도 하나의 핵산을 포함하고, 여기서 적어도 하나의 핵산은 적합한 종양-특이적 조절 영역에 작동가능하게 연결된 것인 복제 종양용해성 바이러스 벡터.
제12항에 있어서, 비-바이러스성 단백질이 IL12, IL15, IL15 수용체 알파 서브유닛, OX40L, CD73, 및 체크포인트 억제제로 이루어진 군으로부터 선택되는 것인 복제 종양용해성 바이러스 벡터.
종양 세포에 유효량의 제1항 내지 제13항 중 어느 한 항의 제1 복제 종양용해성 바이러스 벡터를 제공하는 단계를 포함하는, 종양 세포를 용해시키는 방법.
제14항에 있어서, 종양 세포가 폐암 세포를 포함하는 것인 방법.
제14항에 있어서, 종양 세포가 췌장암 세포, 간암 세포, 또는 유방암 세포를 포함하는 것인 방법.
제1항 내지 제13항 중 어느 한 항의 적어도 하나의 복제 종양용해성 바이러스 벡터 및 제약상 허용되는 담체를 포함하는 치료 조성물.
치료 유효량의 제17항의 조성물을 포함하는 조성물을 투여하는 단계를 포함하는, 암을 앓고 있는 대상체에서 암을 치료하는 방법.
제18항에 있어서, 상기 암이 폐암, 췌장암, 간암 및 유방암으로 이루어진 군으로부터 선택되는 것인 방법.
제18항에 있어서, 암이 KRAS 돌연변이와 연관된 비-소세포 폐암 (NSCLC), 일반적으로 TP53 및 Rb 돌연변이와 연관된 소세포 폐암 (SCLC), 또는 췌장암인 방법.
제18항에 있어서, 투여가 정맥내 (IV) 투여, 복강내 (IP) 투여, 또는 종양내 (IT) 투여인 방법.