JP2003504052A - 複製−コンピテント抗癌ベクター - Google Patents

複製−コンピテント抗癌ベクター

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Abstract

(57)【要約】 新形成細胞において複製コンピテントであって、アデノウイルス死滅蛋白質を過剰発現する新規なベクターを開示する。開示されたベクターのいくつかは新形成細胞または新形成肺胞ＩＩ型細胞に複製−制限される。これらの複製−コンピテントベクターを用いる新形成細胞の死滅を促進するための組成物および方法も開示する。

Description

【発明の詳細な説明】
【０００１】 （政府助成金への参照） 本発明はＮａｔｉｏｎａｌ Ｉｎｓｕｔｉｔｕｔｅｓ ｏｆ Ｈｅａｌｔｈか
らの補助金（補助金番号ＲＯ１ ＣＡ７１７０４およびＣＡ８１８２９）下で政
府の支援により成された。合衆国政府は本発明においてある種の権利を有する。
【０００２】 （発明の背景） （１）発明の分野 本発明は一般に癌の治療、さらに詳しくは、新形成細胞において複製し、アデ
ノウイルス死滅蛋白質（ＡＤＰ）を過剰発現するベクターおよびヒト癌を治療す
るにおけるこのベクターの使用に関する。
【０００３】 （２）関連技術の記載 癌は合衆国および他の国において死亡の主たる原因である。癌のタイプに応じ
て、それは典型的には外科手術、化学療法および／または放射線照射で治療され
る。これらの治療はしばしば失敗する。すなわち外科手術は全ての癌を除去する
ことができないことがあるし、いくつかの癌は化学療法および放射線照射療法に
対して抵抗性であるし、化学療法−抵抗性腫瘍が頻繁に発生する。新しい療法は
単独で、または古典的な技術と組み合わせて使用される必要がある。
【０００４】 活発な研究中の１つの潜在的療法は、抗癌治療蛋白質を発現する組換えウイル
スベクターで腫瘍を治療することである。アデノウイルス−ベースのベクターは
、癌の治療における使用のために、ならびに遺伝的障害の療法のために、それら
を概念的に訴えるものとするいくつかの特徴を含む。アデノウイルス（以後、「
Ａｄｓ」と相互交換的に用いる）は、培養にて安定である高力価ストックまで容
易に増殖させることができる。それらはほとんどのヒト癌細胞タイプで複製する
広い宿主範囲を有する。それらのゲノムは部位特異的突然変異および外来性プロ
モーターから発現された外来性遺伝子の挿入によって操作することができる。
【０００５】 アデノウイルスは蛋白質キャプシド内のＤＮＡ−蛋白質コアよりなる（Ｓｔｗ
ａｒｔら，「Ａｄｅｎｏｖｉｒｕｓ ｓｔｒｕｃｔｕｒｅ ｂｙ Ｘ−ｒａｙ
ｃｒｙｓｔａｌｌｏｇｒａｐｈｙ ａｎｄ ｅｌｅｃｔｒｏｎ ｍｉｃｒｏｓｃ
ｏｐｙ」 ｉｎ：Ｔｈｅ Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ Ｒｅｐｅｒｔｏｉｒｅ ｏｆ
Ａｄｅｎｏｖｉｒｕｓｅｓ，Ｄｏｅｒｆｌｅｒ，Ｗ．ら（編） Ｓｐｒｉｎｇｅ
ｒ−Ｖｅｒｌａｇ，Ｈｅｉｄｅｌｂｅｒｇ，Ｇｅｒｍａｎｙ，ｐ．２５−３８に
よってレビューされている）。ビリオンは特異的細胞受容体に結合し、エンドサ
イトーシスに付され、ゲノムはエンドソームから押し出され、核に輸送される。
該ゲノムは約３６遺伝子をコードする、約３６ｋｄｐの線状デュプレックスＤＮ
Ａである（図１Ａ）。核においては、「即時型」Ｅ１Ａ蛋白質が最初に発現され
、これらの蛋白質はＥ１Ｂ、Ｅ２、Ｅ３およびＥ４転写ユニットによってコード
された「遅延初期」蛋白質の発現を誘導する（Ｓｈｅｎｋ，Ｔ．「Ａｄｅｎｏｖ
ｉｒｉｄａｅ：ｔｈｅ ｖｉｒｕｓｅｓ ａｎｄ ｔｈｅｉｒ ｒｅｐｌｉｃａ
ｔｉｏｎ」 ｉｎ：Ｆｉｅｌｄｓ Ｖｉｒｏｌｏｇｙ，Ｆｉｅｌｄ，Ｂ．Ｎ．ら
，Ｌｉｐｐｅｎｃｏｔｔ−Ｒａｖｅｎ，Ｐｈｉｌａｄｅｌｐｈｉａ，ｐ．２１１
１−２１４８によってレビューされている）。また、Ｅ１Ａ蛋白質は細胞遺伝子
を誘導または抑制し、その結果、細胞周期が刺激される。約２３の初期蛋白質は
細胞を侵奪するように機能し、ウイルスＤＮＡ複製を開始させる。ウイルスＤＮ
Ａは感染後（ｐ．ｉ．）約７時間の時点において複製し、次いで、後期遺伝子が
「主要後期」転写ユニットから発現される。主要後期ｍＲＮＡは、代替プレ−ｍ
ＲＮＡプロセッシングによって、通常の「主要後期プロモーター」から合成され
る。各後期ｍＲＮＡはその５’−末端において通常の「３部リーダー」を含み（
図１中エクソン１、２および３）、これはＡｄ後期ｍＲＮＡの効果的な翻訳を可
能とする。細胞蛋白質合成は停止し、細胞はウイルス蛋白質を作成するための工
場となる。ビリオンは感染後約１日の時点で核で組み立てられ、２ないし３日後
には細胞は溶解し、子孫ウイルスを放出する。細胞溶解はＥ３ １１．６Ｋ蛋白
質によって媒介され、これは「アデノウイルス死滅蛋白質」（ＡＤＰ）と再命名
されている（Ｔｏｌｌｅｆｓｏｎら，Ｊ．Ｖｉｒｏｌ．７０：２２９６−２３０
６，１９９６；Ｔｏｌｌｅｆｓｏｎら，Ｖｉｒｏｌ．２２０：１５２−１６２，
１９９６）。本明細書中で上位概念的意味で用いられる用語ＡＤＰとは、集合的
に、その全てが高度な配列同様性で持って相同ＡＤＰを発現する、例えば、Ａｄ
タイプ１（Ａｄ１）、Ａｄタイプ２（Ａｄ２）、Ａｄタイプ５（Ａｄ５）または
Ａｄタイプ６（Ａｄ６）のごときアデノウイルスからのＡＤＰ群を言う。
【０００６】 ヒト・アデノウイルス５型（Ａｄ５）は癌遺伝子治療で特に有用である。それ
は、主として、年少の子供で無兆候または穏やかな気管感染、続いて長期の実質
的免疫性を引き起こす。患者が免疫無防備状態である場合を除き、死を招く状態
は極端に希である（Ｈｏｒｗｉｔｚ，Ｍ．Ｓ．，Ａｄｅｎｏｖｉｒｕｓｅｓ，ｐ
．２１４９−２１７１ Ｉｎ Ｂ．Ｎ．Ｆｉｅｌｄｓ，Ｄ．Ｍ．Ｋｎｉｐｅ，ａ
ｎｄ Ｐ．Ｍ．Ｈｏｗｌｅｙ（編），Ｆｉｅｌｄｓ Ｖｉｒｏｌｏｇｙ，Ｌｉｐ
ｐｉｎｃｏｔｔ−Ｒａｖｅｎ Ｐｕｂｌｉｓｈｅｒｓ，Ｐｈｉｌａｄｅｌｐｈｉ
ａ，ＰＡ，１９９６）。Ａｄ５は非常によく理解されており、培養において、安
定である高力価ストックまで増殖させることができ、ほとんどのヒト癌細胞型で
複製することができる（Ｓｈｅｎｋ，Ｔ．，Ａｄｅｎｏｖｉｒｉｄａｅ：ｔｈｅ
ｖｉｒｕｓｅｓ ａｎｄ ｔｈｅｉｒ ｒｅｐｌｉｃａｔｉｏｎ，ｐ．２１１
１−２１４８．Ｉｎ Ｂ．Ｎ．Ｆｉｅｌｄｓ，Ｄ．Ｍ．Ｋｎｉｐｅ，ａｎｄ Ｐ
．Ｍ．Ｈｏｗｌｅｙ （編），Ｆｉｅｌｄｓ Ｖｉｒｏｌｏｇｙ，Ｌｉｐｐｉｎ
ｃｏｔｔ−Ｒａｖｅｎ，Ｐｈｉｌａｄｅｌｐｈｉａ，１９９６）。そのゲノムは
部位特異的突然変異誘発および外来性配列の挿入によって操作することができる
。
【０００７】 抗癌および遺伝子治療での使用が調べられつつあるＡｄベクターは、複製−欠
陥または複製−コンピテントいずれかである組換えＡｄに基づく。典型的な複製
−欠陥ＡｄベクターはＥ１ＡおよびＥ１Ｂ遺伝子（集合的にＥ１として知られて
いる）を欠き、外来性遺伝子の発現を駆動するプロモーターおよびプレ−ｍＲＮ
Ａプロセッシングシグナルよりなる発現カセットを所定の箇所に含有する。Ｅ１
Ａ蛋白質は他のＡｄ遺伝子の転写を誘導し、非形質転換細胞において、それは細
胞周期を脱調節し、種々の細胞遺伝子を誘導または抑制し、細胞をＧ０からＳ−
相４８に入れる（Ｗｈｉｔｅ，Ｅ．，Ｓｅｍｉｎ．Ｖｉｒｏｌ．８：５０５−５
１３，１９９８；Ｗｏｌｄら，ｐｐ．２００−２３２ Ｉｎ Ａ．Ｊ．Ｃａｎｎ
（編），ＤＮＡ Ｖｉｒｕｓ Ｒｅｐｌｉｃａｔｉｏｎ：Ｆｒｏｎｔｉｅｒｓ
ｉｎ Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ Ｂｉｏｌｏｇｙ，Ｏｘｆｏｒｄ Ｕｎｉｖｅｒｓｉ
ｔｙ Ｐｒｅｓｓ，Ｏｘｆｏｒｄ）。 Ｅ１Ｂ蛋白質は細胞アポトーシスを阻害
する（同上）。これらのベクターは、Ａｄ遺伝子発現およびＤＮＡ複製を誘導す
るのに必要なＥ１Ａ遺伝子を欠くので、複製することができない。加えて、Ｅ３
遺伝子は培養中の細胞におけるウイルス複製で必須ではないので通常は欠失して
いる。
【０００８】 多数の研究者が、抗癌治療蛋白質を発現する複製−欠陥Ａｄベクターを組み立
てた。通常、これらのベクターはマウスモデルで増殖するヒト腫瘍の直接的注入
によってテストされてきた。最も普通には、これらのベクターは単純疱疹ウイル
スからのチミジンキナーゼ遺伝子を発現し、ベクターによって形質導入された細
胞を殺すためにマウスがガンシクロビールで処理される（例えば、Ｆｅｌｚｍａ
ｎｎら，Ｇｅｎｅ Ｔｈｅｒ．４：１３２２−１３２９，１９９７参照）。もう
１つの自殺遺伝子治療アプローチは、シトシンデアミナーゼを発現する複製欠陥
Ａｄベクターを腫瘍に注入し、続いて、５−フルオロシトシンを投与する（Ｔｏ
ｐｆら，Ｇｅｎｅ Ｔｈｅｒ．５：５０７−５１３，１９９８）。研究者は、Ａ
ｄ−発現サイトカインが腫瘍に対する細胞毒性Ｔ−リンパ球（ＣＴＬ）を含めた
免疫応答を刺激するという予測のもとに、ＩＬ−２、ＩＬ−１２、ＩＬ−６、腫
瘍壊死因子（ＴＮＦ）、Ｉ型インターフェロン、または共刺激分子Ｂ７−１のご
ときサイトカインを発現する複製−欠陥Ａｄベクターを調製し、テストしてきた
（Ｆｅｌｚｍａｎｎら，ｓｕｐｒａ；Ｐｕｔｚｅｒら，Ｐｒｏｃ．Ｎａｔｌ．Ａ
ｃａｄ．Ｓｃｉ．ＵＳＡ ９４：１０８８９−１０８９４，１９９７）。他のベ
クターは腫瘍抗原（例えば、メラノーマＭＡＲＴ１）、細胞周期を脱調節し、ア
ポトーシスを誘導する蛋白質（ｐ５３、ｐＲＢ、ｐ２１Ｋｉｐ１／ＷＡＦ１，ｐ
１６ＣＤＫＮ２、およびＡｄ Ｅ１Ａでさえ）、およびリボザイムを発現する。
ＦａｓＬを発現するＡｄベクターはマウス腫瘍のアポトーシスおよび腫瘍退行を
誘導する（Ａｒａｉら，Ｐｒｏｃ．Ｎａｔｌ．Ａｃａｄ．Ｓｃｉ．ＵＳＡ ９４
：１３８６２−１３８６７，１９９７）。
【０００９】 これらの一般的に肯定的な報告とは無関係に、当該分野においては、複製−欠
陥Ａｄベクターはそれを治療で用いるのに次善にするいくつかの特徴を有すると
認められている。例えば、複製−欠陥ベクターの生産は、それが、Ｅ１Ａ蛋白質
をトランスにて提供する補充細胞系で増殖することを必要とする。そのような細
胞系は栄養条件が面倒であり、ウイルスストックの創製は時間を消費しかつ費用
がかかる。加えて、多くの外来性蛋白質がそのようなベクターから発現されてい
るが、発現のレベルはＡｄ後期蛋白質と比較して低い。
【００１０】 これらの問題と取り組むために、いくつかのグループは治療的使用のために複
製−コンピテントＡｄベクターを用いることを提案している。複製−コンピテン
トベクターは複製に必須のＡｄ遺伝子を保有し、かくして、複製するのに補充細
胞系を必要としない。複製−コンピテントＡｄベクターは、当該ベクターの細胞
周期の天然の一部として細胞を溶解させる。ベクターが外来性蛋白質をコードし
それを発現するように作成されている場合、複製−コンピテントＡｄベクターの
もう１つの利点が生じる。そのようなベクターは、ベクターが複製するにつれて
イン・ビボでコードされた蛋白質の合成を大いに増幅すると期待される。しかし
ながら、ＲＣベクターが正常な組織を損傷し、散在性ウイルス血症を引き起こす
のを防ぐためには、それが癌細胞に対するその複製を制限するいくつかの特徴を
有することが重要である。
【００１１】 Ｗｙｅｔｈ研究所は、Ａｄ血清型４、７および５のワクチン株を用い、ワクチ
ン摂取目的で複製−コンピテントＡｄベクターを開発した（Ｌｕｂｅｃｋら，Ａ
ＩＤＳ Ｒｅｓ．Ｈｕｍ．Ｒｅｔｒｏｖｉｒｕｓｅｓ １０：１４４３−１４４
９，１９９４）。外来性遺伝子は（Ｅ３遺伝子が欠失した）Ｅ３領域に挿入され
、またはゲノムの右側末端の部位に挿入される。用いる２つの外来性遺伝子はＢ
型肝炎表面抗原およびＨＩＶエンベロープ蛋白質であった。それらは培養中に良
好な発現を得、動物モデルにおいて抗血清を生起させることができた。Ｉ相ヒト
試験は不明瞭であり、プロジェクトはほとんど放棄された。
【００１２】 Ｏｎｙｘ Ｐｈａｒｍａｃｅｕｔｉｃａｌｓは、最近、非新形成細胞で複製欠
陥であるが、機能的ｐ５３および／または網膜芽細胞腫（ｐＲＢ）腫瘍サプレッ
サー蛋白質を欠く新形成細胞において複製表現型を呈するアデノウイルス−ベー
スの抗癌ベクターについて報告している（米国特許第５，６７７，１７８号；Ｈ
ｅｉｓｅら，Ｎａｔｕｒｅ Ｍｅｄ．６：６３９−６４５，１９９７；Ｂｉｓｃ
ｈｏｆｆら，Ｓｃｉｅｎｃｅ ２７４：３７３−３７６，１９９６）。この表現
型は、報告されているところによると、ｐ５３に結合することができないコード
されたＥ１Ｂ−５５Ｋ蛋白質を作成するＥ１Ｂ領域中の突然変異および／または
ｐＲＢおよび／もしくは細胞３００ｋＤポリペプチドおよび／もしくは１０７ｋ
Ｄポリペプチドに結合できないコードされたＥ１Ａ蛋白質（ｐ２８９Ｒまたはｐ
２４３Ｒ）を作成するＥ１Ａ領域中の突然変異（群）を含有する組換えアデノウ
イルスによって達成される。Ｅ１Ｂ−５５Ｋは少なくとも２つの独立した機能を
有する：それは腫瘍サプレッサー蛋白質ｐ５３に結合しそれを不活化し、それは
核からのＡｄ ｍＲＮＡの効果的な輸送で必要である。これらのＥ１ＢおよびＥ
１Ａウイルス蛋白質は、アデノウイルスＤＮＡの複製に必要な、細胞のＳ−相へ
の強制に関与する故に、かつｐ５３およびｐＲＢ蛋白質は細胞周期の進行をブロ
ックする故に、Ｏｎｙｘによって記載された組換えアデノウイルスベクターはｐ
５３および／またはｐＲＢが不足する細胞で複製し、これは多くの癌細胞で当て
はまるが、野生型ｐ５３および／またはｐＲＢを持つ細胞では当てはまらない。
Ｏｎｙｘは、ＯＮＹＸ−０１５と命名された、Ｅ１Ｂ−５５Ｋを欠くアデノウイ
ルスの複製がｐ５３−マイナス癌細胞系に制限され（Ｂｉｓｃｈｏｆｆら，前掲
）、およびＯＮＹＸ−０１５が、ヌードマウスで増殖するｐ５３−マイナスヒト
腫瘍の増殖を遅らせ、またはその退行を引き起こす（Ｈｅｉｓｅら、前掲）こと
を報告している。他の者は、ＯＮＹＸ−０１５の複製がｐ５３遺伝子型から独立
しており、いくつかの初代培養ヒト細胞で効果的に起こることを主張するＯｎｙ
ｘ報告に挑戦したＨａｒａｄａおよびＢｅｒｋ，Ｊ．Ｖｉｒｏｌ ７３：５３３
３−５３４４，１９９９）。今日、ＯＮＹＸ−０１５が野生型ｐ５３を持つ細胞
で複製できることが知られている（Ｇｏｏｄｒｕｍら，Ｊ．Ｖｉｒｏｌ．７２：
９４７９−９４９０，１９９８；Ｈａｒａｄａら，Ｊ．Ｖｉｒｏｌ．７３：５３
３３−５３４４，１９９９；Ｈａｙら，Ｈｕｍ．Ｇｅｎｅ Ｔｈｅｒ．１０：５
７９−５９０，１９９９；Ｒｏｔｈｍａｎｎら，Ｊ．Ｖｉｒｏｌ．７２：９４７
０−９４７８，１９９８；Ｔｕｒｎｅｌｌら，Ｊ．Ｖｉｒｏｌ．７３：２０７４
−２０８３，１９９９）。ＯＮＹＸ−０１５は複製せず、並びに野生型アデノウ
イルスは複製しない。何故ならば、Ｅ１Ｂ−５５Ｋは核からのウイルスｍＲＮＡ
輸送を促進するのに利用できないからである。また、ＯＮＹＸ−０１５は野生型
ウイルスよりもＡＤＰを発現するのは低い（後記実施例１参照）。
【００１３】 ＯＮＹＸ−０１５の概念の拡張として、単純疱疹ウイルスチミジンキナーゼ遺
伝子で置き換えたＥ１Ｂ−５５Ｋについての遺伝子を有する複製−コンピテント
アデノウイルスベクターが設計された（Ｗｉｌｄｅｒら，Ｇｅｎｅ Ｔｈｅｒａ
ｐｙ ６：５７−６２，１９９９）。このベクターを構築したグループは、ベク
ター＋ガンシクロビールの組合せがヌードマウスモデルにおいてヒト結腸癌に対
して治療効果を示した効果を報告している（Ｗｉｌｄｅｒら，Ｃａｎｃｅｒ Ｒ
ｅｓ．５９：４１０−４１３，１９９９）。しかしながら、このベクターはＡＤ
Ｐに対する遺伝子を欠き、それに応じて、該ベクターは細胞を溶解させ、ＡＤＰ
を発現する同等なベクターよりも効率低く細胞間に広がる。また、記載されてい
るヒト前立腺特異的抗原の最小エンハンサー／プロモーターがアデノウイルスＥ
１Ａエンハンサー／プロモーターに挿入された、もう１つの複製−コンピテント
アデノウイルスベクターで、ＡＤＰに対する遺伝子が欠けている（Ｒｏｄｒｉｇ
ｕｅｚら，Ｃａｎｃｅｒ Ｒｅｓ．５７：２５５９−２５６３，１９９７）。
【００１４】 複製−コンピテントベクターの改良についてのもう１つの戦略は、組織特異的
プロモーターの制御下に複製を置くことである。１つのグループは、基礎Ｅ１Ａ
プロモーターをα−フェト蛋白質（ＡＦＰ）に対する修飾プロモーターで置き換
えた（Ｈａｌｌｅｎｂｅｃｋら，Ｈｕｍ．Ｇｅｎｅ Ｔｈｅｒ．１０：１７２１
−１７３３，１９９９）。ＡＦＰは発生の間に肝臓で発現されるが、それは成人
では発現されない。しかしながら、それは肝臓細胞癌腫を持つ患者の７０−８０
％で発現される。このベクターの増殖はＡＦＰ−発現細胞に制限され、ベクター
は異物トランスプラントのいくらかの抑制を示した（同上）。前立腺腫瘍特異的
前立腺特異的抗原（ＰＳＡ）およびカリクレインプロモーター／エンハンサーに
依存したＥ１ＡおよびＥ１Ｂ遺伝子の発現を有する一連のＲＣベクターも開発さ
れている（Ｒｏｄｒｉｇｕｅｚら，Ｃａｎｃｅｒ Ｒｅｓ．６０：１１９６，１
９９７；Ｙｕら，Ｃａｎｃｅｒ Ｒｅｓ．５９：４２００−４２０３，２０００
；Ｙｕら，Ｃａｎｃｅｒ Ｒｅｓ ５９：１４９８−１５０４，１９９９）。
【００１５】 かくして、腫瘍において効果的に複製し、広がるが、それが正常な組織におい
ては貧弱にしかまたは全く複製しないように修飾することができるベクターが継
続的に必要とされている。
【００１６】 （発明の概要） 略言すれば、従って、本発明は、新形成細胞において複製コンピテントであっ
て、アデノウイルス死滅蛋白質（ＡＤＰ）を過剰発現する新規なベクターに指向
される。本明細書中で報告する実績は、組換えアデノウイルスによるＡＤＰの過
剰発現が、組換えアデノウイルスが、非新形成細胞においてその複製速度をさも
なければ低下させる突然変異を含有する場合においてさえ、野生型レベルのＡＢ
Ｐを発現するアデノウイルスによって呈されるものと同様またはそれよりも速い
速度で、新形成細胞を殺し、細胞間に広がる複製−コンピテントアデノウイルス
の構築を可能とするという発見を示すものである。ＡＤＰを過剰発現するＡｄベ
クターは活力があるままであり、Ａｄベクターが他の腫瘍細胞に広がることがで
きる新しいウイルス粒子を生産する前に多量のＡＤＰによって感染細胞が死滅さ
れないことは、アデノウイルス生物学について知られていたものからは予測する
ことができなかったので、この発見は予測されなかった。事実、天然に生じるア
デノウイルスは、感染の初期段階においてＥ３プロモーターから少量でＡＤＰを
発現し、一旦ビリオンが細胞核で組み立てられると、感染後２４ないし３０時間
においてのみ大量にＡＤＰを作成し始める。他の非アデノウイルスベクターを含
めた他のウイルスベクターおよびプラスミド発現ベクターを含めた他の非アデノ
ウイルスベクターを用いて、ＡＤＰ細胞−殺傷活性を新形成細胞に送達すること
ができると考えられる。
【００１７】 かくして、１つの好ましい具体例において、ＡＤＰ−発現ベクターは、ｇｐ１
９Ｋ；ＲＩＤα（１０．４Ｋとしても知られている）；ＲＩＤβ（１４．５Ｋと
しても知られている）および１４．７Ｋよりなる群から選択される少なくとも１
つのＥ３蛋白質の発現を欠く組換えアデノウイルスを含む。これらのＥ３蛋白質
はＡｄ−感染細胞の免疫−媒介炎症および／またはアポトーシスを阻害するので
、これらのＥ３蛋白質の１以上を欠く組換えアデノウイルスは、アデノウイルス
で処理された腫瘍へ炎症および免疫細胞が侵潤するよう刺激し、この宿主免疫応
答は腫瘍の破壊並びに転移した腫瘍の破壊を助けると考えられる。好ましい具体
例によって発現されたＡＤＰは、サブグループＣのヒトアデノウイルス、すなわ
ち、Ａｄ１、Ａｄ２、Ａｄ５およびＡｄ６からの天然に生じるアミノ酸配列を含
む。
【００１８】 もう１つの具体例において、ベクターの複製は新形成細胞に制限される。その
ような複製−制限ベクターは、ベクター、特に、その細胞周期の一部として宿主
細胞を殺すウイルスベクターによって引き起こされ得る正常細胞および組織に対
する損傷を排除または低下させるのが望ましい癌患者を治療するのに有用である
。好ましい具体例において、組換えアデノウイルスは複製−制限表現型を有する
。なぜならば、組換えアデノウイルスは、ｐＲＢおよびｐ３００／ＣＢＰ蛋白質
に結合するＥ１Ａウイルス蛋白質を発現できないからであり、かつＥ４プロモー
ターは、新形成細胞および／または特異的組織の細胞においてのみ活性化される
プロモーターで置き換えられているからである。
【００１９】 さらにもう１つの具体例において、本発明はＡＤＰを過剰発現し、その複製が
組織特異的プロモーター、腫瘍特異的プロモーターまたは誘導性プロモーターの
制御下にあるベクターを提供する。好ましい具体例において、ベクターは、組織
特異的プロモーターまたは誘導性プロモーターがＥ４プロモーターに代えて置き
換えられた組換えアデノウイルスを含む。そのようなベクターは、該ベクターお
よびそのＡＤＰ−媒介細胞殺傷の複製を、特定タイプの細胞に、またはプロモー
ターを活性化する外来性剤に暴露された細胞に制限するのに有用である。また、
好ましい組織特異的または誘導性ベクターは、その複製を新形成細胞に制限する
表現型を発現する。
【００２０】 さらにもう１つの具体例において、本発明は、ＡＤＰを過剰発現するが、特異
的遺伝子修飾によって腫瘍に制限されないベクターを提供する。そのようなベク
ターは、サブグループＣの天然に生じるＡｄさえよりも新形成細胞に対して破壊
的である。好ましい具体例において、このベクターは、もう１つの方法によって
治療できないが、Ａｄに対する予め存在する中和抗体を有するか、あるいは中和
抗体を投与することができる末期癌を持つ患者で用いることができる。
【００２１】 さらにもう１つの具体例において、本発明は、新形成細胞において複製コンピ
テントであって、アデノウイルス死滅蛋白質を過剰発現する第１の組換えウイル
スを含む組成物を提供する。１つの具体例において、組換えウイルスは、ウイル
スのあるタイプの細胞への送達を制限する標的化部位を含む送達ビヒクル内に含
有される。この具体例では、複製−コンピテントベクターは本明細書中に記載さ
れるいずれのＡＤＰ−過剰発現形態のものであってもよい。いくつかの具体例に
おいて、該組成物は、複製−欠陥であって、抗癌遺伝子産物を発現する第２の組
換えウイルスを含む。いくつかの具体例において、複製−欠陥ベクターは、この
ベクターの複製が複製−コンピテントベクターによって補われる場合にＡＤＰを
過剰発現するように作成することができる。該組換えウイルスは、複製−欠陥ウ
イルス、並びにそのコードされた抗癌産物の腫瘍を通じての拡大を補充する。好
ましい具体例において、該第１の組換えウイルスは、その複製が新形成細胞に制
限されるおよび／またはＥ３ ｇｐ１９Ｋ；ＲＩＤα；ＲＩＤβ；および１４．
７Ｋ蛋白質の１以上の発現を欠く組換えアデノウイルスである。
【００２２】 さらなる具体例において、本発明は、ＡＤＰを過剰発現し、また、抗癌産物を
発現する複製−コンピテントベクターを提供する。これまでの具体例に関しては
、該ベクターは、ここに提供されるいずれのＡＤＰ−過剰発現形態のものであっ
てもよい。好ましくは、ウイルスの複製は、（ａ）例えば、組織特異的または腫
瘍特異的プロモーターでＥ４プロモーターを置き換えることによって、新形成細
胞に制限されるおよび／または（ｂ）Ｅ３ ｇｐ１９ｔ；ＲＩＤα；ＲＩＤβ；
および１４．７Ｋ蛋白質の１以上の発現を欠くように作成される。いくつかの具
体例において、抗癌産物がＥ３領域に挿入される。
【００２３】 本発明のＡＤＰ−発現ベクターおよび組成物は、新形成細胞の死滅を促進する
方法で有用である。該方法は、新形成細胞を、新形成細胞において複製−コンピ
テントであって、ＡＤＰを過剰発現するベクターと接触させることを含む。新形
成細胞が患者における腫瘍を含む場合、該ベクターは腫瘍に直接投与されるか、
あるいは、他の具体例において、ベクターは全身にあるいはベクターの腫瘍への
送達を指令する標的化部位を含有する送達ビヒクル中にて患者に投与される。該
ベクターは組換えウイルスである具体例において、該方法はウイルスに対して患
者を受動的に免疫化することを含むことができる。
【００２４】 本発明のさらにもう１つの具体例において、ベクターは放射線照射療法と組み
合わせて用いることができる。放射線照射療法は、例えば、ｘ線治療のごとき外
部ビーム照射、ガンマ線放出放射性核種での治療のごとき腫瘍部位近くのまたは
該部位における身体内への放射線活性物質の挿入によって送達される放射線照射
、中性子または荷電粒子等を利用する粒子ビーム療法のような当該分野で用いら
れるいずれの形態の放射線照射療法であってもよい。加えて、この具体例は、放
射線照射療法と組み合わせたカクテル中の本発明の１を超えるベクターの使用を
含む。
【００２５】 本発明のもう１つの具体例は、他のアデノウイルスベクターで開示されている
ごとく（米国特許第５，８４６，９４５号）、化学療法と組み合わせた組換えベ
クターの使用を含む。化学治療剤は当該分野で知られており、ピリミジン−アナ
ログおよびプリン−アナログ抗代謝剤を含めた抗代謝剤、植物アルカロイド、抗
腫瘍抗生物質、アルキル化剤等を含む。化学治療剤（類）と一緒に本発明の１を
超えるベクターを使用することも本具体例内であると考えられる。
【００２６】 本発明によって達成されることが判明したいくつかの利点の中には、従って、
迅速に癌細胞を殺し、腫瘍において細胞間に広がる複製−コンピテントベクター
、特にウイルスの提供；その複製が誘導されることができるか、または腫瘍およ
び／またはある組織型の細胞に制限されるかかるベクターの提供；および正常な
組織においてほとんどまたは全く副作用を引き起こさない抗癌療法のための組成
物および方法の提供を挙げることができる。
【００２７】 （好ましい具体例の記載） 本発明によると、組換えアデノウイルスによるＡＤＰの過剰発現の結果、野生
型レベルのＡＤＰを発現するウイルスよりも細胞単層全体を通じて細胞のより速
い溶解およびウイルスの拡大がもたらされることが判明した。また、ＡＤＰにつ
いてのこの機能は、アデノウイルス複製を新形成細胞に制限するＥ１Ａ突然変異
を含有するアデノウイルスで発現されることも判明した。かくして、新形成細胞
において複製コンピテントであって、ＡＤＰを過剰発現するベクターは抗癌療法
で有用なはずである。
【００２８】 本開示の関係では、以下の用語は特記しない限り、以下のように定義される。
【００２９】 ポリヌクレオチド、ポリペプチドまたはウイルスのごとき対象に適用される「
天然に生じる」は、該対象が天然における源から単離でき、ヒトによって意図し
て修飾されていないことを意味する。
【００３０】 「新形成細胞」は、細胞増殖の制御の有意な喪失によって特徴付けられる異常
増殖表現型を呈する細胞を意味し、能動的に複製する細胞ならびに一時的に非複
製休止状態にある（Ｇ１またはＧ２）細胞を含む。新形成細胞はよく分化した表
現型または貧弱に分化した表現型を有することができ、良性新形成または悪性新
形成を含むことができる。
【００３１】 「組換えウイルス」は、野生型ウイルスゲノムにおける１以上のヌクレオチド
の欠失、挿入または置換により野生型ウイルスとは異なるいずれかのウイルスゲ
ノムまたはビリオンを意味する。組換えウイルスは、コードされ発現されるアミ
ノ酸配列の数、またはウイルスによって発現される蛋白質の量または活性の変化
を有することができる。特に、該用語はヒトの介入によって創製された組換えウ
イルスを含む。
【００３２】 ベクターに適用される「複製−コンピテント」は、ベクターが正常および／ま
たは新形成細胞において複製できることを意味する。組換えウイルスに適用され
るごとく、「複製−コンピテント」は、該ウイルスが正常および／または新形成
細胞において以下の表現型特徴：細胞感染；ウイルスゲノムの複製；および新し
いウイルス粒子の生産および放出を呈することを意味するが、これらの特徴の１
以上はそれらが野生型ウイルスによって感染した同一細胞型で起こるので同一速
度で起こる必要はなく、より速いまたはより遅い速度で起こり得る。組換えウイ
ルスは、その細胞周期の一部として細胞を溶解するアデノウイルスのごときウイ
ルスに由来する場合、細胞培養単層における細胞の少なくとも５ないし２５％が
感染の５日後に死滅しているのが好ましい。好ましくは、複製−コンピテントウ
イルスは感染後５日までに単層の細胞の少なくとも２５ないし５０％、より好ま
しくは少なくとも７５％、最も好ましくは少なくとも９０％に感染し、それを溶
解する。
【００３３】 組換えウイルスに適用される「複製−欠陥」は、該ウイルスが、補充複製−コ
ンピテントウイルスの不存在下でいずれかの細胞型においてそのゲノムを複製す
ることができない、または大いに損なわれることを意味する。この例外は、アデ
ノウイルスＥ１ＡおよびＥ１Ｂ蛋白質を発現するように作成されている２９３細
胞のごとき細胞系である。
【００３４】 本発明のベクターに適用される「複製−制限」は、該ベクターが、正常な非分
裂細胞ともここではいう、新形成ではないおよび／または分裂しない同一タイプ
の細胞におけるよりも、分裂細胞、すなわち、新形成細胞もしくは非新形成分裂
細胞において良好に複製することを意味する。好ましくは、複製−制限ウイルス
は、感染後５日において細胞障害効果（ＣＰＥ）を示す細胞の数によって測定し
て、同一サイズの細胞培養単層における正常な非分裂細胞よりも少なくとも１０
％多く新形成細胞を殺す。より好ましくは、正常細胞よりも２５％および５０％
の間、より好ましくは５０％および７５％の間より多い新形成細胞が複製−制限
ウイルスによって殺される。最も好ましくは、複製−制限アデノウイルスは、感
染後５日までに、等しいサイズの単層において正常細胞よりも７５％および１０
０％の間より多い新形成細胞を殺す。
【００３５】 １つの具体例において、本発明は、新形成細胞において複製−コンピテントで
あって、ＡＤＰを過剰発現するベクターを提供する。本発明で有用なベクターは
、限定されるものではないが、プラスミド−発現ベクター、多数の異なる細胞型
に侵入し、そこで生存することができるＳａｌｍｏｎｅｌｌａ種のごとき細菌ベ
クター、ヒトおよび非ヒトアデノウイルス、アデノウイルス関連ウイルス（ＡＡ
Ｖ）、ポックスウイルス、ヘルペスウイルスのようなＤＮＡウイルスに由来する
ベクター、およびレトロウイルスおよびアルファウイルスのごときＲＮＡウイル
スに由来するベクターを含む。好ましいベクターは、ＡＤＰを過剰発現するよう
に作成された組換えウイルスを含む。組換えアデノウイルスは、ベクター、特に
Ａｄ１、Ａｄ２、Ａｄ５またはＡｄ６に由来するベクターとして用いるのに特に
好ましい。
【００３６】 本発明によるベクターはＡＤＰを過剰発現する。組換えＡｄおよびＡＡＶベク
ターに適用されるごとく、用語「ＡＤＰを過剰発現する」は、同一タイプの分裂
細胞においていずれかの以前に知られている組換えアデノウイルスベクターまた
はＡＡＶによって発現されるよりも当該ベクターによって感染された分裂細胞に
存在するウイルスゲノム当たりより多くのＡＤＰ分子が作成されることを意味す
る。他の非アデノウイルスベクターに適用されるごとく、「ＡＤＰを過剰発現す
る」は、当該ウイルスが、ベクターを含有する細胞を溶解するのに十分なＡＤＰ
を発現することを意味する。
【００３７】 ＡＤＰを過剰発現するベクターはルーチン的な方法を用いて調製することがで
きる。例えば、Ａ Ｌａｂｏｒａｔｏｒｙ Ｃｌｏｎｉｎｇ Ｍａｎｕａｌ，２
ｎｄ Ｅｄ．，ｖｏｌ．３，Ｓａｍｂｒｏｏｋら編、Ｃｏｌｄ Ｓｐｒｉｎｇ
Ｈａｒｂｏｒ Ｌａｂｏｒａｔｏｒｙ Ｐｒｅｓｓ，１９８９参照。例えば、Ａ
ＤＰをコードするポリヌクレオチドは、哺乳動物細胞において異種蛋白質を効果
的に発現することが知られているプラスミド発現ベクターにクローンすることが
できる。該ポリヌクレオチドは適当な終止およびポリアデニル化シグナルも含む
べきである。エンハンサーエレメントをプラスミドに添加して、ＡＤＰ発現の量
を増加させることもできる。ＡＤＰを過剰発現するウイルスベクターは、同様の
材料および技術を用いて調製することができる。
【００３８】 ウイルスが組換えアデノウイルスである場合、ＡＤＰの過剰発現は多くの方法
で達成することができる。一般に、Ｅ３プレ−ｍＲＮＡ分子のより多くがＡＤＰ
に対するｍＲＮＡにプロセッシングされるので、Ｅ３ｍＲＮＡのいずれかに対す
るスプライス部位を除去するＥ３領域におけるいずれのタイプの欠失も、ＡＤＰ
に対するｍＲＮＡの過剰発現に導く。これは、その構築を後記するＫＤ１、ＫＤ
３、ＧＺ１およびＧＺ３ベクター（配列番号：１−４）に例示されている。Ａｄ
ベクターにおいてＡＤＰの過剰発現を達成する他の手段は、限定されるものでは
ないが、プレ−ｍＲＮＡスプライシングおよび切断／ポリアデニル化シグナルの
、ＡＤＰに対する遺伝子を近接にて挟む部位における挿入；Ａｄゲノム中の種々
の部位に挿入されたもう１つのプロモーター、例えば、ヒト・サイトメガロウイ
ルスプロモーターからのＡＤＰの発現；およびＡＤＰの翻訳の内部開始を可能と
するＡＤＰ配列の５’側にある配列、例えば、Ａｄ三部リーダーまたはウイルス
内部リボソーム開始配列と共に、もう１つのＡｄ ｍＲＮＡに対する遺伝子の背
後へのＡＤＰに対する遺伝子の挿入を含む。
【００３９】 本発明によるベクターによって発現されたＡＤＰは、ベクターの複製されたコ
ピーが感染細胞から放出されるように、ベクターを含有する細胞を溶解させる能
力をＡＤＰを発現するベクターに付与する天然に生じる全長ＡＤＰアミノ酸配列
またはその変種を含むいずれかのポリペプチドである。好ましい全長ＡＤＰはＡ
ｄ１、Ａｄ２、Ａｄ５またはＡｄ６によってコードされるＡＤＰアミノ酸配列を
含む。これらの天然に生じるＡＤＰ配列は、各々、配列番号：５−８に記載され
ている。ＡＤＰ変種は、天然に生じるアデノウイルス死滅蛋白質の断片および欠
失突然変異体、ならびに保存的アミノ酸置換を含有する全長分子、断片および欠
失突然変異体を含む。但し、そのような変種は、細胞内部でベクターによって発
現されると、該細胞を溶解する能力を保有するものとする。
【００４０】 保存的アミノ酸置換とは、同様の側鎖を有する残基の相互交換性をいう。保存
的に置換されたアミノ酸は、それらの側鎖の化学的特性に従ってグループ分けす
ることができる。例えば、アミノ酸の１つのグループ分けは、中性および疎水性
側鎖を有するアミノ酸（Ａ、Ｖ、Ｌ、Ｉ、Ｐ、Ｗ、Ｆ、およびＭ）を含み；もう
１つのグループ分けは中性および極性側鎖を有するアミノ酸（Ｇ、Ｓ、Ｔ、Ｙ、
Ｃ、ＮおよびＱ）であり；もう１つのグループ分けは塩基性側鎖を有するアミノ
酸（Ｋ、Ｒ、およびＨ）であり；もう１つのグループ分けは酸性側鎖を有するア
ミノ酸（ＤおよびＥ）であり；もう１つのグループ分けは脂肪族側鎖を有するア
ミノ酸（Ｇ、Ａ、Ｖ、ＬおよびＩ）であり；もう１つのグループ分けは脂肪族−
ヒドロキシル側鎖を有するアミノ酸（ＳおよびＴ）であり；もう１つのグループ
分けはアミン−含有側鎖を有するアミノ酸（Ｎ、Ｑ、Ｋ、Ｒ、およびＨ）であり
；もう１つのグループ分けは芳香族側鎖を有するアミノ酸（Ｆ、Ｙ、およびＷ）
であり；およびもう１つのグループ分けは硫黄−含有側鎖を有するアミノ酸（Ｃ
およびＭ）である。好ましい保存的アミノ酸置換グループはＲ−Ｋ；Ｅ−Ｄ，Ｙ
−Ｆ，Ｌ−Ｍ；Ｖ−１，およびＱ−Ｈである。
【００４１】 本明細書で用いるごとく、ＡＤＰ変種は、１以上のアミノ酸が挿入され、欠失
され、または異なるアミノ酸または修飾されたもしくは異常なアミノ酸で置換さ
れた天然に生じるＡＤＰの修飾、ならびに修飾された配列を含有するＡＤＰ変種
が細胞溶解活性を保有する限り、１以上のアミノ酸のグリコシル化またはリン酸
化のごとき修飾も含むことができる。
【００４２】 後記するごとく、本発明者らは、ここに、細胞死滅を促進するのに必要なＡＤ
Ｐ中の特定のドメインを規定するＡＤＰの構造−機能分析を行った。この情報を
用い、既知の組換えＤＮＡおよびクローニング方法と組み合わせると、当業者で
あれば、天然に生じるアデノウイルス死滅蛋白質のＡＤＰ変種を容易に構築し、
それらを細胞溶解活性につきテストすることができると考えられる。好ましいＡ
ＤＰ欠失突然変異体は、そのＡＤＰ配列が、各々、配列番号：９−１２に記載さ
れた、欠失突然変異体ｄｌ７１６、ｄｌ７１５、ｄｌ７１４およびｄｌ７３７の
いずれかからのＡＤＰアミノ酸配列を含む。
【００４３】 ベクターがウイルスに由来する場合、ウイルスは、感染細胞の免疫−媒介炎症
および／またはアポトーシスのごとき宿主抗ウイルス防御の回避に関与する１以
上のウイルス蛋白質の発現を欠くのが好ましい。例えば、アデノウイルスは、免
疫系によるＡｄ−感染細胞の殺傷を防止する遺伝子のカセットを含有する（Ｗｏ
ｌｄら，Ｓｅｍｉｎ．Ｖｉｒｏｌ．，１９９８（８：５１５−５２３，１９９８
）。ＲＩＤαおよびＲＩＤβよりなる複合体である、Ｅ３−１４．７Ｋ蛋白質お
よびＥ３ ＲＩＤ（受容体内部化および分解）蛋白質は、活性化されたマクロフ
ァージ、ナチュラルキラー（ＮＫ）細胞、および細胞毒性リンパ球（ＣＴＬ）で
発現される、またはそれらによって分泌される腫瘍壊死因子（ＴＮＦ）およびＦ
ａｓリガンドによって誘導されたＡｄ−感染細胞のアポトーシスを阻害する（Ｔ
ｏｌｌｅｆｓｏｎら，Ｎａｔｕｒｅ ３９２：７２７−７３０，１９９８）。Ｅ
３−ｇｐ１９Ｋ蛋白質は、細胞表面へのＭＨＣクラスＩ抗原の輸送をブロックす
ることによって感染細胞のＣＴＬ−殺傷を阻害する（Ｗｏｌｄら，前掲）。かく
して、かかるウイルスベクターによる腫瘍細胞の感染は炎症細胞およびリンパ球
の腫瘍への侵潤を刺激し、免疫系の細胞溶解細胞によって誘導されるアポトーシ
スから、またはサイトカインを誘導するアポトーシスに対して感染腫瘍細胞を妨
げないであろうと考えられる。例えば、マウスをＥ３ ｇｐ１９Ｋ、ＲＩＤおよ
び１４．７Ｋ蛋白質を欠くＡｄ突然変異体で感染させると、炎症細胞およびリン
パ球の感染組織への侵潤の劇的な増加（Ｅ３−陽性Ａｄと比較して）があること
が知られている（Ｓｐａｒｅｒら，Ｊ．Ｖｉｒｏｌ．７０：２４３１−２４３９
，１９９６）。本発明のＡＤＰ−発現ウイルスベクターによって感染された腫瘍
の同様の侵潤は、免疫系の攻撃をＡＤＰ−媒介殺傷活性に添加することによって
、さらに腫瘍の破壊を促進すると期待されるであろう。例えば、ウイルス感染は
、腫瘍細胞におけるのみならず転移したものにおいて新形成細胞を殺すことがで
きる腫瘍−特異的ＣＴＬの形成を刺激するであろうと考えられる。加えて、また
、もしベクターが腫瘍から正常細胞へと広がるならば、ベクター−感染細胞を攻
撃できるベクター−特異的ＣＴＬが創製されるであろうと予測される。ＡＤＰを
過剰発現するウイルスベクターは腫瘍を通じて迅速に広がるので、これらの免疫
メカニズムはベクターの広がりに対してほとんど効果を有しないであろうと考え
られる。
【００４４】 ベクターが組換えアデノウイルスである場合、アデノウイルスはＥ３ ｇｐ１
９Ｋ、ＲＩＤおよび１４．７Ｋ蛋白質の各々の発現を欠くのが好ましい。蛋白質
の「発現を欠く」および「発現を欠いている」とは、当該ウイルスゲノムが、機
能的蛋白質、すなわち、野生型蛋白質の全ての機能を有するものの発現を不活化
する１以上の突然変異を含有することを意味する。不活化突然変異体は、限定さ
れるものではないが、機能的転写体の発現を防止する、あるいは非機能的翻訳産
物をコードする転写体をもたらす、コーディング遺伝子中の１以上のヌクレオチ
ドの置換または欠失を含む。Ａｄ Ｅ３ ｇｐ１９Ｋ、ＲＩＤおよび１４．７Ｋ
蛋白質の発現を不活化するための特に好ましい方法は、これらの蛋白質をコード
する遺伝子を含有するＥ３領域を欠失することによるものである。好ましくは、
Ｅ３ ６．７Ｋおよび１２．５Ｋ蛋白質をコードするＥ３遺伝子の一方または双
方もまた欠失させる。なぜならば、後記する実施例で議論するごとく、ＡＤＰ遺
伝子以外のＥ３遺伝子のほとんどまたは全てが、主要後期プレ−ｍＲＮＡのスプ
ライシングについての競合を低下させることによってＡＤＰ ｍＲＮＡの過剰発
現を容易にすると考えられるからである。ＡＤＰを過剰発現するＥ３欠失を含有
する好ましいＡｄベクターは、その構築および特性が後記実施例に記載されてい
るＧＺ１（配列番号：３）およびＧＺ３（配列番号：４）である。
【００４５】 また、本発明は、その複製が分裂細胞に制限されるＡＤＰ−発現ベクターを提
供する。そのような複製−制限表現型を供することが知られているいずれの手段
も用いることができる。例えば、ＷＯ９６／４０２３８は腫瘍細胞に選択的に侵
入する微生物ならびに腫瘍において選択的に活性化される細菌プロモーターを同
定し単離するための方法を記載する。また、複製に必須の１以上のベクター蛋白
質の発現は、その発現が新形成細胞で上昇調節されることが知られている細胞遺
伝子のためのプロモーターの制御下に置くことができると考えられる。そのよう
な遺伝子の例は、限定されるものではないが、乳癌マーカーママグロビン（Ｗａ
ｔｓｏｎら，Ｏｎｃｏｇｅｎｅ １６：８１７−８２４，１９９８）；ＢＲＣＡ
１（Ｎｏｒｒｉｓら，Ｊ．Ｂｉｏｌ．Ｃｈｅｍ．２７０：２２７７７−２２７８
２，１９９５）ｈｅｒ２／ｎｅｕ（Ｓｃｏｔｔら，Ｊ．Ｂｉｏｌ．Ｃｈｅｍ．２
６９：１９８４８−１９８５８，１９９４）；前立腺特異的抗原（米国特許第５
，６９８，４４３号）；肺胞についての界面活性剤蛋白質Ｂ（Ｙａｎら，Ｊ．Ｂ
ｉｏｌ．Ｃｈｅｍ．２７０：２４８５２−２４８５７，１９９５）；肺について
の第ＶＩＩ因子（Ｇｒｅｅｎｂｅｒｇら，Ｐｒｏｃ．Ｎａｔｌ．Ａｃａｄ．Ｓｃ
ｉ．ＵＳＡ ９２：１２３４７−１２３５１，１９９５）；および一般に癌につ
いてのスルビビン（Ｌｉら，Ｎａｔｕｒｅ ３９６：５８０−５８４）を含む。
ベクターがアデノウイルスである場合、そのような腫瘍−特異的プロモーターを
Ｅ４プロモーターに代えて置き換えることができると考えられるＥ４遺伝子産物
はＡｄ複製に必須であるので、それらの発現を腫瘍−特異的プロモーターの制御
下に置くことは、プロモーターが活性化される腫瘍細胞へのベクターの複製を制
限するはずである。
【００４６】 ＡＤＰ−発現Ａｄベクターの複製を新形成細胞に制限するためのもう１つの戦
略は、その構築および特性が後記実施例に記載された、ＫＤ１（配列番号：１）
、ＫＤ２（配列番号：１３）およびＫＤ３（配列番号：２）ベクターによって例
示される。この戦略は、癌細胞においてのみよく増殖することができる、ここで
はｄｌ０１／０７とも言うｄｌ１１０１／１１０７と命名された（Ｈｏｗｅら，
Ｐｒｏｃ．Ｎａｔｌ．Ａｃａｄ．Ｓｃｉ．，８７：５８８３−５８８７，１９９
０）、Ｅ１Ａ遺伝子中の予め存在するＡｄ５突然変異体を開発する。Ｅ１Ａの役
割は、細胞周期のＧ０およびＧ１相からＳ−相へ細胞を駆動することにある。こ
れは、２つのメカニズムによって達成され、１つはｐＲＢ（およびファミリーメ
ンバー）に関与し、他方はｐ３００および関連蛋白質ＣＢＰに関与する（ＤｅＰ
ｉｎｈｏ，Ｒ．Ａ．，Ｎａｔｕｒｅ，３９１：５３３−５３６，１９９８）。Ｅ
１Ａにおける１つのドメインはｐＲＢファミリーのメンバーに結合する。ｐＲＢ
は、通常は、Ｓ−相において発現される細胞のプロモーター中のＥ２ＦないしＥ
２Ｆ結合部位を介して連結した、転写因子Ｅ２Ｆ−１およびＥ２Ｆファミリーメ
ンバー（Ｅ２Ｆ）との複合体として細胞に存在する。ここに、ｐＲＢは転写共リ
プレッサーとして働く。ｐＲＢへのＥ１Ａの結合はこの抑制を軽減し、ｐＲＢ／
Ｅ２Ｆ複合体からのＥ２Ｆの放出を引き起こす。次いで、遊離Ｅ２Ｆは、Ｓ−相
で発現される遺伝子、例えば、チミジンキナーゼ、リボヌクレオチドレダクター
ゼ等のプロモーターを活性化する。Ｅ１Ａにおけるもう１つのドメインはｐ３０
０／ＣＢＰ転写アダプター蛋白質複合体に結合する。ｐ３００／ＣＢＰは、多く
の異なる転写因子に結合する転写共アクチベーターであり、従って、プロモータ
ーに標的化される。ｐ３００ＣＢＰは固有のヒストンアセチルトランスフェラー
ゼ活性を有する。ｐ３００／ＣＢＰへのＥ１Ａの結合はこのヒストンアセチルト
ランスフェラーゼ活性を阻害すると考えられ、ヒストンのアセチル化および転写
の抑制を行う（Ｃｈａｋｒａｖａｒｔｉら，Ｃｅｌｌ ９６：３９３−４０３，
１９９９；Ｈａｍａｍｏｒｉら，Ｃｅｌｌ ９６：４０５−４１３，１９９９）
。概念的には、ｐ３００／ＣＢＰと相互作用するＥ１Ａの結果として抑制される
遺伝子のいくつかは細胞周期をブロックする役割を演じるが、これは知られてい
ない。癌細胞は周期を進行させ、従って、それは遊離Ｅ２Ｆを有し、恐らくは、
いくつかのｐ３００／ＣＢＰ−調節遺伝子は抑制される。この考え方と合致し、
Ｅ１Ａはｐ３００／ＣＢＰおよびｐＲＢファミリー双方と結合して、初代細胞を
構成的に周期を進行させる状態に変換するに違いない（Ｈｏｗｅら，前掲）。突
然変異体ｄｌ０１／０７は、ｐ３００／ＣＢＰ−およびｐＲＢ−結合ドメイン双
方を欠如し、予測されるごとく、非分裂「正常」細胞または血清飢餓癌細胞にお
いて非常に貧弱にしか複製しないが、増殖する癌細胞においてはよく複製する。
後記するごとく、ｄｌ０１／０７ Ｅ１Ａ突然変異を含有するＫＤ１およびＫＤ
３ベクターの増殖は、非分裂細胞と比較して分裂癌細胞においてかなり良好であ
る。ｄｌ０１／０７突然変異体がラット細胞のオンコジーン形質転換で完全に欠
けている（Ｈｏｗｅら，前掲）ので、このＥ１Ａ突然変異を含有する本発明によ
るベクターは、Ｅ１Ａ−依存性メカニズムを介する（ことができるので，離れて
）ヒトにおいて癌を誘導することができない。
【００４７】 また本発明は、複製に必須の１以上の蛋白質の発現を、組織特異的プロモータ
ーおよび／または腫瘍特異的プロモーターの制御下に置くことによって、その複
製が特異的組織に制限されるＡＤＰを過剰発現するベクターを含む。多数の組織
特異的および／または腫瘍特異的プロモーターが当該分野で記載されている。非
限定的例は、内皮系の細胞において特異的に遺伝子発現を指令する、Ｂｒｅｉｔ
ｍａｎらに対する米国特許第５，４６６，５９６号に記載されたＴＴＦＩ転写因
子を含有する細胞（すなわち、ＩＩ型歯槽細胞（Ｙａｎら，前掲））においての
み活性である界面活性剤蛋白質Ｂプロモーター；前立腺細胞で発現される前立腺
特異的抗原（Ｒｏｄｒｉｇｕｅｚら，前掲）；ヒト・テロメラーゼ蛋白質（ｈＴ
ＥＲＴ）プロモーター（例えば、米国特許第６，０５４，５７５号参照）；乳癌
細胞で発現されるヒトα−ラクトアルブミン遺伝子（Ａｎｄｅｒｓｏｎら，Ｇｅ
ｎｅ Ｔｈｅｒａｐｙ ６：８５４−８６４，１９９９）を含む。多くの他の組
織−特異的、腫瘍特異的または組織−好ましいエンハンサー／プロモーターが報
告されている（ＭｉｌｌｅｒおよびＷｈｅｌａｎ，Ｈｕｍａｎ Ｇｅｎｅ Ｔｈ
ｅｒａｐｙ ８：８０３−８１５，１９９７）。実施例６および１０において界
面活性剤蛋白質Ｂプロモーターで例示されているごとく、組織−特異的プロモー
ターを発現するベクターは、ウイルス複製、ウイルス拡大、細胞溶解および腫瘍
抑制において組織特異性を示すと予測される。
【００４８】 本発明によるベクターの複製は、ベクター複製に必須の１以上の遺伝子を、金
属、ホルモン、抗生物質および温度変化のごとき外因性誘導剤によって活性化さ
れるプロモーターの制御下に置くことによって制御することができる。そのよう
な誘導性プロモーターの例は、限定されるものではないが、メタロチオネインプ
ロモーター、糖質コルチコイドプロモーター、テトラサイクリン応答プロモータ
ー、ｈｓｐ６５および７０プロモーターのごとき熱ショック蛋白質（ｈｓｐ）プ
ロモーターを含む。
【００４９】 また、本発明は、新形成細胞の死滅を促進する有効量のＡＤＰを過剰発現する
組換えベクターを含む組成物、および治療上有効量のベクターを患者における新
形成細胞に投与することを含む方法を提供する。本発明の組成物および方法はい
ずれの起源の新形成細胞を殺すのにも有用であり、腫瘍を含む新形成細胞ならび
に転移性新形成細胞を含む。
【００５０】 また、ＡＤＰ−発現ウイルスベクターを、抗癌遺伝子産物を発現する複製−欠
陥ウイルスと共に新形成細胞に投与することができると考えられる。例えば、癌
療法で用いられる多くの複製−欠陥Ｅ１-Ａｄベクターはよく特徴付けられてい
る。複製−欠陥ベクターの制限は、それが最初に感染し、それが他の細胞に拡大
できない細胞において治療蛋白質を合成するに過ぎないことである。また、ゲノ
ムは複製しないので、転写はインプットゲノムからのみ起こることができ、これ
は細胞当たり１コピーと低くすることができる。対照的に、複製−コンピテント
Ａｄベクターのゲノムは、最初に感染した細胞において約１０４だけ増幅され、
転写のためのより多くの鋳型を提供する。より多くの増幅は、ベクターが他の細
胞に拡大するにつれて達成される。抗癌遺伝子産物を発現する複製−欠陥ウイル
スベクターをここに記載する複製−コンピテントウイルスベクターと組み合わせ
ることによって、鋳型が増幅され、双方のベクターが周囲の細胞に迅速に拡大さ
れる結果となると考えられる。例えば、Ａｄ−ベースのベクターでは、各ベクタ
ーについてのバーストサイズは大きい（〜１０４ＰＦＵ／細胞）はずであり、従
って、双方のベクターによる周囲細胞の共感染の確率は高いであろう。かくして
、複製−コンピテントおよび複製−欠陥ベクター双方は腫瘍を通じて同時に広が
り、より効果的な抗癌療法さえ提供する。
【００５１】 ＡＤＰ過剰発現Ａｄベクターと共に抗癌遺伝子産物を送達する別の方法として
、抗癌遺伝子をここに記載したＡＤＰ過剰発現複製−コンピテントベクターのい
ずれかに入れて作成して、単一ベクター中にＡＤＰおよび抗癌機能双方を提供す
ることができる。当業者が容易に測定することができるごとく、抗癌遺伝子をベ
クターのいずれかの適当な位置に作成することができる。例えば、抗癌遺伝子を
Ｅ３領域に作成することができる。
【００５２】 複製−欠陥ベクターによってコードされた抗癌遺伝子産物の発現は構成的、誘
導性または細胞型特異的プロモーターいずれかの制御下にあるようにできる。抗
癌遺伝子産物は、新形成細胞の死滅を促進するいずれかの物質であり得る。本明
細書中で用いる用語「遺伝子産物」とは、遺伝子の制御下で起こる生化学反応の
結果として生じるいずれの生物学的産物または産物類をもいう。遺伝子産物は、
例えば、遺伝子の初期産物、すなわち、代謝産物である酵素または他の分子の制
御下で生じたＲＮＡ分子、ペプチド、蛋白質または産物であり得る。例えば、遺
伝子は、まず、リボソームの作用によって、癌患者に投与された非毒性プロドラ
ッグを細胞殺傷剤に変換するプロドラッグ変換酵素に翻訳されるＲＮＡ分子の合
成を制御することができる；該酵素によって生じたＲＮＡ分子、酵素、および細
胞殺傷剤は該用語がここに用いられるごとく全ての遺伝子産物である。抗癌遺伝
子産物の例は、限定されるものではないが、アポトーシス−促進剤およびトキシ
ン；プロドラッグ変換酵素；脈管形成阻害剤；および新形成細胞に対して免疫応
答（液性および／または細胞性）を刺激することができる免疫調節分子および抗
原等の細胞殺傷剤を含む。
【００５３】 アポトーシス−促進剤は、限定されるものではないが、ＢＡＸ、ＢＡＤ、ＢＩ
ＤおよびＢＩＫのごときＢＣＬ−２ファミリーのプロ−アポトーシスメンバー、
ならびに該ＢＣＬ−２ファミリーの抗アポトーシスメンバーの発現をブロックす
るアンチセンス分子を含む。免疫調節分子の例は腫瘍壊死因子、Ｆａｓ／Ａｐｏ
１／ＣＤ９５リガンド、腫瘍壊死因子関連アポトーシス誘導リガンド、インター
ロイキン、マクロファージ活性化因子およびインターフェロンγのごときサイト
カインである。脈管形成阻害剤は、限定されるものではないが、エンドスタチン
およびアンジオスタチンを含む。トキシンは、限定されるものではないが、腫瘍
壊死因子、リンフォトキシン、動物細胞においてリシン受容体の欠如のためヒト
に対して毒性でない植物トキシンリシン、および細菌トキシンの毒性サブユニッ
トを含む。プロドラッグ変換酵素およびプロドラッグの組合せの例はＷＯ９６／
４０２３８に記載されており、チミジンキナーゼおよびアシクロビールまたはガ
ンシクロビーム；および細菌シトシンデアミナーゼおよび５−フルオロシトシン
を含む。
【００５４】 例えば、本発明の治療もしくは医薬組成物は、例えば、腫瘍への直接的注入に
よる、または静脈内、皮下、筋肉内、経皮、クモ膜下腔内および脳内のごとき他
の注入経路によることを含めた、当該分野で知られたいずれかの適当な経路によ
って投与することができる。投与は、注射によるように迅速に、または遅延放出
処方の遅延注入または投与によるような一定時間にわたるものとすることができ
る。中枢神経系中の組織を治療するには、投与は脳脊髄液（ＣＳＦ）への注射ま
たは注入によることができる。本発明の組換えベクターを中枢神経系の細胞に投
与することを意図する場合、投与は、脳−血液関門を横切ってのベクターの浸透
を促進することができる１以上の剤を用いて行うことができる。好ましくは、本
発明のベクターは、標的化部位を含有するリポソームまたはポリマーのごとき担
体と共に投与して、ベクターの送達を標的化細胞に限定する。標的化部位の例は
、限定されるものではないが、特異的細胞表面分子に対する抗体、リガンドまた
は受容体を含む。
【００５５】 本発明による組成物は医薬製剤の形態で使用することができる。そのような製
剤は製薬分野でよく知られている方法で作成される。１つの好ましい製剤は生理
食塩水のビヒクルを利用するが、生理学的濃度の他の毒性塩、５％水性グルコー
ス溶液、滅菌水等のごとき他の医薬上許容される担体を用いることもできると考
えられる。また、適当な緩衝液を組成物に存在させることも望ましい。そのよう
な溶液は、所望ならば、容易な注射のための滅菌水の添加によって復元が容易な
滅菌アンプル中に凍結乾燥し、貯蔵することができる。主な溶媒は水性であるか
、あるいは非水性とすることができる。
【００５６】 また、担体は、ｐＨ、浸透圧、粘度、透明性、色、滅菌性、安定性、溶解速度
、または処方の臭いを修飾しまたは維持するための他の医薬上許容される賦形剤
を含有することもできる。同様に、担体は、脳−血液関門を横切る放出または吸
収または浸透を修飾するかまたは維持するためにさらに他の医薬上許容される賦
形剤を含有することができる。そのような賦形剤は、単位投与または多用量形態
いずれかでの非経口投与のための、または連続的または中期的注入による脳脊髄
液への直接的注入のための投与を処方するのに通常および慣用的に使用される物
質である。
【００５７】 ＡＤＰ−発現ベクターを含有するある種の手法は経口投与されると考えられる
。そのような処方は、好ましくは、個体投与形態にて適当な担体でカプセル化し
処方される。適当な担体、賦形剤および希釈剤のいくつかの例はラクトース、デ
キストロース、スクロース、ソルビトール、マンニトール、澱粉、ガムアカシア
、リン酸カルシウム、アルギネート、ケイ酸カルシウム、マイクロクリスタリン
セルロース、ポリビニルピロリドン、セルロース、ゼラチン、シロップ、メチル
セルロース、メチル−およびプロピルヒドロキシベンゾエート、タルク、マグネ
シウム、ステアリン酸塩、水、鉱油等を含む。該処方は、加えて、滑沢剤、湿潤
剤、乳化剤および懸濁化剤、防腐剤、甘味剤または香味剤を含む。組成物は、当
該分野で用いた手法を用いることによって、患者への投与後に有効成分の迅速、
保持または遅延放出を供するように処方することができる。また、処方は、蛋白
質分解を減少させ、例えば、界面活性剤のごとき吸収を促進する物質を含有する
こともできる。
【００５８】 特異的用量は、患者の近似的体重または体表面積または占めるべき身体スペー
スの容量に従って計算される。該用量は選択された特定の投与経路に応じても計
算される。治療用の適当な投与量を決定するのに必要な計算のさらなる工夫は当
業者がルーチン的になすものである。そのような計算は、当業者による過度な実
験なくして行うことができる。正確な投与量は標準的な用量−応答実験と組み合
わせて決定される。現実に投与される組成物の量は、治療すべき疾患または疾患
類、投与すべき組成物の選択、個々の患者の年齢、体重および応答、患者の兆候
のひどさ、および選択された投与の経路を含めた関連状況に徴して、実行者によ
って決定されるであろう。用量の投与が、投与処方の薬物動態学パラメーターお
よび用いる投与経路に応じて反復することができる。
【００５９】 また、本発明では、ＡＤＰを過剰発現するウイルスベクターで治療された患者
を受動的に免疫化することも考えられる。受動的免疫化は、ウイルスベクター、
または抗血清から単離されたガンマ−グロブリンまたはベクター−特異的精製ポ
リクローナルもしくはモノクローナル抗体に対して生起した抗血清を患者に投与
することを含むことができる。好ましくは、ウイルスベクターが、腫瘍中で複製
し、それを通って広がるのに十分な時間の後に患者を受動的に免疫化する。
【００６０】 本発明の好ましい具体例は、以下の実施例に記載される。特許請求の範囲内に
ある他の具体例は、本明細書中に開示した本発明の仕様または実施を考慮して当
業者に明らかである。実施例と共に、明細書は例示的なものであると意図され、
本発明の範囲および精神は実施例に続く請求の範囲によって示される。
【００６１】 実施例１ 本実施例はＫＤ１およびＫＤ３抗癌ベクターの構築および特徴付けを説明する
。
【００６２】 ＫＤ１を構築するため、本発明者らは、ユニークなプラスミドの全Ｅ３領域を
欠失させ、後にクローニング用のユニークなＰａｃＩ部位のみが残された。出発
プラスミドはｐＣＲＩＩであり、これは、全てのＥ３遺伝子の欠失を有するＡｄ
５ ＢａｍＨＩＡ断片を含有し、Ｉｎｖｉｔｒｏｇｅｎから購入し；Ｅ３欠失は
、その配列が、各々、配列番号：１および配列番号：４に与えられるＫＤ１およ
びＧＺ３についてのそれと同一である。Ａｄ５からのＡＤＰ遺伝子をＰａｃＩ部
位にクローンし、次いで、ｄｌ０１／０７と命名されたＡｄ５ Ｅ１Ａ突然変異
体のゲノムのＥ３領域に組み立てた。これは、ｄｌ０１／０７から得られた重複
するＥｃｏＲＩＡ制限断片と共にＡＤＰ遺伝子を含有する前記したＢａｍＨＩＡ
断片をヒト胚腎臓２９３細胞に共トランスフェクトすることによって成された。
完全なウイルスゲノムが、プラスミド中のＢａｍＨＩＭ断片でおよびＥｃｏＲＩ
Ａ断片中のＡｄ配列間の重複組換えによって細胞内に形成される。１２．５Ｋ蛋
白質に対するＥ３遺伝子が出発プラスミドに保持された以外は、ＫＤ３は同様に
構築された。かろうじてＡＤＰを過剰発現するＫＤ２と命名されたベクターも調
製した。各組換えＡｄのプラークを拾い、スクリーニングし、精製し、ＣｓＣｌ
−バンデッドストックに増殖させ、配列決定し、力価測定し、特徴付けた。ＧＺ
１およびＧＺ３は、ＧＺ１およびＧＺ３がＡＤ５またはＡｄ５突然変異体ｄｌ３
０９に見出される野生型Ｅ１Ａ配列を有する以外は、ＫＤ１およびＫＤ３と同一
であるＡｄベクターである。Ａｄ５のＥｃｏＲＩＡ断片をＧＺ１およびＧＺ３で
用いた以外は、ＧＺ１およびＧＺ３はＫＤ１およびＫＤ３で記載したごとく構築
した。
【００６３】 これらの組換えベクターの１つの高力価（１ｍｌ当たり１−８×１０１０プラ
ーク形成単位［ＰＦＵ］）ウイルスストックで、または対照ウイルスｄｌ０１／
０７、ｄｌ３０９、ｄｌ３２７およびＡｄ５（野生型）の１つでヒトＡ５４９肺
癌腫細胞系を感染させることによって、ＫＤ１およびＫＤ３を特徴付けた。細胞
当たり５０ＰＦＵを各ウイルスで用いた。これらのウイルスならびにこれらの実
施例で用いたいくつかの他のウイルスの記載は表１に掲げる。
【００６４】
【表１】
【００６５】 ポリメラーゼ鎖反応（ＰＣＲ）−ベースのプロトコルを用い、Ａｄ５突然変異
体ｄｌ３０９のＥ３領域中のＥ３−ｇｐ１９Ｋ蛋白質に対する遺伝子にイン・フ
レーム停止コドンを導入した（Ｊｏｎｅｓ ａｎｄ Ｓｈｅｎｋ，Ｃｅｌｌ １
７：６８３−６８９，１９７９）。ＳｕｎＩ−ＢｓｔＩ １０７Ｉ断片、Ａｄ５
ゲノム中のヌクレオチド２８，３９０ないし２９，０１２を用い、突然変異誘発
を行い、次いで、これをｄｌ３０９中の同等断片に代えて置き換えた。ｄｌ０１
／０７はＫＤ１おおびＫＤ３に対して親である。今度は、ｄｌ３０９と命名され
たＡｄ５突然変異体はｄｌ０１／０７の親であり、すなわち、ｄｌ３０９がＥ１
Ａ突然変異体を有しない以外はｄｌ３０９はｄｌ０１／０７と同一である。ｄｌ
０１／０７およびｄｌ３０９は共にＥ３ ＲＩＤα、ＲＩＤβおよび１４．７Ｋ
蛋白質に対する遺伝子の欠失を有するが、ＡＤＰに対する遺伝子を保有する。Ａ
ｄ５突然変異体ｄｌ３２７は野生型Ｅ１Ａを有し、それはＡＤＰに対する遺伝子
を欠き、それは１２．５Ｋ蛋白質に対するものを除いて全ての他のＥ３遺伝子を
欠く。
【００６６】 感染後２４および３６時間において、蛋白質をＡ５４９細胞から抽出し、ＡＤ
Ｐに対するウサギ抗血清を用いる免疫ブロットにおいてＡＤＰにつき分析した（
Ｔｏｌｌｅｆｓｏｎら，Ｊ．Ｖｉｒｏｌ．６６：３６３３−３６４２，１９９２
）。結果を図２に示す。より多くのＡＤＰが、ｄｌ０１／０７で感染した細胞に
おけるよりもＫＤ１−およびＫＤ３−感染細胞において感染後２４時間および３
６時間に検出された。また、ｄｌ３０９または他のウイルスよりもＧＺ１および
ＧＺ３によって、より多くのＡＤＰが合成された。最も重要には、ＫＤ１、ＫＤ
３、ＧＺ１およびＧＺ３は、ｄｌ０１／０７またはｄｌ３０９よりも感染後２４
時間においてかなり多くのＡＤＰを発現した（図２）。この結果は、ＫＤ１、Ｋ
Ｄ３、ＧＺ１またはＧＺ３で感染した細胞がより速く溶解し、これらのウイルス
がｄｌ０１／０７またはｄｌ３０９よりも速く細胞間に広がるという後に議論す
る観察と合致する。ＫＤ１、ＫＤ３、ＧＺ１およびＧＺ３がＡｄ５突然変異体ｄ
ｌ１５２０よりも感染後２４および３６時間においてかなり多くのＡＤＰを発現
するのは注目に値する（図２）；ｄｌ１５２０はＯＮＹＸ−０１５に与えられた
元来の名称である（Ｈｅｉｓｅら，Ｎａｔｕｒｅ Ｍｅｄｉｃｉｎｅ ３：６３
９−６４５，１９９７）。予測されるごとく、ｐｍ７３４．１で感染した細胞（
図２）、ＡＤＰにおいてアミノ酸１ないし４８を欠く突然変異体（Ｔｏｌｌｅｆ
ｓｏｎら，Ｊ．Ｖｉｒｏｌ．７０：２２９６−２３０６，１９９６）においてＡ
ＤＰは検出されなかった。ｄｌ０１／０７、ＫＤ１、ＫＤ２およびＫＤ３による
Ｅ１Ａ蛋白質の発現はＡｄ５、ｄｌ３０９またはｄｌ３２７によるよりもわずか
に低く、ｄｌ０１／０７欠失から予測されるごとく、蛋白質はより小さかった（
図３Ａ）。ｄｌ３２７はｄｌ３２４と同質遺伝子であり（Ｔｈｉｍｍａｐｐａｙ
ａら，１９８２ Ｃｅｌｌ ３１：５４３−５１，１９８３）、それはＡＤＰお
よび１２．５Ｋ蛋白質以外の全ての他のＥ３蛋白質に対する遺伝子を欠く。
【００６７】 ＫＤ１およびＫＤ３感染細胞で検出されたＡＤＰの量は、ｄｌ３０９感染細胞
で検出された量よりも有意に高い（図２）。もしＥ１Ａ突然変異を持つウイルス
が、後期蛋白質の遅れた出現によって証明されるごとく幾分遅く複製するという
事実を考慮するならば（図３Ｂ）、ＫＤ１およびＫＤ３はｄｌ３０９よりも細胞
に存在するウイルスゲノム当たりかなり多くのＡＤＰを発現することは明瞭であ
る。この知見は、Ａ５４９細胞をＥ１Ａ突然変異を含有するウイルス、およびＡ
ＤＰを欠くが野生型Ｅ１Ａを有するｄｌ３２７で共感染させた場合、後期蛋白質
のより早い出現によって示されるごとく、Ｅ１Ａ突然変異体ウイルスの複製速度
はスピードアップされるという事実によって支持される（図３Ｂおよび３Ｄを比
較されたし）。かくして、ｄｌ３２７はＥ１Ａ突然変異を補充する。結論として
、これらの実験は、ＡＤＰがＫＤ１、ＫＤ３、ＧＺ１およびＧＺ３によって劇的
に過剰発現されることを示す。ＡＤＰはかろうじてＫＤ２によって過剰発現され
る（示さず）。
【００６８】 実施例２ 本実施例は、ＫＤ１およびＫＤ３が他のアデノウイルスよりも迅速に細胞を溶
解させ、より速く細胞間に広がることを示す。
【００６９】 細胞を溶解させるＫＤ１およびＫＤ３の能力は、Ｔｏｌｌｅｆｓｏｎら（Ｊ．
Ｖｉｒｏｌ．７０：２２９６−２３０６，１９９６）によって実質的に記載され
ているごとく行ったトリパンブルー排除細胞生存率アッセイによって調べた。簡
単に述べれば、Ａ５４９細胞を２０ＰＦＵ／細胞のＫＤ１、ＫＤ３、ｄｌ０１／
０７、ｄｌ３２７またはｄｌ３０９でモック感染させるか、または感染させた。
種々の感染後日数において、生きた細胞の数をヘモサイトメーターを用いて測定
し（６００ないし１０００の細胞を時点当たりカウントした）、結果を図４に示
す。
【００７０】 ＫＤ１およびＫＤ３と同一のＥ１Ａ突然変異を有する、ｄｌ０１／０７で感染
した細胞の４４％と比較して、ＫＤ１−感染細胞の２５％およびＫＤ３−感染細
胞の９％のみが感染後５日において生存した。また、ＫＤ１およびＫＤ３ベクタ
ーは、野生型Ｅ１Ａ領域を有するｄｌ３０９よりも速く細胞を溶解させた。ｄｌ
３２７（ＡＤＰ−、ＥＩＡ＋）で感染させると、細胞の９４％が５日後に生存し
た。細胞溶解を乳酸デヒドロゲナーゼの放出によって見積もると、ＫＤ１および
ＫＤ３はｄｌ０１／０７およびｄｌ３０９よりも速く細胞をもう一度溶解させ、
ｄｌ３２７はほとんど細胞溶解を引き起こさなかった（データは示さず）。かく
して、ＡＤＰは効果的な細胞溶解に必要であり、ＡＤＰの過剰発現は細胞溶解の
速度を増加させる。
【００７１】 細胞溶解を測定し、癌細胞におけるウイルス複製を調べるためのもう１つの手
段として、Ａ５４９細胞の別々の群を２０ＰＦＵ／細胞のＫＤ１、ＫＤ３、ｄｌ
０１／０７またはｄｌ３０９で感染させ、Ａ５４９細胞でのプラークアッセイに
よって、細胞内および細胞外ウイルスの量を測定した。感染後２日において、各
群で形成されたウイルスの全量は同様であり（２−４×１０８ＰＦＵ／ｍｌ）、
これは、全てのウイルスの複製が同様であることを示す。しかしながら、細胞内
ウイルスに対する細胞外ウイルスの比率を計算すると、ＫＤ１およびＫＤ３に対
する値はＡｄ５、ｄｌ３０９またはｄｌ０１／０７に対するよりも２−３ｌｏｇ
高かった（データは示さず）。かくして、野生型量のＡＤＰを発現するウイルス
よりも、ＡＤＰを過剰発現する、ＫＤ１およびＫＤ３で感染させた細胞からウイ
ルスがかなり速く放出される。
【００７２】 細胞間に広がるＫＤ１およびＫＤ３の能力は「細胞広がり」アッセイで測定し
た。このアッセイにおいて、４８ウェル培養皿中のＡ５４９細胞の単層を１０− ３ 、１０−２、１０−１、１００または１０ＰＦＵ／細胞のｄｌ３２７、ｄｌ３
０９、Ａｄ５、ｄｌ０１／０７、ＫＤ１またはＫＤ３でモック感染または感染さ
せた。低いＰＦＵ／細胞において、ウイルスは２または３ラウンドの複製を通過
して、単層の各細胞を感染しなければならない。１．０および１０ＰＦＵ／細胞
において、単層は、最初に細胞を感染したウイルスによって破壊されるべきであ
る。感染後７日までに単層での広がりの量を評価するために、生きた細胞を染め
るが死んだ細胞を染めないクリスタルバイオレットを単層に添加した。結果を図
５に示す。
【００７３】 顕著には、感染後７日において、単層は１０−３ＰＦＵ／細胞においてＫＤ１
およびＫＤ３によって実質的に排除され、他方、１．０ＰＦＵ／細胞がｄｌ０１
／０７、ｄｌ３０９およびＡｄ５で必要であった。この結果は、細胞溶解および
Ａ５４９細胞におけるウイルス拡大を媒介するにおけるＡＤＰの能力を阻止する
。また、この細胞広がりアッセイで測定して、ＫＤ１およびＫＤ３は、他のタイ
プのヒト癌細胞系（ほとんどは、Ａｍｅｒｉｃａｎ Ｔｙｐｅ Ｃｕｌｔｕｒｅ
Ｃｏｌｌｅｃｔｉｏｎ［ＡＴＣＣ］から購入した）を殺すにおいてｄｌ０１／
０７よりも効果的である。１０−２ＰＦＵ／細胞におけるＫＤ１および／または
ＫＤ３で殺傷したＨｅＬａ（頸癌）、ＤＵ１４５（前立腺）、およびｐＣ３（前
立腺）細胞、１０−１ＰＦＵ／細胞におけるＭＥ−１８０（頸部）およびＨｅｐ
３Ｂ（肝臓）、および１０ＰＦＵ／細胞におけるＵ１１８（神経膠芽細胞腫）お
よびＵ３７３（神経膠芽細胞腫）。これらの細胞を殺すのに１０ないし１００倍
多くのｄｌ０１／０７が必要であった（データは示さず）。これらの結果は、Ｋ
Ｄ１およびＫＤ３が多くのタイプの癌に対して効果的であり得ることを示す。
【００７４】 ＡＤＰ過剰発現ベクターが非常に低い多重度の感染において細胞を溶解すると
いう知見の重要な態様は、ヒト腫瘍における感染の多重度が、ベクター注入の見
地に対して末端側、または腫瘍へベクターを運ぶ血管に対して末端側にある部位
において低いようであるということである。かくして、ＡＤＰ過剰発現ベクター
は、ＡＤＰをより少量またはＡＤＰを全く発現しないベクターよりも優れた利点
を有する。
【００７５】 実施例３ 本実施例は、ＫＤ１およびＫＤ３が増殖しない非癌性細胞で貧弱にしか複製し
ないことを示す。ＫＤ１およびＫＤ３の複製表現型は、「正常」ＨＥＬ−２９９
ヒト繊維芽細胞（１０％血清中で増殖するものまたは０．１％血清を用いて休止
としたもの）を用いて評価した。全てのＡｄは増殖する細胞中でよく複製するは
ずであるが、ｄｌ０１／０７ Ｅ１Ａ突然変異を持つウイルスは休止細胞におい
て貧弱にしか複製しない。何故ならば、Ｇ０からそれを出すのにＥ１Ａが必要だ
からである。野生型Ｅ１Ａを有するｄｌ３０９は、増殖するおよび増殖阻止細胞
双方においてよく複製するはずである。
【００７６】 細胞は１００ＰＦＵ／細胞のＫＤ１、ＫＤ３、ｄｌ０１／０７またはｄｌ３０
９で感染させた。異なる感染後日数において、ウイルスを抽出し、力価測定した
。１０％血清において、ＫＤ１、ＫＤ３およびｄｌ０１／０７はよく複製し、１
０６−１０７ＰＦＵ／ｍｌの力価に到達し、これはｄｌ３０９よりもわずかに低
いだけであった（図６）。しかしながら、休止細胞において、ＫＤ１、ＫＤ３お
よびｄｌ０１／０７の複製は増殖細胞におけるよりも１．５〜２ｌｏｇ低く、１
０４ないし２×１０５ＰＦＵ／ｍｌの範囲であった。ｄｌ３０９の力価は増殖す
る細胞で達成されたレベル近くの１０７ＰＦＵ／ｍｌに到達した。感染後１０日
において、１００ＰＦＵ／細胞のＫＤ１、ＫＤ３またはｄｌ０１／０７で感染さ
せた休止ＨＥＬ−２９９細胞単層は無傷であり、他方、野生型Ｅ１Ａを有するｄ
ｌ３０９またはｄｌ３２７で感染させたものは、細胞死滅を示す強力な典型的Ａ
ｄ細胞障害効果を示した（データは示さず）。かくして、ＫＤ１およびＫＤ３の
複製は増殖する細胞系に厳格に制限される。
【００７７】 ｄｌ０１／０７ Ｅ１Ａ突然変異に関連した制限は、単層として増殖する初代
ヒト細胞（Ｃｌｏｎｅｔｉｃｓから購入した）でテストした。気管支上皮細胞（
図７）および小さな気道上皮細胞は感染後５日において１０ＰＦＵ／細胞のＫＤ
１、ＫＤ３またはｄｌ０１／０７によって殺されず、他方、それらは１０ＰＦＵ
／細胞のｄｌ３０９またはｄｌ３２７によって殺された（データは示さず）。肺
内皮細胞は１０日後に１０ＰＦＵ／細胞のＫＤ１、ＫＤ３またはｄｌ０１／０７
によって殺されなかったが、それらは１ＰＦＵ／細胞のｄｌ３０９によって殺さ
れた。最初に感染させると、これらの単層は密集下であり、次いで、密集するま
で増殖した。ここでの刺激の結果は、これらの初代細胞は増殖しつつあったが、
それらはこの時点のフレームにおいて複製を支持せず、ＫＤ１またはＫＤ３によ
って殺されなかったことである。かくして、これらのベクターは癌性細胞に制限
され、身体中で正常に分裂する基底細胞のごとき細胞に対してほとんどまたは全
く効果を有しないと考えられる。加えて、ＫＤ１およびＫＤ３は、そのような細
胞はＡｄによって貧弱にしか感染されないので分裂する白血球に影響するようで
はない。
【００７８】 まとめると、前記実験は、ＫＤ１およびＫＤ３は癌細胞を溶解させ、細胞間に
迅速に拡大し、休止および非癌性細胞において貧弱にしか複製しないことを示す
。これらの特性はそれらを抗癌療法において有用なものとするはずである。
【００７９】 実施例４ 本実施例は、ＫＤ１およびＫＤ３が動物モデルにおいてヒト腫瘍の増殖を阻害
することを示す。
【００８０】 本発明者らは、正常なマウスまたはラットにおいてマウスまたはラットの腫瘍
を評価することができなかった。何故ならば、それらは全体的に非許容性である
からである。ヌードマウスにおいて増殖しつつあるヒト癌細胞系は、Ｏｎｙｘ
Ｐｈａｒｍａｃｅｕｔｉｃａｌｓ （Ｒｉｃｈｍｏｎｄ，ＣＡ）によって用いら
れて、ＯＮＹＸ−０１５、Ｅ１Ｂ ５５ｋＤａ蛋白質の発現を欠くＡｄベクター
の有効性を評価した（Ｈｅｉｓｅら，Ｎａｔｕｒｅ Ｍｄｅ．３：６３９−６４
５，１９９７）。本発明者らは、我々の細胞培養実験の多くで用いたＡ５４９細
胞が、ヌードマウスに皮下注射した場合に、優れた、迅速に増殖する固体腫瘍を
形成することを見い出した。平均腫瘍は４週間のうちに約５００μｌに到達し、
カプセル化され、血管形成され、マウスの皮膚（通常）または筋肉に付着した。
【００８１】 ヌードマウスを２×１０７Ａ５４９細胞で各後側腹部に接種した。１週間後、
腫瘍が形成され、約２０μｌないし５０μｌのサイズ範囲であった。個々の腫瘍
を、３×１０８ＰＦＵの腫瘍当たりの合計ウイルス用量にて、５０μｌの緩衝液
または５×１０７ＰＦＵのｄｌ３０９、ｄｌ０１／０７、ＫＤ１、ＫＤ３または
ｐｍ７３４．１を含有する５０μｌの緩衝液を、３日後に、および４週間引き続
いての週に注入した（合計５つの注入）。突然変異体ｐｍ７３４．１はＡＤＰに
対する遺伝子において２つのナンセンス突然変異のためＡＤＰ活性を欠くが、全
ての他のＡｄ蛋白質は野生型レベルで合成されると予測される（Ｔｏｌｌｅｆｓ
ｏｎら，Ｊ．Ｖｉｒｏｌ．７０：２２９６−２３０６，１９９６）。各ウイルス
（または緩衝液）の効果を６つの腫瘍についてテストした。週間隔にて、Ｍｉｔ
ｕｔｏｙｏデジタルカリパーを用い、腫瘍の長さ（Ｌ）および幅（Ｗ）を測定し
た。腫瘍の容量は、Ｌ×Ｗ×Ｗ／２を乗じることによって計算した。この値を初
期ウイルス注入の時点における腫瘍容量で割り、腫瘍増殖の倍増加を計算し、６
つの腫瘍についての平均をグラフ化した。
【００８２】 図８Ａに示すごとく、緩衝液を接種した腫瘍は増殖し続け、５週間までに約１
４倍増加した。対照的に、正常な量のＡＤＰを発現し、Ｅ３ ＲＩＤおよび１４
．７Ｋおよび蛋白質を欠くｄｌ３０９を注入した腫瘍は、５週間まで約２．５倍
増殖したに過ぎなかった。ＡＤＰを欠くｐｍ７３４．１では、腫瘍ならびに緩衝
液を摂取したものは増殖した。かくして、ｄｌ３０９は腫瘍の増殖速度を顕著に
減少させ、ＡＤＰはこの減少に必要である。ｄｌ０１／０７を接種した腫瘍は５
週間にわたって約８倍増殖した。ｄｌ０１／０７はＥ１Ａ突然変異を除いてｄｌ
３０９と同一であるので、この結果は、Ｅ１Ａ突然変異が、腫瘍の増殖を妨げる
Ａｄの能力を有意に低下させることを示す。この効果は、恐らくは、より低いＡ
ＤＰ発現をもたらす腫瘍におけるウイルス複製の低下によるものであるが、それ
は腫瘍細胞におけるＥ１Ａの他の特性、例えば、突然変異体Ｅ１Ａ蛋白質がアポ
トーシスを誘導できないことも反映できた。最も重要には、ＫＤ１またはＫＤ３
を接種した腫瘍は約２．５倍増殖したに過ぎなかった。かくして、ＫＤ１および
ＫＤ３によるＡＤＰの過剰発現は、ＫＤ１およびＫＤ３がｄｌ０１／０７（その
親対照ウイルス）よりも顕著に遅い速度まで、およびｄｌ３０９のそれと同様の
速度までさえ腫瘍の増殖を低下させるようにする。
【００８３】 ＫＤ１およびＫＤ３は癌細胞に制限されるが、野生型Ａｄはそのような制限を
有しない故に、ＫＤ１およびＫＤ３はＡ５４９腫瘍増殖の速度を低下させるにお
いて野生型Ａｄ（すなわち、ｄｌ３０９）と同程度効果的であるという知見は癌
の治療の意味においてかなり有意義である。
【００８４】 ベクターの５回の注入を摂取したが、ベクターの１用量（この場合、５×１０ ８ の各ＫＤ３またはＧＺ３）を摂取したに過ぎない図８Ａにおける腫瘍は、Ａ５
４９腫瘍増殖の速度を有意に低下させるのに十分である（図８Ｂ）。
【００８５】 本発明者らは、ＫＤ１およびＫＤ３がヒト肝臓癌細胞系、Ｈｅｐ３Ｂ細胞のヌ
ードマウスにおける増殖速度を低下させることも見い出した。これらの細胞は、
かなり血管形成される迅速に増殖する腫瘍を形成する。ヌードマウスに１×１０ ７ のＨｅｐ３Ｂ細胞を各後側腹部に接種した。腫瘍が約１００μｌに到達した後
、それらを５０μｌの緩衝液または５×１０７ＰＦＵのＫＤ１、ＫＤ３またはｄ
ｌ３０９を３週間の間１週間当たり２回注入した。典型的には、テストウイルス
当たり８〜１０の腫瘍があった。腫瘍のサイズを測定し、初期ウイルス注入後０
ないし３．５におけるサイズの倍増加をＡ５４９腫瘍につき前記したごとくグラ
フ化した。緩衝液単独を摂取した腫瘍は３週間にわたって９倍増殖し、突出して
３．５週間にわたって約１２倍増殖した（３週間後、マウスは犠牲にしなければ
ならなかった。何故ならば腫瘍が余りにも大きくなりつつあったからである）（
図９）。ＫＤ１またはＫＤ３を摂取した腫瘍は約４倍増殖し、ＫＤ１およびＫＤ
３がヌードマウスにおいてＨｅｐ３Ｂ腫瘍の増殖を低下させることが確立された
。ｄｌ３０９を注入した腫瘍は２倍増殖した（図９）。ＫＤ１およびＫＤ３がｄ
ｌ３０９よりも幾分効果的でないという知見は、培養における細胞広がりアッセ
イにおいて示されるごとく（データは示さず）、恐らくは、それら、ならびにＨ
ｅｐ３Ｂ細胞においてｄｌ３０９が増殖しないという事実による。いずれの場合
においても、重要な点は、ＫＤ１およびＫＤ２がＨｅｐ３Ｂ腫瘍に対して効果的
であり、それらがそれらの複製を癌細胞に制限するＥ１Ａ突然変異を含有するこ
とである。
【００８６】 これらの結果は、Ａｄベクターにおいて発現される場合、抗腫瘍剤としてのＡ
ＤＰの能力を示す。ＫＤ１およびＫＤ３は、ヒトで増殖する腫瘍を感染させるの
に用いた場合にかなりの臨床的利点を高い確率で提供するであろう。
【００８７】 実施例５ 本実施例は、ＫＤ１またはＫＤ３と組み合わせた複製−血管Ａｄベクターの使
用を説明する。
【００８８】 複製−コンピテント（ＲＣ）ウイルスが複製−血管（ＲＤ）突然変異体を補充
することはよく確立されている。すなわち、同一細胞を感染させた場合、コンピ
テントウイルスは突然変異体ゲノムから作成することができない蛋白質を供給し
、両者のウイルスは増殖するであろう。ＲＤウイルスを補充するＫＤ１およびＫ
Ｄ３の能力をテストするために、β−ガラクトシダーゼを発現する２つのＲＤベ
クターを構築した。Ａｄ−β−ｇａｌと命名された最初のものは、欠失したＥ１
領域に代えて置き換えられたラウス肉腫ウイルスプロモーターの制御下にあるβ
−ｇａｌをコードするｃＤＮＡを有する。Ａｄ−β−ｇａｌはＡＤＰに対する遺
伝子を含めた、欠失されたＥ３領域を有する。Ａｄ−β−ｇａｌ／ＦａｓＬと命
名された第２のものは、それがヒト・サイトメガロウイルスプロモーター／エン
ハンサーからのネズミＦａｓＬを発現する以外はＡｄ−β−ｇａｌと同一である
。これらのベクターは、Ａｄ Ｅ１ＡおよびＥ１Ｂ遺伝子を構成的に発現し、Ｅ
１−マイナスベクターの複製を補充するヒト２９３細胞における重複組換えによ
って構築した。
【００８９】 これらのＲＤベクターはＡ５４９細胞においてβ−ｇａｌを感染させ、それを
発現するはずであるが、複製しないはずである。何故ならば、Ｅ１Ａ蛋白質が欠
けているからである。しかしながら、細胞をＲＣ Ａｄで共感染させた場合には
該ベクターは複製するはずである。これを証明するために、Ａ５４９細胞を、１
０ＰＦＵ／細胞のＡｄ−β−ｇａｌ単独で、または１０ＰＦＵ／細胞のＡｄ−β
−ｇａｌ＋１０ＰＦＵ／細胞のＫＤ１、ＫＤ３、ｄｌ０１／０７、ｄｌ３０９ま
たはｄｌ３２７で感染させた。感染後２日において、ウイルスを抽出し、Ａ５４
９細胞におけるβ−ｇａｌ発現によってＡｄ−β−ｇａｌ力価を測定した。収率
は以下の表２に示す。
【００９０】
【表２】
【００９１】 表２におけるベータは、補充ウイルスがＡｄ−β−ｇａｌの収率を１０３だけ
増加させたことを示す。
【００９２】 ＫＤ１およびＫＤ３の鍵となる特徴は、それらが他のＡｄよりも速く細胞間に
広がることである。従って、それらはＡｄ−β−ｇａｌの広がりを補充するはず
である。これをテストするために、感染中心アッセイを行った。Ａ５４９細胞を
Ａｄ−β−ｇａｌ＋ＫＤ１、ＫＤ３またはｄｌ０１／０７で感染させた。２時間
後、細胞を収集し、希釈し、新鮮なＡ５４９細胞の単層に接種した。４日後、細
胞をＸ−ｇａｌで染色し、結果を図１０に示す。
【００９３】 Ａｄ−β−ｇａｌ単独では、元来感染された細胞（接種前）のみが染色される
はずであり、ベクターは接種した単層上の他の細胞まで広がるはずがない。これ
は事実当てはまった。Ａ５４９を接種した単層において、Ａｄ−β−ｇａｌ単独
で感染した細胞（図１０Ａの頂部左側に示す皿）は、多数の個々の青色細胞（印
刷中に見えない）を含有した；その例を拡大した図１０Ｂに示す。しかしながら
、該単層にＡｄ−β−ｇａｌおよびＫＤ１またはＫＤ３を共感染したＡ５４９細
胞を接種した場合、青色細胞の多数の「コメット」があった（図１０Ａ）。各コ
メットは、１つの最初に−感染された細胞から広がったＡｄ−β−ｇａｌを表す
。コメット内の細胞のほとんどはＸ−ｇａｌで染色された（図１０Ｃ）。また、
ｄｌ０１／０７でコメットが観察されたが、ＫＤ１およびＫＤ３の程度まででは
なかった（図１０Ａ）。ｄｌ３２７（ＡＤＰ−）では、元来感染した細胞からの
広がりはほとんどなかった（データは示さず）。要約すると、ＫＤ１およびＫＤ
３はＡｄ−β−ｇａｌの複製を補充するのみならず、それらはその迅速な広がり
を増強する。
【００９４】 ＫＤ１およびＫＤ３は抗癌治療遺伝子産物を発現するＲＤベクターの広がりを
補充し、それを増強すると予測され、この予測は、複製および前記した感染中心
アッセイでＡｄ−β−ｇａｌ／ＦａｓＬを用いて容易に証明することができる。
【００９５】 ＫＤ１およびＫＤ３は細胞培養においてＲＤベクターの複製を補充するのみな
らず、それらはヌードマウスの後側腹部で増殖するＨｅｐ３Ｂ腫瘍においてもそ
うする。使用したＲＤベクターはＡｄＬｕｃ（Ｅ１およびＥ３領域を欠くＡｄ）
であり、ホタル・ルシフェラーゼ遺伝子がラウス肉腫ウイルスプロモーターから
発現される発現カセットをＥ１領域に挿入する（Ｈａｒｒｏｄら，Ｈｕｍａｎ
Ｇｅｎｅ Ｔｈｅｒａｐｙ ９：１８８５−１８９８，１９９８）。Ｈｅｐ３Ｂ
腫瘍に１×１０７ＰＦＵのＡｄＬｕｃ＋緩衝液、または１×１０７ＰＦＵのＡｄ
Ｌｕｃ＋５×１０７ＰＦＵのＫＤ１、ＫＤ３、ｄｌ０１／０７またはｄｌ３０９
を注射した。２週間後、マウスを犠牲にし、腫瘍を切り出した。蛋白質を腫瘍か
ら抽出し、ルミノメーターを用いてルシフェラーゼ活性を測定した。腫瘍当たり
のルシフェラーゼカウントはＡｄＬｕｃ＋緩衝液では６，８００であり、ＫＤ１
では１１３，５００であり、ＫＤ３では１４６，９００であった（図１１）。か
くして、ＫＤ３およびＫＤ１は、各々、ルシフェラーゼ活性の２２倍および１７
倍増加を引き起こした。この増加は、最初に共感染されたＡｄＬｕｃおよびＫＤ
１またはＫＤ３である細胞におけるルシフェラーゼの上昇した合成によるもので
あり、それはＫＤ１またはＫＤ３によって媒介される腫瘍における細胞間のＡｄ
Ｌｕｃの広がりのためであった。
【００９６】 まとめると、抗癌遺伝子産物を発現するＲＤベクターと共に本発明による複製
−コンピテントＡＤＰ−過剰発現ベクターでの腫瘍の感染は、腫瘍で合成される
抗癌蛋白質の量を大いに増加させるはずであり、それにより、腫瘍の破壊を促進
する複製−血管ベクターの能力を増加させる。
【００９７】 実施例６ 本実施例は、癌性タイプＩＩ肺胞細胞に複製−制限された本発明による組換え
Ａｄベクターの構築および特徴付けを説明する。
【００９８】 前記で示したごとく、ＫＤ１およびＫＤ３におけるｄｌ０１／０７突然変異が
これらのベクターの増殖を癌細胞に制限する。その複製表現型をさらに制限する
ために、各ウイルスにおけるＥ４プロモーターを欠失し、界面活性剤蛋白質Ｂ（
ＳＰＢ）プロモーターによって置き換えて、ＫＤ１−ＳＰＢ（配列番号：１４）
、ＫＤ３−ＳＰＢ（配列番号：１５）およびｄｌ０１／０７−ＳＰＢ（配列番号
：１６）と命名されたベクターを得た。これらのＳＰＢプロモーターは、かくし
てヒト肺のＩＩ型肺胞細胞で主として見い出されているＴＴＦ１転写因子を含有
する細胞でのみ活性である（Ｌａｚｚａｒｏら，Ｄｅｖｅｌｏｐｍｅｎｔ １１
３：１０９３−１１０４，１９９１）。かくして、ＫＤ１−ＳＰＢ、ＫＤ３−Ｓ
ＰＢおよびｄｌ０１／０７−ＳＰＢは、ヒト肺の癌性ＩＩ型肺胞細胞にひどく制
限されるべきである。多くの肺癌はこのタイプのものである。
【００９９】 ＫＤ１−ＳＰＢおよびＫＤ３−ＳＰＢベクターは以下のごとく調製した。Ｅ４
プロモーターはＡｄゲノムの右側端部に位置する（図１）。ＢａｍＨＩ部位（５
９マップ単位）からゲノムの右側端部のＡｄ５ ＤＮＡ配列を含有するｐＣＲＩ
Ｉ−ベースのプラスミド（Ｉｎｖｉｔｒｏｇｅｎ）を用い、かつＰＣＲ−ベース
のプロトコルを用い、ほとんど全ての転写因子結合部位をＥ４プロモーターＡｄ
５塩基対３５，６２３ないし３５，７７５から欠失し、ＳＰＢプロモーターを含
有する５００塩基対断片で置き換えた（Ｙａｎら，Ｊ．Ｂｉｏｌ．Ｃｈｅｍ．２
７０：２４８５２−２４８５７，１９９５）。最終プラスミドは、ウイルスｄｌ
０１／０７−ＳＰＢ、ＫＤ１−ＳＰＢ、およびＫＤ３−ＳＰＢにつき、Ｅ４領域
およびＥ３領域のｄｌ０１／０７、ＫＤ１またはＫＤ３バージョンにＥ４−ＳＰ
Ｂ置換を含む。これらのプラスミドを、ｄｌ０１／０７のゲノムの左側部分を含
有する断片で２９３細胞に共トランスフェクトし、プラークを生成させた。プラ
ークを予測される特徴につきスクリーニングし、精製し、次いで、増殖させてス
トックした。
【０１００】 Ａ５４９−ＴＴＦ１細胞系を発生させて、ｄｌ０１／０７−ＳＰＢ、ＫＤ１−
ＳＰＢおよびＫＤ３−ＳＰＢの複製がＴＴＦ１転写因子を発現する癌性細胞に制
限されるであろうという予測をテストした。これらの細胞を２つのプラスミドで
共トランスフェクトした（１つは、ＴＴＦ１がＣＭＶプロモーターから発現され
るものであり、ネオマイシン耐性クローンに対する抵抗性につきコードするもう
１つは単離され、界面活性剤蛋白質Ｃプロモーターを要求するＴＴＦ１からのク
ロラムフェニコールアセチルトランスフェラーゼを発現するプラスミドでの一過
性トランスフェクションによって判断してＴＴＦ１活性を発現することが示され
ている）。
【０１０１】 ＫＤ１−ＳＰＢおよびＫＤ１を、Ａ５４９−ＴＴＦ１細胞および親Ａ５４９細
胞についての標準的なプラーク発生アッセイに付した。結果を図１２に示す。Ａ
５４９細胞上のＫＤ１−ＳＰＢでは、プラークは８日後には目に見えず、１０日
後にはプラークの最終数の約４％のみが観察され、１２日後には最終プラークの
約５０％が観察された。Ａ５４９−ＴＴＦ１細胞上のＫＤ１−ＳＰＢでは、プラ
ークは６日後に目に見え、１０日後にはプラークの約６０％が観察された。かく
して、予測されるごとく、ＫＤ１−ＳＰＢは、ＴＴＦ１を含有する細胞でかなり
速く増殖した。ＫＤ１はＡ５４９およびＡ５４９−ＴＴＦ１細胞双方でＫＤ１−
ＳＰＢよりも迅速にプラークを形成し、これは、Ｅ４プロモーター−ＳＰＢ置換
がＡｄ複製を誘導するにおいて野生型Ｅ４プロモーターと同程度には効果的でな
いことを示す。しかしながら、Ａ５４９−ＴＴＦ１細胞上のＫＤ１−ＳＰＢおよ
びＫＤ１の間のこの差異は許容され、ＫＤ１−ＳＰＢは約１日だけ遅延する。奇
妙なことには、１６日までに全てのウイルスストックにつき得られた最終力価は
同様であり、Ａ５４９細胞は非常に少量の内因性ＴＴＦ１活性を含有できること
を示す。ＫＤ３−ＳＰＢおよびｄｌ０１／０７−ＳＰＢは、Ａ５４９−ＴＴＦ１
細胞およびＡ５４９細胞で増殖させるとＫＤ１−ＳＰＢと同様に挙動するであろ
うと予測される。
【０１０２】 ＫＤ１−ＳＰＢのＴＴＦ１を含有する細胞への制限を、さらに、Ｈ４４１細胞
、ＴＴＦ１−発現ヒト肺腺癌細胞系（Ｙａｎら，前掲）、およびＨｅｐ３Ｂ細胞
、ＴＴＦ１を発現すると予測されない肺癌細胞系を用いて細胞拡大アッセイで調
べた。Ｈ４４１またはＨｅｐ３Ｂ細胞を含有する培養皿ウェルを、１０ないし１
０−４ＰＦＵ／細胞の範囲の多重度にてＫＤ１−ＳＰＢまたはＫＤ１で感染させ
た。Ｈ４４１およびＨｅｐ３Ｂ細胞を、各々、感染後５日および８日においてク
リスタルバイオレットで染色した。ＫＤ１−ＳＰＢおよびＫＤ１はＨ４４１細胞
上で等しくよく増殖し、広がり、細胞当たり１０−１ＰＦＵにおいて単層の破壊
を引き起こした（図１３）。（Ｈ４４１単層のいくらかは、細胞当たり１０−２ ＰＦＵにおいてＫＤ１−ＳＰＢを含むウェルにおいて、および細胞当たり１０− ４ ＰＦＵのＫＤ１およびＫＤ１−ＳＰＢを含むウェルにおいてでよくはがれた；
これは、場合によって、細胞広がりアッセイで起こり、それはウイルス感染を反
映しない）。Ｈｅｐ３Ｂ細胞では、ＫＤ１はＫＤ１−ＳＰＢよりもかなり良好に
増殖し、広がり、ＫＤ１の細胞当たり１０−２ＰＦＵでは、ＫＤ１−ＳＰＢの細
胞当たり１．０ＰＦＵとして単層のより多い破壊を引き起こす（図１３）。
【０１０３】 要約すると、本実施例は、適当な転写因子を発現する細胞上でよく複製する複
製−コンピテントＡｄが、Ｅ４プロモーターの代わりに置き換えられた組織−特
異的プロモーターで構築することができるのを示す。この方法は多くの他の組織
特異的および細胞型特異的プロモーターに適用できるはずである。１つの可能性
は肝臓−特異的プロモーターであろう。プロモーターは遊離Ｅ２Ｆを有する癌細
胞のごとき細胞でのみ活性である故に、もう１つの可能性はＥ２Ｆプロモーター
、またはＥ２Ｆ部位を持つもう１つのプロモーターを使用することであろう。第
３の可能性は調節可能なプロモーター、合成テトラサイクリン応答プロモーター
（Ｍａｓｓｉｅら，Ｊ．Ｖｉｒｏｌ．７２：２２８９−２２９６，１９９８）を
用いることであり、ここに、プロモーターの活性は患者におけるテトラサイクリ
ンまたはテトラサイクリンアナログのレベルによって制御される。
【０１０４】 実施例７ 本実施例は、ＡＤＰを過剰発現し、複製制限されないベクターの構築および特
徴づけを説明する。
【０１０５】 前記したごとく、ＫＤ１およびＫＤ３におけるｄｌ０１／０７ Ｅ１Ａ突然変
異は減衰し、非分裂および分裂初代ヒト上皮および内皮細胞において増殖を阻害
する。この突然変異を持つＡｄは分裂癌細胞においてよく複製することができる
。しかしながら、そのようなＥ１Ａ突然変異体の複製は、例えば、野生型Ｅ１Ａ
遺伝子を有するｄｌ３０９と同程度には効果的ではない。例えば、プラークが発
生する速度によって測定して、ｄｌ０１／０７の複製の速度は、ｄｌ０１／０７
プラークがｄｌ３０９のものよりも１日遅く出現するように低下する（データは
示さず）。この遅延は、部分的にはＡｄ後期遺伝子の発現における遅延による（
図１３参照）。ｄｌ０１／０７突然変異がＡ５４９細胞において複製の速度を遅
延させるという考えは、図８Ａ中のデータによってさらに支持され、ここに、ｄ
ｌ０１／０７は腫瘍増殖をほとんど阻害せず、同様にｄｌ３０９もそうであった
。ｄｌ０１／０７ Ｅ１Ａ突然変異のこの負の効果にかかわらず、議論したごと
く、ＫＤ１およびＫＤ３ベクターにこの突然変異を有する理論的および実践的態
様がある。それにもかかわらず、容易にシナリオ（例えば末期癌を持つ患者）を
容易に描くことができ、ここに腫瘍を破壊するＡｄベクターの能力は、ベクター
が腫瘍細胞に全く制限されるという要件に取って代わる。そのような場合、野生
型Ｅ１Ａ遺伝子を持つ以外はＫＤ１およびＫＤ３と同様のベクターを有するのが
有利であろう。そのようなベクターがその遺伝子を発現し、細胞を溶解し、細胞
間に広がる速度はＫＤ１およびＫＤ３のそれよりも高いはずである。そのような
ベクターは非癌性細胞および組織に対するいくらかの損傷を引き起こすが、これ
は、外科手術、化学療法および放射線照射療法のごとき抗癌治療の他の様式でも
当てはまる。
【０１０６】 これらの考慮に徴すると、野生型Ｅ１Ａ領域を有する以外は、各々、ＫＤ１お
よびＫＤ３と同一であるＧＺ１およびおよびＧＺ３と命名されたベクターが構築
された。これらのベクターは、Ａ５４９細胞において重複組換えによって構築さ
れた。左側の断片はＡｄ５の野生型Ｅ１Ａ領域を含有し、右側端部断片はＫＤ１
またはＫＤ３のＥ３修飾を含有した。プラークを拾い、予測される遺伝子型につ
いて分析し、プラーク精製し、増殖させてＣｓＣｌ−バンデットストックとした
。Ａ５４９細胞上のこれらのストックの力価はＧＺ１では２．９×１０１０ＰＦ
Ｕ／ｍｌであり、ＧＺ３では１．６×１０１１ＰＦＵ／ｍｌであった。かくして
、これらのベクターは、野生型Ａｄに匹敵する高力価ストックに増殖させること
ができる。ＧＺ１およびＧＺ３プラークはより大きく、ｄｌ３０９についてのプ
ラークよりもかなり早く出現する。大きな迅速に出現するプラークは、細胞を溶
解し、細胞間に広がるＡｄの能力を反映し（Ｔｏｌｌｅｆｓｏｎら，Ｊ．Ｖｉｒ
ｏｌ．７０：２２９６−２３０６，１９９６；Ｔｏｌｌｅｆｓｏｎら，Ｖｉｒｏ
ｌｏｇｙ ２２０：１５２−１６２，１９９６）、議論したこの特性はＡＤＰの
機能によるものである。
【０１０７】 プラーク出現の率はプラーク発生アッセイで定量することができる（Ｔｏｌｌ
ｅｆｓｏｎら，前掲）。ここに、典型的なプラークアッセイを行い、アッセイの
翌日に観察されたプラークを、プラークアッセイの最後に観察されたプラークの
数のパーセンテージとして計算する。図１４に示されるごとく、Ａ５４９細胞で
のプラークアッセイの４日後に、ＧＺ１およびＧＺ３はプラークの最終数の、各
々、４８％および３４％を有し、他方、ｄｌ３０９は１％を有したに過ぎなかっ
た。ただ４日後に出現するのはプラークについてのＡ５４９細胞でのＡｄプラー
クアッセイでは非常に異常である。これらの大きなプラークはＡＤＰの過剰発現
を反映する。これらのＧＺ１およびＧＺ３プラークはＫＤ１およびＫＤ３のもの
よりも早く出現する（データは示さず）。何故ならば、疑いなく、ＧＺ１および
ＧＺ３は野生型Ｅ１Ａ領域を有するのでより速く複製するからである。
【０１０８】 ＧＺ１およびＧＺ３は細胞を溶解させ、ｄｌ３０９よりもかなり効果的に細胞
間に広がる。Ａ５４９細胞の感染後６日において、細胞当たり１０−１ＰＦＵに
おいてｄｌ３０９で観察されたのとほぼ同様に多くの単層破壊が細胞当たり１０ −３ ＰＦＵにおいてＧＺ１およびＧＺ３で観察された（図１５、頂部パネル）。
この結果は、さらに、ＡＤＰの過剰発現が細胞溶解およびウイルス広がりを促進
するという結論を過小評価する。
【０１０９】 理論的には、ＧＺ１およびＧＺ３は腫瘍細胞のみならず正常細胞において複製
することができるはずである。それらは正常細胞で複製できるが、ＧＺ１および
ＧＺ３は抗癌ベクターとして有用である可能性が高い。まず、ＧＺ１およびＧＺ
３は腫瘍に直接注入することができた。多くの腫瘍は血液供給を除いて自己含有
性である（カプセル化されている）。腫瘍の物理的障害はウイルスの他の組織へ
の蒔種を最小化できる。第２に、Ａｄは一般にかなり良性である。Ａｄ５のほと
んどの感染は幼児におけるものであり、その結果、穏やかなまたは無兆候病気と
なり、強力な液性および細胞性免疫によってチェックされる。抗Ａｄ免疫性は生
涯続くようである。ＧＺ１およびＧＺ３は無傷免疫系を有し、恐らくは予め存在
する抗Ａｄ免疫性をも持つ患者においてのみ用いることができる。さらに、ガン
マ−グロブリンまたは特異的精製抗Ａｄ中和抗体を用い、患者をＡｄに対して受
動的に免疫化することができる。第３に、Ａｄ５が、特異的Ａｄ５受容体（ＣＡ
Ｒと命名）ならびに特異的インテグリン（例えば、ａｖｂ５）を呈する肺上皮細
胞に最も効果的に感染する呼吸器系ウイルスであることを考慮し、Ａｄ５に由来
する複製−コンピテントベクターは身体の多くの非癌組織で効果的に広がること
ができない。加えて、腫瘍−特異的、組織−特異的、細胞−特異的、または合成
プロモーターで置換されたＥ４プロモーターを有するＧＺ１およびＧＺ３のバー
ジョンを構築することができると考えられる。そのようなベクターは野生型Ｅ１
ＡおよびＡＤＰに関連する陽性特徴を有するが、腫瘍組織および／または特定の
細胞型に複製が制限される。
【０１１０】 実施例８ 本実施例は、ＫＤ１、ＫＤ３、ＧＺ１またはＧＺ３と放射線照射との組合せが
、ベクター単独または放射線照射単独よりも、培養で増殖する、またはヌードマ
ウスにおいて腫瘍として増殖するＡ５４９細胞を破壊するにおいてより効果的で
あることを説明する。
【０１１１】 これは細胞広がりアッセイで示された。３つの４８ウェル培養皿中で増殖する
Ａ５４９細胞を、図１５に示されるごとく、細胞当たり１０ないし１０−４ＰＦ
Ｕの範囲の感染の多重度にて異なるウイルスでモック感染または感染させた。１
つの皿は照射しなかった。第２の皿は感染後２４時間において６００セントリグ
レイ（ｃＧｙ）を摂取し、第３の皿は同時に２０００ｃＧｙの放射線照射を摂取
した。全ての皿を感染後６日においてクリスタルバイオレットで染色した。照射
されなかった細胞では（図１５において頂部パネル）、ＫＤ１およびＫＤ３はそ
れらの親対照ｄｌ０１／０７よりもより低い感染の多重度において単層破壊を引
き起こした。これは、それらの親対照ｄｌ３０９と比較してＧＺ１およびＧＺ３
についての当てはまる。（細胞当たり１０−４ＰＦＵにおいてＧＺ１またはＧＺ
３で感染させた細胞における細胞の不足は実験的な人工物であり、ＧＺ１または
ＧＺ３による感染によって引き起こされない）。これらのＫＤ１、ＫＤ３、ＧＺ
１およびＧＺ３の結果は初期の結果と合致し、ＡＤＰの過剰発現は増大した細胞
溶解およびウイルス広がりに至ることを示す。
【０１１２】 感染させ、次いで、６００ｃＧｙで照射した皿では、非照射細胞と比較して顕
著に増大した細胞殺傷およびウイルス拡大があった（図１５の底部パネルを頂部
パネルと比較されたし）。例えば、ＫＤ１、ＫＤ３、ＧＺ１およびＧＺ３では、
細胞当たり１０−２ＰＦＵにおける非照射ウェル中におけるように、細胞当たり
１０−４ＰＦＵにおいて照射ウェルでほぼ同一量の細胞破壊があった。同様の結
果が、２０００ｃＧｙの放射線照射を受けた皿で観察され（データは示さず）、
および感染に２４時間先立って６００または２０００ｃＧｙの放射線照射を受け
た皿でも観察された（データは示さず）。
【０１１３】 細胞破壊の量は、細胞からのクリスタルバイオレットを３３％酢酸で抽出し、
次いで、４９０ｎｍにおける吸光度を測定することによって定量した（データは
示さず）。非照射モック感染細胞での吸光度は１００％細胞生存率に設定した。
６００ｃＧｙを受容したモック感染細胞では、生存率において１５％喪失があっ
た（すなわち、１５％低いクリスタルバイオレットが抽出された）。細胞当たり
１０−３ＰＦＵにおけるＫＤ１では、非照射細胞は８０％生存であり、他方、６
００ｃＧｙの照射を受容した細胞は約３０％生存に過ぎなかった。照射および非
照射細胞の間の生存率の同様の差がＫＤ３、ＧＺ１およびＧＺ３で観察された。
これらの結果は、放射線照射＋ベクターの組合せが、相加的効果よりはむしろ、
細胞溶解およびベクター広がりに対して相乗的な効果を有することを議論する。
もし効果が相加的に過ぎなければ、細胞当たり１０−３ＰＦＵにおけるＫＤ１試
料では、細胞生存率は６５％であったはずである（照射単独により生存率の１５
％低下、ＫＤ１単独により２０％低下）。事実、細胞生存率は６５％よりはむし
ろ３０％であった。
【０１１４】 前記したごとく、２０００ｃＧｙとほぼ同程度に多量の細胞溶解およびウイル
ス広がりが６００ｃＧｙで観察された。ベクターと相乗する照射の最適用量を決
定するために、前記したのと同様の実験をモック−、ｄｌ０１／０７−、ＫＤ１
−、ＫＤ３−、ｄｌ３０９、ＧＺ１−、またはＧＺ３−感染Ａ５４９細胞で行っ
た。４８ウェルプレートには、感染後２４時間において０、１５０、３００また
は６００ｃＧｙの照射を受容させた。細胞をクリスタルバイオレットで染色した
。０対６００ｃＧｙの照射を受容した細胞での結果は図１５におけるものと同様
であった。クリスタルバイオレットは、相違ウイルスの細胞当たり１０−３ＰＦ
Ｕで感染させた細胞から抽出した。クリスタルバイオレットの吸光度を測定し、
１００％細胞生存率として非照射モック感染細胞の吸光度を用いてパーセント細
胞生存率をグラフ化した。図１６に示すごとく、全てのウェルにおける細胞生存
率のほぼ直線的減少が増大する照射用量で観察されたが、直線の傾きはモック、
ｄｌ０１／０７、またはｄｌ３０９におけるよりもＫＤ１、ＫＤ３、ＧＺ１また
はＧＺ３でより負であった。ＫＤ１、ＫＤ３、ＧＺ１およびＧＺ３では、それら
の親対照ウイルスでかなり多い細胞溶解およびベクター広がりがあり、ベクター
および照射の間に相乗性があった。例えば、モック感染細胞では、６００ｃＧｙ
は約３０％だけ細胞生存率を低下させた（細胞の７０％が生存した）。照射なく
してもＫＤ１は約２３％だけ細胞生存率を低下させた。６００ｃＧｙ照射＋ＫＤ
１の組合せは細胞生存率を約８５％まで低下させ、その５３％を超えるものは、
照射単独およびＫＤ１単独の総和である。図１５および１６中のデータを一緒に
考えると、約６００ｃＧｙの用量が細胞培養実験のこのタイプで最適である。
【０１１５】 また、ＫＤ３またはＧＺ３と照射との組合せをＡ５４９腫瘍−ヌードマウスモ
デルで調べた（実施例４参照）。Ａ５４９細胞をヌードマウスの後側腹部に注射
し、腫瘍を形成させた。腫瘍がほぼ５０μｌに到達すれば、それらを緩衝液と共
に、または５×１０８ＰＦＵのＫＤ３またはＧＺ３と共に注射した。８ないし１
０の腫瘍をテスト条件当たり注射した。感染後１日において、マウスの半分に６
００ｃＧｙの全身照射を受容させた。腫瘍のサイズを経時的に測定し、（実施例
４に記載されているごとく）腫瘍サイズ対感染後日数の倍増加としてプロットし
た。図１７に示すごとく、非照射緩衝液注射腫瘍はＫＤ３またはＧＺ３を注射し
たものよりも速く増殖した。ＫＤ３および照射の組合せを受容した腫瘍は増殖せ
ず、ＧＺ３および照射の組合せを受容したものは１４日後にサイズが縮んだ。こ
れらの結果は、ＫＤ３＋照射またはＧＺ３＋照射の組合せが、ヌードマウスにお
いてＡ５４９腫瘍増殖の速度を低下させるにおいて、ベクター単独または照射単
独いずれかよりも効果的であることを示す。照射は、ＫＤ１およびＤＺ１、また
は事実いずれかの他の複製−コンピテントまたは複製−欠陥Ａｄベクターの腫瘍
を治療するにおける効果を増加させるようである。
【０１１６】 照射がＡＤＰ過剰発現ベクターが細胞を溶解させ、細胞間でより効果的に広が
るようにするメカニズムは理解されていない。照射は細胞ＤＮＡ修復メカニズム
を誘導すると予測され、それはＡｄ ＤＮＡのより効果的な合成を可能とし得る
。照射はＡＤＰの機能を増強することができる。ＡＤＰは、１以上の細胞蛋白質
と相互作用することによって恐らくは機能し、照射は、ＡＤＰがより効果的に機
能するようにこの蛋白質（類）に影響し得る。
【０１１７】 ＫＤ１、ＫＤ３、ＧＺ１またはＧＺ３あるいはいずらかの他の複製−コンピテ
ントＡｄベクターは、照射と組み合わせて用いると、癌を持つ患者に臨床的利益
を与えるにおいて、ベクター単独または照射単独よりも効果的であろうと考えら
れる。該ベクターは、与えられた量の照射でのより大きな腫瘍破壊を可能とする
はずである。もう１つの方法を述べると、照射は与えられた量のベクターでのよ
り大きな腫瘍破壊を引き起こすはずである。また、これらのベクターは、放射線
照射腫瘍学者が、より少量の照射を用いて同一量の腫瘍破壊を達成するのを可能
とする。より少量の照射は照射の副作用を低下させるであろう。
【０１１８】 また、照射と組み合わせて用いると、ベクターのカクテルはカクテル単独また
は照射単独よりも効果的であろう。該カクテルは、ＡＤＰ生産ベクター＋抗癌治
療蛋白質を発現する１以上の複製欠陥ベクターよりなることができる（実施例５
参照）。
【０１１９】 実施例９ 本実施例はアデノウイルス死滅蛋白質の構造−機能分析を説明する。
【０１２０】 ＡＤＰは内部核膜（ＮＭ）に局所化される１１．６ｋＤａのＮ結合Ｏ結合一体
化膜糖蛋白質である（Ｓｃａｒｉａら，Ｖｉｒｏｌｏｇｙ １９１：７４３−７
５３）。図１８に示すごとく、Ａｄ２−コードＡＤＰ（配列番号：６）は１０１
アミノ酸よりなり；ａａ１−４０（配列番号：１７）はルーメンであり、ａａ４
１−５９（配列番号：１８）は膜貫通シグナルアンカー（ＳＡ）ドメインを構成
し、ａａ６３−７０（配列番号：１９）は核質（ＮＰ）ドメイン内の塩基性プロ
リン（ＢＰ）ドメインを構成し、これはａａ６１−１０１（配列番号：２０）を
構成する。ＡＤＰ中のいずれのドメインが細胞死滅を促進するのに必要かを決定
するために、ＡＤＰ遺伝子の種々の一部を欠く多数のｒｅｃ７００の欠失突然変
異体を調製し、ＮＭに局所化され、死滅を促進するＡＤＰの能力につき調べた。
ｒｅｃ７００ウイルスはＡｄ５−Ａｄ−Ａｄ５組換え体であり、これは他の文献
に記載されている（Ｗｏｌｄら，Ｖｉｒｏｌｏｇｙ １４８：１６８−１８０，
１９８６）。
【０１２１】 ｒｅｃ７００および各欠失突然変異体中のＡＤＰの構造は図１８に模式的に示
す。各欠失突然変異体におけるＡＤＰ遺伝子が、ＰＣＲ方法を用いて配列決定し
て、突然変異が正しいことを保証した。欠失突然変異体におけるＡＤＰの構造お
よび活性は、Ａ５４９細胞を感染させ、続いて、ＡＤＰ突然変異体蛋白質の免疫
ブロット分析によってテストし、ならびに細胞を溶解する能力をテストした。全
ての欠失突然変異体はｐｍ７３４．１を除いて安定なＡＤＰ蛋白質を発現した（
Δ１−４８、すなわち、ａａ１−４８は欠失されている）。Ｓｅｒに突然変異さ
れたＡｓｎ１４を有するｐｍ７３４．７（Ｎ１４）ＡＤＰはＯ−グリコシル化さ
れているがＮ−グリコシル化されていない。何故ならば、Ａｓｎ１４は唯一のＮ
−グリコシル化部位であるからである（データは示さず）。ｄｌ７３５（Δ４−
１１）ＡＤＰはＮ−グリコシル化されているがＯ−グリコシル化されていない。
何故ならば、Ｏ−グリコシル化についての部位は欠失されているからである（デ
ータは示さず）。Ｓｅｒに突然変異されたＳＡドメイン中にＭｅｔ５６を有する
ｐｍ７３４．４（Ｍ５６）ＡＤＰは、専らＮ結合高マンノースオリゴ糖を含有す
る（データは示さず）；Ｍｅｔ５６突然変異は小胞体（ＥＲ）からのＡＤＰの脱
出を排除するのでこれが起こる。シグナルアンカードメインにおいてａａ４６−
６０を欠くｄｌ７３８ＡＤＰは細胞質において不溶性凝集体を形成し；従って、
ａａ４１−５９は、事実、シグナルアンカードメインを含む。ＳＡドメインのＮ
−末端にあるＭｅｔ４１で開始するｐｍ７３４（Δ１−４０）ＡＤＰは、蛋白質
分解プロセッシングによって生じたより低い群のバンドと共に移動した（データ
は示さず）。これは、蛋白質分解部位がＭｅｔ４１近くで起こることを示す。こ
れに合致して、蛋白質分解生成物はｄｌ７３７（Δ２９−４５）で観察されなか
った（データは示さず）。また、生成物のサイズはａａ４１−１０１内に欠失を
持つ全ての突然変異体（ｄｌ７１５．１、ｄｌ７１５、ｄｌ７１４、ｄｌ７１６
）において減少した（データは示さず）。
【０１２２】 細胞死滅を促進するこれらの突然変異体の能力は、トリパンブルー排除、プラ
ーク発生、および乳酸デヒドロゲナーゼ放出アッセイによってモニターした（Ｔ
ｏｌｌｅｆｓｏｎら，Ｊ．Ｖｉｒｏｌ．７０：２２９６−２３０６，１９９６）
。図１５Ａにおけるトリパンブルーの結果は、ＡＤＰの死滅促進機能がａａ１−
４０（ｐｍ７３４）、ａａ１１−２６（ｄｌ７３６．１）、ａａ１８−２２（ｄ
ｌ７３５．１）、またはａａ４−１１（ｄｌ７３５）の欠失によってなくなるこ
とを示す。Ａｓｎ１４におけるＮ−グリコシル化部位の突然変異（ｐｍ７３４．
７）は死滅促進活性をｒｅｃ７００（ＷＴ）の約５０％まで低下させた。ｄｌ７
３７（Δ２９−４５）は細胞死滅を促進するにおいてｒｅｃ７００として効果的
であった；これは、蛋白質分解プロセッシング産物が細胞死滅を促進するのに必
要でなくてもよいことを示す。何故ならば、それらはｄｌ７３７で形成されない
からである。ｄｌ７３８（Δ４６−６０）およびｐｍ７３４．４（Ｍ５６）は完
全に欠失しているので、ＳＡドメインは死滅に必須である（図１９）。ｄｌ７１
５．１はほとんど完全に欠陥であり、これはＢＰドメインが極端に重要であるこ
とを示す。驚くべきことに、ａａ７１−９４（ｄｌ７１４）、７６−８９（ｄｌ
７１５）、および７９−１０１（ｄｌ７１６）は、ＡＤＰの死滅促進活性に影響
することなく欠失できた（図１９）。他方、ａａ８１−８８の欠失（ｄｌ７１７
）はＡＤＰの活性をほとんど完全に無くした（図１９）；これは、恐らくは、Ａ
ＤＰの異常ソーティングの結果である（後記参照）。同様の結果が、細胞死滅を
促進するこれらのＡＤＰ突然変異体の能力を標準的なプラーク発生、ＬＤＨ−放
出およびＭＴＴアッセイで調べた場合に得られた。
【０１２３】 ＡＤＰの細胞内局所化に対するこれらの突然変異の効果は極端に興味深い。感
染後３３時間において免疫蛍光（ＩＦ）によって調べると（データは示さず）、
ｒｅｃ７００（ＷＴ）からのＡＤＰはＮＰに明瞭に局所化された；また、ゴルジ
体への局所化も明らかであった。ｄｌ７１４（Δ７１−９４）およびｄｌ７１５
（Δ７６−８９）では、ＡＤＰは全ての膜、すなわち、ＥＲ、ゴルジ体、原形質
膜およびＮＭに局所化された。これは感染後４５時間においてさえ、より明らか
であった（データは示さず）。かくして、ａａ７１−９４は、ＡＤＰを特異的に
ＮＭに向けるシグナルを含むようである。ＡＤＰはトランス−ゴルジ体ネットワ
ーク（ＴＧＮ）からＮＭに集められるようであり、従って、ＡＤＰにおけるこの
推定シグナルは、恐らくは、このソーティング経路で機能する。ｄｌ７１７（Δ
８１−８８）からのＡＤＰは興味深い；それはＮＭおよびゴルジ体に局所化され
るが、多くの細胞では、「ドット」および円状構造が観察された。再度、これら
の構造が支配的な特徴である場合、これは感染後４５時間においてより明らかで
あった。ｄｌ７１７−感染細胞は感染後４５時間において死滅し始めず、従って
、これらの構造は細胞の残物ではない。興味深い可能性は、これらの構造物は、
ＴＧＮから出されたが、ＮＭに標的化しおよび／またはそれと融合するのに欠陥
がある膜小胞であるということである。
【０１２４】 ｄｌ７３８（ＳＡドメインにおいてΔ４６−６０）では、ＡＤＰは細胞質に凝
集した。これは、再度、ａａ４６−６０がＳＡ配列を含むことを示す。ｐｍ７３
４．４（Ｍ５６）では、ＡＤＰは主としてＮＭに局所化した。前記したごとく、
ｐｍ７３４．４ＡＤＰは専ら高マンノースＮ結合オリゴ糖を有し、これは、それ
が決してＥＲを去らないことを示す。恐らく、ｐｍ７３４．４ＡＤＰのＣ−末端
領域における推定ＮＭ−局所化シグナルが、（外側および内側ＮＭと連続する）
ＥＲからの横方向拡散によってＡＤＰをＮＭに標的化する。
【０１２５】 ｄｌ７３７（Δ２９−４５）では、ＡＤＰはＮＭに局所化した。ｐｍ７３４（
Δ１−４０）、ｐｍ７３４．７（Ｎ１４）（Ｎ結合グリコシル化は起こり得ない
）、およびｄｌ７３５（Δ４−１１；Ｏ−グリコシル化部位は欠失されている）
からのＡＤＰはＮＭよりもかなりより支配的にゴルジ体に局所化した。（ｄｌ７
３５．１（Δ１８−２２）およびｄｌ７３６．１（Δ１１−２６）からのＡＤＰ
もまた、ＮＭよりもゴルジ体にかなり強力に局所化した。かくして、残基１−２
６および／またはグリコシル化は、ゴルジ体／ＴＧＮからＮＭへのＡＤＰの効果
的な輸送に必要なようである。
【０１２６】 まとめると、ａａ４１−５９はＳＡドメインを含み、該ＳＡドメイン中のＭｅ
ｔ５６はＥＲから出るのに必要であり、ａａ１−２６はゴルジ体から効果的に出
るのに必要であり、およびａａ７６−９４はＡＤＰを特異的にＮＭに標的化する
のに必要である。細胞死滅を促進するに関しては、必須の領域はａａ１−２６、
ＳＡドメイン（ＡＤＰは膜に侵入しない）、ＳＡドメイン中のＭｅｔ５６、およ
びＢＰドメイン（ａａ６３−７０）である。ｐｍ７３４（Δ１−４０），ｄｌ７
３５（Δ４−１１）、ｄｌ７３５．１（Δ１８−２２）、ｄｌ７３６．１（Δ１
１−２６）およびｐｍ７３４．７（Ｎ１４）の欠陥死滅促進表現型が、死滅を促
進する配列（またはオリゴ糖）の欠如のためであるか否か、あるいはＡＤＰがゴ
ルジ体からＮＭへかなり遅く出ることによるか否かは明瞭でない。ｄｌ７１４（
Δ７１−９４）およびｄｌ７１５（Δ７６−８９）は、それらがＮＭへ特異的に
局所化するにおいて欠陥があるにもかかわらず、死滅を促進するための野生型表
現型を発現する；これは、恐らくは、十分なＡＤＰがＮＭに依然として侵入して
死滅を促進するからである。ｄｌ７１７（Δ８１−８８）中の欠失はｄｌ７１５
（Δ７６−８９）およびｄｌ７１４（Δ７１−９４）における欠失内にあるが、
ｄｌ７１７ＡＤＰは、死滅を促進するにおいて、ｒｅｃ７００（ＷＴ）、ｄｌ７
１５およびｄｌ７１４の約１５％効果的であるに過ぎない。これは、ｄｌ７１７
ＡＤＰがＮＭに対して局所化されるよりもむしろ小胞に止まる傾向があるからで
あろう。考え合わすと、これらのデータは、細胞死滅を促進するためにはＡＤＰ
はＮＭに局所化されなければならないことを示す。
【０１２７】 実施例１０ 本実施例は、実施例６に記載された組織特異的Ａｄベクターをさらに特徴づけ
る。そこで議論したごとく、Ａｄ Ｅ４プロモーターは欠失され、これらのベク
ターにおいて界面活性剤蛋白質Ｂ（ＳＰＢ）に代えて該プロモーターで置き換え
られる（図２４）。
【０１２８】 材料および方法 本実施例においては、やはり、実施例６に記載された細胞、ベクターおよび方
法を用いた。実施例６で用いたヒト癌細胞系Ａ５４９（ヒト肺癌腫）、Ｈｅｐ
３Ｂ（ヒト肝細胞癌腫）、およびＨ４４１（乳頭状肺腺癌）に加えて、（Ｍｉｃ
ｒｏｂｉｘ（Ｔｏｒｏｎｔｏ，ＯＮ）から得られた）ＨＥＫ２９３細胞およびＶ
Ｋ１０−９細胞を用いた。ＶＫ１０−９細胞は、Ｅ１に加えて、Ｅ４およびｐＩ
Ｘを含有しそれを発現する２９３細胞である。これらの細胞を２９３−Ｅ４細胞
と言う。
【０１２９】 Ｈｅｐ３ＢおよびＨ４４１細胞の位相差顕微鏡を使用する実験は以下のごとく
行った。Ｈｅｐ３ＢまたはＨ４４１細胞の単層を、５ｍｌのＤＭＥＭ（１０％Ｆ
ＢＳ）を含む６０ｍｍ皿中で増殖させ、細胞当たり１０プラーク形成単位（ＰＦ
Ｕ）の感染多重度にてＫＤ１またはＫＤ１−ＳＰＢでモック感染または感染させ
た。単層の位相差写真は感染後４および７日において取った。
【０１３０】 Ｈ４４１またはＨｅｐ３Ｂ細胞のウエスタンブロットを使用する実験は以下の
ごとく行った。（６０ｍｍ皿中の）Ｈ４４１またはＨｅｐ３Ｂ細胞を１０ＰＦＵ
／細胞のＫＤ１またはＫＤ１−ＳＰＢで感染させた。感染後２４時間において、
細胞をＰＢＳで３回洗浄し、掻き取ることによって収穫した。ＲＩＰＡ緩衝液に
よって細胞を溶解させた。ＢＩＯ−ＲＡＤ ＤＣ Ｐｒｏｔｅｉｎ Ａｓｓａｙ
Ｋｉｔ（ＢＩＯ−ＲＡＤ Ｌａｂｏｒａｔｏｒｉｅｓ，Ｈｅｒｃｕｌｅｓ，Ｃ
Ａ）によって蛋白質濃度を測定し、１０μｇの各試料を１５％ドデシル硫酸ナト
リウムポリアクリルアミドゲル（ＳＤＳ−ＰＡＧＥ）上で電気泳動に付した。ゲ
ルをＰＶＤＦ膜（Ｉｍｍｏｂｉｌｏｎ，Ｍｉｌｌｉｐｏｒｅ，Ｂｅｄｆｏｒｄ，
ＭＡ）上で電気ブロットした。１０％乾燥乳（Ｃａｒｎａｔｉｏｎ）を含有する
ＴＢＳＴ（５０ｍＭトリス−Ｃｌ、ｐＨ７．６、１５０ｍＭ ＮａＣｌ、０．２
％Ｔｗｅｅｎ２０）中で膜を４℃にて一晩ブロックした。ブロッキングの後、膜
を、Ｅ４ＯＲＦ３（Ｇａｒｙ Ｋｅｔｎｅｒの贈物）またはＡＤＰ（Ｔｏｌｌｅ
ｆｓｏｎら，Ｊ．Ｖｉｒｏｌ．６６：３６３３−３６４２，１９９２）に対する
ウサギ・ポリクローナル抗血清と共に、またはＭ７３、Ｅ１Ａに対するモノクロ
ーナル抗体（Ｈａｒｌｏｗら，Ｊ．Ｖｉｒｏｌ．５５：５３３−５４６，１９８
５）と共にインキュベートした。二次抗体はヤギ抗ウサギＩｇＧ−ＨＲＰまたは
ヤギ抗マウスＩｇＧ−ＨＲＰであった。ＥＬＣプロトコル（Ａｍｅｒｓｈａｍ
Ｐｈａｒｍａｃｉａ，Ａｒｌｉｎｇｔｏｎ Ｈｅｉｇｈｔｓ，ＩＬ）を用いてブ
ロットを発生させた。
【０１３１】 細胞溶解のために乳酸デヒドロゲナーゼ放出アッセイ（Ｔｏｌｌｅｆｓｏｎら
，Ｊ．Ｖｉｒｏｌ．７０：２２９６−２３０６）を使用する実験は以下のごとく
行った。Ｈ４４１細胞（３５ｍｍ皿当たり７．７×１０５細胞）およびＨｅｐ
３Ｂ細胞（３５ｍｍ皿当たり９．０×１０５細胞）を１ｍｌの無血清ＤＭＥＭ中
で２０ＰＦＵ／細胞にて感染させた。１時間の吸着時間の後、３ｍｌのＤＭＥＭ
（１０％ＦＢＳ）を添加した（７．５％の最終ＦＢＳ濃度）。細胞を３７℃にて
６％ＣＯ２でインキュベートした。日間隔で、上清を集め、ミクロ遠心に付して
浮遊細胞を除去し、無細胞上清をアッセイするまで−７０℃で凍結した。Ｃｙｔ
ｏ Ｔｏｘ９６キット（Ｐｒｏｍｅｇａ，Ｍａｄｉｓｏｎ，ＷＩ）に含まれた１
０×溶解緩衝液の添加によって、全溶解試料を調製した。全ての試料を収集した
後、ＬＤＨアッセイキットＣｙｔｏ Ｔｏｘ９６を用いて２０μｌの試料を三連
にてアッセイし、４９０ｎｍにおいてＥＬ３６０マイクロプレートリーダー（Ｂ
ｉｏＴｅｃＴＭ Ｉｎｓｔｒｕｍｅｎｔｓ，Ｉｎｃ．）で読み取った。
【０１３２】 Ｈ４４１およびＨｅｐ ３Ｂ細胞の免疫蛍光評価を使用する実験は以下のごと
く行った。Ｈ４４１およびＨｅｐ ３Ｂ細胞を３５ｍｍ皿中のＣｏｒｎｉｎｇ＃
１カバーグラス上で平板培養した。Ｈ４４１（１．５×１０６細胞／ｍｍ皿）お
よびＨｅｐ ３Ｂ（９．０×１０５細胞／ｍｍ皿）を、１ｍｌの無血清ＤＭＥＭ
中の２０ＰＦＵ／細胞の示されたウイルスで感染させた。１時間後、１ｍｌのＤ
ＭＥＭ／２０％ＦＢＳを添加した（１０％ＦＢＳの最終濃度）。示された時間（
感染後４８時間または６日）において、細胞をＰＢＳ中の３．７％パラホルムア
ルデヒドで１０分間固定し、次いで、メタノール（−２０℃）中で６分間浸透さ
せ、ＰＢＳ中で再水和させた。カバーグラスを、Ａｄ Ｅ２Ａ−コーデッドＤＮ
Ａ結合蛋白質（ＤＢＰ）（１：４００希釈；Ｍａｕｒｉｃｅ Ｇｒｅｅｎの贈物
）に対するウサギ抗ペプチド抗血清および繊維（１：４００希釈；Ｊｅｆｆ Ｅ
ｎｇｌｅｒの贈物）に対するマウスモノクローナル抗体で染色し、あるいはＥ４
ＯＲＦ３（１：２５０希釈；Ｇａｒｙ Ｋｅｔｎｅｒの贈物）に対するウサギ抗
血清で染色した。二次抗体（Ｃａｐｐｅｌ／ＩＣＮ）は１：５０希釈で用いた。
全ての抗体は、１％ＢＳＡおよび０．１％アジ化ナトリウムを含有するＰＢＳ中
で希釈した。１００×ＰｌａｎａｐｏレンズおよびＴｍａｘ４００フィルム（Ｋ
ｏｄａｋ）を用いて、Ｎｉｋｏｎエピ蛍光顕微鏡で写真を取った。Ｄｉａｆｉｎ
ｅ現像液でフィルムを現像した。
【０１３３】 サザーンハイブリダイゼーションによるウイルスＤＮＡ複製の分析は以下のご
とく行った。１０％ＦＢＳを補足したＤＭＥＭにて６０ｍｍ皿中で、Ｈ４４１お
よびＨｅｐ３Ｂ細胞を増殖させた。細胞を１０ＰＦＵ／細胞のＫＤ１またはＫＤ
１−ＳＰＢで７０％密集において感染させた。皿を３７℃の湿潤化５％ＣＯ２雰
囲気中でインキュベートした。全ゲノムＤＮＡを感染後５、２４、４８、７２お
よび９６時間に単離した。等量の全ゲノムＤＮＡをＨｉｎｄＩＩＩで消化し、膜
への移動に先立って１％アガロースゲルで分解した。ランダムプライマー３２Ｐ
−標識ｐＢＨＧ１０プラスミドプローブ（Ｂｅｔｔら，Ｐｒｏｃ．Ｎａｔｌ．Ａ
ｃａｄ．Ｓｃｉ．ＵＳＡ ９１：８８０２−８８０６，１９９４）をハイブリダ
イゼーションのために用い、ブロットをオートラジオグラフィーに付した。ＤＮ
Ａ断片をＭｏｌｅｃｕｌａｒ Ｄｙｎａｍｉｃｓ ＰｈｏｓｐｈｏｒＩｍａｇｅ
ｒで定量した。
【０１３４】 ウイルスの収率は以下のごとく測定した。３５ｍｍ皿にて単層として増殖させ
たＨｅｐ ３Ｂ細胞またはＨ４４１細胞を１０ＰＦＵ／細胞のＫＤ１またはＫＤ
１−ＳＰＢで感染させた。感染後０ないし４日（Ｈ４４１につき）または０ない
し９日（Ｈｅｐ ３Ｂにつき）において、細胞および培養培地を−７０℃で凍結
させた。試料を３回凍結させ解凍させて細胞からウイルスを放出させ、全ウイル
ス収率はＡ５４９単層でのプラークアッセイによって測定した。
【０１３５】 Ｈ４４１およびＨｅｐ ３Ｂ腫瘍に対するＫＤ１−ＳＰＢおよびＫＤ１の効果
は、ヌードマウスモデル（Ｄｏｒｏｎｉｎら，Ｊ．Ｖｉｒｏｌ．７４：６１４７
−６１５５，２０００）で調べた。腫瘍細胞（Ｈ４４１細胞では２００μｌのＢ
ＭＥＭ、５０％Ｍａｔｒｉｇｅｌ［Ｂｅｃｔｏｎ Ｄｉｃｋｉｎｓｏｎ Ｌａｂ
ｗａｒｅ，Ｂｅｄｆｏｒｄ，ＭＡ］中の１０７細胞、またはＨｅｐ ３Ｂ細胞で
は２００μｌのＤＭＥＭ＋１０％Ｍａｔｒｉｇｅｌ中の１０７細胞）を５〜６週
齢無胸腺ヌードマウスの側腹部に注入し、約１００μｌ（Ｈ４４１）または１５
０μｌ（Ｈｅｐ ３Ｂ）容量まで３週間増殖させた。予め確立された腫瘍（ｎ＝
１０）に、５０μｌのＤＭＥＭまたはＤＭＥＭ中の５×１０７ＰＦＵの示された
ウイルスを注入した。ウイルスの注入は、腫瘍当たり３．０×１０８ＰＦＵの合
計用量になるまで３週間の間毎週２回反復した。腫瘍のサイズの測定は、Ｓｙｌ
ｖａｃデジタルカリパーを用い、Ｈ４４１細胞では一週間当たり２回、またはＨ
ｅｐ ３Ｂ細胞では毎週行った。腫瘍の用量は式：長さ×幅２／２に従って計算
した。データは初期注入における腫瘍サイズに対する腫瘍サイズの増加の平均と
して表す。
【０１３６】 結果 種々の細胞型におけるＫＤ１−ＳＰＢの特性をその「親」ＫＤ１のものと比較
した。図２５は、２９３−Ｅ４、２９３、およびＡ５４９細胞についてのこれら
のベクターのプラーク発生特性を示す。データは、アッセイの最後（すなわち、
新しいプラークが出現するのが止む時）に観察されたプラークの数のパーセンテ
ージとして、プラークアッセイのいずれかの日に観察されたプラークの数として
プロットする（Ｔｏｌｌｅｆｓｏｎら、Ｊ．Ｖｉｒｏｌ．７０：２２９６−２３
０６，１９６６）。このアッセイはプラークのサイズのインジケーターである。
ＫＤ１は２９３−Ｅ４および２９３細胞で等しくよくプラークを形成した（図２
５Ａ）。ＫＤ１−ＳＰＢでは、プラークは、２９３細胞と比較して２９３−Ｅ４
では約３ないし４日早く観察された（図２Ａ）。Ａ５４９細胞では、ＫＤ１は、
ＫＤ１−ＳＰＢよりも４ないし６日早くプラークを形成した（図２５Ｂ）。
【０１３７】 ＫＤ１−ＳＰＢ対ＫＤ１の特性をＨ４４１細胞、ＴＴＦ１転写因子を発現する
ことが知られており、ＳＰＢプロモーターがその中で活性であるヒト乳頭状肺腺
癌細胞系において詳細に特徴付けた（Ｙａｎら，Ｊ．Ｂｉｏｌ．Ｃｈｅｍ．２７
０：２４８５２−２４８５７，１９９５）。その中でＳＰＢプロモーターが活性
ではないはずであるＨｅｐ ３Ｂ細胞、ヒト肝細胞癌腫を陰性対照として用いた
。Ｈ４４１およびＨｅｐ ３Ｂ単層を１０ＰＦＵ／細胞のＫＤ１またはＫＤ１−
ＳＰＢで感染させ、感染後４および７日において写真を取った。モック感染Ｈｅ
ｐ ３Ｂ細胞は比較的均一な単層を形成したが、Ｈ４４１細胞はシンシチウムに
似た構造を形成する傾向がある（図２６Ａ、Ｂ）。予測されるごとく、ＫＤ１は
、感染後４および７日において双方の細胞系で細胞障害効果（ＣＰＥ）を生じた
（図２６Ａ、Ｂ）。また、予測されるごとく、ＫＤ１−ＳＢＰはＨ４４１細胞で
ＣＰＥを引き起こしたが、Ｈｅｐ ３Ｂ細胞では引き起こさなかった。Ａｄ−感
染細胞におけるＣＰＥは、通常、ウイルス増殖のインジケーターであるので、こ
れらの結果は、ＫＤ１−ＳＰＢがＨ４４１で増殖するが、Ｈｅｐ３Ｂ細胞では増
殖しないことを示唆する。
【０１３８】 ウイルスＤＮＡ複製を調べるために、Ｈ４４１およびＨｅｐ ３Ｂ細胞を１０
ＰＦＵ／細胞のＫＤ１またはＫＤ１−ＳＰＢで感染させ、次いで、ＤＮＡブロッ
トによってウイルスＤＮＡの蓄積を測定した。Ｈ４４１細胞では、ＫＤ１および
ＫＤ１−ＳＰＢのＤＮＡは、感染後４８−９６時間において、同様レベルで容易
に検出できた（図２７Ａ）。Ｈｅｐ ３Ｂ細胞では、ＫＤ１ ＤＮＡレベルはＨ
４４１細胞におけるものと同様であるが、ＫＤ１−ＳＰＢのＤＮＡはほとんど検
出されなかった。これは、ＤＮＡバンドのＰｈｏｓｐｈｏｒＩｍａｇｅｒ分析に
よって確認した（図２７Ｂ）。
【０１３９】 Ｈ４４１およびＨｅｐ ３Ｂ細胞におけるＫＤ１−ＳＰＢおよびＫＤ１の増殖
は単一工程増殖アッセイによって測定した。細胞を１０ＰＦＵ／細胞のベクター
で感染させ、次いで、全ベクター収率をプラークアッセイによって測定した。両
方のベクターの全収率はＨ４４１細胞で同様であり、２日後にプラトーに到達し
た（図２８Ａ）。ＫＤ１収率は感染後２ないし４日後にＨｅｐ ３Ｂ細胞でプラ
トーに達した（図２８Ｂ）。しかしながら、ＫＤ１−ＳＰＢレベルは、２ないし
４日後に、Ｈｅｐ ３Ｂ細胞において約５ｌｏｇ低く、９日までさえ、それらは
ＫＤ１のレベルを達成しなかった。本発明者らは、ＫＤ１−ＳＰＢは、Ｈ４４１
対Ｈｅｐ ３Ｂ細胞に対する有意な特異性をもって増殖すると結論する。さらに
、ＫＤ１−ＳＰＢはＨ４４１細胞でのＫＤ１と同程度によく増殖し、これは、そ
れ自体によるＥ４プロモーター欠失が有意にベクターを損なわず、Ｅ４プロモー
ターが複製−コンピテントベクターにおいて組織−特異的プロモーターによって
置き換えることができるのを示す。
【０１４０】 Ｈ４４１およびＨｅｐ ３Ｂ細胞におけるＫＤ１−ＳＰＢ対ＫＤ１の複製につ
いてさらなる詳細を得るために、ＫＤ１−ＳＰＢおよびＫＤ１による代表的なＡ
ｄ蛋白質の発現を調べた。Ｈ４４１またはＨｅｐ ３Ｂ細胞を１０ＰＦＵ／ｍｌ
のＫＤ１またはＫＤ１−ＳＰＢでモック感染または感染させ、次いで、感染後２
４時間において、蛋白質を抽出し、Ｅ１Ａ、Ｅ４ＯＲＦ３、およびＡＤＰ蛋白質
をイムノブロットによって調べた。Ｅ４ＯＲＦ３はＥ４転写単位によってコード
された６つの蛋白質のうちの１つである（Ｌｅｐｐａｒｄ，Ｊ．Ｇｅｎ．Ｖｉｒ
ｏｌ．７８：２１３１−２１３８，１９９７）。予測されるごとく、ＫＤ１−Ｓ
ＰＢはＨ４４１細胞においてＥ４ＯＲＦ３をよく発現したが、Ｈｅｐ ３Ｂ細胞
においては痕跡レベルにおけるに過ぎなかった（図２９）。ＫＤ１−ＳＰＢはＨ
ｅｐ ３Ｂ細胞においてＥ１Ａ蛋白質を発現した。Ｈｅｐ ３Ｂ細胞におけるＫ
Ｄ１−ＳＰＢによるＥ１Ａ蛋白質の合成が予測される。何故ならば、Ｅ１Ａ発現
はＥ４蛋白質を必要としないからである；それは、また、ＫＤ１−ＳＰＢでの感
染に対するブロックがＥ１Ａの下流であることを示す。ＫＤ１は双方の細胞系に
おいてＥ１Ａを発現したが、その量はＨｅｐ ３Ｂ細胞においてＫＤ１−ＳＰＢ
で得られたものよりも低かった（図２９）。ＫＤ１−ＳＰＢで観察された増大し
たＥ１Ａレベルは、感染の後期相に入るその貧弱な能力を反映し得る（考察参照
）。ＫＤ１−ＳＰＢはＨ４４１細胞におけるＫＤ１と同程度によくＡＤＰを発現
したが、それはＨｅｐ ３Ｂ細胞において検出可能なＡＤＰを作成しなかった。
ＡＤＰは主として後期蛋白質であり、従って、この結果は、Ｈｅｐ ３Ｂ細胞に
おけるＥ４蛋白質発現、ＤＮＡ複製およびＫＤ１−ＳＰＢの増殖の相対的欠如と
一致する。
【０１４１】 個々の細胞で起こる複製事象に対する洞察を得るために、Ｅ４ＯＲＦ３、Ｅ２
Ａ−ＤＢＰおよび繊維後期蛋白質の発現を免疫蛍光によって調べた。Ｈ４４１ま
たはＨｅｐ ３Ｂ細胞を２０ＰＦＵ／細胞で感染させた。感染後４８時間または
６日後に、細胞を固定し、免疫染色した。Ｅ４ＯＲＦ３は、ＫＤ１、ＫＤ１−Ｓ
ＰＢまたはｄｌ３０９では、感染後４８時間においてＨ４４１細胞の核で検出さ
れた（図３０Ａ）。（ｄｌ３０９は野生型Ｅ１Ａを有し、Ａｄ５レベルのＡＤＰ
を発現し、かつＥ３−ＲＩＤおよびＥ３−１４．７Ｋ遺伝子を欠くＡｄ５突然変
異体である）。Ｅ４ＯＲＦ３は、感染後６日においてさえ、ＫＤ１−ＳＰＢ（図
３０Ａ）で感染させたＨｅｐ ３Ｂ細胞のほとんど大部分で検出できなかった（
図３０Ｂ）。かくして、ＫＤ１−ＳＰＢはＨ４４１においてＥ４ＯＲＦ３をよく
発現するが、Ｈｅｐ ３Ｂ細胞においては発現しない。
【０１４２】 図３１Ａは、ＫＤ１またはＫＤ１−ＳＰＢでは、感染後４８時間において同一
のＨｅｐ ３Ｂ細胞でＤＢＰおよび繊維の二重標識免疫蛍光を示す。ＫＤ１では
、感染後４８時間においてＤＢＰに典型的な核における強力な斑点染色パターン
があった（図３１Ａ、頂部左側パネル）。これらの同一の細胞を通じて繊維の強
力な染色があった（図３１Ａ、頂部右側パネル）。細胞質および核の染色が予測
される。何故ならば、繊維は細胞質で合成され、次いで、ビリオンが組み立てら
れる核に移動するからである。感染後４８時間におけるＫＤ１−ＳＰＢでは、細
胞の約２５％がＤＢＰについての斑点染色を示し、進行した斑点パターンを持つ
１つの細胞（合計の７％）のみが繊維でも染色された（図３１Ａ、底部２つのパ
ネル）。感染後６日においてさえ、細胞の約３０％のみがＤＢＰにつき染色を示
し、約２０％のみが繊維につき示した（図３１Ｂ）。かくして、ＫＤ１−ＳＰＢ
で感染した顕著により少ないＨｅｐ ３Ｂ細胞が、ＫＤ１と比較して、ＤＢＰお
よび特に繊維を発現した。これらの結果は、ＫＤ１−ＳＰＢがＨ４４１細胞にお
いてＫＤ１と同程度よく複製することを示す。何故ならば、疑いなく、ＳＰＢプ
ロモーターはＨ４４１細胞で活性だからである（Ｙａｎら，Ｊ．Ｂｉｏｌ．Ｃｈ
ｅｍ．２７０：２４８５２−２４８５７，１９９５）。恐らくは、ＳＰＢプロモ
ーターはこれらの細胞において最小に活性である故に、ＫＤ１−ＳＰＢはＨｅｐ
３Ｂ細胞でほとんど複製しない。
【０１４３】 複製の最高点において、Ａｄ−感染細胞が溶解され、ウイルスは他の細胞に広
がる；このプロセスはＡＤＰによって大部分が媒介される（Ｔｏｌｌｅｆｓｏｎ
ら，Ｖｉｒｏｌｏｇｙ ２２０：１５２−１６２，１９９６；Ｔｏｌｌｅｆｓｏ
ｎら，Ｊ．Ｖｉｒｏｌ．７０：２２９６−２３０６，１９９６）。ベクター誘導
細胞溶解を調べるために、Ｈ４４１およびＨｅｐ ３Ｂ細胞を２０ＰＦＵ／細胞
のＫＤ１、ＫＤ１−ＳＰＢまたはｄｌ３０９でモック感染させるか、感染させ、
乳酸デヒドロゲナーゼの放出によって細胞溶解を測定した（Ｔｏｌｌｅｆｓｏｎ
ら，Ｊ．Ｖｉｒｏｌ．７０：２２９６−２３０６，１９９６）。全てのベクター
は、感染後２ないし３日においてはじまり、Ｈ４４１細胞を溶解させた（図３２
Ａ）。ＫＤ１およびｄｌ３０９もまた同一期間でＨｅｐ ３Ｂ細胞を溶解させた
；しかしながら、ＫＤ１−ＳＰＢは最小の細胞溶解を引き起こしたに過ぎなかっ
た（図９Ｂ）。かくして、実施例６および図１３における細胞広がりデータと共
にこれらのデータは、ＫＤ１−ＳＰＢが、Ｈ４４１において細胞を溶解させ、細
胞間に効果的に広がるが、Ｈｅｐ ３Ｂ細胞ではそうならないことを示す。
【０１４４】 ヌードマウスにおいてＫＤ１−ＳＰＢまたはＫＤ１がＨ４４１腫瘍を抑制する
か否かを決定するために実験を行った。Ｈ４４１細胞を各後側腹部に注入した。
腫瘍が約１００μｌ（Ｈ４４１）または１５０μｌ（Ｈｅｐ ３Ｂ）まで増殖す
れば、それらに、ＤＭＥＭ（モック）または５０μｌのＤＭＥＭ中の５×１０７ ＰＦＵのテストウイルス（３．０×１０８合計ＰＦＵ）を３週間の間毎週２回注
入した。１０腫瘍（５匹）を各ウイルスで用いた。Ｈ４４１腫瘍の増殖はＫＤ１
−ＳＰＢおよびＫＤ１によって同様に抑制された（図３３Ａ）。ＫＤ１はＨｅｐ
３Ｂ腫瘍の増殖を抑制し、他方、ＫＤ１−ＳＰＢは最小抑制のみを引き起こし
た（図３３Ｂ）。これらの結果は、ＳＰＢプロモーターが活性である場合、ＫＤ
１−ＳＰＢが腫瘍を抑制するにおいてＫＤ１と同程度効果的であることを示す。
さらに、イン・ビトロにてＫＤ１−ＳＰＢで観察された細胞型特異性はイン・ビ
ボで維持される。
【０１４５】 考察 腫瘍の特異性は、癌遺伝子療法が直面する最大の攻撃の１つであり、すなわち
、治療遺伝子を有することは癌細胞において特異的に発現される。特異性はＲＣ
ウイルスで非常に重要である。理論的には、特異性：形質導入標的化および転写
標的化を付与する２つの主な戦略が記載されている。標的細胞上の特異的細胞表
面受容体にベクターの特異性を向けることが種々の方法を介して試みられてきた
。このアプローチは理論的には魅力的ではあるが、それは、作成蛋白質のビリオ
ンへの取り込みの欠如（Ｓｃａｒｉａら，Ｖｉｒｏｌｏｇｙ １９１：７４３−
７５３，１９９２）または標的化受容体を通じる感染性の欠如（Ｃｏｓｓｅｔら
，Ｊ．Ｖｉｒｏｌ．６９：６３１４−６３２２，１９９５）のごとき複数の障害
に遭遇し得る。転写標的化は腫瘍および組織特異的プロモーターを利用する。複
製−欠陥ベクターにおいて、これらの調節配列は細胞毒性遺伝子の発現を特異的
組織に制限する。複製−コンピテントベクターにおいて、調節の付加された層と
して、ベクターの複製それ自体を腫瘍または組織特異的プロモーター／エンハン
サー配列の制御下に置くことができる。複製−コンピテントＡｄにおいて、組織
または腫瘍特異的プロモーター／エンハンサーのＥ１Ａプロモーター／エンハン
サー領域への挿入が専ら用いられてきた（Ｈａｌｌｅｎｂｅｃｋら，Ｈｕｍ．Ｇ
ｅｎｅ Ｔｈｅｒ．１０：１７２１−１７３３，１９９９；Ｒｏｄｒｉｇｕｅｚ
ら，Ｃａｎｃｅｒ Ｒｅｓ．５７：２５５９−２４６３，１９９７；Ｙｕら，Ｃ
ａｎｃｅｒ Ｒｅｓ．５９，４２００−４２０３，１９９９，Ｙｕら，Ｃａｎｃ
ｅｒ Ｒｅｓ．５９：１４９８−１５０４，１９９９）。これらのベクターの背
後にある合理性はＥ１Ａの発現、従って、全Ａｄ転写プログラムがこれらの組織
または腫瘍特異的プロモーターに依存するであろうことである。しかしながら、
上位概念的アプローチとして、困難性があろう。Ｅ１Ａエンハンサー／プロモー
ターは非常に複雑である。エンハンサーはＥ１ＡプロモーターのみならずＥ４プ
ロモーターのごとき区別されるプロモーターも制御する（Ｓｈｅｎｋ，Ｔ．ｐｐ
．２１１１−２１４８ Ｉｎ Ｂ．Ｎ．Ｆｉｅｌｄｓ，Ｄ．Ｍ．Ｋｎｉｐｅ，お
よびＰ．Ｍ．Ｈｏｗｌｅｙ（編），Ｆｉｅｌｄｓ Ｖｉｒｏｌｏｇｙ，Ｌｉｐｐ
ｉｎｃｏｔｔ−Ｒａｖｅｎ，Ｐｈｉｌａｄｅｌｐｈｉａ，１９９６）。加えて、
逆転末端反復領域におけるＥ１Ａエンハンサーが細胞プロモーターの組織特異性
を変化させることが示されている（Ｓｈｉら，Ｈｕｍ．Ｇｅｎｅ Ｔｈｅｒ．８
：４０３−４１０，１９９７）。また、Ｅ１Ａエンハンサー／プロモーターは、
Ａｄゲノムをビリオンにパッケージするのに必要なシグナル内に部分的に埋もれ
ており、ウイルス生産を損なうことなく全てのＥ１Ａエンハンサーエレメントを
除去するのは問題であろう。従って、本発明者らは、Ｅ４プロモーターを組織特
異的プロモーターで置き換えることを選択した。Ｅ４遺伝子はＡｄ複製に必須で
あり、従って、本発明者らは、組換えウイルスの複製が組織特異的調節エレメン
トに依存するであろうと予測した。
【０１４６】 ＫＤ１−ＳＰＢを構築するために、約３００ｂｐのＥ４プロモーターを欠失し
、ＳＰＢプロモーターのＢ−５００バージョン（約５００ｂｐ）を挿入した（Ｙ
ａｎら，前掲）（図２４Ｃ、Ｄ）。本発明者らは、その厳格な組織特異性のため
ＳＰＢプロモーターを選択した：それは肺のタイプＩＩ肺胞細胞および気管支上
皮細胞で専ら活性である（Ｂｏｈｉｎｓｋｉら，１９９４，Ｍｏｌ．Ｃｅｌｌ．
Ｂｉｏｌ．１４：５６７１−５６８１，１９９４）。親ウイルスＫＤ１は、ウイ
ルス複製を腫瘍細胞に制限する２つのＥ１Ａ突然変異を含有しそれを発現する（
Ｄｏｒｏｎｉｎら，前掲）ので、本発明者らは、該ウイルスは肺腫瘍に由来する
細胞において選択的に複製するであろうと予測した。かくして、Ｈ４４１細胞、
乳頭状肺癌腫細胞系を用いて、ＫＤ１−ＳＰＢの複製、遺伝子発現、および機能
プロフィールを特徴付けた。
【０１４７】 ＫＤ１−ＳＰＢは、２９３細胞上よりも、Ｅ４蛋白質を発現する２９３−Ｅ４
細胞上で３ないし４日早くプラークを形成し、他方、ＫＤ１は双方の細胞系で同
一のキメティックスにてプラークを形成した。これらのデータは、Ｅ４プロモー
ターが、２９３細胞で活性であり、ＳＰＢプロモーターが２９３細胞において非
常に低い活性を呈することを示す。何故ＫＤ１−ＳＰＢが２９３細胞でプラーク
を形成するかは明らかでない；これらの細胞はヒト胚腎臓に由来し、ＳＰＢプロ
モーター（Ｂｏｈｉｎｓｋｉら，前掲）を調節する転写因子の少なくとも１つ、
肝細胞核因子３が胚腎臓で発現される。また、ＴＴＦ１、ＳＰＢ発現のマスター
調節因子は２９３細胞で最小に活性である可能性がある。
【０１４８】 ＫＤ１はＨ４４１およびＨｅｐ ３Ｂ細胞において等しく高い力価まで増殖し
た（図２８Ａ、Ｂ）。対照的に、ＫＤ１−ＳＰＢは、その中でＳＰＢプロモータ
ーが活性である（Ｙａｎら，前掲）（図２８Ａ）Ｈ４４１細胞においてＫＤ１と
同程度に効果的に複製するが、Ｈｅｐ ３Ｂ細胞においては貧弱にしか複製しな
い。これは、ＳＰＢプロモーターが不活性であるからであろう（図２８Ｂ）。こ
の選択性は、２つの細胞系においてウイルスＤＮＡ生産を測定することによって
確認されている。ＫＤ１−ＳＰＢ ＤＮＡ複製は、Ｈ４４１においてキネティッ
クス的にかつ定量的にＫＤ１ ＤＮＡ複製に似ているが、しかしながら、Ｈｅｐ
３Ｂ細胞においては、ＫＤ１−ＳＰＢ ＤＮＡはほとんど検出できなかった（
図２７Ａ，Ｂ）。細胞障害効果、Ａｄ複製の代理マーカーは同様の特異性を示し
た（図２６）。
【０１４９】 観察された組織特異性の分子的基礎についての我々の予測をさらに確認するた
めに、我々はウイルス蛋白質の発現をモニターした。細胞をＫＤ１−ＳＰＢで感
染させると、Ｅ１Ａを除いて全てのウイルス蛋白質（初期または後期）は組織特
異的に発現された（Ｈ４４１では高発現、Ｈｅｐ ３Ｂでは検出できない発現と
低い）（図２９−３１）。我々はＥ４プロモーター活性（Ｅ４ＯＲＦ３発現）お
よびＥ２Ａ−ＤＢＰ、ＡＤＰ、および繊維蛋白質の発現のレベルの間に良好な相
関を見い出した。かくして、ＳＰＢプロモーターはＡｄゲノムにおいてその組織
特異性を保持し、それは、テストした細胞系におけるＡｄ遺伝子発現の限定的因
子であるらしい。予測されるごとく、Ｅ１Ａの発現は組織特異的ではない。かく
して、組織−特異的Ａｄ ＤＮＡ複製の調節工程はＥ１Ａの下流にある。Ｈｅｐ
３Ｂ細胞において、ＫＤ１−ＳＰＢはＫＤ１よりも高レベルでＥ１Ａを発現し
（図２９）、これは、Ｈｅｐ３Ｂ細胞のほとんどにおけるＫＤ１−ＳＰＢ複製が
初期段階に止まっていることを強く示唆する。
【０１５０】 ＫＤ１−ＳＰＢの細胞溶解効果は組織−特異的プロフィール（図３２；実施例
６の図１３）、すなわち、Ｈｅｐ ３Ｂ細胞よりもＨ４４１細胞の優先的溶解、
ＤＮＡ複製のレベルで観察された特異性に類似のパターン（図２７）およびウイ
ルス蛋白質合成（図２９−３１）を示した。この細胞型特異性は、これらの細胞
がヌードマウスにおいて腫瘍として増殖しつつある場合にも観察された。Ｈ４４
１腫瘍の増殖は、同様の効率にて、ＫＤ１−ＳＰＢおよびＫＤ１によって抑制さ
れた（図３３Ａ）。対照的に、ＫＤ１とは異なってＫＤ１−ＳＰＢはＨｅｐ ３
Ｂ腫瘍の増殖に対して最小効果を有したに過ぎない（図３３Ｂ）。
【０１５１】 まとめると、Ｅ４プロモーターの組織特異的プロモーターとの置き換えは、Ａ
ｄベクターの高度に組織特異的な複製を可能とし、標的組織においては、それは
親ウイルスの複製と同程度に効果的である。ＫＤ１−ＳＰＢはＡＤＰを除いて全
てのＥ３遺伝子を欠く。Ｅ３ ｇｐ１９Ｋ、ＲＩＤおよび１４．７Ｋは、細胞特
性リンパ球ならびに腫瘍壊死因子およびＦａｓリガンドのごときアポトーシス−
誘導サイトカインによる攻撃からＡｄ−感染細胞を保護することが示されている
（Ｗｏｌｄら，ｐｐ．２００−２３２ Ｉｎ Ａ．Ｊ．Ｃａｎｎ（編）、ＤＮＡ
Ｖｉｒｕｓ Ｒｅｐｌｉｃａｔｉｏｎ：Ｆｒｏｎｔｉｅｒｓ ｉｎ Ｍｏｌｅ
ｃｕｌａｒ Ｂｉｏｌｏｇｙ，Ｏｘｆｏｒｄ Ｕｎｉｖｅｒｓｉｔｙ Ｐｒｅｓ
ｓ，Ｏｘｆｏｒｄ，２０００；Ｗｏｌｄら，Ｃｕｒｒ．Ｏｐｉｎ．Ｉｍｍｕｎｏ
ｌ．１１：３８０−３８６，１９９９）。
【０１５２】 ＫＤ１−ＳＰＢの治療指標（Ｈｅｐ ３Ｂ細胞と比較したＨ４４１細胞で生産
されたウイルス）は最初の４ないし５日間は１０４〜１０５である（図２８）。
これらのデータを、それらの前立腺特異的ウイルスについてのＣａｌｙｄｏｎに
よって報告されているデータ（１０４−１０５）（Ｒｏｄｒｉｇｕｅｚら，前掲
、Ｙｕら，Ｃａｎｃｅｒ Ｒｅｓ．５９，４２００−４２０３，１９９９；Ｙｕ
ら，Ｃａｎｃｅｒ Ｒｅｓ．５９：１４９８−１５０４，１９９９）と比較する
。我々は、ＫＤ１−ＳＰＢは、複製を癌細胞に制限するＥ１Ａの突然変異体形態
をコードする故に、他の研究所によって報告されたベクターよりもいくらか付加
された利点を有するということを示唆する（Ｄｏｒｏｎｉｎら，前掲）。
【０１５３】 肺は合衆国において男性および女性双方につき第２に高い癌部位としてランク
付けされているが（Ｒｅｉｓら，Ｃａｎｃｅｒ Ｒｅｓ．８８：２３９８−２４
２４，２０００）、肺癌は癌ベクター遺伝子治療の主な標的ではなかった。とい
うのは、ウイルスの腫瘍内注入は一般に肺では可能でないからである。しかしな
がら、複製−欠陥Ａｄベクターの肺腫瘍への腫瘍内注入の最近の報告があり、そ
のようなアプローチはＫＤ１−ＳＰＢで試みることができた。また、ＫＤ１−Ｓ
ＰＢを肺において全身投与することもできる。
【０１５４】 前記を考慮すれば、本発明のいくつかの利点が達成され、他の有利な結果が得
られることが理解されよう。
【０１５５】 本発明の精神を逸脱することなく種々の変形を前記方法および組成物でなすこ
とができ、前記記載に含まれ、添付の図面に示された全ての事項は例示的なもの
であって限定的な意味ではないと解釈されるべきである。
【０１５６】 特許および特許出願を含めた本明細書中で引用した全ての文献は、出典明示に
よって本明細書の一部と見なす。本明細書中における文献の考察は、単に、その
著者によってなされた主張をまとめる意図であり、いずれの文献も先行技術を構
成することを許容するものではない。出願人は、引用した文献の正確性および関
連性を攻撃する権利を保有する。
【配列表】
【図面の簡単な説明】
【図１】 図１はＡｄ５（図１Ａ）および本発明の好ましい具体例（図１Ｂ
）であるＫＤ３における遺伝子発現の模式図であり、ここに、各ゲノムは斑点を
つけた棒線によって表され、転写単位は棒線の上方および下方の矢印によって表
され、Ｅ３蛋白質は、Ｅ３転写単位、および示された後期ｍＲＮＡのＬ１ないし
Ｌ５ファミリーについての矢印の上方にリストされる。
【図２】 図２は、ＫＤ１、ＫＤ３、ＧＺ１およびＧＺ３によるＡＤＰの過
剰発現を説明し、示されたウイルスで感染させ、抗ＡＤＰ抗体でプローブされた
ヒトＡ５４９細胞から単離された蛋白質の免疫ブロットを示し、ＡＤＰは、異な
ってグリコシル化され、蛋白質分解的に処理されたＡＤＰの形態を示す。
【図３】 図３は、図面中および以後ｄｌ０１／０７というＥ１Ａ ｄｌ１
１０１／１１０７突然変異体が後期蛋白質の発現を遅らせることを説明し、野生
型Ｅ１Ａ領域を有し、および１２．５Ｋ蛋白質をコードする遺伝子を除いて全て
のＥ３遺伝子の欠失を有する、ｄｌ３２７の不存在下（図３Ａおよび３Ｂ）また
は存在下（図３Ｃおよび３Ｄ）で示されたウイルスで感染させたＡ５４９細胞に
おけるＥ１Ａ蛋白質および後期蛋白質の免疫ブロットを示す（図３Ｃおよび３Ｄ
）。Ｅ１Ａ蛋白質に特異的な抗血清を図３Ａおよび３Ｃで用いた。Ａｄ５ビリオ
ンに対して生起した抗血清を図３Ｂおよび３Ｄで用いた。
【図４】 図４はＡＤＰを少量しかまたは全く発現しない対照ウイルスより
も効果的にＫＤ１およびＫＤ３が細胞を殺すことを説明し、トリパンブルー排除
によって測定して、感染後示された日において生存した示されたウイルスで感染
させたＡ５４９細胞のパーセントのグラフを示す。
【図５】 図５は、ＡＤＰの過剰発現がウイルスの細胞間広がりを増強する
ことを説明する細胞広がりアッセイであり、生きた細胞を染色するが死滅した細
胞を染色しないクリスタルバイオレットで感染後７日において処理した示された
ＰＦＵ／細胞での示された細胞で感染させた単層を示す。
【図６】 図６は、増殖する細胞においてＫＤ１およびＫＤ３がよく複製す
るが、増殖阻止細胞においてはそうではないことを説明し、１００ＰＦＵ／ｍｌ
の以下のウイルス：ｄｌ３０９（図６Ａ）、ｄｌ０１／０７（図６Ｂ）、ＫＤ１
（図６Ｃ）およびＫＤ３（図６Ｄ）での感染に続いて種々の回数、増殖するまた
は増殖阻止ＨＥＬ−２２９細胞から抽出されたウイルス力価を示す。
【図７】 図７は初代ヒト気管支上皮細胞を殺すにおいてＫＤ１およびＫＤ
３が効果的であることを説明し、１０ＰＦＵ／ｍｌの示されたウイルスで３０％
密集において感染させ、ニュートラルレッドで感染後５日において染色したこれ
らの細胞単層を示す。
【図８】 図８は、ＫＤ１およびＫＤ３がヌードマウスにおいて増殖するヒ
トＡ５４９細胞腫瘍の増殖速度を低下させることを説明し、図８Ｂにおいては、
週間隔にて緩衝液または示されたウイルスの５×１０７ＰＦＵでの腫瘍の感染に
続く週の数に対してプロットした腫瘍サイズの平均倍増加のグラフを示し、図８
Ｂにおいては、５×１０８ＰＦＵのＫＤ３またはＧＺ３で一回注射した腫瘍の同
様のグラフを示す。
【図９】 図９は、ＫＤ１およびＫＤ３がヌードマウスで増殖するヒトＨｅ
ｐ ３Ｂ細胞腫瘍の増殖速度を低下させることを説明し、毎週２回の間隔での緩
衝液または示されたウイルス（ｄｌ３０９、ＫＤ１またはＫＤ３）の５×１０７ ＰＦＵでの腫瘍の注射に続く週の数に対してプロットした腫瘍サイズの平均倍増
加のグラフを示す。
【図１０】 図１０は、感染性中心アッセイを用い、β−ガラクトシダーゼ
を発現するＡｄ−β−ｇａｌ、複製−欠陥ベクターの複製および広がりをＫＤ１
およびＫＤ３が補充することを説明し、図１０Ａでは、Ａｄ−β−ｇａｌ単独ま
たは示されたウイルスで感染させたＡ５４９細胞を接種したＡ５４９細胞単層の
図を示し、図１０Ｂおよび１０Ｃでは、図１０Ａの単層の２つのクローズアップ
図を示す。
【図１１】 図１１は、腫瘍に示された組合せのウイルスが注入され、次い
で、感染後２週間において抽出し、ルシフェラーゼ活性につきアッセイするアッ
セイを用い、ヌードマウスで増殖するヒトＨｅｐ ３Ｂ細胞腫瘍においてＫＤ１
およびＫＤ３がルシフェラーゼの発現を増加させることを示す棒グラフである。
括弧に入れた数は、Ａｄｌｕｃベクター＋緩衝液のそれと比較したルシフェラー
ゼ活性の倍増加を示した。
【図１２】 図１２は、ＴＴＦ１転写因子を発現するように作成されたＡ５
４９細胞（Ａ５４９／ＴＴＦ１）および親５４９細胞に対するＫＤ１およびＫＤ
１−ＳＰＢについての標準的プラーク発生アッセイの結果を示すグラフであり、
ここに、データは、アッセイにおける特定の日に観察されたプラークの数をその
ウイルスで観察されたプラークの最終数で割り、１００を掛けたものとしてプロ
ットする。
【図１３】 図１３はＨ４４１およびＨｅｐ ３Ｂ細胞についてのＫＤ１お
よびＫＤ１−ＳＰＢについての細胞広がりアッセイであり、ここに、細胞はＫＤ
１またはＫＤ１−ＳＰＢの示された量で感染させ、Ｈ４４１およびＨｅｐ ３Ｂ
細胞は、各々、感染後５日においておよび感染後８日においてクリスタルバイオ
レットで染色した。
【図１４】 図１４は、ｂｌ３０９および本発明の２つの好ましい実施例、
ＧＺ１およびＧＺ３についての標準的プラーク発生アッセイの結果を示すグラフ
であり、ここに、データは、アッセイにおける特定の日に観察されたプラークの
数をそのウイルスで観察されたプラークの最終数で割り、１００を掛けたものと
してプロットする。
【図１５】 図１５は、ＫＤ１、ＫＤ３、ＧＺ１またはＧＺ３とＸ線照射の
組合せが、ウイルスベクター単独または照射単独よりもＡ５４９細胞単層を破壊
するにおいてより効果的であることを示す細胞広がりアッセイであり、ここに、
細胞は示された量の示されたウイルスで感染させ、６００センチグレイ（ｃＧｙ
）のｘ−照射で照射し（底部パネル）、またはモック照射し（頂部パネル）、次
いで感染後６日においてクリスタルバイオレットで染色した。
【図１６】 図１６は、１５０、３００または６００センチグレイの照射と
組み合わせて用いた１０−３ＰＦＵのＫＤ１、ＫＤ３、ＧＺ１またはＧＺ３が、
ウイルスベクター単独または照射単独よりもＡ５４９細胞単層を破壊するにおい
てより効果的であることを説明する細胞広がりアッセイのグラフである。細胞生
存率は、モック感染非照射ウェルを１００％生存率として用い、培養ウェルから
抽出したクリスタルバイオレットの量に基づく。
【図１７】 図１７は、ＫＤ３またはＧＺ３＋ｘ線照射の組み合わせが、Ｋ
Ｄ３単独またはＧＺ３単独よりもヌードマウスで増殖するＡ５４９細胞腫瘍の増
殖を低下させるにおいて効果的であることを説明する。
【図１８】 図１８はＡＤＰの構造−機能分析を説明し、図１８Ａにおいて
、種々の推定ドメインおよび標識されたグリコシル化部位を持つ、Ａｄ２によっ
てコードされたアデノウイルス死滅蛋白質のアミノ酸配列を示し、図１８Ｂにお
いて、ｒｅｃ７００および示された欠失突然変異体におけるＡＤＰ遺伝子の模式
図を示し、右欄は野生型表現型のパーセンテージとしての種々の突然変異体の死
滅促進表現型をまとめる。
【図１９】 図１９Ａおよび１９Ｂは示されたＡＤＰ突然変異体の細胞生存
率アッセイを説明し、感染後の時間（図１９Ａ）または日数（図１９Ｂ）に対し
てプロットしたトリパンブルー排除によって測定された生存率のグラフを示す。
【図２０】 図２０は、Ａｄ１、Ａｄ２、Ａｄ５およびＡｄ６（配列番号：
５−８）のＡＤＰ蛋白質についての、Ａｄ２ ＡＤＰ突然変異体ｄｌ７１６、ｄ
ｌ７１５、ｄｌ７１４およびｄｌ７３７（配列番号：９−１２）についての、お
よび推定ルーメンドメイン（配列番号：１７）、膜貫通ドメイン（配列番号：１
８）、サイトゾル塩基性−プロリンドメイン（配列番号：１９）、およびＡｄ２
のＡＤＰ蛋白質のサイトゾルドメインの残り（配列番号：２０）についての、単
一文字暗号で示したアミノ酸配列を示す。
【図２１】 図２１はＡｄ５のゲノムの完全なヌクレオチド配列を表す。
【図２２】 図２２はＫＤ１のゲノムの完全なヌクレオチド配列（配列番号
：１）を表す。
【図２３】 図２３はＫＤ３のゲノムの完全なヌクレオチド配列（配列番号
：２）を表す。
【図２４】 図２４は以下のベクターの模式図である：Ａ．Ａｄ５。斑点を
入れた棒線は３６ｋｂｐのＤＮＡゲノムを示す。塗り潰ぶしていない矢印は即時
型Ｅ１Ａ転写ユニットを示し、黒色矢印は遅延した初期Ｅ１Ｂ、Ｅ２、Ｅ３およ
びＥ４転写ユニットである。ハッチングを施した矢印は主な後期ｍＲＮＡの５つ
のファミリー、および主な後期転写ユニットの一部として合成されるＡＤＰ ｍ
ＲＮＡを示す。各主要後期ｍＲＮＡはその５’末端にスプライスされた三部リー
ダー（リーダー１、２および３）を有する。Ｂ．ｄｌ３０９。ｄｌ３０９はそれ
が欠失されたＥ３−ＲＩＤおよびＥ３−１４．７Ｋ遺伝子を有する以外はＡｄ５
と同一である。ｄｌ３０９はＡｄ５と同様なレベルでＡＤＰを発現する。Ｃ．Ｋ
Ｄ１。ＫＤ１は、Ｅ１Ａ蛋白質のｐＲＢまたはｐ３００／ＣＢＰへの結合をなく
するＥ１Ａ遺伝子中の２つの小さな欠失（「Ｘ」マークで示す）を有する。それ
はａｄｐ以外の全てのＥ３遺伝子を欠く。ＡＤＰは、Ａｄ５またはｄｌ３０９か
らのＡＤＰよりも感染において初期に、かつより豊富に発現される。Ｄｏｒｏｎ
ｉｎら，Ｊ．ｖｉｒｏｌ．７４：６１４７−６１５５。Ｄ．ＫＤ１−ＳＰＢ。Ｋ
Ｄ１−ＳＰＢは、それが界面活性剤蛋白質Ｂ（ＳＰＢ−Ｐ）に代えてプロモータ
ーによって置き換えられたＥ４プロモーターを有する以外はＫＤ１と同一である
。
【図２５】 図２５は、ＫＤ１−ＳＰＢがＨ４４１肺癌腫細胞においてＫＤ
１と同程度よく増殖するが、Ｈｅｐ ３Ｂ肝臓腫瘍細胞においてはＫＤ１よりも
かなり貧弱にしか増殖しないことを示すグラフを表す。ＫＤ１−ＳＰＢおよびＫ
Ｄ１のＣｓＣｌ−バンデッドストックは標準的な方法を用い（Ｔｏｌｌｅｆｓｏ
ｎら，Ｐ．１−９ Ｉｎ Ｗ．Ｓ．Ｍ．Ｗｏｌｄ（編）、Ａｄｅｎｏｖｉｒｕｓ
Ｍｅｔｈｏｄｓ およびＰｒｏｔｏｃｏｌｓ．Ｈｕｍａｎ Ｐｒｅｓｓ，Ｉｎ
ｃ．，Ｔｏｔｏｗａ，ＮＪ，１９９８）、２９３Ｅ４または２９３−細胞（Ａ）
につき、またはＡ５４９細胞（Ｂ）につき力価測定した。データは、アッセイの
最終日に観察されたプラークの数のパーセンテージとしてのプラークアッセイの
いずれかの日に観察されたプラークの数としてプロットする（Ｔｏｌｌｅｆｓｏ
ｎら，Ｖｉｒｏｌｏｇｙ ２２０：１５２−１６２，１９９６）。
【図２６】 図２６は、ＫＤ１−ＳＰＢがＨ４４１細胞においてＣＰＥを誘
導するが、Ｈｅｐ ３Ｂ細胞では誘導しないことを示す顕微鏡写真を表す。Ｈ４
４１およびＨｅｐ ３Ｂ単層をモック感染させ、または１０ＰＦＵ／細胞のＫＤ
１またはＫＤ１−ＳＰＢで感染させ、次いで、感染後４または７日において位相
差下で写真を取った。
【図２７】 図２７は、ＫＤ１−ＳＰＢ ＤＮＡがＨ４４１細胞では効果的
に合成されるが、Ｈｅｐ ３Ｂ細胞ではそうではないことを説明するサザーンハ
イブリダイゼーションおよびグラフを示す。Ｈ４４１またはＨｅｐ ３Ｂ細胞を
１０ＰＦＵ／細胞のＫＤ１またはＫＤ１−ＳＰＢで感染させた。全ゲノムＤＮＡ
を感染後０、５、２４、４８、７２および９６時間において単離し、ＨｉｎｄＩ
ＩＩで消化し、アガロースゲル電気泳動によって分解し、ブロットし、３２Ｐ−
標識Ａｄ ＤＮＡとハイブリダイズさせた。Ａ．オートラジオグラム。Ｂ．パネ
ルＡにおけるＤＮＡバンドのＰｈｏｓｐｈｏｒＩｍａｇｅｒ定量。
【図２８】 図２８は単一工程増殖曲線を示すグラフを表し、ＫＤ１−ＳＰ
ＢがＨ４４１でよく増殖するが、Ｈｅｐ ３Ｂ細胞では増殖しないことを示す。
細胞は１０ＰＦＵ／細胞のＫＤ１またはＫＤ１−ＳＰＢで感染させた。ベクター
は感染後示された日に抽出し、力価はプラークアッセイによって測定した。
【図２９】 図２９は、ＫＤ１−ＳＰＢがＨ４４１においてＥ４ＯＲＦ３お
よびＡＤＰを発現するが、Ｈｅｐ ３Ｂ細胞では発現しないことを示す免疫ブロ
ットを表す。細胞は１０ＰＦＵ／細胞のＫＤ１またはＫＤ１−ＳＰＢで感染させ
た。感染後２４時間において、蛋白質抽出物を、特異的抗血清を用いてＥ１Ａ、
Ｅ４ＯＲＦ３およびＡＤＰにつき分析した。Ｅ１Ａ蛋白質は複数バンドとして出
現する。ＡＤＰは２つのバンドとして出現する；上方バンドはグリコシル化され
ており、下方バンドは蛋白質分解により切断された種である（Ｓｃａｒｉａら，
Ｖｉｒｏｌｏｇｙ １９１：７４３−７５３，１９９２；Ｔｏｌｌｅｆｓｏｎら
，Ｊ．Ｖｉｒｏｌ．６６：３６３３−３６４２）。
【図３０】 図３０は、ＫＤ１−ＳＰＢがＨ４４１ではＥ４ＯＲＦ３を発現
するが、Ｈｅｐ ３Ｂ細胞では発現しないことを示す免疫蛍光顕微鏡写真を示す
。カバーグラス上で増殖する細胞を２０ＰＦＵ／細胞のＫＤ１、ＫＤ１−ＳＰＢ
またはｄｌ３０９（野生型）で感染させた。４８時間（パネルＡ）または６日（
パネルＢ）において、細胞を固定し、Ｅ４ＯＲＦ３に対するウサギ・ポリクロー
ナル抗ペプチド抗血清で染色した。写真は１００×Ｐｌａｎａｐｏレンズを用い
て取った。各パネルは約８つの核を示す。この図面は図３１に示した同一実験の
一部である。
【図３１】 図３１は、ＫＤ１−ＳＰＢがＨｅｐ ３Ｂ細胞においてＥ２−
ＤＢＰまたは繊維を効果的に発現しないことを示す免疫蛍光顕微鏡写真を表す。
Ｈｅｐ ３Ｂ細胞は２０ＰＦＵ／細胞のＫＤ１−ＳＰＢまたはＫＤ１で感染させ
た。感染後４８時間（Ａ）または６日（Ｂ）において、細胞を固定し、ＤＢＰに
対するウサギ・ポリクローナル抗血清および繊維に対するマウス・モノクローナ
ル抗体を用いて二重染色した。同一視野をＤＢＰおよび繊維につき示す。この図
面は図３０に示した同一実験の一部である。
【図３２】 図３２は、ＫＤ１−ＳＰＢがＫＤ１と同程度に効果的にＨ４４
１を溶解するが、Ｈｅｐ ３Ｂを溶解しないことを説明するグラフを表す。Ｈ４
４１またはＨｅｐ ３Ｂ細胞をモック感染し、あるいは２０ＰＦＵ／細胞のＫＤ
１またはＫＤ１−ＳＰＢで感染させた。細胞溶解は、細胞から培地への乳酸デヒ
ドロゲナーゼの放出によって測定した。
【図３３】 図３３はＫＤ１−ＳＰＢがＫＤ１と同程度よくヌードマウスに
おいてＨ４４１腫瘍の増殖を抑制することを説明するグラフを表す。腫瘍細胞は
ヌードマウスの側腹部に注射し、約１００μｌ（Ｈ４４１）または１５０μｌ（
Ｈｅｐ ３Ｂ）容量まで増殖させた。腫瘍（ｎ＝１０）はＤＭＥＭ（モック）を
、または５×１０７ＰＦＵのＫＤ１またはＫＤ１−ＳＰＢを注入した。ウイルス
の注射は、腫瘍当たり３．０×１０８ＰＦＵの合計用量まで３週間の間毎週２回
反復した。腫瘍を測定し、腫瘍サイズの平均倍増加を計算した。
───────────────────────────────────────────────────── フロントページの続き (51)Int.Cl.7 識別記号 ＦＩ テーマコート゛(参考） Ａ６１Ｐ 31/12 Ａ６１Ｐ 35/00 35/00 43/00 １１１ 43/00 １１１ １２１ １２１ Ｃ１２Ｎ 7/00 Ｃ１２Ｎ 5/10 15/00 ＺＮＡＡ // Ｃ１２Ｎ 7/00 5/00 Ｂ (81)指定国 ＥＰ(ＡＴ，ＢＥ，ＣＨ，ＣＹ， ＤＥ，ＤＫ，ＥＳ，ＦＩ，ＦＲ，ＧＢ，ＧＲ，ＩＥ，Ｉ Ｔ，ＬＵ，ＭＣ，ＮＬ，ＰＴ，ＳＥ)，ＯＡ(ＢＦ，ＢＪ ，ＣＦ，ＣＧ，ＣＩ，ＣＭ，ＧＡ，ＧＮ，ＧＷ，ＭＬ， ＭＲ，ＮＥ，ＳＮ，ＴＤ，ＴＧ)，ＡＰ(ＧＨ，ＧＭ，Ｋ Ｅ，ＬＳ，ＭＷ，ＭＺ，ＳＤ，ＳＬ，ＳＺ，ＴＺ，ＵＧ ，ＺＷ)，ＥＡ(ＡＭ，ＡＺ，ＢＹ，ＫＧ，ＫＺ，ＭＤ， ＲＵ，ＴＪ，ＴＭ)，ＡＥ，ＡＧ，ＡＬ，ＡＭ，ＡＴ， ＡＵ，ＡＺ，ＢＡ，ＢＢ，ＢＧ，ＢＲ，ＢＹ，ＣＡ，Ｃ Ｈ，ＣＮ，ＣＲ，ＣＵ，ＣＺ，ＤＥ，ＤＫ，ＤＭ，ＤＺ ，ＥＥ，ＥＳ，ＦＩ，ＧＢ，ＧＤ，ＧＥ，ＧＨ，ＧＭ， ＨＲ，ＨＵ，ＩＤ，ＩＬ，ＩＮ，ＩＳ，ＪＰ，ＫＥ，Ｋ Ｇ，ＫＰ，ＫＲ，ＫＺ，ＬＣ，ＬＫ，ＬＲ，ＬＳ，ＬＴ ，ＬＵ，ＬＶ，ＭＡ，ＭＤ，ＭＧ，ＭＫ，ＭＮ，ＭＷ， ＭＸ，ＮＯ，ＮＺ，ＰＬ，ＰＴ，ＲＯ，ＲＵ，ＳＤ，Ｓ Ｅ，ＳＧ，ＳＩ，ＳＫ，ＳＬ，ＴＪ，ＴＭ，ＴＲ，ＴＴ ，ＴＺ，ＵＡ，ＵＧ，ＵＳ，ＵＺ，ＶＮ，ＹＵ，ＺＡ， ＺＷ (72)発明者 トス・カロリー アメリカ合衆国 ミズーリ 63126 セン トルイス アンカレジ レーン 9514 (72)発明者 トレフソン・アン・イー アメリカ合衆国 ミズーリ 63123−4635 ファイロ アヴェニュー 9026 (72)発明者 ドローニン・コンスタンティン ロシア 117465 モスクワ テプリー ス タン ９ ビー７ アパートメント 201 Ｆターム(参考） 4B024 AA01 CA04 DA03 EA02 FA02 GA11 HA17 4B065 AA93X AA95Y AB01 CA24 CA44 4C084 AA02 AA07 AA27 MA01 NA01 NA14 ZB26 ZB33 4C086 AA01 AA02 AA03 EA16 MA10 NA01 NA14 ZB26 ZB33 ZC80 4C087 AA01 AA02 BC83 CA12 CA22 CA23 CA34 CA43 MA01 NA01 NA14 ZB26 ZB33 ZC80

Claims (32)

    【特許請求の範囲】
  1. 【請求項１】 新形成細胞において複製−コンピテントであって、アデノウ
    イルス死滅蛋白質を過剰発現する組換えベクター。
  2. 【請求項２】 該アデノウイルス死滅蛋白質が配列番号：５、配列番号：６
    、配列番号：７または配列番号：８のアミノ酸１−２６、４１−５９、および６
    ３−７０またはその共保存的に置換された変種を含むか、あるいは該アデノウイ
    ルス死滅蛋白質が配列番号：５、配列番号：６、配列番号：７または配列番号：
    ８を含む請求項１に記載の組換えベクター。
  3. 【請求項３】 組換えウイルスを含む請求項２に記載の発現ベクター。
  4. 【請求項４】 該組換えウイルスが、ｇｐ１９Ｋ；ＲＩＤα；ＲＩＤβおよ
    び１４．７Ｋよりなる群から選択される少なくとも１つのＥ３蛋白質の発現を欠
    くアデノウイルスである請求項３に記載の組換えベクター。
  5. 【請求項５】 配列番号：３または配列番号：４を含む請求項４に記載の組
    換えベクター。
  6. 【請求項６】 新形成細胞に対して複製が制限された請求項３に記載の組換
    えベクター。
  7. 【請求項７】 配列番号：１または配列番号：２を含む請求項６に記載の組
    換えベクター。
  8. 【請求項８】 該組換えアデノウイルスが、Ｅ４プロモーターに代えて置き
    換えられた組織特異的プロモーター、腫瘍特異的プロモーター、または誘導性プ
    ロモーターを含む請求項３に記載の組換えベクター。
  9. 【請求項９】 組織−特異的プロモーターが界面活性剤蛋白質Ｂプロモータ
    ーである請求項８に記載の組換えベクター。
  10. 【請求項１０】 配列番号：１４、配列番号：１５または配列番号：１６を
    含む請求項６に記載の組換えベクター。
  11. 【請求項１１】 該ベクターが、さらに、抗癌産物をコードする遺伝子を含
    む請求項１に記載の組換えベクター。
  12. 【請求項１２】 抗癌産物をコードする該遺伝子が当該ベクターのＥ３領域
    にある請求項１１に記載の組換えベクター。
  13. 【請求項１３】 新形成細胞を、新形成細胞において複製コンピテントであ
    って、アデノウイルス死滅蛋白質を過剰発現する少なくとも１つのベクターと接
    触させることを特徴とする新形成細胞の死滅を促進する方法。
  14. 【請求項１４】 該アデノウイルス死滅蛋白質が、配列番号：５、配列番号
    ：６、配列番号：７または配列番号：８のアミノ酸１−２６、４１−５９、およ
    び６３−７０またはその共保存的に置換された変種であるか、あるいは該アデノ
    ウイルス死滅プロモーターが配列番号：５、配列番号：６、配列番号：７、また
    は配列番号：８を含む請求項１３に記載の方法。
  15. 【請求項１５】 該ベクターがｇｐ１９Ｋ；ＲＩＤα；ＲＩＤβおよび１４
    ．７Ｋよりなる群から選択される少なくとも１つのＥ３蛋白質の発現を欠く組換
    えアデノウイルスを含む請求項１４に記載の方法。
  16. 【請求項１６】 該新形成細胞が患者における腫瘍を含む、該接触工程が該
    組換えアデノウイルスを該腫瘍に投与することを含む請求項１５に記載の方法。
  17. 【請求項１７】 さらに、組換えアデノウイルスに対して患者を受動的に免
    疫化する工程を含む請求項１６に記載の方法。
  18. 【請求項１８】 該組換えアデノウイルスが配列番号：３または配列番号：
    ４を含む請求項１７に記載の方法。
  19. 【請求項１９】 該ベクターが新形成細胞に対して複製が制限された請求項
    １５に記載の方法。
  20. 【請求項２０】 該ベクターが配列番号：１または配列番号：２を含む組換
    えアデノウイルスである請求項１９に記載の方法。
  21. 【請求項２１】 該組換えアデノウイルスが、Ｅ４プロモーターに代えて置
    き換えられた、組織特異的プロモーターまたは誘導性プロモーターを含む請求項
    １５に記載の方法。
  22. 【請求項２２】 該組織特異的プロモーターが界面活性剤蛋白質Ｂプロモー
    ターである請求項２１に記載の方法。
  23. 【請求項２３】 該組換えアデノウイルスが配列番号：１４、配列番号：１
    ５または配列番号：１６を含む請求項２２に記載の方法。
  24. 【請求項２４】 さらに、腫瘍を放射線照射で処理することを含む請求項１
    ６に記載の方法。
  25. 【請求項２５】 １を超える組換えアデノウイルスを該腫瘍に投与し、次い
    で、該腫瘍を放射線照射で治療することを含む請求項２４に記載の方法。
  26. 【請求項２６】 さらに、該腫瘍を化学療法で処理することを含む請求項１
    ６に記載の方法。
  27. 【請求項２７】 １を超える組換えアデノウイルスを該腫瘍に投与し、該腫
    瘍を化学療法で処理することを含む請求項２６に記載の方法。
  28. 【請求項２８】 さらに、抗癌遺伝子産物を発現する１以上の複製−欠陥ア
    デノウイルスを該腫瘍に投与することを含み、ここに、該組換えアデノウイルス
    が腫瘍における複製−欠陥アデノウイルスの広がりを補充する請求項１６に記載
    の方法。
  29. 【請求項２９】 新形成細胞において複製コンピテントであって、アデノウ
    イルス死滅蛋白質を過剰発現する第１の組換えウイルス；および 複製欠陥であって、抗癌遺伝子産物を発現する第２の組換えウイルスを含み、 ここに、該第１の組換えウイルスは該第２の組換えウイルスの複製を補うこと
    を特徴とする組成物。
  30. 【請求項３０】 該第１の組換えウイルスが、ｇｐ１９Ｋ；ＲＩＤα；ＲＩ
    Ｄβおよび１４．７Ｋよりなる群から選択される少なくとも１つのＥ３蛋白質の
    発現を欠く組換えアデノウイルスを含む請求項２９に記載の組成物。
  31. 【請求項３１】 該組換えアデノウイルスが、配列番号：１；配列番号：２
    ；配列番号：１４；配列番号：１５；配列番号：１６；配列番号：３；または配
    列番号：４よりなる群から選択されるヌクレオチド配列を含む請求項３０に記載
    の組成物。
  32. 【請求項３２】 新形成細胞において複製−欠陥であって、アデノウイルス
    死滅蛋白質を過剰発現する第１の組換えウイルス、および 新形成細胞において複製−コンピテントである第２の組換えウイルスを含む組
    成物。
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