CN110628703A - 一种放射性肺损伤体外细胞模型及其构建方法和应用 - Google Patents

一种放射性肺损伤体外细胞模型及其构建方法和应用 Download PDF

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Abstract

本发明涉及一种放射性肺损伤体外细胞模型及其构建方法和应用，所述放射性肺损伤体外细胞模型是由以下方法构建：采用6MV X射线10Gy单次照射A549细胞，剂量率为2Gy/min，并在照射后继续培养第12h‑24h内检测放射性肺损伤相关指标。本发明还包括所述放射性肺损伤体外细胞模型在制备治疗/预防放射性肺损伤的药物及其致病机制中的应用。其优点表现在：克服了现有技术存在的缺陷：造模周期过长(通常需6个月以上)，且受到实验动物个体影响较大，可重复性低，在细胞机制方面的研究性价比低等。本发明的构建方法为放射性肺损伤机制研究以及治疗药物的研发提供了重要的研究技术支持，具有很好的应用前景。

Description

一种放射性肺损伤体外细胞模型及其构建方法和应用
技术领域
本发明涉及细胞生物学技术与应用技术领域，具体地说，是一种放射性肺损伤体外细胞模型及其构建方法和应用。
背景技术
肺癌是目前世界范围内发病率和死亡率最高的恶性肿瘤之一，放射治疗在肺癌的治疗中具有重要的作用。然而，在临床常见的胸部肿瘤放射治疗中，肺作为辐射中度敏感器官，肿瘤附近的肺组织因受到放射剂量超过其生物效应的阈值而产生不同程度的损伤。放射性肺损伤是胸部肿瘤放射治疗后常见的并发症之一，临床分为放射性肺炎期(放疗3-6个月内)和放射性肺纤维化期(放疗6个月以上)。目前临床中，常使用一些更为精准的放射技术来避免过多正常组织受到照射，从而允许更高剂量的放射治疗得到更大获益。然而，放射性肺损伤依然时有发生，这不仅降低局部肿瘤控制率，还严重影响患者生活质量。目前放射性肺损伤发生机制尚不明确，只能使用糖皮质激素这类不良反应明显的药物控制，如若不能早发现早治疗控制疾病进展，将会出现不可逆转的放射性肺纤维化，最终导致患者呼吸衰竭乃至死亡。因此，对于放射性肺损伤的作用机制研究以及相关新药的研发显得尤为重要。
目前，关于放射性肺损伤的基础研究大多以动物模型为主，即通过适当剂量(12-20Gy)单次照射大鼠或小鼠全胸，建立动物放射性肺损伤模型以进行后续实验，以肺系数、肺组织病理切片等作为评价放射性肺损伤的标准，其缺点是造模周期过长(通常需6个月以上)，且受到实验动物个体影响较大，可重复性低，在细胞机制方面的研究性价比低等。放射性肺损伤体外细胞模型可以很好的解决这些问题，但目前关于放射性肺损伤的体外细胞模型的研究较少，国际及国内尚无统一的建模方法及建模标准。
肺泡上皮细胞死亡是放射性肺损伤重要的病理生理过程之一。肺泡Ⅱ型上皮细胞死亡导致呼吸膜完整性受损，肺表面活性物质无法发挥正常作用，继而出现肺泡萎陷、微肺不张及肺水肿。因此，以肺泡Ⅱ型上皮细胞作为研究对象进行放射性肺损伤细胞模型构建具有代表性。本研究提供了一种建立体外放射性肺损伤细胞模型的方法，以人肺泡Ⅱ型上皮细胞A549细胞为研究对象，通过不同剂量放射线干预后，采用CCK实验以及细胞克隆形成实验检测细胞的抑制率。为放射性肺损伤机制研究以及治疗药物的研发提供了重要的研究技术支持。关于本发明一种放射性肺损伤体外细胞模型及其构建方法和应用目前还未见报道。
发明内容
本发明的第一个目的是针对现有技术的不足，提供一种放射性肺损伤体外细胞模型。
本发明的第二个目的是针对现有技术的不足，提供如上所述放射性肺损伤体外细胞模型的构建方法。
本发明的第三个目的是针对现有技术的不足，提供如上所述放射性肺损伤体外细胞模型的用途。
为实现上述第一个目的，本发明采取的技术方案是：
一种放射性肺损伤体外细胞模型，所述放射性肺损伤体外细胞模型由以下方法构建：
a.复苏人肺泡Ⅱ型上皮细胞A549细胞；
b.传代培养人肺泡Ⅱ型上皮细胞A549细胞；
c.采用6MV X射线10Gy单次照射步骤b处理后得到的A549细胞，剂量率为2Gy/min，并在照射后继续培养第12h-24h内检测放射性肺损伤相关指标。
作为本发明的一个优选实施方案，步骤a的具体方法为：
(1)从液氮中取出待复苏的A549细胞株，放入37℃水浴中使之溶解得到已溶解的第一细胞液；
(2)将步骤(1)得到的已溶解的第一细胞液立即移入离心管中，并加入培养基，1000rpm，离心5min，得到第二细胞液；
(3)将步骤(2)得到的第二细胞液去上清，然后加入培养液重选细胞后，按照步骤(2)的方法再次离心，得到第三细胞液；
(4)将第三细胞液去上清，重悬后，吸进新的培养瓶中，加入5ml培养基，37℃，于50ml/LCO2的培养箱，进行培养；
(5)次日，观察细胞状态并换液。
作为本发明的一个优选实施方案，所述方法还包括如下步骤：
(1)细胞克隆形成：
用一般传代方法将对数生长期的单层培养的A549细胞分散成单细胞悬液，计数；将细胞悬液按梯度倍数稀释，以2000个接种于含2mL培养液的6孔细胞培养板中，然后以“十”字方向轻轻晃动培养板，使细胞分散均匀；将细胞培养板移入CO2孵育箱中，在37℃、5％CO2及饱和湿度环境下，静置24h，待其贴壁；
X射线照射后，继续培养12d，弃去培养液，终止培养，用PBS小心浸洗两次；加无水乙醇5mL固定15min；弃去固定液后，加吉姆萨染色液10-30min，然后流水缓慢冲去染液，空气干燥；用肉眼直接计数克隆数，每50个以上的细胞团为一克隆，按下列公式计算：克隆形成率以及细胞存活分数：
(2)CCK-8法检测细胞增殖：人肺泡Ⅱ型上皮细胞A549细胞消化、计数、配制成浓度为5×104个/mL的细胞悬液，96孔细胞培养板每孔加入100μL细胞悬液，将96孔细胞培养板置于37℃，5％CO2培养箱中培养24h后射线照射，将照射后的实验组细胞以及对照组细胞置于37℃，5％CO2培养箱中培养1、6、12、24、48h；将96孔板进行CCK-8染色，λ＝450nm，测定OD值：①每孔加入10μL CCK-8，在培养箱继续培养3h；②摇床10min轻轻混匀；③调整λ＝450nm，酶标仪读出每孔的OD值，计算抑制率，抑制率计算公式如下：
为实现上述第二个目的，本发明采取的技术方案是：
如上所述的放射性肺损伤体外细胞模型的构建方法，包括如下步骤：
a.复苏人肺泡Ⅱ型上皮细胞A549细胞；
b.传代培养人肺泡Ⅱ型上皮细胞A549细胞；
c.采用6MV X射线10Gy单次照射步骤b处理后得到的A549细胞，剂量率为2Gy/min，并在照射后继续培养第12h-24h内检测放射性肺损伤相关指标。
作为本发明的一个优选实施方案，步骤a的具体方法为：
(1)从液氮中取出待复苏的A549细胞株，放入37℃水浴中使之溶解得到已溶解的第一细胞液；
(2)将步骤(1)得到的已溶解的第一细胞液立即移入离心管中，并加入培养基，1000rpm，离心5min，得到第二细胞液；
(3)将步骤(2)得到的第二细胞液去上清，然后加入培养液重选细胞后，按照步骤(2)的方法再次离心，得到第三细胞液；
(4)将第三细胞液去上清，重悬后，吸进新的培养瓶中，加入5ml培养基，37℃，于50ml/L CO2的培养箱，进行培养；
(5)次日，观察细胞状态并换液。
作为本发明的一个优选实施方案，还包括如下步骤：
(1)细胞克隆形成：
用一般传代方法将对数生长期的单层培养的A549细胞分散成单细胞悬液，计数；将细胞悬液按梯度倍数稀释，以2000个接种于含2mL培养液的6孔细胞培养板中，然后以“十”字方向轻轻晃动培养板，使细胞分散均匀；将细胞培养板移入CO2孵育箱中，在37℃、5％CO2及饱和湿度环境下，静置24h，待其贴壁；
X射线照射后，继续培养12d，弃去培养液，终止培养，用PBS小心浸洗两次；加无水乙醇5mL固定15min；弃去固定液后，加吉姆萨染色液10-30min，然后流水缓慢冲去染液，空气干燥；用肉眼直接计数克隆数，每50个以上的细胞团为一克隆，按下列公式计算：克隆形成率以及细胞存活分数：
(2)CCK-8法检测细胞增殖：人肺泡Ⅱ型上皮细胞A549细胞消化、计数、配制成浓度为5×104个/mL的细胞悬液，96孔细胞培养板每孔加入100μL细胞悬液，将96孔细胞培养板置于37℃，5％CO2培养箱中培养24h后射线照射，将照射后的实验组细胞以及对照组细胞置于37℃，5％CO2培养箱中培养1、6、12、24、48h；将96孔板进行CCK-8染色，λ＝450nm，测定OD值：①每孔加入10μL CCK-8，在培养箱继续培养3h；②摇床10min轻轻混匀；③调整λ＝450nm，酶标仪读出每孔的OD值，计算抑制率，抑制率计算公式如下：
为实现上述第三个目的，本发明采取的技术方案是：
如上所述的放射性肺损伤体外细胞模型在制备治疗/预防放射性肺损伤的药物中的应用。
如上所述的放射性肺损伤体外细胞模型在研究放射性肺损伤疾病的致病机制中的应用。
作为本发明的一个优选实施方案，所述放射性肺损伤包括肺纤维化、肺组织炎症、肺上皮细胞损伤。
本发明优点在于：
克服了现有技术的缺陷：动物模型造模周期过长(通常需6个月以上)，且受到实验动物个体影响较大，可重复性低，在细胞机制方面的研究性价比低等。本发明一种放射性肺损伤体外细胞模型的构建方法，构建得到的体外细胞模型具有造模周期短、操作简便、可重复性高、制作成本低的优点，通过选择最佳的射线照射剂量、并在照射后第12h-24h内检测放射性肺损伤相关指标(该时间段内最符合放射性肺损伤细胞模型状态)，得到的体外细胞模型能够充分模拟放射性肺损伤的病理特征，模拟程度高，对治疗/预防放射性肺损伤的药物开发具有重要意义，同时为放射性肺损伤机制研究提供了重要的研究技术支持，具有很好的应用前景。
附图说明
附图1是不同放射线剂量下A549细胞集落克隆形成变化；图中：A.观察不同剂量作用下六孔板中A549细胞集落形成个数变化；B.计数不同射线剂量作用下六孔板内集落形成个数，比较相邻两组剂量作用下细胞集落个数差异(ns:P＞0.05；*:P＜0.05；**:P＜0.01)；C.不同射线剂量作用下细胞克隆形成率(platingefficiency,PE)以及细胞存活分数(survivalfraction,SF)的变化。
附图2是CCK-8检测不同放射线剂量照射A549细胞后不同时间点细胞增殖能力变化，图中：A.不同射线剂量组照射后不同时间点OD值的变化(*:P＜0.05；***:P＜0.001)；B.照射后不同时间点下个剂量组细胞抑制率变化。
具体实施方式
下面结合具体实施方式，进一步阐述本发明。应理解，这些实施例仅用于说明本发明而不用于限制本发明的范围。此外应理解，在阅读了本发明记载的内容之后，本领域技术人员可以对本发明作各种改动或修改，这些等价形式同样落于本申请所附权利要求书所限定的范围。
实施例1
1.材料和方法
1.1细胞
A549细胞株购于上海生物科学院细胞库，完全培养基为90％RPMI1640+10％FBS，于37℃、5％CO2、饱和湿度的培养箱中培养。
A549细胞复苏主要步骤如下：
①从液氮中取出将需要复苏的A549细胞株，放入37℃水浴中使之快速溶解；
②将已溶解的细胞液快速移入离心管中，加入适当的培养基，1000rpm，离心5min；
③去上清，加入培养液重选细胞后，采取上述离心方法再次离心；
④去上清，重悬后，吸进新的培养瓶中，加入5ml左右培养基，37℃，于50ml/L CO2的培养箱，进行培养；
⑤次日，观察细胞状态及换液。
A549细胞的传代培养主要步骤如下：
①实验前将所需物品准备齐全；
②将需要传代的A549细胞培养瓶，倒掉旧培养基，生理盐水清洗一次；
③加入0.25％EDTA的胰蛋白酶，约1ml左右，消化细胞，待消化充分，加入培养基终止其消化，吹打细胞下来；
④移入离心管中1000rpm，5min，离心，去上清，加培养液，重悬，移入新的培养瓶中，加入5ml左右的培养液，37℃，于50ml/L CO2孵箱培养；
⑤次日，观察细胞状态及换液。传至2-3代应用。
1.2主要试剂和仪器
2.5ul、10ul、200ul、1000ul移液器(德国eppendorf)，96well cell cultureplate(美国Corning Incorporated 3599)，Cell Counting Kit-8(日本DOJINDOLaborataries CP736)，DMSO(溶解Formazan结晶)(中国上海久亿化学试剂有限公司20120322)，DMSO(溶解受试药品)(美国SIGMA D2650)。超净工作台(中国苏州净化SW-CJ-1FD)，生物倒置显微镜(日本OLYMPUSIX51)，酶标仪(美国BioTek ELx800)，振荡器(中国上海沪西分析仪器厂WH-2)，通风橱(中国苏州亿达)。
1.3方法
1.3.1放射线照射造模
A549细胞分为实验组和对照组。实验组细胞给予高能直线加速器X射线(剂量分别为2Gy、4Gy、6Gy、8Gy、10Gy、12Gy))照射，照射参数为6MV X线，剂量率2.0Gy/min，源皮距1m。对照组细胞同样置于直线加速器下相同时间，但不接受射线照射。
1.3.2细胞克隆形成实验
用一般传代方法将对数生长期的单层培养的A549细胞分散成单细胞悬液，计数。将细胞悬液按梯度倍数稀释，以2000个接种于含2mL培养液的6孔细胞培养板中，然后以“十”字方向轻轻晃动培养板，使细胞分散均匀。将细胞培养板移入CO2孵育箱中，在37℃、5％CO2及饱和湿度环境下，静置24h，待其贴壁。
X射线照射后，继续培养12d，弃去培养液，终止培养，用PBS小心浸洗两次。加无水乙醇5mL固定15min。弃去固定液后，加吉姆萨染色液10-30min，然后流水缓慢冲去染液，空气干燥。用肉眼直接计数克隆数，每50个以上的细胞团为一克隆，按下列公式计算：克隆形成率(plating efficiency,PE)以及细胞存活分数(survival fraction,SF)。
1.3.3CCK-8法检测细胞增殖
A549细胞消化、计数、配制成浓度为5×104个/mL的细胞悬液，96孔细胞培养板每孔加入100μL细胞悬液。将96孔细胞培养板置于37℃，5％CO2培养箱中培养24h后射线照射。将照射后的实验组细胞以及对照组细胞置于37℃，5％CO2培养箱中培养1、6、12、24、48h。将96孔板进行CCK-8染色，λ＝450nm，测定OD值：①每孔加入10μL CCK-8，在培养箱继续培养3h；②摇床10min轻轻混匀；③调整λ＝450nm，酶标仪读出每孔的OD值，计算抑制率。计算公式如下：
1.3.4统计分析
使用SPSS21.0进行统计分析，均值±标准差表示计量数据，采用样本配对t检验比较同一射线剂量组照射后不同时间点差异，单因素方差分析比较不同射线剂量组差，不同组间两两比较采用Tukey HSD方法，P＜0.05具有统计学意义。
2.结果
2.1不同射线剂量对A549细胞集落克隆增殖的影响
通过细胞集落克隆实验结果(图1A)可知，随着放射线剂量的增加，细胞克隆扩增集落个数逐渐减少，说明放射线对细胞的增殖具有损伤作用，并且随着射线剂量增加，细胞损伤作用越明显。比较相邻两组剂量之间细胞集落克隆个数，0Gy剂量组与2Gy剂量组之间差异(P＝0.001)，2Gy剂量组与4Gy剂量组之间差异(P＝0.005)，以及8Gy剂量组与10Gy剂量组之间差异(P＝0.034)具有统计学意义(图1B)，说明在照射剂量达到10Gy时，可以对细胞的克隆增殖能力产生较为明显的影响。克隆形成率(platingefficiency,PE)以及细胞存活分数(survivalfraction,SF)也随放射线剂量的增加呈递减趋势(图1C)，当剂量达到12Gy时，SF及PE均＜0.1。综上所述，考虑选择8Gy或10Gy作为适宜的建模剂量。
2.2不同射线剂量对A549细胞不同时间点增殖活力的影响
通过CCK-8实验，不同射线剂量组细胞在照射后第1h、6h、12h、24h、48h的OD值的分布变化趋势如图2A所示，0Gy组细胞OD值在1h-6h出现轻度下降，之后一直呈上升趋势，但第24h-48h之间上升趋势趋于平缓；2Gy、4Gy、6Gy组细胞OD值在1h-24h的变化趋势较0Gy组相似，但在第24h-48h之间出现轻度平缓或轻度下降趋势；8Gy组细胞在1h-6h OD值呈下降趋势，之后在第12h-48h之间OD值变化不明显；10Gy组细胞在照射后OD值呈持续下降趋势，在第12h-24h内下降最为明显；12Gy组细胞OD值变化趋势较10Gy组细胞相似，但下降趋势更为明显。
通过进一步统计分析，在照射后1h，各照射剂量组OD值较0Gy组差异无统计学意义，同时各组之间差异也无统计学意义；照射后6h，10Gy组和12Gy组OD值较0Gy组差异具有统计学意义(P＜0.05、P＜0.001)，各相邻组间比较无统计学差异；照射后12h，10Gy组和12Gy组OD值较0Gy组差异具有统计学意义(P＜0.05、P＜0.001)，各相邻组间比较10Gy组与12Gy组之间具有统计学差异(P＜0.01)，其余相邻两组间比较无统计学差异；照射后24h，10Gy组和12Gy组OD值较0Gy组差异具有统计学意义(P＜0.001、P＜0.001)，各相邻组间比较10Gy组与12Gy组之间具有统计学差异(P＜0.05)，其余相邻两组间比较无统计学差异；照射后48h，6Gy、8Gy、10Gy组和12Gy组OD值较0Gy组差异具有统计学意义(P＜0.05、P＜0.001、P＜0.001和P＜0.001)，各相邻组间比较8Gy组与10Gy组之间具有统计学差异(P＜0.05)，其余相邻两组间比较无统计学差异。
通过各组在不同时间点所测得的OD值，计算相应的细胞增殖抑制率，所得结果如图2B所示，各剂量组的细胞抑制率随照射后时间的延长均呈升高趋势，特别是在第12h-24h之间变化最为明显。通过图2B所示，50％细胞抑制率出现在10Gy剂量组细胞照射后12h-24h时间段内，在10Gy组细胞照射后24h(抑制率＝56.7％)的细胞抑制率与50％最为接近。
3.讨论分析
通过细胞集落实验结果所示，射线剂量对细胞的克隆扩增具有损伤作用，随着射线剂量增加，损伤作用更为明显。当射线剂量达到12Gy时，细胞增殖损伤明显，细胞存活率及集落形成率均不足百分之一，因此该剂量过大，不适宜建模。当射线剂量在第2Gy-6Gy时，组间克隆个数变化差异不具有统计学意义，当射线剂量为8Gy-10Gy，组间克隆个数差异明显，因此8Gy或10Gy或许是适宜的建模的剂量。通过CCK-8实验发现，10Gy组与12Gy组照射后各时间点OD值均较未照射组均在统计学差异，结合细胞集落实验结果，10Gy剂量或许是最佳建模剂量。
同时照射后多久的细胞增殖状态接近放射性肺损伤细胞也是建模应考虑的重要问题，一般定义细胞生长抑制率为50％时，最符合放射性肺损伤细胞模型状态。通过OD值计算各组细胞照射后不同时间点的细胞抑制率发现，50％细胞抑制率出现在10Gy剂量组细胞照射后12h-24h时间段内，在10Gy组细胞照射后24h(抑制率＝56.7％)的细胞抑制率与50％最为接近。因此，通过10Gy剂量X射线照射A549细胞，并在照射后第12h-24h内检测放射性肺损伤相关指标是建立放射性肺损伤体外细胞模型的最佳模式。
本发明克服了现有技术的缺陷(动物模型造模周期过长(通常需6个月以上)，且受到实验动物个体影响较大，可重复性低，在细胞机制方面的研究性价比低等)。通过本发明的构建方法得到的体外细胞模型具有造模周期短、操作简便、可重复性高、制作成本低的优点，通过选择最佳的射线照射剂量、并在照射后第12h-24h内检测放射性肺损伤相关指标(该时间段内最符合放射性肺损伤细胞模型状态)，得到的体外细胞模型能够充分模拟放射性肺损伤的病理特征，模拟程度高，对治疗/预防放射性肺损伤的药物开发具有重要意义，同时为放射性肺损伤机制研究提供了重要的研究技术支持，具有很好的应用前景。
以上所述仅是本发明的优选实施方式，应当指出，对于本技术领域的普通技术人员，在不脱离本发明原理的前提下，还可以做出若干改进和补充，这些改进和补充也应视为本发明的保护范围。

Claims (9)

1.一种放射性肺损伤体外细胞模型，其特征在于，所述放射性肺损伤体外细胞模型由以下方法构建：
a.复苏人肺泡Ⅱ型上皮细胞A549细胞；
b.传代培养人肺泡Ⅱ型上皮细胞A549细胞；
c.采用6MV X射线10Gy单次照射步骤b处理后得到的A549细胞，剂量率为2Gy/min，并在照射后继续培养第12h-24h内检测放射性肺损伤相关指标。
2.根据权利要求1所述的放射性肺损伤体外细胞模型，其特征在于，步骤a的具体方法为：
(1)从液氮中取出待复苏的A549细胞株，放入37℃水浴中使之溶解得到已溶解的第一细胞液；
(2)将步骤(1)得到的已溶解的第一细胞液立即移入离心管中，并加入培养基，1000rpm，离心5min，得到第二细胞液；
(3)将步骤(2)得到的第二细胞液去上清，然后加入培养液重选细胞后，按照步骤(2)的方法再次离心，得到第三细胞液；
(4)将第三细胞液去上清，重悬后，吸进新的培养瓶中，加入5ml培养基，37℃，于50ml/LCO2的培养箱，进行培养；
(5)次日，观察细胞状态并换液。
3.根据权利要求1所述的放射性肺损伤体外细胞模型，其特征在于，所述方法还包括如下步骤：
(1)细胞克隆形成：
用一般传代方法将对数生长期的单层培养的A549细胞分散成单细胞悬液，计数；将细胞悬液按梯度倍数稀释，以2000个接种于含2mL培养液的6孔细胞培养板中，然后以“十”字方向轻轻晃动培养板，使细胞分散均匀；将细胞培养板移入CO2孵育箱中，在37℃、5％CO2及饱和湿度环境下，静置24h，待其贴壁；
X射线照射后，继续培养12d，弃去培养液，终止培养，用PBS小心浸洗两次；加无水乙醇5mL固定15min；弃去固定液后，加吉姆萨染色液10-30min，然后流水缓慢冲去染液，空气干燥；用肉眼直接计数克隆数，每50个以上的细胞团为一克隆，按下列公式计算：克隆形成率以及细胞存活分数：
(2)CCK-8法检测细胞增殖：人肺泡Ⅱ型上皮细胞A549细胞消化、计数、配制成浓度为5×104个/mL的细胞悬液，96孔细胞培养板每孔加入100μL细胞悬液，将96孔细胞培养板置于37℃，5％CO2培养箱中培养24h后射线照射，将照射后的实验组细胞以及对照组细胞置于37℃，5％CO2培养箱中培养1、6、12、24、48h；将96孔板进行CCK-8染色，λ＝450nm，测定OD值：①每孔加入10μL CCK-8，在培养箱继续培养3h；②摇床10min轻轻混匀；③调整λ＝450nm，酶标仪读出每孔的OD值，计算抑制率，抑制率计算公式如下：
4.权利要求1所述的放射性肺损伤体外细胞模型的构建方法，其特征在于，包括如下步骤：
a.复苏人肺泡Ⅱ型上皮细胞A549细胞；
b.传代培养人肺泡Ⅱ型上皮细胞A549细胞；
c.采用6MV X射线10Gy单次照射步骤b处理后得到的A549细胞，剂量率为2Gy/min，并在照射后继续培养第12h-24h内检测放射性肺损伤相关指标。
5.根据权利要求4所述的构建方法，其特征在于，步骤a的具体方法为：
(1)从液氮中取出待复苏的A549细胞株，放入37℃水浴中使之溶解得到已溶解的第一细胞液；
(2)将步骤(1)得到的已溶解的第一细胞液立即移入离心管中，并加入培养基，1000rpm，离心5min，得到第二细胞液；
(3)将步骤(2)得到的第二细胞液去上清，然后加入培养液重选细胞后，按照步骤(2)的方法再次离心，得到第三细胞液；
(4)将第三细胞液去上清，重悬后，吸进新的培养瓶中，加入5ml培养基，37℃，于50ml/LCO2的培养箱，进行培养；
(5)次日，观察细胞状态并换液。
6.根据权利要求4所述的构建方法，其特征在于，还包括如下步骤：
(1)细胞克隆形成：
用一般传代方法将对数生长期的单层培养的A549细胞分散成单细胞悬液，计数；将细胞悬液按梯度倍数稀释，以2000个接种于含2mL培养液的6孔细胞培养板中，然后以“十”字方向轻轻晃动培养板，使细胞分散均匀；将细胞培养板移入CO2孵育箱中，在37℃、5％CO2及饱和湿度环境下，静置24h，待其贴壁；
X射线照射后，继续培养12d，弃去培养液，终止培养，用PBS小心浸洗两次；加无水乙醇5mL固定15min；弃去固定液后，加吉姆萨染色液10-30min，然后流水缓慢冲去染液，空气干燥；用肉眼直接计数克隆数，每50个以上的细胞团为一克隆，按下列公式计算：克隆形成率以及细胞存活分数：
(2)CCK-8法检测细胞增殖：人肺泡Ⅱ型上皮细胞A549细胞消化、计数、配制成浓度为5×104个/mL的细胞悬液，96孔细胞培养板每孔加入100μL细胞悬液，将96孔细胞培养板置于37℃，5％CO2培养箱中培养24h后射线照射，将照射后的实验组细胞以及对照组细胞置于37℃，5％CO2培养箱中培养1、6、12、24、48h；将96孔板进行CCK-8染色，λ＝450nm，测定OD值：①每孔加入10μL CCK-8，在培养箱继续培养3h；②摇床10min轻轻混匀；③调整λ＝450nm，酶标仪读出每孔的OD值，计算抑制率，抑制率计算公式如下：
7.权利要求1所述的放射性肺损伤体外细胞模型在制备治疗/预防放射性肺损伤的药物中的应用。
8.权利要求1所述的放射性肺损伤体外细胞模型在研究放射性肺损伤疾病的致病机制中的应用。
9.根据权利要求7-8任一所述应用，其特征在于，所述放射性肺损伤包括肺纤维化、肺组织炎症、肺上皮细胞损伤。
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Cited By (1)

* Cited by examiner, † Cited by third party
Publication number Priority date Publication date Assignee Title
CN111424029A (zh) * 2020-04-22 2020-07-17 中国人民解放军空军军医大学 一种放射性细胞损伤模型的构建方法

Citations (7)

* Cited by examiner, † Cited by third party
Publication number Priority date Publication date Assignee Title
WO2008136213A1 (ja) * 2007-04-27 2008-11-13 Oncolys Biopharma Inc. 放射線増感増強剤
CN103100144A (zh) * 2013-02-28 2013-05-15 胡晓云 放射性肺损伤兔阶梯模型的制备方法
CN104017799A (zh) * 2013-08-08 2014-09-03 中南大学湘雅医院 一种放射线照射模式筛选鼻咽癌放疗抵抗细胞的方法
CN105232565A (zh) * 2015-08-13 2016-01-13 北京农学院 罗汉果皂苷或其药学上可接受的盐在制备肿瘤放射增敏剂中的应用
CN106367391A (zh) * 2016-08-25 2017-02-01 李懿 一种直肠癌放疗抵抗细胞模型及其构建方法
CN107779438A (zh) * 2017-09-25 2018-03-09 杭州市第人民医院 一种放疗耐受肺癌细胞系及其构建方法和应用
US20180104336A1 (en) * 2016-10-13 2018-04-19 Gunnar Boysen Method of Increasing Radiation Sensitivity of Tumor Cells

Patent Citations (7)

* Cited by examiner, † Cited by third party
Publication number Priority date Publication date Assignee Title
WO2008136213A1 (ja) * 2007-04-27 2008-11-13 Oncolys Biopharma Inc. 放射線増感増強剤
CN103100144A (zh) * 2013-02-28 2013-05-15 胡晓云 放射性肺损伤兔阶梯模型的制备方法
CN104017799A (zh) * 2013-08-08 2014-09-03 中南大学湘雅医院 一种放射线照射模式筛选鼻咽癌放疗抵抗细胞的方法
CN105232565A (zh) * 2015-08-13 2016-01-13 北京农学院 罗汉果皂苷或其药学上可接受的盐在制备肿瘤放射增敏剂中的应用
CN106367391A (zh) * 2016-08-25 2017-02-01 李懿 一种直肠癌放疗抵抗细胞模型及其构建方法
US20180104336A1 (en) * 2016-10-13 2018-04-19 Gunnar Boysen Method of Increasing Radiation Sensitivity of Tumor Cells
CN107779438A (zh) * 2017-09-25 2018-03-09 杭州市第人民医院 一种放疗耐受肺癌细胞系及其构建方法和应用

Non-Patent Citations (4)

* Cited by examiner, † Cited by third party
Title
刘小群: "ATM激酶在CpG ODN增强X射线诱导A549细胞G2/M期阻滞和凋亡中的作用研究", 《复旦大学硕士学位论文》 *
常金 等，: "人肺腺癌A549细胞株胰岛素受体与放射敏感性的实验研究", 《泰山医学院学报》 *
杨燕: "X-射线照射后A549细胞释放的exosome对同源细胞及巨噬细胞功能的影响", 《河北医科大学硕士学位论文》 *
栾瑾微 等，: "人肺腺癌细胞A549放射治疗前后Dystrobrevin蛋白表达的变化", 《黑龙江医学》 *

Cited By (1)

* Cited by examiner, † Cited by third party
Publication number Priority date Publication date Assignee Title
CN111424029A (zh) * 2020-04-22 2020-07-17 中国人民解放军空军军医大学 一种放射性细胞损伤模型的构建方法

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