CN104017799A

CN104017799A - 一种放射线照射模式筛选鼻咽癌放疗抵抗细胞的方法

Info

Publication number: CN104017799A
Application number: CN201410274855.3A
Authority: CN
Inventors: 邱元正; 刘勇; 李果; 粟忠武; 任舒灵; 田勇泉
Original assignee: Xiangya Hospital of Central South University
Current assignee: Xiangya Hospital of Central South University
Priority date: 2013-08-08
Filing date: 2014-06-19
Publication date: 2014-09-03

Abstract

一种放射线照射模式筛选鼻咽癌放疗抵抗细胞的方法，采用放射线梯度递增的筛选模式。采用本发明，细胞在相对较短的时间内更快适应高剂量放射线照射，缩短单次高剂量放射线照射后的生长恢复时间，增加放疗抵抗性产生的几率，同时减少人力、物力、时间方面的投入；构建的鼻咽癌放疗抵抗细胞为鼻咽癌放疗抵抗研究提供良好的细胞模型；本发明适用于体外培养的鼻咽癌细胞株，亦可为其他肿瘤放疗抵抗细胞的建立提供借鉴。

Description

一种放射线照射模式筛选鼻咽癌放疗抵抗细胞的方法

技术领域

本发明涉及一种筛选鼻咽癌放疗抵抗细胞的方法，尤其是涉及一种放射线照射模式筛选鼻咽癌放疗抵抗细胞的方法。

背景技术

目前，国内外鼻咽癌放疗抵抗细胞的构建方式，大多采用对肿瘤亲本细胞予以亚致死剂量模式（10-12 Gy）（如《Cancer Res》2010年第9期第70卷发表的 " Identification of biomarkers for predicting nasopharyngeal carcinoma response to radiotherapy by proteomics "一文；）或者小剂量分割照射模式（1.8-2 Gy）（如《Radiat Res》2001年第6期第156卷发表了 " The generation and characterization of a radiation-resistant model system to study radioresistance in human breast cancer cells "一文）进行筛选的方法，但亚致死剂量筛选模式存在细胞难以存活、细胞易出现变性死亡和筛选周期长等不足；小剂量分割照射方法存在照射次数多，放疗抵抗性难以建立，污染几率增加等问题。

发明内容

　　本发明要解决的技术问题是，克服现有技术亚致死剂量筛选模式和小剂量分割照射模式的不足，提供一种放射线照射模式筛选鼻咽癌放疗抵抗细胞的方法。

本发明解决其技术问题采用的技术方案是，一种放射线照射模式筛选鼻咽癌放疗抵抗细胞的方法，其采用的筛选模式为放射线梯度递增的筛选模式，即从低放射剂量开始，待细胞能适应放疗剂量（即细胞接受该放疗剂量后，经过一段时间培养，能恢复放疗前的生长能力，不能耐受放疗剂量则表现为细胞死亡），再增加放射剂量，使获得的鼻咽癌细胞对放疗剂量的耐受能力不断增加。

所述鼻咽癌放疗抵抗细胞为可进行体外培养的鼻咽癌细胞株。

具体包括以下步骤：

（1）将指数生长期鼻咽癌细胞株胰酶消化后，稀释至500-1000个细胞/ml（该浓度细胞可使细胞分散均匀，不易成团生长，易形成集落）；

（2）稀释后细胞加入培养瓶或培养皿等容器中，置于37℃，5% CO2，饱和湿度，无菌条件下培养6-12小时，使细胞处于贴壁但不增殖或少量增殖状态；

（3）进行放射照射：每个放疗剂量要求重复一次或以上；初次为2Gy初始剂量（小剂量）；放疗剂量增加量在原来基础上增加1-2Gy，若细胞不能耐受增加后的放射剂量，则维持之前的原放射剂量，直至放射线总剂量≥60Gy；

放疗时，增加剂量次数设为n，增加量为A，A为1Gy-2Gy，使单次放疗剂量为（2+n×A）Gy，该放疗剂量可重复1次至多次，直至细胞能耐受下一梯度放射剂量（2+(n+1)×A）Gy；

（4）经过步骤（3）照射后，继续在37℃，5％CO₂饱和湿度的培养皿内培养至融合度（指细胞占据培养容器的面积）达到50%以上，并通过胰酶消化传代；待稳定传代2~3次后，进行放射线抵抗能力检测，通过SF2（2 Gy辐射量的细胞存活率）判断细胞敏感性。

进一步，所述放疗射线为X射线。

本发明的有益效果是：①细胞在相对较短的时间内更快适应高剂量放射线照射，缩短单次高剂量放射线照射后的生长恢复时间（通过实验我们发现，现有技术中，亲本细胞给予10Gy高剂量照射后，细胞全部死亡，或者需要平均13.8±2.2天细胞可进行第二次传代；而经过本发明放疗筛选的细胞，第一次给予10Gy高剂量照射后，需7.8±2.5天，细胞可进行第二次传代，通过梯度放射筛选的细胞在接触高剂量放射后，其恢复生长的时间较亲本细胞明显缩短），增加放疗抵抗性产生的几率，同时减少人力、物力、时间方面的投入；②构建的鼻咽癌放疗抵抗细胞为鼻咽癌放疗抵抗研究提供良好的细胞模型；③该发明适用于体外培养的鼻咽癌细胞株，亦可为其他肿瘤放疗抵抗细胞的建立提供借鉴。

具体实施方式

以下结合具体实施例对本发明作进一步详细说明。

实施例1

本实施例包括以下步骤：

（1）将指数生长期鼻咽癌细胞CNE-2经胰酶消化后，稀释至约1000个细胞/ml，该浓度细胞可使细胞分散均匀，不亦成团，易形成集落；

（2）稀释后细胞加入培养瓶，置于37℃，5％CO₂，饱和湿度，无菌条件下培养6小时，使细胞处于贴壁但不增殖或少量增殖状态；

（3）进行放射照射（放疗射线为X射线）：第一次：2Gy、第二次：2Gy、第三次：4Gy、第四次：4Gy、第五次：6Gy、第六次：6Gy、第七次：8Gy、第八次：8Gy、第九次：10Gy、第十次：10Gy、第十一次：10Gy；总放疗剂量是70Gy；放疗后形成细胞命名为放疗抵抗细胞。

（4）每次照射后，继续在37℃，5％CO₂饱和湿度的培养皿内培养至融合度达到50%以上，并通过胰酶消化传代；待稳定传代2~3次后，进入下一次放射线照射，在总剂量达到60Gy后，进行放射线抵抗能力检测，细胞CNE-2 的SF2值为0.38，其放疗筛选后细胞的SF2值为0.68，细胞CNE-2 的SF2值低于其放疗筛选后细胞的SF2值；放疗后形成放疗抵抗细胞命名为放疗抵抗细胞CNE-2-Rs。

实施例2

本实施例包括以下步骤：

（1）将指数生长期鼻咽癌细胞6-10B细胞株经胰酶消化后，稀释至500个细胞/ml，该浓度细胞可使细胞分散均匀，不亦成团，易形成集落；

（2）稀释后细胞加入培养皿，置于37℃，5％CO₂，饱和湿度，无菌条件下培养8小时，使细胞处于贴壁但不增殖或少量增殖状态；

（3）进行放射照射：第一次：2Gy、第二次：2Gy、第三次：4Gy、第四次：4Gy、第五次：6Gy、第六次：6Gy、第七次：8Gy、第八次：8Gy、第九次：10Gy、第十次：10Gy；、第十一次：10Gy；总放疗剂量是70Gy；放疗后形成细胞命名为放疗抵抗细胞；

（4）每次照射后，继续在37℃，5％CO₂饱和湿度的培养皿内培养至融合度达到50%以上，并通过胰酶消化传代；待稳定传代2~3次后，进入下一次放射线照射，在总剂量达到60Gy后，进行放射线抵抗能力检测，细胞6-10B 的SF2值为0.55，其放疗筛选后细胞的SF2值为0.72，细胞6-10B 的SF2值低于其放疗筛选后细胞的SF2值；放疗后形成放疗抵抗细胞命名为放疗抵抗细胞6-10B-Rs。

总筛选过程至总剂量达到临床最低放疗总剂量（鼻咽癌为60-70Gy，《肿瘤学》第7版，人民卫生出版社），并且通过集落生存实验、CCK-8等试验证实细胞的放疗抵抗性出现统计学、生物学上的明显差异。此时我们命名筛选出细胞为筛选出的鼻咽癌放疗抵抗细胞。

Claims

1.一种放射线照射模式筛选鼻咽癌放疗抵抗细胞的方法，其特征在于，采用放射线梯度递增的筛选模式。

2.一种如权利要求1所述的放射线照射模式筛选鼻咽癌放疗抵抗细胞的方法，其特征在于，具体包括以下步骤：

（1）将指数生长期鼻咽癌细胞株胰酶消化后，稀释至500-1000个细胞/ml；

（2）稀释后细胞加入培养瓶或培养皿中，置于37℃，5％CO₂，饱和湿度，无菌条件下培养6-12小时，使细胞处于贴壁但不增殖或少量增殖状态；

（3）进行放射照射：每个放疗剂量要求重复一次或以上；初次为2Gy初始剂量；放疗剂量增加量在原来基础上增加1-2Gy，若细胞不能耐受增加后的放射剂量，则维持之前的原放射剂量，直至放射线总剂量≥60Gy；

（4）经过步骤（3）照射后，继续在37℃，5％CO₂饱和湿度的培养皿内培养至融合度达到50%以上，并通过胰酶消化传代；待稳定传代2~3次后，进行放射线抵抗能力检测，通过2 Gy辐射量的细胞存活率判断细胞敏感性。

3.根据权利要求1或2所述的放射线照射模式筛选鼻咽癌放疗抵抗细胞的方法，其特征在于，所述鼻咽癌放疗抵抗细胞为进行体外培养的鼻咽癌细胞株。

4.根据权利要求1或2所述的放射线照射模式筛选鼻咽癌放疗抵抗细胞的方法，其特征在于，所述放疗射线为X射线。