CN113621574B - 一种人胶质母细胞瘤放疗抵抗细胞株及其应用 - Google Patents

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Abstract

本发明提供了一种人胶质母细胞瘤放疗抵抗细胞株A172‑R，保藏于中国微生物菌种保藏管理中心CGMCC，保藏号CGMCC No.21411；它是由人胶质母细胞瘤细胞株A172经多次X射线照射和培养后获得的放疗抵抗细胞株，放射抵抗性强，在人胶质母细胞瘤放疗抵抗机制的细胞模型中具有良好应用前景。

Description

一种人胶质母细胞瘤放疗抵抗细胞株及其应用
技术领域
本发明属于生物技术领域，具体涉及一种人胶质母细胞瘤放疗抵抗细胞株及其应用。
背景技术
放疗是治疗恶性肿瘤的主要手段之一，是肿瘤综合治疗中不可或缺的关键组成部分。临床上，有超过70％的肿瘤患者在病程中需接受放疗。目前尽管放疗技术取得了巨大进步,放疗抵抗仍是放射治疗的主要障碍，最终可导致肿瘤复发、转移。找出恶性肿瘤对放疗抵抗的原因，从而增加肿瘤对放疗的敏感性是恶性肿瘤治疗领域一个急需解决的问题。
然而，放疗抵抗是一个复杂的生物学过程，与DNA损伤反应异常、细胞凋亡、自噬、基因突变、细胞周期检查点、信号通路失控等多种因素的共同作用有关。放疗抵抗细胞模型的应用可以为逆转放疗抵抗的研究奠定基础。由于在特定肿瘤类型中采用不同放射敏感性的细胞株无法排除不同细胞株的遗传背景差异所带来的影响，体外通过X射线对细胞反复照射筛选获得具有放疗耐受性的细胞株，并与亲本细胞进行对照研究，是在体外研究放疗抵抗机制的重要方法。
专利申请CN110878284A和CN107779438B分别公开了对人肺癌细胞株A549和PC9的放疗抵抗细胞系的构建方法；专利申请CN109735495A和CN104017799A分别公开了人鼻咽癌细胞株CNE-2的放疗抵抗细胞系的构建方法；专利申请CN106367391A公开了一种人直肠癌细胞SW480放疗抵抗细胞系的构建方法。上述现有技术均是对亲本细胞进行不同方法模式的X射线照射，成功构建了相应的放疗抵抗细胞系，得到的放疗抵抗细胞系与各自的亲本细胞相比，放疗抵抗的效果随构建方法的不同存在差异。
目前的现有技术还未见对人胶质母细胞瘤细胞系的放疗抵抗细胞株及其制备方法的报道。为进一步研究人胶质母细胞瘤放疗抵抗的分子机制、筛选放疗抵抗靶点、提高放疗敏感性，亟需研究具有优异放疗抵抗能力的人胶质母细胞瘤细胞株。
发明内容
本发明的目的在于提供一种具有优异放疗抵抗特性的人胶质母细胞瘤放疗抵抗细胞株，并提供该细胞株的构建方法和应用。
本发明提供了一种人胶质母细胞瘤放疗抵抗细胞株，它是保藏于中国微生物菌种保藏管理中心CGMCC，保藏号CGMCC No.21411的人胶质母细胞瘤放疗抵抗细胞株A172-R。
生物材料保藏：
本发明的人胶质母细胞瘤放疗抵抗细胞株A172-R已于2020年12月11日，保藏于中国微生物菌种保藏管理委员会普通微生物中心(CGMCC，地址：中国，北京，中国科学院微生物研究所)，保藏中心登记入册编号为：CGMCC No.21411。
进一步地，它是人胶质母细胞瘤细胞株A172经X射线照射后仍存活的细胞和/或其子代细胞。
更进一步地，上述X射线照射是三轮X射线照射，其中，每轮X射线照射的方法是以2Gy/次的剂量照射15次。
本发明还提供了制备上述放疗抵抗细胞株的方法，包括如下步骤：
(1)取人胶质母细胞瘤细胞A172以2Gy/次的剂量照射15次，得到仍存活的细胞；
(2)重复步骤(1)三次后，即得人胶质母细胞瘤放疗抵抗细胞株A172-R。
进一步地，步骤(1)所述人胶质母细胞瘤细胞株A172为对数生长期的胶质母细胞瘤细胞株A172。
进一步地，步骤(1)还包括对存活的细胞进行消化、传代、培养的步骤。
本发明还提供了上述放疗抵抗细胞株在人胶质母细胞瘤放疗抵抗细胞模型中的应用。
进一步地，上述放疗抵抗细胞模型是筛选放疗增敏药物的细胞模型，或筛查放疗抵抗基因的细胞模型，或研究人胶质母细胞瘤放疗抵抗机制的细胞模型。
实验结果表明，本发明的人胶质母细胞瘤放疗抵抗细胞株A172-R具有很强的放射抵抗性，在高达8Gy的辐照剂量下，A172-R的存活分数达到其亲本细胞A172的16倍以上。本发明提供的人胶质母细胞瘤放疗抵抗细胞株为进一步研究人胶质母细胞瘤放疗抵抗的分子机制、筛选放疗抵抗靶点、提高放疗敏感性，筛选放疗增敏药物和筛查放疗抵抗基因提供了基础。
显然，根据本发明的上述内容，按照本领域的普通技术知识和惯用手段，在不脱离本发明上述基本技术思想前提下，还可以做出其它多种形式的修改、替换或变更。
以下通过实施例形式的具体实施方式，对本发明的上述内容再作进一步的详细说明。但不应将此理解为本发明上述主题的范围仅限于以下的实例。凡基于本发明上述内容所实现的技术均属于本发明的范围。
附图说明
图1为人胶质母细胞瘤亲本细胞A172和本发明方法构建的人胶质母细胞瘤放疗抵抗细胞A172-R的放射存活曲线。
具体实施方式
人胶质母细胞瘤细胞A172购自ATCC(American type culture collection，美国模式培养物集存库)，由四川大学生物治疗国家重点实验室培养传代及保种。其余实验试剂及设备均为已知产品，通过购买市售产品所得。
实施例1、本发明放疗抵抗细胞株的构建
采用多次常规分割建立放疗抵抗细胞株，即采用常规剂量(2Gy)分三轮间歇照射诱导法进行总剂量2Gy×45f的照射，通过多次小剂量放疗富集“放疗抵抗细胞”。具体操作方法如下：
(1)对人胶质母细胞瘤细胞A172细胞进行培养，取对数生长期的细胞制备成单细胞悬液，按合适的浓度种植于培养瓶中，培养8-12小时后，保持细胞贴壁、状态良好。
(2)利用X射线生物辐照仪(RS2000系列，Rad Source)照射细胞，辐照仪电压160kV，电流25mA，剂量率为1.071Gy/min。
(3)第一轮照射剂量2Gy/f，每周照射5次(周一至周五照射，周六、周日不照射)，共15次，累积剂量30Gy。照射期间每48小时换液，去除培养上清中的死细胞。
(4)第一轮照射完成后停止照射，将存活的克隆样细胞团块消化成单细胞进行培养、传代，培养2-8周待细胞恢复状态后进行第二轮照射。细胞恢复期间视细胞密度及时传代及冻存细胞。
(5)第二轮照射剂量仍为2Gy/f，每周照射5次，共15次，第二轮照射累积剂量30Gy。照射期间每48小时换液，去除培养上清中的死细胞。
(6)第二轮照射完成后停止照射，将存活的克隆样细胞团块消化成单细胞进行培养、传代，培养2-10周待细胞恢复状态后进行第三轮照射。细胞恢复期间视细胞密度及时传代及冻存细胞。
(7)第三轮照射完成后仍存活的克隆样细胞团块即为放疗抵抗细胞，命名为A172-R。
经过检测，通过上述方法制得的A172-R细胞株具有非常优异的放射抵抗性，因此，将该A172-R细胞株于2020年12月11日，保藏于中国微生物菌种保藏管理委员会普通微生物中心(CGMCC，地址：中国，北京，中国科学院微生物研究所)，保藏中心登记入册编号为：CGMCC No.21411。
以下通过实验例证明本发明细胞株的放疗抵抗效果。
实验例1、本发明方法构建放疗抵抗细胞株的放疗抵抗特性检测
1、实验方法
克隆形成实验检测：
放疗抵抗细胞的准备：将实施例1得到的A172-R继续培养并传5代以后进行实验，培养过程中及时冻存。
亲本细胞的准备：将未受照射的A172细胞作为亲本细胞，按较稀的浓度种植于培养瓶中，与实施例1的细胞同步培养，并及时进行细胞传代与冻存。
具体步骤如下：
(1)将处于对数生长期的细胞(包括亲本细胞及放疗抵抗细胞)进行消化后接种于六孔板内，根据X射线照射剂量的不同分别接种不同数量的细胞，每个剂量点设置3个复孔。
(2)次日利用X射线生物辐照仪按照0Gy、2Gy、4Gy、6Gy、8Gy的剂量梯度辐照细胞。辐照完毕后立即将细胞放回CO2培养箱继续培养2周左右，每3-5天更换细胞一次细胞培养基。
(3)六孔板内出现肉眼可见的细胞克隆时即可终止培养，弃掉六孔板内培养基，用1×DPBS清洗细胞两次。
(4)加入适量纯甲醇室温下固定15min，弃掉固定液，然后加入结晶紫染液，室温下静置20min染色。
(5)弃掉结晶紫染色液，用双蒸水缓慢冲洗直至残留的紫色液清洗干净为止，放室温下晾干，在显微镜下计数细胞克隆数(超过50个细胞的细胞团视为一个克隆)。
(6)计算接种率及存活分数
接种率＝[集落形成数(0Gy)/细胞接种数(0Gy)]×100％
存活分数＝集落形成数(X Gy)/[(接种细胞数(X Gy)×接种率)]
(7)采用GraphPadPrism7.0绘制存活曲线，比较两组细胞间的放疗抵抗性的差异。
2、实验结果
通过克隆形成实验以及细胞存活曲线分析细胞的放射敏感性。结果提示：在给予不同剂量梯度(0Gy、2Gy、4Gy、6Gy、8Gy)照射后，A172-R的存活率显著高于亲本细胞A172(如表1和图1所示)：
表1
以上结果说明，在高达8Gy的辐照剂量下，A172-R的存活分数达到其亲本细胞A172的16倍以上。证实A172-R细胞与亲本细胞相比具有显著提升的放射抵抗性。
综上，本发明采用间歇照射诱导法诱导人胶质母细胞瘤细胞A172，挑选得到了一株具有非常强的放射抵抗性的细胞A172-R，其在高达8Gy的辐照剂量下，A172-R的存活分数达到其亲本细胞A172的16倍以上。本发明提供的人胶质母细胞瘤放疗抵抗细胞株为进一步研究人胶质母细胞瘤放疗抵抗的分子机制、筛选放疗抵抗靶点、提高放疗敏感性提供了基础。

Claims (8)

1.一种人胶质母细胞瘤放疗抵抗细胞株，其特征在于，它是保藏于中国微生物菌种保藏管理中心CGMCC，保藏号CGMCC No.21411的人胶质母细胞瘤放疗抵抗细胞株A172-R；所述人胶质母细胞瘤放疗抵抗细胞株A172-R是人胶质母细胞瘤细胞株A172经X射线照射后仍存活的细胞和/或其子代细胞，所述X射线照射是三轮X射线照射，其中，每轮X射线照射的方法是以2Gy/次的剂量照射15次。
2.如权利要求1所述的放疗抵抗细胞株，其特征在于，它由如下方法步骤获得：
（1）取人胶质母细胞瘤细胞A172以2Gy/次的剂量照射15次，得到存活的细胞；
（2）重复步骤（1）三次后，即得人胶质母细胞瘤放疗抵抗细胞株A172-R。
3.如权利要求2所述的放疗抵抗细胞株，其特征在于，步骤（1）所述人胶质母细胞瘤细胞株A172为对数生长期的人胶质母细胞瘤细胞株A172。
4.如权利要求2所述的放疗抵抗细胞株，其特征在于，步骤（1）还包括对存活的细胞进行消化、传代、培养的步骤。
5.权利要求1~4任一项所述放疗抵抗细胞株在人胶质母细胞瘤放疗抵抗细胞模型中的应用。
6.如权利要求5所述的应用，其特征在于，所述放疗抵抗细胞模型是筛选放疗增敏药物的细胞模型。
7.如权利要求5所述的应用，其特征在于，所述放疗抵抗细胞模型是筛查放疗抵抗基因的细胞模型。
8.如权利要求5所述的应用，其特征在于，所述放疗抵抗细胞模型是研究人胶质母细胞瘤放疗抵抗机制的细胞模型。
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