CN110669726A - 一种人皮肤成纤维细胞伽马射线辐照后可长期传代细胞株及其构建方法 - Google Patents

一种人皮肤成纤维细胞伽马射线辐照后可长期传代细胞株及其构建方法 Download PDF

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Abstract

本发明涉及生物医学技术领域，具体涉及一种人皮肤成纤维细胞(HFF‑1)伽马射线辐照后可长期传代细胞株及其构建方法。本发明采用人皮肤成纤维细胞(HFF‑1)为诱导对象，对其使用特定剂量(10Gy)伽马射线辐照，小鼠胚胎成纤维细胞辐照后，细胞增殖减慢，凋亡增加，迁移能力减弱，这种细胞自身特性的改变不因细胞传代数的增加而发生改变，可随细胞本身的传代而遗传至下一代。本细胞模型在实际应用中更贴近临床上皮肤鳞癌放疗后伤口长期不愈合的临床实际，在研究伤口放疗后不愈合的病理机制、新药物研发等方面具有重要的应用前景。

Description

一种人皮肤成纤维细胞伽马射线辐照后可长期传代细胞株及 其构建方法
技术领域
本发明涉及生物医学技术领域，具体地说，是一种人皮肤成纤维细胞(HFF-1)伽马射线辐照后可长期传代细胞株及其构建方法。
背景技术
放疗是指利用放射线电离辐射(Ionizing Radiation，IR)效应杀伤肿瘤细胞的治疗方法，在头颈部恶性肿瘤治疗中占有重要地位。据文献统计，全球每年新增头颈癌病例约5492200人，超过50％的患者在治疗过程中需要接受放疗。临床上，放疗除治疗作用外，常引发的并发症是皮肤的急性损害(主要表现为皮肤红斑、干燥脱屑、毛发脱落、溃疡等)及外科手术后皮肤伤口愈合障碍。后者主要表现为局部手术伤口延迟愈合、不愈或反复破溃，增加了创伤部位感染及组织坏死的几率，最终转变为辐射性皮肤溃疡。
细胞模型的建立是研究临床疾病的基础，贴近临床实际的疾病细胞模型往往会使临床疾病的研究事半功倍，因此，建立更加符合临床实际的疾病细胞模型将更有利于临床疾病机制的研究。传统使用的伽马射线辐照模型多使用直接照射后的细胞，不对细胞进行照射后传代，这样对辐照后的细胞直接进行检测与干预，得到的只是急性辐照损伤后细胞的生理生化改变结果，这与临床实际中的慢性伤口不愈合的实际不符，因此对指导辐照后细胞长期损伤的机制研究方面的价值有限，不能更好的揭示细胞辐照的病理机制改变原因，而长期可以传代的伽马射线照射的细胞模型，尚未见有人研究报道，细胞模型的构建方法也并未有人做深入研究。
发明内容
本发明的目的在于提供一种伽马射线辐照后慢性不愈合伤口研究中的应用细胞株，本发明的另一目的是提供该细胞株的构建方法。
为了实现上述目的，本发明的主要技术方案是利用特定剂量的伽马射线对人皮肤成纤维细胞(HFF-1)细胞进行照射，辐照后对细胞进行正常传代，并对正常传代的细胞进行细胞增殖、凋亡、迁移等指标监测，最终建立一种伽马射线辐照后可以长期传代的细胞株的方法。
本发明的第一方面，提供一种人皮肤成纤维细胞(HFF-1)伽马射线辐照后可长期传代细胞株，其构建方法包括以下步骤：
取人皮肤成纤维细胞(HFF-1)细胞复苏后用含质量浓度10％的胎牛血清(FBS)和质量浓度1％的青霉素-链霉素双抗生素溶液的DMEM培养基培养，于37℃，5％CO2培养箱中培养；待细胞混合程度达90％时，使用1ml含EDTA(EDTA质量浓度为0.25％)的胰酶进行消化，消化5min后，使用2ml培养液终止培养瓶内细胞消化，将培养瓶中3ml液体反复吹打均匀后，转移入15ml离心管，放置于Co60γ射线源处进行照射，照射总剂量为10Gy；辐照后的细胞拿回细胞房后平铺于培养瓶中继续培养，待细胞汇合达到80％以上可以继续进行传代，辐照后细胞按1：2比例进行传代；细胞辐照后可继续传代，第3代及其以后的细胞即为所述的可长期传代细胞株。
进一步的，所述的可长期传代细胞株是在10Gy伽马射线辐照后，细胞损伤可以稳定遗传3代或以上的细胞株。
本发明的第二方面，提供一种人皮肤成纤维细胞(HFF-1)伽马射线辐照后可长期传代细胞株的构建方法，包括以下步骤：
取人皮肤成纤维细胞(HFF-1)细胞复苏后用含质量浓度10％的胎牛血清(FBS)和质量浓度1％的青霉素-链霉素双抗生素溶液的DMEM培养基培养，于37℃，5％CO2培养箱中培养；待细胞混合程度达90％时，使用1ml含EDTA(EDTA质量浓度为0.25％)的胰酶进行消化，消化5min后，使用2ml培养液终止培养瓶内细胞消化，将培养瓶中3ml液体反复吹打均匀后，转移入15ml离心管，放置于Co60γ射线源处进行照射，照射总剂量为10Gy；辐照后的细胞拿回细胞房后平铺于培养瓶中继续培养，待细胞汇合达到80％以上可以继续进行传代，辐照后细胞按1：2比例进行传代；细胞辐照后可继续传代，第3代及其以后的细胞即为所述的可长期传代细胞株。
本发明的第三方面，提供一种如上所述的人皮肤成纤维细胞(HFF-1)伽马射线辐照后可长期传代细胞株在伽马射线辐照后慢性不愈合伤口研究中的应用。
本发明的第四方面，提供一种如上所述的人皮肤成纤维细胞(HFF-1)伽马射线辐照后可长期传代细胞株在伽马射线辐照后长期可传代细胞损伤机制研究中的应用。
本发明的第五方面，提供一种如上所述的人皮肤成纤维细胞(HFF-1)伽马射线辐照后可长期传代细胞株在伽马射线辐照后慢性不愈合伤口治疗药物的研制中的应用。
本发明通过细胞CCK-8增殖曲线、细胞凋亡实验和划痕实验，评价该细胞株的生物学特性。
本发明优点在于：
本发明采用人皮肤成纤维细胞(HFF-1)为诱导对象，对其使用特定剂量(10Gy)伽马射线辐照，小鼠胚胎成纤维细胞辐照后，细胞增殖减慢，凋亡增加，迁移能力减弱，这种细胞自身特性的改变不因细胞传代数的增加而发生改变，可随细胞本身的传代而遗传至下一代。
本发明制备的细胞模型可用于实验室对于辐照后长期可传代细胞损伤机制的研究，更加贴合临床鳞癌治疗中伽马射线放疗后皮肤伤口不愈合的实际；可用于分析伽马辐照后长期可传代细胞的形态学及生物学表型的变化，对造成这些变化的分子机制进行研究，可用于伽马辐照后伤口长期不愈合新药的研制，具有较高的科研和生产应用价值，在研究伤口放疗后不愈合的病理机制、新药物研发等方面具有重要的应用前景。
附图说明
图1是人皮肤成纤维细胞(HFF-1)的诱导建立示意图；
图2是光学显微镜下正常人皮肤成纤维细胞(HFF-1)和辐照后人皮肤成纤维细胞(HFF-1)第1代与第3代细胞形态；
图3是正常人皮肤成纤维细胞(HFF-1)和辐照后人皮肤成纤维细胞(HFF-1)第1代(A图)与第3代(B图)细胞CCK-8生长曲线图；
图4是人皮肤成纤维细胞(HFF-1)细胞凋亡检测图；其中A图为HFF-1细胞辐照后第1代细胞流式凋亡检测结果，B图为HFF-1细胞第3代细胞流式凋亡检测结果。
图5是人皮肤成纤维细胞(HFF-1)的划痕实验图；其中A图是第1代细胞辐照后划痕愈合情况，B图为第3代细胞辐照后划痕愈合情况。
具体实施方式
下面结合实施例对本发明提供的具体实施方式作详细说明。
实施例所用的人皮肤成纤维细胞(HFF-1)细胞购自美国ATCC细胞库；实施例所用的伽马射线辐照源来自海军军医大学辐照中心。
实施例1：辐照后可稳定长期传代人皮肤成纤维细胞(HFF-1)细胞建立验证
取人皮肤成纤维细胞(HFF-1)细胞复苏后用含质量浓度10％的胎牛血清(FBS)和质量浓度1％的青霉素-链霉素双抗生素溶液的DMEM培养基培养，于37℃，5％CO2培养箱中培养；待细胞混合程度达90％时，使用1ml含EDTA(EDTA质量浓度为0.25％)的胰酶进行消化，消化5min后，使用2ml培养液终止培养瓶内细胞消化，将培养瓶中3ml液体反复吹打均匀后，转移入15ml离心管，放置于Co60γ射线源处进行照射，照射总剂量为10Gy。辐照后的细胞拿回细胞房后平铺于培养瓶中继续培养，待细胞汇合达到80％以上可以继续进行传代，辐照后细胞按1：2比例进行传代。细胞辐照后可继续传代，第3代及其以后的细胞可以看做长期传代细胞株(图1)。
实施例2：辐照后可长期传代人皮肤成纤维细胞(HFF-1)细胞的形态学观察
倒置相差显微镜观察活细胞形态：分别取对数生长期的人皮肤成纤维细胞(HFF-1)对照细胞和人皮肤成纤维细胞(HFF-1)辐照细胞，生理盐水清洗换液后，在倒置显微镜(×200倍)下对第1代与第3代细胞观察活细胞形态。第1代细胞在伽马射线辐照后细胞形态未见明显变化，在逐渐传代过程中，细胞核颜色由淡转深，细胞结构变得松散，形态由卵圆形逐渐变为梭型，细胞间密度逐渐降低，边界模糊，部分细胞胞质内出现不规则囊泡，细胞膜透明变亮，呈现凋亡前形态(图2)。
实施例3：可长期传代人皮肤成纤维细胞(HFF-1)细胞的增殖曲线曲线测定
将正常对照细胞与辐照后的小鼠胚胎成纤维细胞，用胰酶消化后添加适合的新的培养基重悬细胞，按照5×103cells/ml的浓度接种到96孔板中，对照组、辐照组第1代、第3代每个各设5个对照，保证细胞均匀分散在每个培养孔中，放入培养箱中过夜，待其贴壁后进行检测。方法为每孔加入10μl CCK-8溶液,在37℃培养箱中培养1h，在476nm吸光波长下检测其吸光度OD值，根据细胞实际增长情况连续检测5-7d。应用SPSS 19.0软件系统进行统计学处理，以P﹤0.05为差异有统计学意义。实验重复3次。
连续检测两细胞的生长状态后发现：CCK-8细胞增殖实验结果显示，辐照后第1代细胞未出现明显的形态改变，第3代可见细胞结构较为松散，细胞形态由短梭型变为长椭圆形，胞质松散，部分细胞细胞膜清晰透亮，少量细胞核颜色变深。
CCK-8细胞增殖实验结果显示，人胚胎成纤维细胞辐照后第1代细胞的增殖与对照组相比明显减慢，第4、5天与对照组相比差异均有统计学意义(P<0.05)(图3A)。在传代过程中，这种差异可以基本保持不变，第1代与第3代各时间节点对比差异均无统计学意义(P>0.05)。
实施例4：可长期传代人皮肤成纤维细胞(HFF-1)细胞的凋亡检测
按细胞周期检测中同样步骤处理细胞，在辐照后24h后收集细胞，用0.5％的胰酶消化收集细胞，800rpm离心5min，弃去上清液，PBS洗涤2次，按AnnexinV——FITC和PI双染试剂盒的说明书提示检测凋亡情况，以未染色细胞作为调零参照，以AnnexinV——FITC和PI单染色管作为基准参照，辐照组与对照组各选3个样本，人皮肤成纤维细胞(HFF-1)第1代与第3代每代用FlowJo.V10软件获取参数并进行资料分析，计算凋亡细胞的百分比。实验重复3次。
分析结果显示：辐照组早期凋亡与晚期凋亡数目均有所增加，总凋亡数与对照组比较差异有统计学意义(P<0.05)，在逐渐传代过程中发现辐照组细胞存在持续凋亡现象，第3代总凋亡数目与第3代对照组比较差异依然有统计学意义(P<0.05)(图4)。
实施例5：可长期传代人皮肤成纤维细胞(HFF-1)细胞划痕修复能力检测
分别收集对数生长期NIH3T3的对照组细胞、辐照组细胞第1代、第3代细胞接种于6孔板内，待细胞汇合达到90％时，吸去培养液，PBS洗涤2次，24h后用20ul吸头进行划痕实验，划痕后用PBS洗细胞2次，去除划下的细胞，加入含1％FBS血清的培养基，放入37℃5％CO2培养箱培养，按0h、12h、24h 3个时间点取样，拍照，计算细胞24h迁移率，细胞24h迁移率＝(初始划痕宽度-24h时划痕宽度/初始划痕宽度)×100％。实验重复3次。
结果如图5所示，在辐照后细胞迁移能力持续减弱，传代过程中迁移能力持续减低。
以上已对本发明创造的较佳实施例进行了具体说明，但本发明创造并不限于所述实施例，熟悉本领域的技术人员在不违背本发明创造精神的前提下还可做出种种的等同的变型或替换，这些等同的变型或替换均包含在本申请权利要求所限定的范围内。

Claims (6)

1.一种人皮肤成纤维细胞伽马射线辐照后可长期传代细胞株，其特征在于，其构建方法包括以下步骤：
取人皮肤成纤维细胞细胞复苏后用含质量浓度10％的胎牛血清和质量浓度1％的青霉素-链霉素双抗生素溶液的DMEM培养基培养，于37℃，5％CO2培养箱中培养；待细胞混合程度达90％时，使用1ml含质量浓度0.25％EDTA的胰酶进行消化，消化5min后，使用2ml培养液终止培养瓶内细胞消化，将培养瓶中3ml液体反复吹打均匀后，转移入15ml离心管，放置于Co60γ射线源处进行照射，照射总剂量为10Gy；辐照后的细胞拿回细胞房后平铺于培养瓶中继续培养，待细胞汇合达到80％以上可以继续进行传代，辐照后细胞按1：2比例进行传代；细胞辐照后可继续传代，第3代及其以后的细胞即为所述的可长期传代细胞株。
2.根据权利要求1所述的人皮肤成纤维细胞伽马射线辐照后可长期传代细胞株，其特征在于，所述的可长期传代细胞株是在10Gy伽马射线辐照后，细胞损伤可以稳定遗传3代或以上的细胞株。
3.一种人皮肤成纤维细胞伽马射线辐照后可长期传代细胞株的构建方法，其特征在于，包括以下步骤：
取人皮肤成纤维细胞细胞复苏后用含质量浓度10％的胎牛血清和质量浓度1％的青霉素-链霉素双抗生素溶液的DMEM培养基培养，于37℃，5％CO2培养箱中培养；待细胞混合程度达90％时，使用1ml含质量浓度0.25％的胰酶进行消化，消化5min后，使用2ml培养液终止培养瓶内细胞消化，将培养瓶中3ml液体反复吹打均匀后，转移入15ml离心管，放置于Co60γ射线源处进行照射，照射总剂量为10Gy；辐照后的细胞拿回细胞房后平铺于培养瓶中继续培养，待细胞汇合达到80％以上可以继续进行传代，辐照后细胞按1：2比例进行传代；细胞辐照后可继续传代，第3代及其以后的细胞即为所述的可长期传代细胞株。
4.一种如权利要求1或2所述的人皮肤成纤维细胞伽马射线辐照后可长期传代细胞株在伽马射线辐照后慢性不愈合伤口研究中的应用。
5.一种如权利要求1或2所述的人皮肤成纤维细胞伽马射线辐照后可长期传代细胞株在伽马射线辐照后长期可传代细胞损伤机制研究中的应用。
6.一种如权利要求1或2所述的人皮肤成纤维细胞伽马射线辐照后可长期传代细胞株在伽马射线辐照后慢性不愈合伤口治疗药物的研制中的应用。
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RJ01 Rejection of invention patent application after publication

Application publication date: 20200110

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