CN110699324A

CN110699324A - 一种小鼠成纤维细胞肿瘤细胞株及其应用

Info

Publication number: CN110699324A
Application number: CN201911166130.1A
Authority: CN
Inventors: 顾玲; 李圆圆
Original assignee: West China Second University Hospital of Sichuan University
Current assignee: West China Second University Hospital of Sichuan University
Priority date: 2019-11-25
Filing date: 2019-11-25
Publication date: 2020-01-17
Anticipated expiration: 2039-11-25
Also published as: CN110699324B

Abstract

本发明公开了一种小鼠成纤维细胞肿瘤细胞株及其应用，该细胞株为国内外首次建立的白血病相关小鼠成纤维细胞肿瘤细胞株，其细胞名称是小鼠成纤维细胞肿瘤细胞株HXWMF‑1，保藏编号为CCTCC NO:C2019244，可用于建立小鼠成纤维细胞肿瘤动物模型等多方面的应用。

Description

一种小鼠成纤维细胞肿瘤细胞株及其应用

技术领域

本发明是一种小鼠成纤维细胞肿瘤细胞株及其应用，具体涉及白血病相关小鼠成纤维细胞肿瘤细胞株HXWMF-1及其应用，属于生物医学技术领域。

背景技术

成纤维细胞，也称纤维母细胞，是疏松结缔组织中的主要细胞成分。肿瘤相关成纤维细胞（tumor-associated fibroblasts, TAFs）是肿瘤微环境中活化的成纤维细胞，是肿瘤间质细胞的主要细胞成分，也是构成肿瘤微环境的重要组成部分。TAFs分泌多种生长因子和细胞因子，如VEGE、HGF、TGFβ、IL-6、IL-8、CCL2、CCL5、CXCL9和PGE2等，为肿瘤生长提供有利的微环境，促进肿瘤生长、转移、诱导血管生成，甚至参与诱导肿瘤耐药，影响患者预后。随着对肿瘤研究的深入，肿瘤微环境日益受到关注，其与肿瘤的发生、发展和转归密不可分。白血病相关成纤维细胞于2019年9月在BLOOD杂志初见报道，目前，国内外尚无白血病相关成纤维细胞肿瘤以及肿瘤相关成纤维细胞肿瘤的报道，也无相关细胞株的报道。

已有研究报道，体外诱导得到的肿瘤相关成纤维细胞TAF能够促进白血病细胞抵抗化疗，参见尹春荣等在“肿瘤相关成纤维细胞可介导急性髓系白血病细胞抵抗化疗”（《肿瘤》，TUMOR Vol.36,July 2016,758-764）对骨髓中肿瘤相关成纤维细胞TAF在急性髓系白血病化疗抵抗中的作用做出的研究，经研究发现，TGFβ受体拮抗剂SB431542能够减弱CAF对白血病细胞的化疗保护作用，提示了TGFβ通路在TAF介导白血病细胞抵抗化疗的过程中亦起到了关键作用。

发明内容

本发明的目的在于提供一种小鼠成纤维细胞肿瘤细胞株，该细胞株为国内外首次建立的白血病相关小鼠成纤维细胞肿瘤细胞株。

本发明通过下述技术方案实现：一种小鼠成纤维细胞肿瘤细胞株，其细胞名称是小鼠成纤维细胞肿瘤细胞株HXWMF-1，保藏编号为CCTCC NO：C2019244，保藏日期：2019年9月26日，保藏单位：中国典型培养物保藏中心，保存单位地址：湖北省武汉市武昌区八一路299号武汉大学校内（武汉大学第一附小对面），武汉大学保藏中心。

所述小鼠成纤维细胞肿瘤细胞株来源于人白血病细胞裸鼠移植瘤模型，是一株白血病相关小鼠成纤维细胞肿瘤细胞株。

进一步的，该细胞株为原代建株的小鼠成纤维细胞肿瘤细胞株。该细胞株的原代细胞来源于人急性淋巴细胞白血病细胞株接种于裸鼠裸区皮下所形成的移植瘤；取肿块剪碎成单细胞，体外接种培养，去除悬浮细胞，获得贴壁生长细胞；细胞传代10代后，形态比较均一，梭形或不规则三角形，核浆比倒置，核仁清晰，无接触抑制，可交叉重叠生长，细胞密集时成团聚集；在体外稳定无限传代，具高致瘤性；命名为小鼠成纤维细胞肿瘤细胞株HXWMF-1。

本发明还提供了该小鼠成纤维细胞肿瘤细胞株在建立小鼠成纤维细胞肿瘤动物模型中的应用、在获取白血病细胞所导致的成纤维细胞肿瘤化生的机制中的应用、在获取白血病相关成纤维细胞肿瘤与白血病微环境的关系中的应用、以及在获取白血病相关成纤维细胞肿瘤与白血病化疗耐药的关系和机制中的应用。为白血病治疗提供新的思路和靶点；体外建立白血病微环境研究平台；探索靶向TAFs的肿瘤治疗新方法，等多方面的应用。

本发明涉及的小鼠成纤维细胞肿瘤细胞株HXWMF-1具有以下生物学特性：

经STR检测分析，其结果如下表1所示：HXWMF-1细胞DNA进行小鼠细胞STR分型，扩增后图谱清晰，分型结果良好，为小鼠来源细胞。

表1：HXWMF-1细胞的STR位点分型

经western bloting和流式细胞检测结果显示：该细胞高表达S100A4，α-SMA，Vimentin，HSP47，CD34，LY-6A和CD166，为成纤维细胞来源肿瘤。

HXWMF-1细胞在RPMI 1640完全培养基中贴壁生长，呈梭形，形态比较均一，体外培养生长良好，按1.5×10⁵/55cm²密度接种，3～4天传代一次，已经体外连续培养超过18个月，传代超过100代，群体倍增超过600代，连续传代过程中细胞形态比较均一、增殖动力学稳定、遗传学特征稳定，状态良好；经液氮或超低温冻存、复苏后性状不变，为一株永生化细胞株。

采用MTT和台盼蓝染色细胞计数法绘制HXWMF-1细胞的生长曲线，计算细胞倍增时间为12～18小时，增殖速率稳定，可见分裂相，分裂后细胞仍贴壁；证实细胞株具有增殖动力学稳定性。

采用PI染色法证实，HXWMF-1细胞为近4倍体细胞，具有细胞周期稳定性。

本发明与现有技术相比，具有以下优点及有益效果：

（1）本发明为目前首次建立的白血病相关小鼠成纤维细胞肿瘤细胞株HXWMF-1，该细胞株具有高致瘤性，可用于建立小鼠成纤维细胞肿瘤动物模型，将HXWMF-1细胞接种裸鼠，接种后2天即可在皮下触及肿块，5天后肿块迅速生长，致瘤率100%，且成瘤细胞与体外培养的HXWMF-1细胞来源一致。

（2）本发明可将小鼠成纤维细胞肿瘤细胞株HXWMF-1应用于白血病微环境的研究中，获取白血病细胞导致成纤维细胞肿瘤化生的相关数据，获取白血病相关成纤维细胞肿瘤与白血病微环境的关系的相关数据，为其在治疗白血病过程中获取白血病化疗耐药等相关数据。

附图说明

图1为倒置相差显微镜下HXWMF-1细胞观察图（×200）。

图2 为普通光学显微镜下HXWMF-1细胞瑞士-吉木萨染色图（×400）。

图3为HXWMF-1细胞生长曲线图。

图4为HXWMF-1细胞周期图。

图5为Western blotting检测HXWMF-1细胞S100A4，α-SMA，Vimentin，HSP47表达图。

图6 为HXWMF-1细胞裸鼠皮下肿瘤形成实验图。

图7为HXWMF-1细胞裸鼠皮下肿瘤生长曲线图。

图8为HXWMF-1细胞裸鼠皮下肿瘤HE染色图（×200）。

具体实施方式

下面结合实施例对本发明作进一步地详细说明，但本发明的实施方式不限于此。

实施例1：

本实施例涉及小鼠成纤维细胞肿瘤细胞株HXWMF-1的分离和建株。

（1）将处于对数生长期的人急性淋巴细胞白血病细胞HXEX-ALL1按5×10⁶个/100µl/只，接种于雌性 Balb/c (nu/nu) 小鼠（5周龄，体重14～16g）裸区皮下；隔日观察接种部位肿瘤生成情况，接种10天后肿块体积约920 mm³，取瘤块制成细胞悬液；按5×10⁵个/ml 密度将细胞重悬在含10%胎牛血清（Thermo公司）的RPMI 1640培养基（Gibco公司）中，置37℃、饱和湿度、5% CO₂培养箱培养。3天后可见贴壁细胞生长，去除上清和悬浮细胞，每3~5天换液，24天后贴壁细胞形态较均一，接种40天后细胞增殖加快。

（2）HXWMF-1细胞传代时的初始密度为1.5×10⁵个/55cm²，当细胞增殖到90%融合时1:5传代。

（3）HXWMF-1细胞冻存前48小时换液，使细胞处于对数生长期，计数细胞，无菌条件下，将细胞转入离心管，1200转/分离心5分钟，弃上清，加入冻存液，调整细胞浓度为3×10⁶个/ml，充分混匀，移入无菌冻存管，4℃，30min； -20℃，60min；-80℃过夜，次日移入液氮。

（4）复苏时，从液氮中取出冻存管，迅速置于37℃温水中，待冻存物融化后，将细胞悬液移入加入5ml RPMI 1640培养基的离心管中，轻柔混匀，1200转/分，离心5分钟，弃上清，细胞沉淀中加入RPMI 1640完全培养基，混匀，转移入培养皿，置37℃、饱和湿度、5% CO₂培养箱培养。

（5）HXWMF-1细胞经反复如上述方法3）和方法4）冻存复苏，稳定生长，不影响细胞的生物学特征，显微镜下见细胞形态比较均一，梭形或不规则三角形，贴壁生长，细胞倍增时间维持在12～20小时。

（6）所述RPMI 1640完全培养基的配方为：90% RPMI 1640培养基，10%胎牛血清。

（7）所述冻存液的配方为：60% RPMI 1640培养基，30%胎牛血清，10% DMSO（Sigma公司）。

实施例2：

本实施例涉及小鼠成纤维细胞肿瘤细胞株HXWMF-1的生长和生物学特性鉴定。

（1）细胞形态学观察：

取对数生长期的HXWMF-1细胞于倒置显微镜下观察活细胞形态，如图1所示，细胞贴壁生长，形态比较均一，梭形或不规则三角形，核浆比倒置，核仁清晰，无接触抑制，可交叉重叠生长，细胞密集时成团聚集；常规爬片固定，瑞士-吉木萨染色，于正置显微镜下观察细胞形态，如图2所示，见细胞梭形，核浆比大，可见分裂相，核圆形，可见多个核仁。

（2）生长曲线和倍增时间测定：

离心收集对数生长期的细胞，调整细胞浓度为1×10⁴个/9.6cm²，接种于6孔板中，置37℃、5%CO₂、21% O₂培养箱中培养8天，每天用台盼蓝染色计数细胞。以时间为横坐标，细胞数为纵坐标，绘制细胞生长曲线，如图3所示，计算细胞倍增时间为12～18小时，可见细胞株经反复传代，群体倍增次数到600多代，仍然保持增殖动力学稳定性。

（3）PI染色法监测细胞周期：

收获1×10⁶个细胞，4℃预冷PBS洗2次，4℃ 70% 乙醇固定过夜，4℃ PBS洗2次，PI室温避光染色10min，流式细胞仪检测细胞的G₁/G₀、S及G₂/M期的比率，结果如图4所示，HXWMF-1细胞为近四倍体细胞，经反复传代，能保持细胞周期稳定性。

（4）STR检测证实HXWMF-1细胞为小鼠来源细胞。

（5）流式细胞检测结果显示：该细胞高表达S100A4，CD34，LY-6A和CD166。

（6）western bloting检测结果显示：该细胞高表达S100A4，α-SMA，Vimentin和HSP47，为成纤维细胞来源肿瘤，如图5所示。

（7）以上结果显示，白血病细胞可以导致成纤维细胞肿瘤化生。

实施例3

本实施例涉及将细胞株HXWMF-1建立成纤维细胞肿瘤动物模型。

裸鼠成瘤实验：将处于对数生长期的HXWMF-1细胞按3×10⁶个/100µl/只，接种于雌性 Balb/c (nu/nu) 小鼠（5周龄，体重14～16g）裸区皮下；隔日观察接种部位肿瘤生成情况，结果如图6和图7所示，接种2天后可在裸鼠皮下触及米粒大小肿块，接种5天后肿瘤迅速生长，隔天测量肿块大小，可见肿块体积从第5天的161 mm³生长到第15天的2835 mm³，15天后取瘤块，留取部分组织行多聚甲醛固定，石蜡包埋，切片，HE染色（见图8）显示肿瘤细胞排列紧密，生长活跃，核质深染，免疫组织化学染色检测结果提示该肿瘤高表达S100A4，α-SMA，Vimentin和HSP47。

以上所述，仅是本发明的较佳实施例，并非对本发明做任何形式上的限制，凡是依据本发明的技术实质对以上实施例所作的任何简单修改、等同变化，均落入本发明的保护范围之内。

Claims

1.一种小鼠成纤维细胞肿瘤细胞株，其特征在于：其细胞名称是小鼠成纤维细胞肿瘤细胞株HXWMF-1，保藏编号为CCTCC NO：C2019244，保藏日期：2019年9月26日，保藏单位：中国典型培养物保藏中心。

2.根据权利要求1所述一种小鼠成纤维细胞肿瘤细胞株，其特征在于：所述小鼠成纤维细胞肿瘤细胞株来源于人白血病细胞裸鼠移植瘤模型，是一株白血病相关小鼠成纤维细胞肿瘤细胞株。

3.根据权利要求1所述小鼠成纤维细胞肿瘤细胞株在建立小鼠成纤维细胞肿瘤动物模型中的应用。

4.根据权利要求1所述小鼠成纤维细胞肿瘤细胞株在获取白血病细胞所导致的成纤维细胞肿瘤化生的机制中的应用。

5.根据权利要求1所述小鼠成纤维细胞肿瘤细胞株在获取白血病相关成纤维细胞肿瘤与白血病微环境的关系中的应用。

6.根据权利要求1所述小鼠成纤维细胞肿瘤细胞株在获取白血病相关成纤维细胞肿瘤与白血病化疗耐药的关系和机制中的应用。