CN103387958A - 人胚肺成纤维细胞sv-7及其应用 - Google Patents

Abstract

本发明提供保藏号为CGMCC No.6956的人胚肺成纤维细胞SV-7及其应用，SV-7细胞特征明显，生长旺盛，生命周期长，平均群体倍增水平为60代，且纯净无污染，培养方法简单，对多种病毒具有适应性，可用于水痘带状疱疹病毒、肠道病毒71型、脊髓灰质炎病毒、柯萨奇A16病毒、风疹病毒、甲肝病毒、狂犬病病毒、轮状病毒、麻疹病毒的培养，进一步可用于针对上述病毒的疫苗的研发和制备。细胞培养成本低廉，具有良好的经济价值和广阔的应用前景。

Description

人胚肺成纤维细胞SV-7及其应用

技术领域

本发明涉及生物技术领域，具体地说，涉及人胚肺成纤维细胞SV-7及其应用。

背景技术

人二倍体细胞来源于正常的人组织，可以在体外进行有限代次的传代培养并建立稳定的细胞库体系，具有正常的人二倍体染色体数目，无潜在的致肿瘤性。对人用疫苗而言，使用人二倍体细胞为基质，无需考虑外源细胞蛋白和外源DNA残留量的影响。目前国内、外用于疫苗生产的人二倍体细胞主要有WI-38、MRC-5、2BS、KMB-17等。40多年的临床使用经验表明人二倍体细胞作为疫苗生产用细胞基质具备良好的安全性和有效性。

人二倍体细胞液存在某些缺点，影响其在疫苗生产中的广泛应用，例如细胞的繁殖代次有限，培养条件要求较高，培养时间较长，病毒产量较低等，国内外在使用人二倍体细胞过程中存在的主要问题包括：

（一）原始种子匮乏，细胞极限寿命较短，病毒产量低。前述的4种国内外通用人二倍体细胞极限寿命均为50代左右，生产使用代次限定在40代以内。从官方或其他正规渠道获得的原始细胞种子代次接近20代，很难将细胞扩增达到理想的生产规模，同时细胞代次越高培养难度越大，细胞的生长状态越差，这些都会直接影响到病毒的产量，增加生产成本。

（二）细胞的使用权限和范围的限制。可获得的用于生产的上述细胞株数量十分有限，如果用于生产则需要支付高昂的使用许可费，同时限定了生产疫苗的种类，严重阻碍了企业开发和生产更多品种。

由此可见，现有的人二倍体细胞株已经无法满足目前疫苗生产的需求，研制并开发出生物特性良好，病毒适应范围广，生产病毒较容易的人二倍体细胞基质成为疫苗生产领域的迫切需求。

发明内容

本发明的目的是提供人胚肺成纤维细胞SV-7及其应用。

为了实现本发明目的，本发明从具有如图1所示核型的14周龄的男性胚胎中取出一部分人胚肺组织。将该肺组织经过剪碎预处理后用PBS缓冲液（pH值7.2）浸润洗涤，然后用含有胶原酶的组织消化液进行处理直至细胞分离无明显可视组织块，再将细胞悬液进行过滤和离心处理。细胞重悬后至细胞密度5×10⁵个/mL，转移至细胞培养瓶中进行连续培养。通过染色体核型检测，表明该细胞株是正常的人二倍体细胞株，命名为人胚肺成纤维细胞SV-7，现已保藏于中国微生物菌种保藏管理委员会普通微生物中心，地址北京市朝阳区大屯路，中国科学院微生物研究所，邮编100101，保藏日期2012年12月7日，保藏编号CGMCC No.6956。

本发明还提供SV-7的体外培养方法，将SV-7细胞接种于含有5-10%胎牛或小牛血清的MEM、M199或DMEM培养基中，置于35-37℃，5%CO₂条件下培养。

本发明还提供SV-7在病毒培养中的应用，或利用SV-7细胞制备病毒液的方法：SV-7细胞经扩增及传代培养，在传代后的SV-7细胞上接种病毒，培养和收获感染后的SV-7细胞，获得病毒悬液。纯化后的病毒悬液可用于疫苗制备。

前述应用或方法中，所述的病毒为水痘带状疱疹病毒、肠道病毒71型、脊髓灰质炎病毒、柯萨奇A16病毒、风疹病毒、甲肝病毒、狂犬病病毒、轮状病毒或麻疹病毒等。

前述应用或方法中，先将SV-7细胞培养至细胞汇合度90-100%，按1:2-4的分种比例传代培养，待细胞达到90-100%汇合度时接种病毒。

前述应用或方法中，按0.01-0.1MOI在传代后的SV-7细胞上接种病毒，置于33-37℃，5%CO₂条件下培养。

前述应用或方法中，培养SV-7细胞使用的培养基为含有5-10%胎牛或小牛血清的MEM、M199或DMEM培养基。

本发明提供的人胚肺成纤维二倍体细胞SV-7，在目前检测水平下，未检测到细胞内外源病毒因子污染，为纯净无污染的人二倍体成纤维细胞。

本发明提供的人胚肺成纤维二倍体细胞SV-7在裸鼠动物试验中得以证明该细胞株不具有致肿瘤性。

本发明提供的人胚肺成纤维二倍体细胞株SV-7具有如下生物学特性：

（1）成纤维二倍体细胞特征明显，细胞生长旺盛

如图2A和图2B所示，SV-7细胞在光镜下显示出典型的梭形，呈纤维状极性生长。随着细胞代次的增高，细胞出现个体增大，性状变长，生长速度缓慢，直至停止，证明细胞具有终极寿命特征。如图3A和图3B所示，SV-7细胞在电镜下显示细胞在生长期轮廓完整，细胞核大，细胞内均有十分丰富的内质网、核糖体、线粒体，证明细胞生命状态旺盛。

（2）细胞生命周期长

本发明的人胚肺成纤维二倍体细胞SV-7细胞周期最长平均可达60代。

（3）本发明的人胚肺二倍体细胞纯净，无其它细胞污染

本发明提供一种鉴别SV-7细胞的方法，其是利用多组固定的细胞遗传标记对细胞进行鉴别检测，即STR图谱分析法。本发明通过对SV-7细胞整个生命期内5个代次的STR图谱（16个位点）进行检测，结果表明所有位点完全一致，证明具备人源二倍体细胞特性，各个代次均未受到其它细胞的污染，为同一个体的细胞。

（4）细胞培养简单

在含有5-10%的胎牛或小牛血清的MEM、M199或DMEM培养基中，于35-37℃，5%CO₂条件下培养SV-7细胞，待形成致密单层后，按照传代比例1:2-4进行连续传代。

（5）对风疹病毒敏感性较高

通过对本发明的SV-7细胞进行多种病毒的适应性研究，包括水痘带状疱疹病毒，肠道病毒71型、脊髓灰质炎病毒和柯萨奇A16病毒，风疹病毒，甲肝病毒，狂犬病病毒和轮状病毒等。SV-7细胞株对狂犬病病毒的适应性高，病毒传代过程中滴度均高于5.0lgLD₅₀/mL，病毒滴度最高可达6.5lgLD₅₀/mL，并逐代稳定。SV-7细胞株对风疹病毒、麻疹病毒、甲肝病毒、肠道病毒71型、柯萨奇A16病毒、轮状病毒、脊髓灰质炎病毒和麻疹病毒均具有良好的适应性，病毒滴度（或抗原含量）不低于同类人二倍体细胞，可用于规模化生产。

附图说明

图1为SV-7株细胞核型图；其中，图1A为完成排列的染色体核型图谱，图1B为电镜下观察到的染色体核型图。

图2为SV-7细胞光镜下的照片；其中，图2A为20代SV-7细胞形态特征，图2B为30代SV-7细胞形态特征。

图3为SV-7细胞电镜的照片；其中，图3A为20代SV-7细胞核形态特征，图3B为20代SV-7细胞质形态特征。

图4为SV-7细胞每代的生长时间。

图5为SV-7细胞株的STR图谱。

图6为按MOI0.001接种时，水痘带状疱疹病毒的滴度。

图7为SV-7细胞培养狂犬病病毒连续传代病毒滴度结果。

图8为肠道病毒71型在SV-7细胞中的增殖曲线。

图9为SV-7细胞培养肠道病毒71型连续传代病毒滴度结果。

图10为柯萨奇A16病毒在SV-7细胞中的增殖曲线。

图11为SV-7细胞培养柯萨奇A16病毒连续传代病毒滴度结果。

图12为在SV-7和MRC-5细胞中培养的风疹病毒的滴度结果。

图13为G1血清型轮状病毒在SV-7细胞中的增殖曲线。

图14为SV-7细胞培养G1血清型轮状病毒连续传代病毒滴度结果。

图15为按MOI0.01-0.1接种时，甲肝病毒在SV-7和2BS细胞中的滴度比较。

图16为按MOI0.01-0.1接种时，脊髓灰质炎病毒在SV-7株细胞中的生长曲线。

具体实施方式

以下实施例用于说明本发明，但不用来限制本发明的范围。若未特别指明，实施例中所用的技术手段为本领域技术人员所熟知的常规手段，所用原料均为市售商品。

实施例1SV-7细胞株的获得与核型分析

1SV-7细胞株的获得

从具有如图1A和图1B所示核型的14周龄的男性胚胎中取肺组织边缘剪碎成约1mm³的组织块，用PBS溶液（pH值7.2）润洗2分钟，吸弃上清，重复3次。用含0.2%Ⅰ型胶原酶的组织消化液在37℃消化30分钟。每隔8分钟振荡一次，用含15%胎牛血清的细胞生长液吹打，使细胞分离直至无明显可视组织块。将细胞悬液经100目不锈钢筛网过滤后进行离心，1000-1200转/分钟，离心5分钟。重悬至细胞密度为5×10⁵/mL左右，移入T75细胞培养瓶中，置于36.5±0.5℃，5%CO₂培养箱内培养。再用0.25%胰蛋白酶处理后，对细胞进行连续培养。获得的人二倍体细胞SV-7最长生命周期为61代，平均为60代，如表1所示。随着代次的增加，SV-7株细胞的生长速度缓慢，符合正常的人二倍体细胞的特性。

表1SV-7株细胞的生命周期

实验表明，在含有5-10%的胎牛血清的MEM培养基中，于35～37℃，5%CO₂条件下培养SV-7细胞，待形成致密单层后，按照传代比例1:2-4进行连续传代，可得到用于病毒培养的细胞。

在含有5-10%的胎牛血清的M199培养基中，于35～37℃，5%CO₂环境下培养SV-7细胞，待形成致密单层后，按照传代比例1:2-4进行连续传代，可得到用于病毒培养的细胞。

在含有5-10%的胎牛血清的DMEM培养基中，于35～37℃，5%CO₂环境下培养SV-7细胞，待形成致密单层后，可得到用于病毒培养的细胞。

2比较SV-7细胞株和其它二倍体细胞株染色体的核型

用秋水仙素处理细胞，观察细胞的染色体，根据《中国药典》2010年版第三部的要求，与同类人二倍体比较染色体的倍数、数目、形态和结构。随机取500个分裂中期细胞观察，并选择了50个分裂中期细胞进行显微照相，做核型分析，与其他同类人二倍体细胞的比较结果如表2所示。

表2SV-7细胞与其它人二倍体细胞的染色体核型比较

注：*括号外数字为百分数，**括号内数字为检查细胞个数

3SV-7株细胞的遗传标志检测

细胞的遗传标志检测采用了STR图谱分析法，STR（short tandemrepeat）一般由2-6个碱基序列组成，核心序列串联重复排列，对于同一个体的重复次数是固定的。STR图谱分析法能够准确检测出细胞间的交叉污染，是细胞性质和交叉污染鉴定的最有效和准确的方法。本实施例通过对SV-7细胞整个生命期内6个代次的STR图谱（16个位点）进行检测，结果位点完全一致。各位点的分析结果如下：Amelogenin：X,Y；vWA：17,18；D21S11：28,31.2；D18S51：20,22；PentaE：16,18；D5S818：12,13；D13S317：8,12；D7S820：12,12；D16S539：11,13；FGA：23,23；D3S1358：15,15；TH01：9,9；D8S1179：16,16；TPOX：8,9；CSF1PO：11,12；PentaD：9,10。图5为STR图谱分析结果，可通过每个位点上的两个阿拉伯数字和对应的峰进行识别。通过染色体核型检测，证明本发明的SV-7细胞株是正常的人胚肺成纤维二倍体细胞株，

实施例2水痘带状疱疹病毒在SV-7细胞株中的适应性

将Oka株水痘带状疱疹病毒（来自ATCC，编号为VR-795）工作种子按照MOI为0.001接种至SV-7和MRC-5细胞，将接种病毒的细胞瓶置于35.0±1.0℃吸附1小时，每20分钟摇匀一次；吸附结束后补加病毒维持液，置于35.0±1.0℃培养箱中继续培养。为保证细胞及病毒生长，病毒培养过程中每48±4小时更换一次病毒培养液，分别于接毒后的第12、24、36、48、60、72、84、96、108、120、132、144、168、192和216小时显微镜下观察并记录病变状态，弃掉培养液用PBS溶液洗细胞表面，再加入PBS溶液，冻融细胞，采用微量细胞病变法进行病毒滴定。结果见图6。

实施例3狂犬病病毒在SV-7细胞株中的适应性

1、将实施例1中获得的人二倍体细胞株SV-7培养成致密单层，用0.25%胰蛋白酶消化，并用含有10%牛血清的MEM、EMEM、DMEM、M199及L60等培养基收集并制备成3×10⁵个/mL细胞悬液，将狂犬病病毒CTN-1V株按照MOI为0.01-0.1接种至细胞，添加病毒维持液，置于33℃培养13天，观察细胞病变，每2天更换病毒维持液，收获的细胞上清液检测病毒滴度。表3为不同代次的SV-7细胞接种狂犬病毒的滴度结果。

表3不同代次的SV-7细胞培养的狂犬病毒的滴度结果

2、病毒传代稳定性：病毒培养9天后，收获病毒液，作为传代用狂犬病病毒种子。将狂犬病病毒种子在新建人二倍体细胞SV-7株上连续传18代，观察细胞病变并检测病毒滴度，以检测病毒在新建人二倍体细胞SV-7株上的传代稳定性。结果表明，SV-7细胞株对狂犬病毒的敏感性高，病毒传代过程中滴度均高于5.0lgLD₅₀/ml，病毒滴度最高为7.0lgLD₅₀/mL，并逐代稳定（图7）。

实施例4EV71病毒在SV-7细胞株中的适应性

1、培养实施例1中获得的人二倍体细胞株SV-7，并传代培养至2×10⁷个/175cm²，将EV71病毒（由北京科兴中维生物技术有限公司提供）工作种子按照MOI为0.01-0.1接种至SV-7细胞，添加2%胎牛或小牛血清病毒维持液，置于36±1℃培养7天，观察细胞病变，同时每天取样检测病毒抗原含量。结果见图8。结果表明，EV71病毒培养2天后病毒滴度逐渐升高，培养至8天时达到峰值396U/mL，可见SV-7株对EV71病毒有良好的敏感性。

2、病毒传代稳定性：当细胞病变程度达到+++至++++时，冻融细胞收获病毒液，作为传代用EV71病毒种子。将EV71病毒种子在SV-7细胞上连续传8代，观察细胞病变并检测病毒滴度，以检测病毒在新建人二倍体细胞上的传代稳定性。结果见图9。滴度结果显示EV71病毒在新建人二倍体细胞SV-7上传代稳定，且产毒量相对较高，连续8代滴度均高于5.5lgCCID₅₀/mL，最高可达6.9lgCCID₅₀/mL。

实施例5柯萨奇A16病毒在SV-7细胞株中的适应性

1、培养实施例1中获得的人二倍体细胞株SV-7，并传代至2×10⁷个/175cm²适宜数量，将CA16病毒（CGMCC No.5371）工作种子按照MOI为0.001-0.01接种至细胞，添加2%牛血清病毒维持液，置于36±1℃培养10天，观察细胞病变，同时每天取样检测病毒抗原含量。结果见图10。CA16病毒培养2天后抗原含量逐渐升高，培养至5天时达到峰值894.7U/mL，随后6天病毒抗原结果趋于平稳。

2、病毒传代稳定性：当细胞病变程度达到+++至++++时，冻融细胞收获病毒液，作为传代用CA16病毒种子。将CA16病毒种子在SV-7细胞上连续传10代，观察细胞病变并检测病毒滴度，以检测病毒在人二倍体细胞SV-7株上的传代稳定性。结果见图11，结果表明CA16病毒种子在SV-7细胞上连续传4代病毒滴度维持在5.63～5.90lgCCID₅₀/mL，具有良好的传代稳定性。

实施例6风疹病毒在SV-7细胞株中的适应性

培养MRC-5细胞和SV-7细胞至2×10⁷个/175cm²，将风疹病毒工作种子RA27/3株（ATCC编号为VR-135q^Tm）按照MOI为0.01-0.1接种细胞，添加2%牛血清的细胞维持液，置于32.0±1℃培养，每隔一天取样并检测病毒滴度，在第6、12天收获全部病毒液，更换细胞维持液，共培养18天。结果见图12。结果表明SV-7细胞株对风疹病毒的敏感性较高，连续18天病毒滴度均高于6.0lgCCID₅₀/mL，第6天达到最高峰为6.7lgCCID₅₀/mL。

实施例7轮状病毒在SV-7细胞株中的适应性

培养实施例1中获得的人二倍体细胞SV-7株，并传代至2×10⁷个/175cm²，将G1、G2、G3、G4、G9、P1A[8]、G5和G8血清型的人牛（UK）重配轮状病毒（来自美国国立卫生院NIH）工作种子按照MOI为0.01-0.1分别接种至SV-7细胞，添加病毒维持液，置于36±1℃培养3-5天，观察细胞病变，同时每天取样检测病毒滴度。结果见图13。轮状病毒培养1天后病毒滴度逐渐升高，培养至3天时达到峰值7.2lgCCID₅₀/mL，3天后随着细胞病变程度达到++++，细胞完全病变脱落，病毒滴度出现降低。

2、病毒传代稳定性：当细胞病变程度达到++至+++时，冻融细胞收获病毒液，作为传代用轮状病毒种子。将轮状病毒种子在SV-7细胞上连续传10代，观察细胞病变并检测病毒滴度，以检测病毒在新建人二倍体细胞上的传代稳定性。结果见图14，结果表明轮状病毒在SLF-细胞上的连续10代病毒滴度维持在6.8～7.8lgCCID₅₀/mL，产毒量较高且较稳定。

实施例8甲肝病毒在SV-7细胞株中的适应性

培养实施例1中获得的人二倍体细胞SV-7株，并传代至2×10⁷个/175cm²时，将甲肝病毒种子TZ84株按照MOI为0.01-0.1接种至SV-7细胞，添加病毒维持液，置于33℃培养28天，观察细胞病变，培养14天后每天取样检测甲肝病毒抗原含量，病毒培养至28天。

甲肝病毒在人二倍体细胞SV-7株和2BS株中均不产生细胞病变。其在人二倍体细胞SV-7株和2BS株中抗原含量及其抗原含量的变化趋势基本一致，随着培养时间的延长，抗原含量增加，甲肝抗原含量的变化范围为1100～2800U/mL（图16）。

实施例9髓灰质炎病毒在SV-7细胞株中的适应性

将长成致密单层的SV-7株细胞弃掉培养液，消化后，用含有10%牛血清的MEM培养基将细胞收集，制成3.0～5.0×10⁵个/mL的悬液，按照MOI为0.01-0.1，分别加入SabinⅠ、Ⅱ、Ⅲ型病毒（来自ATCC，编号VR-302、301、300），置于33℃摇床悬浮吸附25min。将悬浮吸附好的病毒接种于培养瓶中，于33℃静置培养，结果见图17。脊灰病毒培养12小时后病毒滴度逐渐升高，培养至60小时后可达到8.5lgCCID₅₀/mL。

实施例10麻疹病毒在SV-7细胞株中的适应性

将长成单层SV-7细胞弃掉培养液，消化后，按体积比1:2传代，毒种的感染剂量MOI为1:1000。将细胞、病毒和培养液同时分装到175cm²瓶中，60ml/瓶，置37℃培养。当细胞病变达50％以上时，用3000mL PBS冲洗细胞，去除血清，加入细胞维持液60mL／瓶，置35℃培养。当细胞病变达90％以上时，收到4℃冷库，释放病毒1周，按0.3％加入人白蛋白作保护剂。表4为不同代次的SV-7培养麻疹病毒的滴度结果。

表4不同代次的SV-7细胞培养麻疹病毒的滴度结果

虽然，上文中已经用一般性说明及具体实施方案对本发明作了详尽的描述，但在本发明基础上，可以对之作一些修改或改进，这对本领域技术人员而言是显而易见的。因此，在不偏离本发明精神的基础上所做的这些修改或改进，均属于本发明要求保护的范围。

Claims (8)

1.人胚肺成纤维细胞SV-7，其保藏编号为CGMCC No.6956。

2.权利要求1所述细胞SV-7的体外培养方法，其特征在于，将SV-7细胞接种于含有5-10%胎牛或小牛血清的MEM、M199或DMEM培养基中，置于35-37℃，5%CO₂条件下培养。

3.权利要求1所述细胞SV-7在病毒培养中的应用。

4.根据权利要求3所述的应用，其特征在于，所述病毒为水痘带状疱疹病毒、肠道病毒71型、脊髓灰质炎病毒、柯萨奇A16病毒、风疹病毒、甲肝病毒、狂犬病病毒、轮状病毒或麻疹病毒。

5.根据权利要求3所述的应用，其特征在于，SV-7细胞经扩增及传代培养，在传代后的SV-7细胞上接种病毒，培养和收获感染后的SV-7细胞，获得病毒悬液。

6.根据权利要求5所述的应用，其特征在于，先将SV-7细胞培养至细胞汇合度90-100%，按1:2-4的分种比例传代培养，待细胞达到90-100%汇合度时接种病毒。

7.根据权利要求5所述的应用，其特征在于，按0.01-0.1MOI在传代后的SV-7细胞上接种病毒，置于33-37℃，5%CO₂条件下培养。

8.根据权利要求5所述的应用，其特征在于，培养SV-7细胞使用的培养基为含有5-10%胎牛或小牛血清的MEM、M199或DMEM培养基。

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