CN111004772A

CN111004772A - 一种人二倍体细胞zfb细胞及其构建方法、规模化培养方法

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Publication number: CN111004772A
Application number: CN201910851946.1A
Authority: CN
Inventors: 蒋仁生; 徐文龙; 沈慧莉; 靳正伟; 陶立峰; 谭小东; 杨世龙
Original assignee: Anhui Zhifei Longcom Biopharmaceutical Co ltd; Chongqing Zhifei Biological Products Co Ltd; Beijing Zhifei Lvzhu Biopharmaceutical Co Ltd
Current assignee: Anhui Zhifei Longcom Biopharmaceutical Co ltd; Chongqing Zhifei Biological Products Co Ltd; Beijing Zhifei Lvzhu Biopharmaceutical Co Ltd
Priority date: 2019-09-10
Filing date: 2019-09-10
Publication date: 2020-04-14

Abstract

本发明公开一种人二倍体细胞ZFB细胞及其构建方法、规模化培养方法，细胞的分类命名为ZFB‑2，保藏编号为CGMCC No.17481；ZFB‑3，保藏编号为CGMCC No.17482；ZFB细胞株的构建方法，包括如下步骤：取胚胎组织块贴壁培养；细胞长成致密单层时，采用含10％胎牛血清的MEM培养液培养上述单层细胞并传代；弃去细胞培养上清液，消化，冻存；ZFB细胞的规模化培养方法，包括如下步骤：取工作细胞库的ZFB细胞株，接种于一级生物反应器中进行细胞的扩增；取一级生物反应器中覆盖满细胞的微载体，洗涤，再加入含有0.1％胶原蛋白酶的胰蛋白酶，消化；然后接种于二级生物反应器进行培养。本发明提出的ZFB‑2细胞、ZFB‑3细胞状态良好，生长快速、传代寿命长，对病毒的敏感性高，便于广泛使用。

Description

一种人二倍体细胞ZFB细胞及其构建方法、规模化培养方法

技术领域

本发明属于生物技术领域，特别涉及一种人二倍体细胞ZFB细胞及其构建方法、规模化培养方法。

背景技术

人二倍体细胞是从人体正常组织(通常来源于胚胎)中分离的，并在体外培养传代建立的细胞株。人二倍体细胞(如WI-38、MRC-5、KMB-17、2BS等) 具有有限的生长代次，传代寿命一般在40-60代，超过一定的代次后细胞将停止增殖，并逐渐衰老、死亡。在其传代寿命内，人二倍体细胞具有广泛的病毒敏感性，良好的稳定性，无致瘤性。除终末代次的细胞会出现低概率的染色体条数和结构异常的外，其他代次的人二倍体细胞基本上能保持二倍体核型，与原代细胞相比，人二倍体细胞可以建立成熟的细胞库系统，并且能够达到充分鉴定和标准化的水平，从而有利于质量控制。与连续传代细胞相比，人二倍体细胞理论上没有致瘤性的危险。从上个世纪60年代，人二倍体细胞被国际接受用于生产疫苗以来，已经有数以十亿剂的人二倍体细胞生产的病毒疫苗服务于全球，并且人二倍体细胞生产的病毒疫苗被证实是安全有效的。人二倍体细胞已被世界卫生组织(World Health Organization，简称“WHO”)推荐为较为安全的病毒性疫苗生产用细胞基质。

人二倍体细胞株具有极为广泛的病毒易感性，为病毒研究和病毒诊断增添了新的手段(Fortunato,2014)。据不完全统计，二倍体细胞对大约200种病毒易感。在国外，用于病毒培养并建立细胞库的主要人二倍体细胞是WI-38和 MRC-5。但是考虑到WI-38细胞因为检测到曾被污染，现已不用于疫苗生产。 MRC-5细胞因为WHO授权的细胞数量稀少，加之二倍体细胞自身代次有限，目前生产用一般最高为35代，导致抗原产量严重受限，而且多种病毒在该种细胞上适应的病毒滴度有待提高，特别是乙脑病毒。因此，需要一种传代寿命长、病毒敏感性高的人二倍体细胞。

发明内容

针对上述问题，本发明公开了一种人二倍体细胞ZFB细胞，该细胞的分类命名为人胚肺纤维细胞ZFB-2，保藏编号为CGMCC No.17481。

一种人二倍体细胞ZFB细胞，该细胞的分类命名为人胚肺纤维细胞ZFB-3，保藏编号为CGMCC No.17482。

一种人二倍体细胞ZFB细胞株的构建方法，包括如下步骤：

步骤一、取胚胎组织块漂洗至组织块发白，将组织块转移至细胞培养瓶中加入MEM培养液贴壁培养；

步骤二、到达预设时间后换液，观察，直至细胞长成致密单层细胞；

步骤三、采用含10％胎牛血清的MEM培养液培养所述单层细胞并传代；

步骤四、细胞传代完成后，弃去细胞培养上清液，加入胰蛋白酶消化，消化后加入细胞冻存液、分装入细胞冻存管冻存。

进一步地，所述步骤三中细胞传代频率为2-3天传代一次，且每次传代按 1:2-1:4分种率接种。

进一步地，所述步骤三中传代第3-8代为原始细胞库，第15-16代为主细胞库，第20-21代为工作细胞库。

一种人二倍体细胞ZFB细胞的规模化培养方法，包括如下步骤：

步骤一、取细胞库代次为20代或21代的ZFB细胞株，加入到细胞生长液中，利用胰蛋白酶消化细胞，传代扩增，制成细胞悬液并接种于一级生物反应器中进行细胞的扩增；

步骤二、取微载体经磷酸缓冲盐溶液水化后灭菌，加入无菌的一级生物反应器和二级生物反应器中，用细胞生长液孵育微载体；

步骤三、取所述一级生物反应器中覆盖满细胞的微载体，加入预热的磷酸缓冲盐溶液洗涤，再加入含有0.1％胶原蛋白酶的胰蛋白酶，消化细胞；

步骤四、将消化后的细胞和微载体悬液混匀，接种于二级生物反应器进行培养。

进一步地，所述步骤一中消化后的细胞传代至若干个十层细胞工厂，且传代率为1:3。

进一步地，所述步骤一中一级生物反应器扩增细胞的培养参数为：温度 37℃，转速40～50rpm，溶氧30～50％，pH为7.2～7.3，碱自动控制。

进一步地，所述步骤一中，待ZFB细胞汇合率达到90％以上时，加入胰蛋白酶消化细胞。

进一步地，所述步骤二中所述一级生物反应器与所述二级生物反应器微载体使用总量为1:3～1:5。

进一步地，所述步骤二中细胞生长液孵育微载体时设置参数为：温度 36～38℃，转速40～50rpm，溶氧30～50％，pH为7.2～7.4。

进一步地，所述步骤三中待90％细胞消化脱离微载体得到分散均匀的细胞悬液，所述一级生物反应器的转速设置为50rpm，添加细胞生长液，收集消化的细胞和微载体悬液。

进一步地，所述步骤四中消化后的细胞悬液接种于二级生物反应器的具体步骤为：边加入所述细胞悬液边搅拌，所述二级生物反应器的初始转速为 50～60rpm，当细胞悬液全部加入所述二级生物反应器后维持体积在终体积的 1/2，低转速吸附15min，补足细胞生长液至工作体积。

进一步地，所述步骤四中二级生物反应器扩增细胞的培养参数为：温度37℃，转速50～60rpm，溶氧40～60％，pH为7.2，碱自动控制。

进一步地，所述步骤四中细胞培养24h后开始灌流培养，每天灌流进出液的量为二级生物反应器体积的1/3～1/2。

本发明以组织块贴壁培养技术为基础，避免了获取原代细胞时直接胰蛋白酶处理，造成细胞损伤的情况，制备出细胞传代寿命为55代左右的人胚肺纤维细胞ZFB-2细胞和细胞传代寿命为65代左右的人胚肺纤维细胞ZFB-3细胞。且 ZFB-2细胞、ZFB-3细胞状态良好，生长快速、传代寿命长，对病毒的敏感性高，便于广泛使用。本发明的其它特征和优点将在随后的说明书中阐述，并且，部分地从说明书中变得显而易见，或者通过实施本发明而了解。本发明的目的和其他优点可通过在说明书、权利要求书以及附图中所指出的结构来实现和获得。

附图说明

为了更清楚地说明本发明实施例或现有技术中的技术方案，下面将对实施例或现有技术描述中所需要使用的附图作一简单地介绍，显而易见地，下面描述中的附图是本发明的一些实施例，对于本领域普通技术人员来讲，在不付出创造性劳动的前提下，还可以根据这些附图获得其他的附图。

图1示出了ZFB-2细胞生命线传代图；

图2示出了ZFB-3细胞生命线传代图；

图3示出了14天后细胞形态观察图；图3A、ZFB-2细胞主细胞库，21代；图3B、ZFB-2细胞工作细胞库，25代；图3C、ZFB-3细胞主细胞库，20代；图3D、ZFB-3细胞工作细胞库，24代；

图4-1示出了体外不同指示细胞接种培养法检测ZFB-2株工作库外源病毒因子细胞病变结果图；图4-1A、ZFB-3细胞；图4-1B、MRC-5细胞；图4-1C、 Vero细胞；图4-1D、ZFB-3细胞加乙脑病毒；

图4-2示出了体外不同指示细胞接种培养法检测ZFB-3株工作库外源病毒因子细胞病变结果图；图4-2A、ZFB-2细胞；图4-2B、MRC-5细胞；图4-2C、 Vero细胞；图4-2D、ZFB-2细胞加水痘-带状疱疹病毒；

图5示出了ZFB-3细胞在微载体上长满状态图。

具体实施方式

为使本发明实施例的目的、技术方案和优点更加清楚，下面将结合本发明实施例中的附图，对本发明实施例中的技术方案进行清楚、完整地说明，显然，所描述的实施例是本发明一部分实施例，而不是全部的实施例。基于本发明中的实施例，本领域普通技术人员在没有做出创造性劳动前提下所获得的所有其他实施例，都属于本发明保护的范围。

实施例1——ZFB细胞株建立

实验方法

本发明向安徽医科大学第一附属医院临床医学研究伦理委员会成功申请到《人二倍体细胞ZFB株的建立伦理审查批件》。经过对捐赠胚胎父母的各项体检和家族遗传病史调查，筛选出两个合适的胚胎，分别为2号胚胎和3号胚胎。

1、原代细胞获取

由安徽医科大学第一附属医院医生采用水囊引产方法获得胎儿，并取出胚胎肺组织，置入无菌运输箱中运送至实验室。在生物安全柜中，使用手术剪刀将组织交叉剪成1mm³的小块，无菌磷酸缓冲盐溶液漂洗3次至组织块发白。将组织块转移至T225细胞培养瓶中，加入适量的MEM(10％胎牛血清)培养液至刚刚没过组织块，使得组织块紧贴培养瓶瓶壁，置于37℃，5％CO₂培养箱静置培养。

2、单层细胞获取

每日观察，可见组织块周围人二倍体细胞扩展，达到预设时间48h后换液，观察直至细胞长成致密单层。

3、细胞培养

采用含10％胎牛血清的MEM培养液培养，待细胞长满后传代。弃去细胞培养上清，加入磷酸缓冲盐溶液，润洗2遍后，加入胰蛋白酶，消化，待细胞出现松动，加入细胞生长液终止消化，轻轻吹打，制成细胞悬液。通常每隔2-3 天传代一次，每次按1:2-1:4分种率接种。

4、细胞冻存

待细胞大量扩增后，弃去细胞培养上清，加入磷酸缓冲盐溶液，润洗2遍后，加入胰蛋白酶，消化，待细胞出现松动后，加入细胞生长液终止消化，轻轻吹打，制成细胞悬液，细胞悬液经1000rpm，离心5min，弃去细胞生长液，加入细胞冻存液(90％FBS+10％DMSO)，轻吹混匀，制成浓度为3.0×10⁶个/ml 的细胞悬液，分装入细胞冻存管，每支装1ml。将装有细胞的冻存管用棉花包裹、泡沫盒密封后置入4℃冰箱30min，再移至﹣20℃冰箱放置2h，再置于超低温冰箱过夜，最后转移至液氮容器中保存。

5、细胞生命线传代

从原始细胞库，主细胞库和工作细胞库各复苏一支细胞，培养，传代，并观察细胞状态，直至细胞衰老死亡。

上述的原始细胞库为第3-8代，主细胞库为第15-16代，工作细胞库为第 20-21代。

实验结果

2号胚胎按实施例1的试验方法进行操作，成功建立了人胚肺纤维细胞 ZFB-2株，人胚肺纤维细胞ZFB-2株原始细胞库(代次在3-8代内)，主细胞库(代次为16代)和工作细胞库(代次为21代)，人胚肺纤维细胞ZFB-2细胞已于2019年03月28日保藏于中国微生物菌种保藏管理委员会普通微生物中心，保藏中心地址为：北京市朝阳区北辰西路1号院3号中国科学院微生物研究所；保藏编号为CGMCC No.17481。

3号胚胎按实施例1的试验方法进行操作，成功建立了人胚肺纤维细胞 ZFB-3株，人胚肺纤维细胞ZFB-3株原始细胞库(代次在3-8代内)，主细胞库(代次为15代)和工作细胞库(代次为20代)，人胚肺纤维细胞ZFB-3细胞，已于2019年03月28日保藏于中国微生物菌种保藏管理委员会普通微生物中心，保藏中心地址为：北京市朝阳区北辰西路1号院3号中国科学院微生物研究所；保藏编号为CGMCC No.17482。

细胞生命线传代结果如图1，图2所示，细胞生命线传代实验结果可知：人胚肺纤维细胞ZFB-2株和人胚肺纤维细胞ZFB-3株能稳定增殖，并且细胞形态和生命线表现均符合人二倍体细胞特征。其中，人胚肺纤维细胞ZFB-2细胞寿命为55代左右，人胚肺纤维细胞ZFB-3细胞寿命为65代左右。

实施例2——ZFB细胞株检定

实验方法

1、细胞形态观察及血吸附试验

1.1红细胞悬液制备

采集豚鼠血和鸡血分别保存于细胞保存液中。血细胞经2000rpm，5min离心，弃上清，加入适量的生理盐水并用吸管反复吹打混匀，连续洗2次；2000rpm， 10min离心，弃上清，用生理盐水配制成浓度1％红细胞悬液，2-8℃保存备用。新鲜红细胞在2-8℃保存不得超过7天，且溶液中不含钙、镁离子。

1.2细胞形态观察及血吸附试验

将适量的待检细胞接种于6个T25细胞培养瓶中，逐日镜检观察细胞形态，培养14天后，拍照，细胞形态结果如图3所示，图3A、ZFB-2细胞主细胞库， 21代；图3B、ZFB-2细胞工作细胞库，25代；图3C、ZFB-3细胞主细胞库，20代；图3D、ZFB-3细胞工作细胞库，24代；并用0.2～0.5％豚鼠红细胞和鸡红细胞混合悬液进行血吸附试验。加入红细胞后，取3瓶置于2～8℃作用30min，另外3瓶置于20～25℃作用30min，分别镜检，观察红细胞吸附情况。ZFB株外源病毒因子血吸附实验结果如表1所示。

表1 血吸附实验检测ZFB株外源病毒因子结果

2、细胞内、外源病毒因子检查——体外不同指示细胞接种培养法

2.1红细胞悬液制备

采集豚鼠血和鸡血分别保存于细胞保存液中。血细胞经2000rpm，5min离心，弃上清，加入适量的生理盐水并用吸管反复吹打混匀，连续洗2次；2000rpm， 10min离心悬液，弃上清，用生理盐水配制成浓度1％红细胞悬液，2-8℃保存备用。新鲜红细胞在2-8℃保存不得超过7天，且溶液中不含钙、镁离子。

2.2指示细胞制备

Vero细胞、MRC-5细胞和不同株的ZFB细胞作为指示细胞。将20ml含2 ×10⁸个待检细胞的细胞悬液反复冻融，离心取上清，并接种于已长满的3种指示细胞瓶中，每种指示细胞接种3瓶(T25)，每瓶接种2ml，置于37℃，5％CO₂培养箱静置培养。培养7天后，每种指示细胞各取1瓶细胞上清转接种于新制备的相应指示细胞瓶(T25)中，与另2瓶初次接种的指示细胞继续培养7天，观察细胞病变情况。乙型脑炎病毒接种ZFB-3细胞作为阳性对照。实验结果如图4所示，图4-1示出了体外不同指示细胞接种培养法检测ZFB-2株工作库外源病毒因子细胞病变结果图；图4-1A、ZFB-3细胞；图4-1B、MRC-5细胞；图 4-1C、Vero细胞；图4-1D、ZFB-3细胞加乙脑病毒；

图4-2示出了体外不同指示细胞接种培养法检测ZFB-3株工作库外源病毒因子细胞病变结果图；图4-2A、ZFB-2细胞；图4-2B、MRC-5细胞；图4-2C、 Vero细胞；图4-2D、ZFB-2细胞加水痘-带状疱疹病毒。

2.3血吸附试验

取接种和转接种的Vero细胞、MRC-5细胞和不同株的ZFB细胞，用 0.2～0.5％豚鼠红细胞和鸡红细胞混合悬液进行血吸附试验。将混合红细胞分别加入各指示细胞瓶中，各2瓶，取1瓶置于2～8℃作用30min，另1瓶置于20～25℃作用30min，分别镜检，观察红细胞吸附情况。

2.4血凝试验

取初次接种和次接种的Vero细胞、MRC-5细胞和不同株的ZFB细胞上清液进行红细胞凝集试验。采用50μl体系进行试验，吸取50μl生理盐水加入U 型血凝板中(第1纵排除外)。吸取100μl待检样品加入第1纵排孔，吹打15 下后吸取50μl再加入第2纵排孔，再吹打15下后吸取50μl再加入第3纵排孔，直至第11纵排孔，吹打混匀吸取50μl弃去，第12纵排孔为红细胞对照。加 0.2～0.5％豚鼠红细胞和鸡红细胞混合悬液，每孔50μl，然后置室温反应40min。以完全凝集的孔作为病毒的血凝滴度。

体外不同指示细胞接种培养法血吸附试验和血凝试验结果如表2A和2B所示。其中，表2A为体外不同指示细胞接种培养法血吸附和血凝检测ZFB-2株工作库外源病毒因子结果；表2B为体外不同指示细胞接种培养法血吸附和血凝检测ZFB-3株工作库外源病毒因子结果。

表2A 体外不同指示细胞接种培养法血吸附和血凝检测ZFB-2株工作库外源病毒因子结果

表2B 体外不同指示细胞接种培养法血吸附和血凝检测ZFB-3株工作库外源病毒因子结果

3、细胞内、外源病毒因子检查——动物和鸡胚接种

实验方法

按《中国药典》2015版，动物体内接种法检测细胞内、外源病毒因子。按表3所列方法进行试验和观察。

表3 动物体内接种法检测外源病毒因子

注：

①经尿囊腔接种的鸡胚，在观察末期，应用豚鼠和鸡红细胞混合悬液进行直接红细胞凝集试验。

②每只家兔于皮内注射10处，每处0.1ml。

乳鼠的接种途径有脑内和腹腔两种，其中脑内途径对应的接种细胞液量为0.01ml/只，腹腔途径对应的接种细胞液量为0.1ml/只；

成年小鼠的接种途径有脑内和腹腔两种，其中脑内途径对应的接种细胞液量为0.03ml/只，腹腔途径对应的接种细胞液量为0.5ml/只；

家兔的接种途径有皮下和皮内两种，其中皮下途径对应的接种细胞液量为9.0ml/只，皮内途径对应的接种细胞液量为0.1×10ml/只。

3.2鸡胚尿囊液血凝试验

经尿囊腔接种的鸡胚，在观察末期收获鸡胚尿囊液，置于超低温冰箱保存。应用0.2～0.5％豚鼠和鸡红细胞混合悬液进行直接红细胞凝集试验。采用50μl体系进行试验，吸取50μl生理盐水加入U型血凝板中(第1纵排除外)。吸取 100μl待检样品加入第1纵排孔，吹打15下后吸取50μl再加入第2纵排孔，再吹打15下后吸取50μl再加入第3纵排孔，直至第11纵排孔，吹打混匀吸取50μl 弃去，第12纵排孔为红细胞对照。加红细胞：加0.2～0.5％豚鼠红细胞和鸡红细胞混合悬液，每孔50μl，然后置室温反应40min。以完全凝集的孔作为病毒的血凝滴度。

表4 动物体内接种法检测ZFB-2细胞外源病毒因子结果

表5 动物体内接种法检测ZFB-3细胞外源病毒因子结果

表6 动物体内接种法鸡胚尿囊液血凝试验检测ZFB株外源病毒因子结果

实验结果

1、如图3所示，ZFB-2细胞主细胞库和工作细胞库，以及ZFB-3细胞主细胞库和工作细胞库的形态均正常，如表1所示，无血吸附现象出现。

2、如表2A和表2B以及图4-1和图4-2所示，阳性对照组中细胞出现明显病变，而阴性对照组细胞形态正常，无血吸附现象出现，ZFB-2细胞主细胞库和工作细胞库，以及ZFB-3细胞主细胞库和工作细胞库均表现阴性。说明细胞ZFB-2和ZFB-3细胞的主细胞库和工作细胞库均无内、外源病毒因子污染。

3、如表4和表5所示，在动物体内接种法实验结果中，ZFB-2细胞主细胞库和工作细胞库，以及ZFB-3细胞主细胞库和工作细胞库细胞接种的所有实验动物健存率均达到100％，即符合《中华人民共和国药典2015版三部》要求。如表6所示，经尿囊腔接种的鸡胚尿囊液进行红细胞凝集试验后发现，ZFB-2 细胞主细胞库和工作细胞库，以及ZFB-3细胞主细胞库和工作细胞库细胞结果均为阴性。综合表4、5和6结果，说明细胞ZFB-2和ZFB-3细胞的主细胞库和工作细胞库均无内、外源病毒因子污染。

实施例3

本发明已委托中国食品药品检定研究院进行ZFB-2和ZFB-3细胞8-12代鉴别试验、内外源病毒因子检查、成瘤性检查、染色体核型检查，并出具报告。实验结果证明ZFB-2和ZFB-3细胞均合格。

其中，ZFB-2合格编号分别为：SH201804814(P11)、SH201804813(P22)、SH201804812(P31)、SH201804811(P41)、SH201804810(P52)；

ZFB-3合格编号分别为：SH201804801(P10)、SH201804802(P21)、 SH201804803(P31)、SH201804804(P42)、SH201804805(P50)；SH201804806 (P60)。

实施例4、人二倍体细胞病毒敏感性比较实验方法：

1、狂犬病病毒

1.1细胞准备

分别复苏ZFB-2、ZFB-3和MRC-5细胞至T75方瓶，细胞长满单层后消化接种至新的细胞培养瓶，细胞代次不超过P35。

1.2病毒制备

采用混合接种法制备狂犬病病毒。细胞长满单层后，用胰蛋白酶消化，将消化下来的细胞吹打均匀并接入新的细胞培养瓶，同时根据感染复数MOI 0.1、 0.01、0.001接种狂犬病病毒稀释液，48h后，更换细胞维持液，35℃继续培养。

1.3病毒取样

采用直接收集接毒细胞的培养上清进行取样。在更换细胞维持液后第3、4、5、6天分别取样，分装，每支冻存管装量为150μl，-70℃保存，小鼠脑内接种法检测病毒滴度。

1.4小鼠脑内接种法检测病毒滴度

根据《中国药典2015年版》，采用小鼠脑内接种病毒法检测病毒滴度。将待检样品10倍系列稀释，取10^-3-10^-7稀释度病毒液脑内接种体重为11-13g昆明小鼠或其他品系小鼠，每稀释度注射小鼠6只，每只0.03ml，逐日观察，3天内死亡者不计(动物死亡数量应不得超过试验动物总数的20％)，观察14天。

2、水痘-带状疱疹病毒

2.1细胞准备

2.2病毒制备

采用直接接种法制备水痘-带状疱疹病毒。将长满单层的细胞，按照感染复数MOI0.1、0.01、0.001接种水痘-带状疱疹病毒稀释液，加入细胞维持液，35℃继续培养。

2.3病毒收获

采用反复冻融破碎细胞法收集病毒收获液。当细胞病变达75％时，弃细胞瓶内维持液，加入病毒保护液，-70℃反复冻融，致细胞破裂，病毒释放。收集病毒液，分装入冻存管中，-70℃保存。

2.4蚀斑法检测水痘-带状疱疹病毒滴度

采用蚀斑法检测水痘-带状疱疹病毒收获液滴度。

病毒噬斑技术是1952年Dulbecco在研究西方马脑脊髓炎病毒时建立的，直至今日一直被广泛应用。由于噬斑是由单个病毒颗粒的感染所形成，一般认为每个噬斑代表一个病毒感染性粒子，因而该方法是测定病毒数量和感染力的较为精确的定量方法，同时可用于病毒的纯化。另外噬斑的大小反映了病毒的感染性和毒力。病毒滴度是根据噬斑数和待测样本液稀释浓度进行计算，最终得出每毫升病毒原液的噬斑形成单位PFU。观察记录蚀斑的形态、大小、数目，计算蚀斑滴度，空斑形成单位(PFU/ml)＝每孔平均空斑数×病毒稀释度/每孔接种病毒量，病毒滴度以(LgPFU/ml)表示。

将ZFB-2、ZFB-3和MRC-5细胞接种于六孔板中，待细胞长满单层后，接种病毒收获液的稀释液，培养10天，经考马斯亮蓝染液染色，清洗后计空斑数，计算病毒滴度。

3、乙脑病毒

3.1细胞准备

3.2病毒制备

采用混合接种法制备乙脑病毒。细胞长满单层后，用胰蛋白酶消化，将消化下来的细胞吹打均匀并接入新的细胞培养瓶，同时根据感染复数MOI 0.1、 0.01、0.001接种乙脑病毒稀释液，48h后，更换细胞维持液，35℃继续培养。

3.3病毒取样

采用直接收集接毒细胞的培养上清进行取样。在更换细胞维持液后第3天取样，-70℃保存，小鼠脑内接种法检测病毒滴度。

3.4小鼠脑内接种法检测病毒滴度

根据《中国药典2015年版》，采用小鼠脑内接种病毒法检测病毒滴度。将待检样品10倍系列稀释，取10^-6-10^-9稀释度病毒液脑内接种体重为7-9g昆明小鼠或其他品系小鼠，每稀释度注射小鼠6只，每只0.03ml，逐日观察，3天内死亡者不计(动物死亡数量应不得超过试验动物总数的20％)，观察14天。

4、甲肝病毒

4.1细胞准备

4.2病毒制备

采用混合接种法制备甲肝病毒。细胞长满单层后，用胰蛋白酶消化，将消化下来的细胞吹打均匀并接入新的细胞培养瓶，同时分别按MOI 0.01、0.1和 0.5接种甲肝病毒稀释液，48h后，更换细胞维持液，继续培养，每5-7天更换一次细胞维持液。

4.3病毒收获

病毒接种第28天，收获病毒液。用磷酸缓冲盐溶液直接吹打种毒细胞，分装于冻存管中，置-70℃保存。

4.4酶联免疫吸附测定法检测病毒滴度。

酶联免疫吸附测定(enzyme linked immunosorbent assay，ELISA)指将可溶性的抗原或抗体结合到聚苯乙烯等固相载体上，利用抗原抗体结合专一性进行免疫反应的定性和定量检测方法。

这一方法的基本原理是：①使抗原或抗体结合到某种固相载体表面，并保持其免疫活性。②使抗原或抗体与某种酶连接成酶标抗原或抗体，这种酶标抗原或抗体既保留其免疫活性，又保留酶的活性。在测定时，把受检标本(测定其中的抗体或抗原)和酶标抗原或抗体按不同的步骤与固相载体表面的抗原或抗体起反应。用洗涤的方法使固相载体上形成的抗原抗体复合物与其他物质分开，最后结合在固相载体上的酶量与标本中受检物质的量成一定的比例。加入酶反应的底物后，底物被酶催化变为有色产物，产物的量与标本中受检物质的量直接相关，故可根据颜色反应的深浅定性或定量分析。由于酶的催化效率很高，故可极大地放大反应效果，从而使测定方法达到很高的敏感度。

实验结果

表7、8、9、10分别为狂犬病病毒、水痘-带状疱疹病毒、乙脑病毒、甲肝病毒接种ZFB-2、ZFB-3和MRC-5细胞后病毒收获液的滴度。结果表明ZFB-3、 ZFB-2对病毒敏感性高于MRC-5细胞。

表7 狂犬病病毒收获液滴度(LgLD50/ml)

表8 水痘-带状疱疹病毒连续传代滴度结果

	MRC-5	ZFB-2	ZFB-3
				0.1	3.5	4.0	4.5
0.01	4.1	5.0	5.2
				0.001	4.0	4.8	5.2

表9 乙脑病毒收获液滴度(LgLD50/ml)

	MRC-5	ZFB-2	ZFB-3
				0.1	6.5	7.2	8.3
0.01	6.6	7.6	8.9
				0.001	6.9	7.9	9.8

表10 甲肝病毒收获液滴度(lgCCID50/mU)

	MRC-5	ZFB-2	ZFB-3
				0.5	5.8	6.3	7.8
0.1	5.0	5.8	7.2
				0.01	4.2	4.6	6.5

实施例5、ZFB-3细胞的微载体放大培养：

(1)一级反应器扩增细胞

采用ZFB-3细胞株，细胞库代次P20代，细胞生长液为含10％胎牛血清的 MEM。

37℃水浴迅速溶解传代后的细胞，加入细胞生长液中，37℃、5％CO₂培养。当ZFB-3细胞汇合率达到90％以上时，0.25％胰蛋白酶消化细胞，按1:3进行传代扩增至若干个十层细胞工厂中。

将5L生物反应器罐体及补料瓶、取样瓶等玻璃器皿硅化处理，连接管道后 121℃高压灭菌30min。称取50g微载体，经水化灭菌后，使用含胎牛血清的MEM 培养基进行孵育过夜。取消化细胞工厂中的ZFB-3细胞，将细胞悬液接种于种子生物反应器中，边加入边搅拌，初始转速为50～60rpm，当细胞全部加入反应器后，低转速吸附，转速为40～45rpm，补足细胞生长液至工作体积5.0L，设置培养参数为温度37℃，搅拌转速40～50rpm，溶氧30～50％，pH为7.2～7.3，碱自动控制。

(2)新微载体处理：30L生物反应器连接管道后，在线灭菌。确保二级生物反应器无菌合格。称取适量的Cytodex 1微载体，一级反应器与二级生物反应器使用微载体总量为1:3～1:5。微载体经磷酸缓冲盐溶液水化后灭菌，加入无菌的生物反应器中，用细胞生长液孵育微载体过夜，孵育时设置温度36～38℃，搅拌转速40～50rpm，溶氧30～50％，pH为7.2～7.4。

(3)细胞消化、接种至二级生物反应器培养：取样观察，待一级生物反应器中细胞覆盖满微载体，关闭反应器搅拌、溶氧、pH等控制以避免对微载体沉降造成影响，待微载体完全沉降后将上清培养液通过管道排出；

加入预热磷酸缓冲盐溶液(0.02％EDTA)2L洗涤1次，加入预热的0.25％胰蛋白酶(含0.1％胶原蛋白酶)0.5～1L，开启反应器搅拌(使微载体搅动的最低转速即可)；

在细胞消化过程中，取样观察，待90％细胞消化脱离微载体得到分散均匀的细胞悬液，转速设置到正常培养转速的50rpm，加快细胞解离，添加约2L细胞生长液终止消化，收集消化的细胞和微载体悬液；

混匀后接种于二级生物反应器，边加入边搅拌，初始转速为50～60rpm，当细胞全部加入二级生物反应器后维持体积在终体积的1/2左右，低转速吸附 15min，补足细胞生长液至工作体积30L。设定细胞培养参数为温度37℃，搅拌 50～60rpm，溶氧40～60％，pH为7.2，碱自动控制。细胞培养24h后开始灌流培养，每天灌流进出液的量为二级生物反应器体积的1/3～1/2。细胞长满后如图5所示。

在人的二倍体细胞规模化放大培养的过程中选择在一级生物反应器中消化放大，与常规方法相比，消化效率更高，细胞状态更佳，更易于成功放大培养。也不会出现新旧微载体同时孵育造成体积过大，增加消化难度的现象。

实施例6、MRC-5细胞的微载体放大培养：

人二倍体细胞细胞为MRC-5细胞，细胞库代次P21代，过程同实施例5中 ZFB-3细胞的微载体放大培养的步骤。表11示出了ZFB-3细胞与MRC-5细胞微载体培养结果，结果表明ZFB-3细胞微载体培养相比MRC-5更有优势，规模化培养效率更高。

表11 ZFB-3细胞与MRC-5细胞微载体培养结果

尽管参照前述实施例对本发明进行了详细的说明，本领域的普通技术人员应当理解：其依然可以对前述各实施例所记载的技术方案进行修改，或者对其中部分技术特征进行等同替换；而这些修改或者替换，并不使相应技术方案的本质脱离本发明各实施例技术方案的精神和范围。

Claims

1.一种人二倍体细胞ZFB细胞，其特征在于：该细胞的分类命名为人胚肺纤维细胞ZFB-2，保藏编号为CGMCC No.17481。

2.一种人二倍体细胞ZFB细胞，其特征在于：该细胞的分类命名为人胚肺纤维细胞ZFB-3，保藏编号为CGMCC No.17482。

3.一种人二倍体细胞ZFB细胞株的构建方法，其特征在于：包括如下步骤：

4.根据权利要求3所述的一种人二倍体细胞ZFB细胞株的构建方法，其特征在于：所述步骤三中细胞传代频率为2-3天传代一次，且每次传代按1:2-1:4分种率接种。

5.根据权利要求3所述的一种人二倍体细胞ZFB细胞株的构建方法，其特征在于：所述步骤三中传代第3-8代为原始细胞库，第15-16代为主细胞库，第20-21代为工作细胞库。

6.一种如权利要求1或2所述人二倍体细胞ZFB细胞的规模化培养方法，其特征在于：包括如下步骤：

7.根据权利要求6所述的一种人二倍体细胞ZFB细胞的规模化培养方法，其特征在于：所述步骤一中消化后的细胞传代至若干个十层细胞工厂，且传代率为1:3。

8.根据权利要求6所述的一种人二倍体细胞ZFB细胞的规模化培养方法，其特征在于：所述步骤一中一级生物反应器扩增细胞的培养参数为：温度37℃，转速40～50rpm，溶氧30～50％，pH为7.2～7.3，碱自动控制。

9.根据权利要求6所述的一种人二倍体细胞ZFB细胞的规模化培养方法，其特征在于：所述步骤一中，待ZFB细胞汇合率达到90％以上时，加入胰蛋白酶消化细胞。

10.根据权利要求6所述的一种人二倍体细胞ZFB细胞的规模化培养方法，其特征在于：所述步骤二中所述一级生物反应器与所述二级生物反应器微载体使用总量为1:3～1:5。

11.根据权利要求6所述的一种人二倍体细胞ZFB细胞的规模化培养方法，其特征在于：所述步骤二中细胞生长液孵育微载体时设置参数为：温度36～38℃，转速40～50rpm，溶氧30～50％，pH为7.2～7.4。

12.根据权利要求6所述的一种人二倍体细胞ZFB细胞的规模化培养方法，其特征在于：所述步骤三中待90％细胞消化脱离微载体得到分散均匀的细胞悬液，所述一级生物反应器的转速设置为50rpm，添加细胞生长液，收集消化的细胞和微载体悬液。

13.根据权利要求6所述的一种人二倍体细胞ZFB细胞的规模化培养方法，其特征在于：所述步骤四中消化后的细胞悬液接种于二级生物反应器的具体步骤为：边加入所述细胞悬液边搅拌，所述二级生物反应器的初始转速为50～60rpm，当细胞悬液全部加入所述二级生物反应器后维持体积在终体积的1/2，低转速吸附15min，补足细胞生长液至工作体积。

14.根据权利要求6所述的一种人二倍体细胞ZFB细胞的规模化培养方法，其特征在于：所述步骤四中二级生物反应器扩增细胞的培养参数为：温度37℃，转速50～60rpm，溶氧40～60％，pH为7.2，碱自动控制。

15.根据权利要求6所述的一种人二倍体细胞ZFB细胞的规模化培养方法，其特征在于：所述步骤四中细胞培养24h后开始灌流培养，每天灌流进出液的量为二级生物反应器体积的1/3～1/2。