CN115627255A - 一种采用低血清培养基培养人二倍体细胞的方法 - Google Patents

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Abstract

本发明提出了一种采用低血清培养基培养人二倍体细胞的方法，所述方法包括：将人二倍体细胞接种于培养基中；在适于人二倍体细胞增殖的条件下，对所述人二倍体细胞进行贴壁培养。利用本发明的方法可以实现在低血清条件下培养人二倍体细胞，增殖倍数和细胞活率高，生长速率快，提高生产效率，在提高产能效率的同时降低血清等动物源性添加物的安全风险，尤其可以适用于疫苗领域时，以避免引发不必要的免疫反应。

Description

一种采用低血清培养基培养人二倍体细胞的方法
技术领域
本发明涉及生物技术领域。具体地，本发明涉及一种采用低血清培养基培养人二倍体细胞的方法。
背景技术
二倍体细胞是指由受精卵发育而来，且体细胞中含有两个染色体组的细胞。人和几乎全部的高等动物，还有一半以上的高等植物都是二倍体。人二倍体细胞来源于人体组织，是目前已经公知的可用于制备病毒疫苗的宿主细胞。人二倍体细胞目前经过数十年的研究，其生长特性、遗传稳定性、外源因子污染检查、致肿瘤阴性等特征已被充分验证，另外，人二倍体细胞来源于人体组织，用于制备疫苗时其内的残余成分不会成为超敏反应原，因此，其所制得的疫苗的安全性较高。
然而，目前人二倍体细胞的培养方法仍有待研究。
发明内容
本发明旨在至少在一定程度上解决上述技术问题之一或至少提供一种有用的商业选择。为此，本发明的一个目的在于提出一种利用低血清培养基贴壁培养人二倍体细胞的方法。
本申请是基于发明人的下列发现而完成的：
现有的人二倍体细胞培养方式是在含有10%左右血清的MEM培养基中生长，血清能够为细胞的生长增殖提供所需的激素、生长因子、转移蛋白和其它营养物质。但是血清的成分复杂，且不同产地、批次之间存在着质量差异，因而给细胞大规模培养工艺造成了诸多不利影响。另外，利用含血清培养基培养细胞获得产物的过程中，血清成为分离和纯化的主要障碍，残留的血清进入人体内会不可避免地引发不必要的免疫反应。
有鉴于此，发明人结合之前在细胞培养领域积累的丰富经验，进行了大量的筛选和优化工作，在减少血清用量的前提下，意外获得了一种添加在MEM培养基中的添加剂，利用添加有该添加剂的MEM培养基可以在低血清条件下高效培养人二倍体细胞，生长速率快，提高生产效率，同时能够在多项指标上获得优异表现，尤其可以适用于疫苗领域时，以避免引发不必要的免疫反应。
在本发明的一个方面，本发明提出了培养人二倍体细胞的方法。根据本发明的实施例，所述方法包括：将人二倍体细胞接种于培养基中；在适于人二倍体细胞增殖的条件下，对所述人二倍体细胞进行贴壁培养；其中，所述培养基包括：MEM培养基；3-5%的血清（NBS）；添加剂，所述添加剂包括：17重量份的L-丙氨酸；200重量份的L-盐酸精氨酸；65重量份的L-天门冬氨酸；62重量份的L-门冬酰胺；16重量份的L-半胱氨酸盐酸盐一水合物；18重量份的L-胱氨酸二盐酸盐；61重量份的L-谷氨酸；293重量份的L-谷氨酰胺；46.16重量份的甘氨酸；28重量份的L-羟脯氨酸；20重量份的L-盐酸赖氨酸；30重量份的L-甲硫氨酸；50重量份的L-苯丙氨酸；51重量份的L-脯氨酸；84重量份的L-丝氨酸；30重量份的L-苏氨酸；100重量份的L-缬氨酸；1000重量份的丙酮酸钠；3000重量份的HEPES；1000重量份的消泡剂F68；25重量份的四水硝酸钙；17重量份的无水硫酸镁；245.5重量份的无水磷酸氢二钠；2500重量份的D-无水葡萄糖；0.25重量份的还原型谷胱甘肽；0.31重量份的七水硫酸亚铁；0.34重量份的七水硫酸锌；1.5重量份的维生素C；16.65重量份的氯化胆碱；0.63重量份的D-泛酸钙；0.575重量份的叶酸；16.803重量份的肌醇；0.025重量份的九水硝酸铁；0.625重量份的氯化锂；2.75重量份的柠檬酸；5重量份的牛磺酸；1.05重量份的EDTA；1.39重量份的烟酰胺；1.293重量份的维生素B6；0.41重量份的维生素B1；3.19重量份的维生素B12；28重量份的无水L-酪氨酸二钠盐；0.0013重量份的五水硫酸铜；41.9重量份的六水氯化镁；0.45重量份的D-生物素；8.95重量份的次黄嘌呤；0.31重量份的亚油酸；1.05重量份的硫辛酸；0.3重量份的1，4-丁二胺二盐酸盐；0.65重量份的维生素B2；1.95重量份的胸苷；1.3重量份的对氨基苯甲酸；0.002重量份的氯化铝；0.006重量份的乙酸钡；0.0025重量份的六水氯化钴；0.0002重量份的四水氯化锰；0.0075重量份的氟化钠；0.00175重量份的氯化亚锡；0.00175重量份的氯化镉；0.00075重量份的二氧化锗；0.05重量份的亚硒酸钠；0.01重量份的九水偏硅酸钠；0.00025重量份的氯化镍；0.0005重量份的偏钒酸铵；0.000065重量份的溴化钾；0.0002重量份的碘化钾；1.66重量份的维生素E；0.2重量份的维生素A醋酸酯；50.7重量份的吐温80；0.05重量份的烟酸；0.75重量份的2D-脱氧核糖；0.01重量份的氢化可的松；0.101重量份的肉豆蔻酸；0.101重量份的油酸；0.101重量份的棕榈酸；0.101重量份的硬脂酸；2重量份的EGF；1重量份的IGF。
根据本申请的实施例，本申请的发明人发现不同细胞所适用的培养条件的通用性差，需要基于细胞自身的生长特性开发不同的培养方法，才能实现有效地细胞扩增或者培养。进而，发明人针对人二倍体细胞特性进行了大量的优化和筛选实验，筛选获得了上述添加剂，将其添加至MEM培养基中可以实现在低血清条件下培养人二倍体细胞，增殖倍数和细胞活率高，生长速率快，提高生产效率，在提高产能效率的同时降低血清等动物源性添加物的安全风险。
根据本发明的实施例，所述人二倍体细胞选自MRC-5细胞或2BS细胞。
在本发明的另一方面，本发明提出了一种扩增病毒的方法。根据本发明的实施例，所述方法包括：按照前面所述培养人二倍体细胞的方法，对人二倍体细胞进行贴壁培养，得到培养液；和在所述培养液中接种病毒，以便对所述病毒进行扩增。由此，采用根据本发明实施例的方法培养所得人二倍体细胞培养液有助于实现病毒增殖，提高病毒效价，从而更好地应用于疫苗病毒的扩增生产。
根据本发明的实施例，所述病毒包括水痘、狂犬病病毒、乙脑病毒、甲肝病毒。
在本发明的又一方面，本发明提出了一种制备疫苗的方法。根据本发明的实施例，所述方法包括：按照前面所述的方法扩增病毒。由此，利用根据本发明实施例的方法可以获得高病毒效价且高产量的疫苗，并且制备方法操作简便，产能高，适于规模化生产应用。
根据本发明的实施例，所述方法进一步包括：将所述扩增病毒所得到的病毒液进行减毒或者灭活处理，以便获得所述疫苗。由此，可以避免病毒进入机体产生不良反应。
在本发明的又一方面，本发明提出了一种疫苗。根据本发明的实施例，所述疫苗是通过前面所述制备疫苗的方法获得的。由此，根据本发明实施例的疫苗安全、有效，接种后不良反应小，适于推广应用。
术语“疫苗”是指含有有效诱导受试者的抗特定病原体或疾病的治疗程度的免疫性的活性组分的试剂或组合物，在此是治疗性地针对感染病毒所引发的疾病。疫苗可以包括药学上可接受的载体、稀释剂和/或佐剂。
在本发明的又一方面，本发明提出了前面所述疫苗在制备药物中的用途。根据本发明的实施例，所述药物用于治疗或者预防病毒相关疾病。
本发明的疫苗可以通过标准途径给药，所述途径包括但不限于胃肠外(例如，静脉内、椎管内的、皮下或肌肉内)、口服、粘膜(例如鼻内)或局部途径。
本发明的附加方面和优点将在下面的描述中部分给出，部分将从下面的描述中变得明显，或通过本发明的实践了解到。
附图说明
本发明的上述和/或附加的方面和优点从结合下面附图对实施例的描述中将变得明显和容易理解，其中：
图1显示了根据本发明一个实施例的MRC-5细胞在不同培养基中连续传代的细胞总量分析图；
图2显示了根据本发明一个实施例的MRC-5细胞在不同培养基中连续传代的细胞活率分析图；
图3显示了根据本发明一个实施例的MRC-5细胞在不同培养基中连续传代倍增时间分析图。
具体实施方式
下面将结合实施例对本发明的方案进行解释。本领域技术人员将会理解，下面的实施例仅用于说明本发明，而不应视为限定本发明的范围。实施例中未注明具体技术或条件的，按照本领域内的文献所描述的技术或条件或者按照产品说明书进行。所用试剂或仪器未注明生产厂商者，均为可以通过市购获得的常规产品。
实施例1
1、配制培养基
1.1 MEM培养基
Figure 684185DEST_PATH_IMAGE001
1.2 SLM1培养基
在MEM培养基中添加3%NBS和如下组分：
Figure 132484DEST_PATH_IMAGE002
Figure 335058DEST_PATH_IMAGE003
1.3 SLM2培养基（5%NBS，以MEM培养基总体积计）
组成与SLM1培养基区别在于，血清的含量为5%。
1.4 SLM3培养基（3%血清，以MEM培养基总体积计）
组成与SLM1培养基区别在于，在MEM培养基中添加如下组分：
原料名称 mg/L（以MEM培养基总体积计）
D-无水葡萄糖 2000
HEPES 3000
四水硝酸钙 20
无水硫酸镁 15
无水磷酸氢二钠 225.5
还原型谷胱甘肽 0.18
七水硫酸亚铁 0.28
七水硫酸锌 0.34
L-丙氨酸 13.6
L-盐酸精氨酸 160
L-天门冬氨酸 52
L-门冬酰胺 49.6
L-半胱氨酸盐酸盐一水 12.8
L-胱氨酸二盐酸盐 14.4
L-谷氨酸 48.8
L-谷氨酰胺 234.4
甘氨酸 36.928
L-羟脯氨酸 22.4
L-盐酸赖氨酸 16
L-甲硫氨酸 24
L-苯丙氨酸 40
L-脯氨酸 40.8
L-丝氨酸 67.2
L-苏氨酸 24
L-缬氨酸 80
丙酮酸钠 800
维生素C 1.2
氯化胆碱 13.32
D-泛酸钙 0.504
叶酸 0.46
肌醇 13.4424
九水硝酸铁 0.02
氯化锂 0.5
柠檬酸 2.2
牛磺酸 4
0
烟酰胺 1.112
维生素B6 1.0344
维生素B1 0.328
维生素B12 2.552
L-酪氨酸二钠盐无水 22.4
五水硫酸铜 0.00104
六水氯化镁 33.52
D-生物素 0.36
次黄嘌呤 7.16
亚油酸 0.248
硫辛酸 0.84
1，4-丁二胺二盐酸盐 0.24
维生素B2 0.52
胸苷 1.56
对氨基苯甲酸 1.04
氯化铝 0.0016
乙酸钡 0.0048
六水氯化钴 0.002
四水氯化锰 0.00016
氟化钠 0.006
氯化亚锡 0.0014
氯化镉 0.0014
二氧化锗 0.0006
亚硒酸钠 0.04
九水偏硅酸钠 0.008
氯化镍 0.0002
偏钒酸铵 0.0004
溴化钾 0.000052
碘化钾 0.00016
维生素E 1.328
维生素A 醋酸酯 0.16
烟酸 0.04
2D-脱氧核糖 0.6
氢化可的松 0.008
肉豆蔻酸 0.0808
油酸 0.0808
棕榈酸 0.0808
硬脂酸 0.0808
EGF 1.6
IGF 0.8
EDTA 0.84
F68 900
1.5 商业培养基
Gibco（货号A3969001），按使用说明配制。
2、细胞培养和检测
在前面得到MEM+10%NBS、SLM1培养基、SLM2培养基、SLM3培养基和商业培养基后，按照4.5×106cells将MRC-5细胞接种于T75方瓶，置于37℃、5％CO2的培养箱内进行培养。培养3d后用0.25%胰酶进行消化计数，随即再按上述细胞数接种至T75方瓶中，进行连续传代。传代过程中细胞总量、细胞活率、倍增时间如图1、2、3所示。本发明的添加剂可实现在3%、5%血清条件下培养人二倍体细胞，增殖倍数和细胞活率高，生长速率快，均优于市售商品培养基。
在本说明书的描述中，参考术语“一个实施例”、“一些实施例”、 “示例”、“具体示例”、或“一些示例”等的描述意指结合该实施例或示例描述的具体特征、结构、材料或者特点包含于本发明的至少一个实施例或示例中。在本说明书中，对上述术语的示意性表述不必须针对的是相同的实施例或示例。而且，描述的具体特征、结构、材料或者特点可以在任一个或多个实施例或示例中以合适的方式结合。此外，在不相互矛盾的情况下，本领域的技术人员可以将本说明书中描述的不同实施例或示例以及不同实施例或示例的特征进行结合和组合。
尽管上面已经示出和描述了本发明的实施例，可以理解的是，上述实施例是示例性的，不能理解为对本发明的限制，本领域的普通技术人员在本发明的范围内可以对上述实施例进行变化、修改、替换和变型。

Claims (8)

1.一种培养人二倍体细胞的方法，其特征在于，包括：
将人二倍体细胞接种于培养基中；
在适于人二倍体细胞增殖的条件下，对所述人二倍体细胞进行贴壁培养；
其中，所述培养基包括：
MEM培养基；
3-5%的血清；
添加剂，所述添加剂包括：
17重量份的L-丙氨酸；
200重量份的L-盐酸精氨酸；
65重量份的L-天门冬氨酸；
62重量份的L-门冬酰胺；
16重量份的L-半胱氨酸盐酸盐一水合物；
18重量份的L-胱氨酸二盐酸盐；
61重量份的L-谷氨酸；
293重量份的L-谷氨酰胺；
46.16重量份的甘氨酸；
28重量份的L-羟脯氨酸；
20重量份的L-盐酸赖氨酸；
30重量份的L-甲硫氨酸；
50重量份的L-苯丙氨酸；
51重量份的L-脯氨酸；
84重量份的L-丝氨酸；
30重量份的L-苏氨酸；
100重量份的L-缬氨酸；
1000重量份的丙酮酸钠；
3000重量份的HEPES；
1000重量份的消泡剂F68；
25重量份的四水硝酸钙；
17重量份的无水硫酸镁；
245.5重量份的无水磷酸氢二钠；
2500重量份的D-无水葡萄糖；
0.25重量份的还原型谷胱甘肽；
0.31重量份的七水硫酸亚铁；
0.34重量份的七水硫酸锌；
1.5重量份的维生素C；
16.65重量份的氯化胆碱；
0.63重量份的D-泛酸钙；
0.575重量份的叶酸；
16.803重量份的肌醇；
0.025重量份的九水硝酸铁；
0.625重量份的氯化锂；
2.75重量份的柠檬酸；
5重量份的牛磺酸；
1.05重量份的EDTA；
1.39重量份的烟酰胺；
1.293重量份的维生素B6；
0.41重量份的维生素B1；
3.19重量份的维生素B12；
28重量份的无水L-酪氨酸二钠盐；
0.0013重量份的五水硫酸铜；
41.9重量份的六水氯化镁；
0.45重量份的D-生物素；
8.95重量份的次黄嘌呤；
0.31重量份的亚油酸；
1.05重量份的硫辛酸；
0.3重量份的1，4-丁二胺二盐酸盐；
0.65重量份的维生素B2；
1.95重量份的胸苷；
1.3重量份的对氨基苯甲酸；
0.002重量份的氯化铝；
0.006重量份的乙酸钡；
0.0025重量份的六水氯化钴；
0.0002重量份的四水氯化锰；
0.0075重量份的氟化钠；
0.00175重量份的氯化亚锡；
0.00175重量份的氯化镉；
0.00075重量份的二氧化锗；
0.05重量份的亚硒酸钠；
0.01重量份的九水偏硅酸钠；
0.00025重量份的氯化镍；
0.0005重量份的偏钒酸铵；
0.000065重量份的溴化钾；
0.0002重量份的碘化钾；
1.66重量份的维生素E；
0.2重量份的维生素A醋酸酯；
50.7重量份的吐温80；
0.05重量份的烟酸；
0.75重量份的2D-脱氧核糖；
0.01重量份的氢化可的松；
0.101重量份的肉豆蔻酸；
0.101重量份的油酸；
0.101重量份的棕榈酸；
0.101重量份的硬脂酸；
2重量份的EGF；
1重量份的IGF。
2.根据权利要求1所述的方法，其特征在于，所述人二倍体细胞选自MRC-5细胞或2BS细胞。
3.一种扩增病毒的方法，其特征在于，包括：
按照权利要求1或2所述的方法，对人二倍体细胞进行贴壁培养，得到培养液；和
在所述培养液中接种病毒，以便对所述病毒进行扩增。
4.根据权利要求3所述的方法，其特征在于，所述病毒包括水痘、狂犬病病毒、乙脑病毒、甲肝病毒。
5.一种制备疫苗的方法，其特征在于，包括：按照权利要求3或4所述的方法扩增病毒。
6.根据权利要求5所述的方法，其特征在于，进一步包括：
将所述扩增病毒所得到的病毒液进行减毒或者灭活处理，以便获得所述疫苗。
7.一种疫苗，其特征在于，所述疫苗是通过权利要求5或6所述制备疫苗的方法获得的。
8.权利要求7所述疫苗在制备药物中的用途，其特征在于，所述药物用于治疗或者预防病毒相关疾病。
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