CN104894057A - 一种mrc-5细胞制备狂犬病疫苗的培养基及其使用方法 - Google Patents
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Abstract
本发明提供一种适用于在生物反应器中培养MRC-5细胞制备狂犬病疫苗的培养基。
Description
技术领域
本发明属于生物制品领域，涉及一种培养基的配置和使用方法，更具体的，涉及一种使用生物反应器培养MRC-5细胞制备狂犬病疫苗的培养基。
背景技术
人体二倍体细胞是指正常人体组织在体外培养的细胞。细胞株来源于正常人胚胎或者其他组织的细胞群体，其染色体数目与原供体细胞染色体数目相同，为二倍体，在正常情况下具有有限生命期，是有限生命细胞株。由于人二倍体细胞为正常核型细胞，无致癌性，无外源因子污染，而且具有高免疫原性和良好的耐受性，对病毒敏感谱广，所以在培养病毒和制备病毒类疫苗方面价值很大。以人二倍体细胞制备得到的狂犬病疫苗为例：人二倍体细胞狂犬病疫苗的抗体应答速度更快，相同时间内产生的免疫保护更显著，且免疫持久性，有报道表明，接受此疫苗注射后32年仍可检测到狂犬病抗体的免疫记忆反应。同时，在临床应用方面，很多研究表明人二倍体细胞狂犬病疫苗有着很好的安全性，不论在体液免疫还是细胞介导的免疫应答中都能产生迅速和有效的免疫保护。
目前在国内外生物工程生产中普遍应用的人二倍体细胞株主要包括：MRC-5细胞株，KMB-17细胞株和2BS细胞株。
MRC-5细胞株是英国于1966年由一个14周龄的人工流产男性胎儿的肺组织建立的，有限生命为48代。经鉴定认为该细胞株可用于疫苗生产，随后MRC-5细胞株被确定为国际参考株，取代因种子细胞被发现在更早次代受到污染而无法成为生物制药用株的WI-38细胞株。现在，法国、美国等发达国家均在病毒疫苗领域广泛使用MRC-5细胞株。
在我国，尚未有应用MRC-5细胞株制备而得的病毒疫苗产品。同时，在研发和生产领域，人二倍体细胞的培养在培养基的选用、优化，和如何实现大规模培养(例如使用生物反应器)方面多年来存在一定困难，有待进一步深入研究。
发明内容
本发明提供一种适用于在生物反应器中培养MRC-5细胞制备狂犬病疫苗的培养基及其使用方法。使用本发明所述的培养基，以较低血清浓度(5％-10％)，在生物反应器中对MRC-5细胞进行大规模培养。接种狂犬病病毒后，继续使用本发明所述的培养基用来维持病毒在细胞液中的增殖。本发明提供的培养基及其使用方法，使MRC-5细胞高效贴附在微载体上，细胞生长过程中生长速度快，细胞形态好，在灌流培养方式下可以在3-5天内达到较高密度；接种狂犬病病毒后，在维持培养基培养下，可以连续收获病毒液5天。
本发明的一种在生物反应器中培养MRC-5细胞制备狂犬病疫苗的培养基，其组成成分及重量份为：
上述培养基的组成成分及重量份优选为：
上述培养基，在使用前加入5％-10％的胎牛血清或小牛血清，经过膜过滤制成在在生物反应器培养环境下使用的培养MRC-5细胞的培养液。
使用上述培养基培养MRC-5细胞3-5天至较高细胞密度时，接入狂犬病病毒，继续使用同一培养基维持病毒感染时期的细胞生长和病毒增殖。
所述培养MRC-5细胞所用的生物反应器可使用本领域常用的内部结构支持使用载体的各类生物反应器，例如德国Eppendorf(艾本德)公司New Brunswick Scientific生物反应器，德国Satorious公司生物反应器，荷兰Applicon公司生物反应器生物反应器，杭州安普公司生物反应器，上海日泰公司生物反应器，广州旗帜公司生物反应器。优选使用德国Eppendorf(艾本德)公司New BrunswickScientific生物反应器，德国Satorious公司生物反应器，荷兰Applicon公司生物反应器，更优选使用德国Eppendorf(艾本德)公司New Brunswick Scientific生物反应器。
所述载体可选自常规使用的各种材料制的载体，包括化工材料的聚丙烯，PLA,PGA,多孔硅，PLGA，PPF等，和天然材料的葡聚糖，胶原蛋白，琼脂，谷物蛋白等。优选使用葡聚糖材料的微载体，更优选使用美国GE公司Cytodex3球形微载体。
所述MRC-5细胞培养的条件是本领域中常规的使用条件，生物反应器的参数设置参考生物反应器厂家的使用说明书设置。优选的培养条件是：37摄氏度，溶氧DO为30-50％，按比例通入压缩空气，氧气，二氧化碳和氮气四种气体，通气量为1.0，转速为110rpm。
接种狂犬病病毒种毒液，使用病毒液维持培养基时，培养的条件是本领域中常规的使用条件，生物反应器的参数设置参考生物反应器厂家的使用说明书设置。优选的培养条件是：36摄氏度，溶氧DO为50-70％，通入压缩空气，氧气，二氧化碳和氮气四种气体，通气量为1.2，转速为110rpm。
本方法所述的培养基及其使用方法，在生物反应器中大规模培养MRC-5细胞时使用较低浓度血清，在接种狂犬病病毒后，使用同样的培养基维持病毒增殖，在较短时间内，通过灌流方式培养生产大量的滴度高质量好的病毒液，制备狂犬病疫苗。
本方法所述的培养基及其使用方法，适用于制备人用狂犬病疫苗。
附图说明
图1为细胞培养的生长曲线对比图。
图2为接种狂犬病病毒后病毒滴度曲线对比图
具体实施方式
材料与设备
1，材料
1)MEM培养基，DMEM培养基，GIBCO公司
2)胎牛血清，GIBCO公司
3)Cytodex3球形微载体，GE公司
2，主要设备
1)生物反应器：德国Eppendorf(艾本德)公司New Brunswick 5升生物反应器(工作体积3.5升)
2)二氧化碳培养箱，日本三洋公司
3)高速离心机，Beckman公司
4)超速离心机，Beckman公司
5)4度和-20度冰箱，日本三洋公司
6)分光光度计，德国Eppendorf(艾本德)公司
生产过程主要参数
以下实施例在实施过程中的主要参数均设置为同样数值，仅在培养基的使用上有所区别，具体成分见实施例1，实施例2，实施例3。
1，灭菌和预处理
按照设备使用说明调试与准备生物反应器，进行必要的清洗，灭菌步骤，并进行无菌试验，以确认生物反应器处于良好的生产状态。对选用Cytodex3微载体进行浸泡和灭菌准备。按10克/升培养基加入微载体，每台5升生物反应器(工作体积3.5升)加入35克经预处理的Cytodex3微载体。
2，MRC-5细胞培养的条件是本领域中常规技术的使用条件，生物反应器的参数设置参考生物反应器厂家的使用说明书设置。细胞接种密度为3x105个细胞/毫升。在全部实施例中，MRC-5细胞大规模培养时的参数设置为：温度37摄氏度，溶氧DO为40％，按70％，20％，5％，5％的比例分别通入空气，氧气，二氧化碳和氮气四种气体，通气量为1.0升/分钟，转速为110rpm。
3，以灌流方式培养MRC-5细胞5天。用台盼蓝法检测细胞浓度和活性。将生物反应器中的培养基更换为病毒液维持培养基，具体成分见实施例1，实施例2，实施例3。按照MOI为0.05的量接种狂犬病病毒种毒液。培养的条件是本领域中常规的使用条件，生物反应器的参数设置参考生物反应器厂家的使用说明书设置。在全部实施例中，接入狂犬病病毒种毒液后的参数设置为：温度36摄氏度，溶氧DO为50％，按50％，42％，7％，1％的比例分别通入空气，氧气，二氧化碳和氮气四种气体，通气量为1.1升/分钟，转速为110rpm。
4，以灌流方式维持病毒液5天，将5天内收集得到的全部病毒液，经灭活，纯化，稀释等后续步骤制成狂犬病疫苗。
实施例1
使用的在生物反应器中培养MRC-5细胞的培养基，其组成成分和重量份的比例如下：
在上述培养基中加入8％的胎牛血清，制成在生物反应器中培养MRC-5细胞的培养液。
实验结果见表1，表2中“实施例1”的数据。
实施例2
使用的在生物反应器中培养MRC-5细胞的培养基，其组成成分和重量份的比例如下：
在上述培养基中加入8％的胎牛血清，制成在生物反应器中培养MRC-5细胞的培养液。
实验结果见表1，表2中“实施例2”的数据。
实施例3
使用的在生物反应器中培养MRC-5细胞的培养基，其组成成分和重量份的比例如下：
在上述培养基中加入8％的胎牛血清，制成在生物反应器中培养MRC-5细胞的培养液。
实验结果见表1，表2中“实施例3”的数据。
在同样条件下，使用本发明所述培养基的细胞生长曲线与使用普通股市售MEM培养基，M199培养基，分别加入15％胎牛血清的细胞生长曲线对比如表1
表1 MRC-5细胞生长曲线对比表
单位：105细胞/ml
| 0天 | 1天 | 3天 | 4天 | 5天 | |
| 实施例1 | 3 | 3.2 | 15.5 | 21.6 | 33.5 |
| 实施例2 | 3 | 3.4 | 14.9 | 22.7 | 32.3 |
| 实施例3 | 3 | 3.5 | 18.3 | 28.8 | 40.5 |
| MEM+15％FBS | 3 | 2.8 | 14.5 | 20.2 | 18.3 |
| M199+15％FBS | 3 | 2.7 | 9.2 | 13.8 | 21.7 |
在同样条件下，接种狂犬病病毒种毒液后，使用本发明所述维持病毒增殖的培养基与使用MEM培养基，M199培养基，分别加入15％胎牛血清的病毒滴度对比如表2：
表2 狂犬病病毒滴度对比表
单位：IU/ml
Claims (5)
1.一种在生物反应器中培养MRC-5细胞制备狂犬病疫苗的培养基，其特征在于：培养基的组成成分为：
2.如权利要求1所述的在生物反应器中培养MRC-5细胞制备狂犬病疫苗的培养基，其特征在于：培养基的组成成分为：
3.如权利要求1或2所述的培养基，在使用前加入5％-10％的胎牛血清或小牛血清，经过膜过滤制成在生物反应器培养环境中使用的培养MRC-5细胞的培养液。
4.一种在生物反应器中培养MRC-5细胞制备狂犬病疫苗的培养方法，其特征在于：使用权利要求1-3之一所述的培养基，在生物反应器中以灌流培养的方式大规的培养MRC-5细胞；接种狂犬病病毒种毒液，以灌流培养的方式维持狂犬病病毒的增殖，直到收获病毒液。
5.如权利要求4所述的方法，其特征在于：使用权利要求1或2所述的培养基加入5％-10％浓度的血清，在生物反应器中大规模培养MRC-5细胞，然后接种狂犬病病毒，使用同一培养基维持病毒增殖。
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|---|---|
| CN (1) | CN104894057A (zh) |
Cited By (1)
| Publication number | Priority date | Publication date | Assignee | Title |
|---|---|---|---|---|
| CN115627255A (zh) * | 2022-12-01 | 2023-01-20 | 天信和(苏州)生物科技有限公司 | 一种采用低血清培养基培养人二倍体细胞的方法 |
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| Publication number | Priority date | Publication date | Assignee | Title |
|---|---|---|---|---|
| CN1099797A (zh) * | 1993-09-03 | 1995-03-08 | 上海康达氨基酸厂 | 一种粉末型动物细胞培养基的制备方法 |
| CN103074293A (zh) * | 2012-12-28 | 2013-05-01 | 杭州国牧生物科技有限公司 | 一种mdck细胞制备流感疫苗的培养基及其使用方法 |
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2015
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