CN1099797A

CN1099797A - 一种粉末型动物细胞培养基的制备方法

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Publication number: CN1099797A
Application number: CN93112550A
Authority: CN
Inventors: 方美华; 徐俊杰; 王炳华; 王克勤; 叶争; 邱俊
Original assignee: Shanghai Kangda Amino-Acid Factory
Current assignee: Shanghai Kangda Amino-Acid Factory
Priority date: 1993-09-03
Filing date: 1993-09-03
Publication date: 1995-03-08
Anticipated expiration: 2013-09-03
Also published as: CN1049246C

Abstract

一种粉末型动物细胞培养基制备方法，采用原料分组称量，分组溶解，混和搅拌，过滤，喷雾或冷冻干燥，包装诸步骤；还提供了包括原料干燥，分组称量，再次干燥，对分组后原料逐步混合球磨，包装诸步骤以及冷冻干燥-球磨法的制备方法。本发明制备工艺简单，成本低，产率高，制出的培养基具有性能稳定、不易变质、贮存方便、保存期长、重量轻、溶解性好等特点，适用于科研、医疗检验和药物生产中的细胞培养，提高了细胞培养工作的效率。

Description

本发明涉及培养基的制备方法，特别是一种粉末型动物细胞培养基的制备方法。

合成培养基是一种人工配制的适合动物细胞营养要求的混合物质，一般分为用鸡胚、血清消化液等天然成份配制而成的培养基以及应用化学原料配制而成的合成培养基或者综合培养基。从培养基的物理性质来看，还可以分成加入凝固剂（如琼脂）的固体培养基以及液体培养基。一般来说，液体培养基适用于动物细胞的培养，但是液体培养基容易变质，也给贮存以及运输带来诸多的不变，使细胞培养工作的效率受到了一定程度的影响。因此，把液体培养基改变成粉末状的培养基便可克服上述缺陷，只要将粉末状培养基按比例投入液体内溶解后就可使用。在制备粉末状培养基时，由于原料中各物质的理化性质不一，且含量相差悬殊，如何使混合后培养基中各成份分布均匀，培养基性能稳定，成品溶解性好，并能提高产率，降低成本，长期以来一直是人们在制备工艺上渴望解决的问题。

本发明的目的在于提供制备粉末状动物细胞培养基的方法，使其制出的粉末状动物细胞培养基质量稳定，不易变质，且各种成份分布均匀，容易溶解。

本发明的技术方案如下：

方法1.将原料按性质分组并称量，所有原料依组分别用纯水或乙醇溶解，然后将所有分组溶解后的溶液混合搅拌均匀，配成总浓度为30～40%的溶液，加入用NaOH溶解的酚红和吐温80，过滤除去少量不溶物，除菌后用高速旋转喷雾干燥机喷雾干燥，其转速3500转/分以上，溶液流速为4～5立升/小时，干燥室热风温度为220±10℃，风速为8～10米/秒，用旋风式粉末分离器收集粉末，其温度在70～80℃，最后对成品进行包装。

本方法可将维生素A、D等液体原料制成固体粉末，且不会在高温气流中蒸发水份而使维生素遭到破坏。只要液体原料的含量不超过固体原料含量的1%，喷雾后液体原料也能被固体原料粉末所吸收。使用本方法所制得产品成份分布均匀，稳定性好，形成的粉末溶解极为迅速。

方法2.根据原料中各化合物的理化性质不同，分别对物料进行低温真空干燥和高温干燥，对干燥后的原料进行分组称量，再次将原料进行干燥，然后按原料分组的量从小到大依次投入球磨罐进行混合球磨，制得成品后进行包装。

本方法可采用液体物料微胶囊理论，球磨时不必剔除液体物料，工艺操作简单等特点，产率高，成本低，其产品具有较好的稳定性。

方法3.将原料按其理化性质分组称量，分别将水不溶物及难溶物（如维生素A、E、D₂、K等）溶于乙醇，其他物料用纯水溶解，然后将所有溶液合并混合搅拌均匀，滤去不溶物后置入冷冻干燥机内干燥制粉，制得成品后包装。

采用该法制成的培养基成份含量精确，分布均匀，性能稳定。

方法4.将部分原料（微量元素）分组称量，然后分组溶解后温和搅拌，过滤，冷冻干燥，制得冻干粉半成品A;将其他物料经低温真空干燥或高温干燥，分组称量后连半成品A再次干燥，然后混合球磨，制得成品后进行包装。

方法4尤其适合于原料中含有不稳定物质的培养基的生产，制出的产品稳定性极好，成份分布均匀，且制备工艺成本较低。

综上所述，本发明制备工艺简单，成本低，产率高，所制出的动物细胞培养基具有性能稳定、不易变质、贮存方便、保存期长、重量轻、溶解性好等特点，提高了细胞培养工作的效率。

以下结合实施例对本发明作进一步的描述。

实施例1.

一、配方（单位：毫克/升）

L-氨基酸甲组:

精氨酸 100 胱氨酸 25

组氨酸 25 异亮氨酸 25

亮氨酸 25 赖氨酸盐酸盐 20

苯丙氨酸 75 酪氨酸 10

缬氨酸 10

L-氨基酸乙组:

门冬氨酸 10 门冬酰胺 2.5

谷氨酸 10 谷胱甘肽 0.5

甘氨酸 5 羟脯氨酸 10

甲硫氨酸 7.5 脯氨酸 10

丝氨酸 15 苏氨酸 10

谷氨酰胺 150 色氨酸 2.5

维生素组:

生物素 100 泛酸钙 125

氨化胆碱 1.5 叶酸 500

肌醇 17.5 烟酰胺 500

对氨基苯甲酸 500 磷酸吡哆胺 500

维生素B₁₂2.5 维生素B₁500

维生素B₂100

无机盐葡萄糖组:

NaCl 3000 KCl 200

Ca(NO₃)₂50 葡萄糖 1000

MgSO₄·7H₂O 25 Na₂HPO₄·12H₂O 1000

酚红 2.5

二、生产操作步骤

1.将物料分别按组称量并溶解，搅拌混和，过滤。

（1）称取无机盐葡萄糖组，置于20立升搪瓷桶中，加9立升离子交换水，加热搅拌到完全溶解，冷却备用;

（2）正确称取L-氨基酸甲组各化合物，置于1立升三角烧瓶中，加入用离子交换水配制的1N HCl550毫升，在水浴中适当加热，搅拌使之溶解，冷却备用;

（3）正确称取L-氨基酸乙组各化合物，置于2立升三角烧瓶中，加入1立升离子交换水，搅拌使之溶解;

（4）正确称取维生素组各化合物，置于1立升三角烧瓶中，加入500毫升离子交换水，搅拌使其溶解;

（5）称取酚红2.5毫克于钵中，加入1N NaOH20毫升，研磨使其溶解;

（6）将MgSO₄·7H₂O称取后置于250毫升三角烧瓶中，加入100毫升离子交换水，加热搅拌溶解;

（7）将Na₂HPO₄·12H₂O称取之后，置于2立升三角烧瓶中，加入1立升离子交换水，加热搅拌溶解，冷却备用;

将（2）～（5）所得到的溶液依次加到（1）溶液中去，搅拌混匀，而后将（6）溶液逐渐倒入（1）溶液中，边加边搅拌，防止产生沉淀，加完后再将（7）溶液缓慢加入，边加边搅拌，防止沉淀大量产生。

制得的溶液最终容量为14立升左右，pH值3～4，用布氏漏斗过滤，清液置于塑料汽油箱中。

2.喷雾干燥制成粉末。

将配制成的溶液在室温中用转盘式喷雾器喷成雾滴。转盘的转速为35000转/分，溶液流入转盘喷雾器的流速为4～5立升/小时;

喷雾器喷成的雾滴在园塔形干燥室中除去水份，此干燥室是单式立式向下并流型，采用电加热空气流，气流的温度为220℃，进风速度为8～10米/秒，直线流动;

干燥后的粉末和热气流经过旋风式分离器分离，在分离器固体粉末出口处用毡袋收集培养基粉末，分离器的温度为70～80℃，收集一定量之后，将培养基粉末倒入塑料袋中，袋口扎紧置于干燥操作箱中。

粉末的产率为45～55%;

进风温度不能过低，低于200℃时，粉末产率极低，不足10%，每次喷雾干燥的连续使用时间为4～5小时，连续使用时间过长，产品会焦化。

3.产品包装。

喷雾干燥后的综合培养基粉末极易吸湿潮解，包装产品要在有空气调节装置的干燥室内进行，或在防潮的操作箱内进行。

为了在贮藏期防潮，保证产品不变质，采用青霉素瓶包装产品，并在铝盖轧封后浸蜡头防潮。

为了使用方便，采用每100毫升中应含固体培养基的量包装，即以1.1克/100毫升及5.5克/500毫升两种包装，前者适用于医疗单位化验用，后者适用于科研单位，开瓶后能一次配成液体培养基。

实施例2.

一、配方（单位：毫克/升）

无机盐:

无水氯化钙 200.00 硝酸铁 0.72

氯化钾 400.00 无水硫酸镁 97.07

氯化钠 6800.00 磷酸二氢钠二水物 158.26

氨基酸:

DL-丙氨酸 50.00 DL-天门冬氨酸 60.00

L-精氨酸盐酸盐 70.00 DL-亮氨酸 120.00

L-谷氨酰胺 100.00 甘氨酸 50.00

L-羟脯氨酸 10.00 L-异亮氨酸 40.00

L-赖氨酸盐酸盐 70.00 DL-甲硫氨酸 30.00

L-苯丙氨酸 50.00 L-脯氨酸 40.00

DL-丝氨酸 50.00 DL-苏氨酸 60.00

DL-色氨酸 20.00 L-酪氨酸 42.56

DL-缬氨酸 50.00

L-组氨酸盐酸盐一水物 20.15

L-半胱氨酸盐酸盐一水物 0.097

L-胱氨酸二盐酸盐 26.00

DL-谷氨酸(一水物) 150.00

维生素:

维生素C 0.05 磷酸生育酚 0.01

d-生物素 0.01 维生素D₂0.10

D-泛酸钙 0.01 氯化胆碱 0.50

叶酸 0.025 i-肌醇 0.05

维生素K₃0.01 烟酸 0.025

烟酰胺 0.025 对-氨基苯甲酸 0.05

盐酸吡哆醇 0.025 盐酸吡哆醛 0.025

核黄素 0.01 盐酸硫胺素 0.01

维生素A 0.14

其它化合物:

腺嘌呤硫酸盐 10.00 腺嘌呤三磷酸 1.00

腺嘌呤一磷酸 0.20 胆固醇 0.20

脱氧核糖 0.50 葡萄糖 1000.00

还原谷胱甘肽 0.05 盐酸鸟嘌呤 0.30

次黄嘌呤 0.354 酚红 10.00

核糖 0.50 乙酸钠 50.00

胸腺嘧啶 0.30 吐温80 10.00

尿嘧啶 0.80 黄嘌呤 0.344

二、生产操作步骤

1.干燥：大多数的原料需要干燥，尤其是称量多的葡萄糖和氯化钠。干燥分为低温真空干燥和高温干燥两种，根据化合物的性质不同分别进行;

2.分组称量：称量要用不同数量级的天平进行，按配方中数量准确称取。这种操作需要在无菌室中进行;

3.分组逐步球磨：将数量级相近的化合物合并在一起球磨均匀，合并时还需考虑化合物的氧化还原性质，先是量小的加小球球磨，待其混合均匀后，加入量较多的化合物球磨，并增加球的数目和中球，待磨均匀后加入量多的化合物，并增加球的数目和大球来磨，此时加入pH指示剂酚红，这样磨出的产品外观色泽呈桃红色，每批一致。最后加入量最多的葡萄糖和氯化钠，并增加大球进行球磨，采用此法进行球磨混合，得到的成品相当均匀;

4.氯化钠和葡萄糖在称量后加入球磨之前必须经干燥，氯化钠采用高温干燥，葡萄糖采用低温真空干燥;

5.球磨完成后即为半成品，用无菌容器贮放，并要保持冷藏和干燥，并进行抽样检验，合格后进入包装车间包装。

6.包装：按1升溶液培养基的重量准确称取后，放入耐高温的复合铝膜袋中，封口包装，并尽量将袋中空气赶出，复合铝膜袋要经过无菌处理。

以上操作要在无菌室中进行。

实施例3.

一、将微量元素分组称量后溶解

1.将下列物料称量后溶于100毫升乙醇中

胆固醇 200毫克维生素A 140毫克

维生素E 10毫克维生素D₂100毫克

维生素K₃10毫克吐温80 20毫克

2.将下列物料称量后溶于含有0.5毫升氨水的100毫升双蒸水中，并加热至60℃：

胸腺素 300毫克尿嘧啶 300毫克

黄嘌呤 300毫克次黄嘌呤 300毫克

3.将下列物料称量后加入250毫升双蒸水振动摇晃使其溶解：

叶酸 10毫克核黄素 10毫克

4.将下列物料溶于200毫升0.075N盐酸溶液中，加热至50℃：

生物素 10毫克盐酸鸟嘌呤 300毫克

5.将下列物料溶于20毫升双蒸水中：

腺嘌呤三磷酸 100毫克腺苷酸 200毫克

脱氧核糖 500毫克谷胱甘肽 50毫克

核糖 500毫克 D-泛酸钙 10毫克

维生素C 50毫克氯化胆碱 500毫克

i-肌醇 50毫克烟酸 25毫克

烟酰胺 25毫克对氨基苯甲酸 50毫克

盐酸吡哆醛 25毫克盐酸吡哆醇 25毫克

盐酸硫胺素 10毫克

二、合并溶液

将上述五组溶液合并，最后再加入1000克葡萄糖，搅拌均匀后，定溶至1000毫升，配成溶液为1000份培养基的用量。

三、冷冻干燥

将上述配成的溶液存放在搪瓷盘中，放进冷冻干燥机内，进行冷冻干燥24～32小时，取出制得冻干粉A，备用。

四、分组称量其他物料

a组:氯化钠 1020克无水氯化钙 30克

氯化钾 60克无水醋酸钠 7.5克

无水硫酸镁 14.7克磷酸二氢钠 23.74克

硫酸腺嘌呤 1.5克酚红 7.50毫克

硝酸铁 108毫克

b组:DL-丙氨酸 7.5克 DL-天门冬氨酸 9克

L-谷氨酰胺 15克甘氨酸 7.5克

DL-异亮氨酸 6克 DL-亮氨酸 18克

DL-甲硫氨酸 4.5克 DL-苯丙氨酸 7.5克

L-羟脯氨酸 1.5克 L-脯氨酸 6克

DL-丝氨酸 7.5克 DL-苏氨酸 9克

DL-色氨酸 3克 L-酪氨酸 6克

DL-缬氨酸 7.5克冻干粉A 153.94克

L-精氨酸盐酸盐 10.5克

L-半胱氨酸盐酸盐一水物 16.5毫克

L-胱氨酸二盐酸盐 3.9克

DL-谷氨酸一水物 22.5克

L-组氨酸盐酸盐一水物 3.28克

L-赖氨酸盐酸盐 10.5克

五、干燥

1.将a组物料放进烘箱里加温105℃，干燥2小时左右;

2.取出已干燥过的a组物料与b组物料合并，再放进真空箱抽真空干燥15小时以上。

六、球磨

将上述干燥过的物料倒入球磨罐内，再加入一定量的球，进行连续10小时搅拌混合球磨，制得微粒粗细均匀粉末。

每球磨一批生产量为1.5公斤。

七、质检

每生产一批产品经检验，含量测试，合格者进入包装。

八、包装

在无菌环境中进行包装：

1.包装前严格消毒包装材料和工具;

2.包装材料为复合膜，包装规格为净重9.85克/包。

将包装好产品贮藏在干燥避光低温中。

实施例4.

将199培养基的100倍浓缩液（配制方法见实施例1）置于不锈钢冷冻盘中，倒入的浓缩液其厚度不超过1厘米，而后置于低温冰箱（-30℃）内预冻，一般放置24小时，使冻结物（物料盘）的温度达到-30℃左右，然后进入冷冻干燥的冻干室。冻干室内搁板事先制冷到-20℃，放入物料盘，抽真空到0.1τ，维持该真空度到冷冻干燥结束。用二支点温度计测量样品温度与冻干室温度，待物料温度为-20℃以下、冻干室温度为-20℃、搁板温度-20℃、冷凝器温度-50℃、真空度显示0.1τ之后，将搁板加热到30℃，使物料中水分从固体状态直接升华，一般在24小时可将物体中的水份升华完毕，此时温度仪显示物料温度、冻干室温度和搁板温度都达到30℃，冷凝器温度为-50℃，真空度为0.1τ，维持30分钟，而后关机（即停止加热和停止抽真空），开启真空蝶阀，使真空度缓缓下降，最后和大气压相同，打开冻干室，取出物料盘，迅速将样品刮到瓶中。整个操作过程保持干燥无菌。产品得率为90%，产品含水量为3～5%。

本实施例也适用于冷冻干燥-球磨法中部分原料制成冷冻干粉。

Claims

1、一种粉末型动物细胞培养基的制备方法，依次包括：原料分组称量，分组溶解，混和搅拌，过滤，喷雾干燥，制得成品后包装诸步骤。

2、根据权利要求1所述的细胞培养基制备方法，其特征在于：所述的喷雾干燥是用高速旋转喷雾器，速度为3500转/分以上，溶液流速4～5立升/小时，干燥室热风温度为220±10℃，风速为8～10米/秒，分离器温度为70～80℃。

3、一种粉末型动物细胞培养基的制备方法，依次包括：原料干燥，分组称量，再次对原料进行干燥，对分组后的原料逐步混合球磨，制得成品后包装诸步骤。

4、根据权利要求3所述的细胞培养基制备方法，其特征在于：原料的干燥为低温真空干燥或高温干燥。

5、根据权利要求4所述的细胞培养基制备方法，其特征在于：所述的高温干燥温度为110℃以下，干燥时间为6小时。

6、根据权利要求3所述的细胞培养基制备方法，其特征在于：球磨时按原料分组量从小到大依次投入混合球磨。

7、一种粉末型动物细胞培养基的制备方法，依次包括：原料分组称量，分组溶解，混合搅拌，过滤，冷冻干燥，包装诸步骤。

8、一种粉末型动物细胞培养基的制备方法，依次包括以下步骤：a.将部分原料分组称量，分组溶解，混和搅拌，冷冻干燥，制得冻干粉半成品;b.将其他原料以及冻干粉半成品按比例分组称量、干燥、混合球磨，制得成品后包装。

9、根据权利要求8所述的细胞培养基制备方法，其特征在于：所述的干燥为高温干燥或低温真空干燥。

10、根据权利要求9所述的细胞培养基制备方法，其特征在于：所述的高温干燥温度为110℃以下，干燥时间为6小时。