CN1049246C

CN1049246C - 一种粉末型动物细胞培养基的制备方法

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Publication number: CN1049246C
Application number: CN93112550A
Authority: CN
Inventors: 方美华; 徐俊杰; 王炳华; 王克勤; 叶争; 邱俊
Original assignee: Shanghai Kangda Amino-Acid Factory
Current assignee: Shanghai Kangda Amino-Acid Factory
Priority date: 1993-09-03
Filing date: 1993-09-03
Publication date: 2000-02-09
Anticipated expiration: 2013-09-03
Also published as: CN1099797A

Abstract

一种粉末型动物细胞培养基制备方法，采用原料分组称量，分组溶解，混和搅拌，过滤，喷雾或冷冻干燥，包装诸步骤；还提供了包括原料干燥，分组称量，再次干燥，对分组后原料逐步混合球磨，包装诸步骤以及冷冻干燥一球磨法的制备方法。本发明制备工艺简单，成本低，产率高，制出的培养基具有性能稳定、不易变质、贮存方便、保存期长、重量轻、溶解性好等特点，适用于科研、医疗检验和药物生产中的细胞培养，提高了细胞培养工作的效率。

Description

一种粉末型动物细胞培养基的制备方法

本发明涉及培养基的制备方法，特别是一种粉末型动物细胞培养基的制备方法。

合成培养基是一种人工配制的适合动物细胞营养要求的混合物质，一般分为用鸡胚、血清消化液等天然成份配制而成的培养基，以及应用化学原料配制而成的合成培养基或者综合培养基。从培养基的物理性质来看，还可以分成加入凝固剂(如琼脂)的固体培养基以及液体培养基。一般来说，液体培养基适用于动物细胞的培养，但是液体培养基容易变质，也给贮存以及运输带来诸多的不便，使细胞培养工作的效率受到了一定程度的影响。因此，把液体培养基改变成粉末状的培养基便可克服上述缺陷，使用时只要将粉末状培养基按比例投入液体内溶解后即可。但在制备粉末状培养基时，由于原料中各物质的理化性质不一，且含量相差悬殊，如何使混合后培养基中各成份分布均匀，培养基性能稳定，成品溶解性好，并能提高产率，降低成本，长期以来一直是人们在制备工艺上渴望解决的问题。

本发明的目的在于提供制备粉末状动物细胞培养基的方法，使其制出的粉末状动物细胞培养基质量稳定，不易变质，且各种成份分布均匀，容易溶解。本发明的技术方案如下：

方法1：

a、将所有原料按维生素、氨基酸、无机盐及其余化合物类别进行分组称量，其分组称量时各组原料成份及含量(单位：毫克/升)为：

维生素组：

维生素C 0.05 磷酸生育酚 0.01

d—生物素 0.01 维生素D2 0.10

D—泛酸钙 0.01 氯化胆碱 0.50

叶酸 0.025 i—肌醇 0.05

维生素K3 0.01 烟酸 0.025

烟酰胺 0.025 对—氨基苯甲酸 0.05

盐酸吡哆醇 0.025 盐酸吡哆醛 0.025

核黄素 0.01 盐酸硫胺素 0.01

维生素A 0.14

氨基酸组：

DL—丙氨酸 50.00 DL—天门冬氨酸 60.00

L—精氨酸盐酸盐 70.00 DL—亮氨酸 120.00

L—谷氨酰胺 100.00 甘氨酸 50.00

L—羟脯氨酸 10.00 L—异亮氨酸 40.00

L—赖氨酸盐酸盐 70.00 DL—甲硫氨酸 30.00

L—苯丙氨酸 50.00 L—脯氨酸 40.00

DL—丝氨酸 50.00 DL—苏氨酸 60.00

DL—色氨酸 20.00 L—酪氨酸 42.56

DL—缬氨酸 50.00

L—胱氨酸二盐酸盐 26.00

L—半胱氨酸盐酸盐一水物 0.097

DL—谷氨酸(一水物) 150.00

L—组氨酸盐酸盐一水物 20.15

无机盐组：

无水氯化钙 200.00 硝酸铁 0.72

氯化钾 400.00 无水硫酸镁 97.07

氯化钠 6800.00 磷酸二氢钠二水物 158.26

其余化合物组：

腺嘌呤硫酸盐 10.00 腺嘌呤三磷酸 1.00

腺嘌呤—磷酸 0.20 胆固醇 0.20

脱氧核糖 0.50 葡萄糖 1000.00

还原谷胱甘肽 0.05 盐酸鸟嘌呤 0.30

次黄嘌呤 0.354 酚红 10.00

核糖 0.50 乙酸纳 50.00

胸腺嘧啶 0.30 吐温80 10.00

尿嘧啶 0.80 黄嘌呤 0.344

b、再按分组称量后的各组进行干燥：维生素组和其余化合物组的原料在50℃-60℃的真空中干燥，无机盐组的原料在100℃-110℃中干燥。

c、按分组中原料量从小到大依次逐步混合球磨，然后按各分组量从小到大依次逐步混合球磨，制得成品后包装。

本方法采用的是液体物料微胶囊理论，球磨时不必剔除液体物料，工艺操作简单，产率高，成本低，其产品具有较好的稳定性。采用该法制成的培养基成份含量精确，分布均匀，性能稳定。

方法2：依次包括以下步骤

a、将原料中微量元素按下列成份分组称量及溶解：

(1)

胆固醇 200毫克维生素A 140毫克

磷酸生育酚 10毫克维生素D₂ 100毫克

维生素K₃ 10毫克吐温80 20毫克

(2)

胸腺嘧啶 300毫克尿嘧啶 300毫克

黄嘌呤 300毫克次黄嘌呤 300毫克

(3)

叶酸 10毫克核黄素 10毫克

(4)

生物素 10毫克盐酸鸟嘌呤 300毫克

(5)

腺嘌呤三磷酸 100毫克腺苷酸 200毫克

脱氧咳糖 500毫克谷胱甘肽 50毫克

核糖 500毫克 D—泛酸钙 10毫克

维生素C 50毫克氯化胆碱 500毫克

i—肌醇 50毫克烟酸 25毫克

烟酰胺 25毫克对氨基苯甲酸 50毫克

盐酸吡哆醛 25毫克盐酸吡哆醇 25毫克

盐酸硫胺素 10毫克

b、将上述各组原料混合再加入1000克葡萄糖搅拌均匀后，冷冻干燥，制得冻干粉半成品A；

c、将其余原料以及冻干粉半成品A按下列成份分组称量：

a组

氯化钠 1020克无水氯化钙 30克

氯化钾 60克无水醋酸钠 7.5克

无水硫酸镁 14.7克磷酸二氢钠 23.74克

硫酸腺嘌呤 1.5克酚红 7.50毫克

硝酸铁 108毫克

b组

DL—丙氨酸 7.5克 DL—天门冬氨酸 9克

L—谷氨酰胺 15克甘氨酸 7.5克

DL—异亮氨酸 6克 DL—亮氨酸 18克

DL—甲硫氨酸 4.5克 DL—苯丙氨酸 7.5克

L—羟脯氨酸 1.5克 L—脯氨酸 6克

DL—丝氨酸 7.5克 DL—苏氨酸 9克

DL—色氨酸 3克 L—酪氨酸 6克

DL—缬氨酸 7.5克冻干粉半成品A 153.94克

L—精氨酸盐酸盐 10.5克

L—半胱氨酸盐酸盐一水物 16.5毫克

L—胱氨酸二盐酸盐 3.9克

DL—谷氨酸一水物 22.5克

L—组氨酸盐酸盐一水物 3.28克

L—赖氨酸盐酸盐 10.5克

d、将上述a组物料加温至105℃进行干燥，再与b组物料合并后进行真空干燥；

e、最后将上述物料混合球磨，制得成品后包装。

该方法尤其适合原料于中含有不稳定物质的培养基的生产，制出的产品稳定性极好，成份分布均匀，且制备工艺成本较低。

综上所述，本发明制备工艺简单，成本低，产率高，所制出的动物细胞培养基具有性能稳定、不易变质、贮存方便、保存期长、重量轻、溶解性好等特点，提高了细胞培养工作的效率。

以下结合实施例对本发明作进一步的描述。

实施例1.

一、配方(单位：毫克/升)

无机盐组：

无水氯化钙 200.00 硝酸铁 0.72

氯化钾 400.00 无水硫酸镁 97.07

氯化钠 6800.00 磷酸二氢钠二水物 158.26

氨基酸组：

DL—丙氨酸 50.00 DL—天门冬氨酸 60.O0

L—精氨酸盐酸盐 70.00 DL—亮氨酸 120.00

L—谷氨酰胺 100.00 甘氨酸 50.00

L—羟脯氨酸 10.00 L—异亮氨酸 40.00

L—赖氨酸盐酸盐 70.00 DL—甲硫氨酸 30.00

L—苯丙氨酸 50.00 L—脯氨酸 40.00

DL—丝氨酸 50.00 DL—苏氨酸 60.00

DL—色氨酸 20.00 L—酪氨酸 42.56

DL—缬氨酸 50.00

L—胱氨酸二盐酸盐 26.00

L—半胱氨酸盐酸盐一水物 0.097

DL—谷氨酸(一水物) 150.00

L—组氨酸盐酸盐一水物 20.15

维生素组：

维生素C 0.05 磷酸生育酚 0.01

d—生物素 0.01 维生素D₂ 0.10

D—泛酸钙 0.01 氯化胆碱 0.50

叶酸 0.025 i—肌醇 0.05

维生素K₃ 0.01 烟酸 0.025

烟酰胺 0.025 对—氨基苯甲酸 0.05

盐酸吡哆醇 0.025 盐酸吡哆醛 0.025

核黄素 0.01 盐酸硫胺素 0.01

维生素A 0.14其余化合物组：

腺嘌呤硫酸盐 10.00 腺嘌呤三磷酸 1.00

腺嘌呤一磷酸 0.20 胆固醇 0.20

脱氧核糖 0.50 葡萄糖 1000.00

还原谷胱甘肽 0.05 盐酸鸟嘌呤 0.30

次黄嘌呤 0.354 酚红 10.00

核糖 0.50 乙酸纳 50.00

胸腺嘧啶 0.30 吐温80 10.00

尿嘧啶 0.80 黄嘌呤 0.344

二、生产操作步骤

1.分组称量：将所有原料按上述配方进行分组称量，称量要用不同数量级的天平进行，按配方中数量准确称取。这样的操作需要在无菌室中进行。

2.干燥：固体原料需要进行干燥，尤其是称量多的葡萄糖和氯化钠。干燥分为低温真空干燥和高温干燥两种，根据化合物的性质不同分别进行，其中无机盐组的原料在100℃-110℃中干燥6小时，氨基酸组、维生素组和其余化合物组的原料在50℃-60℃的真空中干燥。

3.分组逐步球磨：

球磨时应将数量级相近的化合物合并在一起球磨均匀，还需考虑化合物的氧化还原性质，量小的加小球球磨，待其混合均匀后，加入量较多的化合物球磨，并增加球的数目和中球，待磨均匀后加入量多的化合物，并增加球的数目和大球来磨。

再按配方中原料分组量从小到大依次逐步混合球磨，即在本实施例中按维生素组、氨基酸组、其余化合物组(葡萄糖除外)和无机盐组(氯化钠除外)次序逐步投入原料进行混合球磨。

此时加入PH指示剂酚红，这样磨出的产品外观色泽呈桃红色，每批一致。最后加入量最多的葡萄糖和氯化钠，并增加大球进行球磨，采用此法进行球磨混合，得到的成品相当均匀。

4.球磨完成后即为半成品，用无菌容器贮放，并要保持冷藏和干燥，并进行抽样检验，合格后进入包装车间包装。

5.包装：按1升溶液培养基的重量准确称取后，放入耐高温的复合铝膜袋中，封口包装，并尽量将袋中空气赶出，复合铝膜袋要经过无菌处理。

以上操作要在无菌室中进行。

实施例2

一、将微量元素按下列分组并称量后溶解

1.将下列物料称量后溶于100毫升乙醇中：

胆固醇 200毫克维生素A 140毫克

磷酸生育酚 10毫克维生素D₂ 100毫克

维生素K₃ 10毫克吐温80 20毫克

2.将下列物料称量后溶于含有0.5毫升氨水的100毫升双蒸水中，并加热至60℃：

胸腺嘧啶 300毫克尿嘧啶 300毫克

黄嘌呤 300毫克次黄嘌呤 300毫克

3.将下列物料称量后加入250毫升双蒸水振动摇晃使其溶解：

叶酸 10毫克核黄素 10毫克

4.将下列物料溶于200毫升0.075N盐酸溶液中，加热至50℃：

生物素 10毫克盐酸鸟嘌呤 300毫克

5.将下列物料溶于20毫升双蒸水中：

腺嘌呤三磷酸 100毫克腺苷酸 200毫克

脱氧咳糖 500毫克谷胱甘肽 50毫克

核糖 500毫克 D—泛酸钙 10毫克

维生素C 50毫克氯化胆碱 500毫克

i—肌醇 50毫克烟酸 25毫克

烟酰胺 25毫克对氨基苯甲酸 50毫克

盐酸吡哆醛 25毫克盐酸吡哆醇 25毫克

盐酸硫胺素 10毫克

二、合并溶液

将上述五组溶液合并，最后再加入1000克葡萄糖，搅拌均匀后，定至1000毫升，配成溶液为1000份培养基的用量。

三、冷冻干燥

将上述配成的溶液存放在搪瓷盘中，放进冷冻干燥机内，进行冷冻干燥24-32小时，取出制得冻干粉A，备用。

其具体方法是：将合并溶液置于盘中，到入的溶液厚度不超过1厘米，而后置于低温冰箱(-30℃)内预冻，一般放置24小时，使冻结物(物料盘)的温度达到-30℃左右，然后进入冷冻干燥的冻干室。冻干室内隔板事先制冷到-20℃左右，放入物料盘，抽真空到0.1τ，维持该真空度到冷冻干燥结束。用二支点温度计测量样品温度与冻干室温度，待物料温度为-20℃以下、冻干室温度为-20℃、搁板温度-20℃、冷凝温度-50℃、真空度显示0.1τ之后，将搁板加热到30℃，使物料中水分从固体状态直接升华，一般24小时可将物体中的水分升华完毕，此时温度仪显示物料温度、冻干室温度和搁板温度都达到30℃，冷凝器温度为-50℃，真空度为0.1τ，维持30分钟，而后关机(即停止加热和停止抽真空)，开启真空蝶阀，使真空度缓缓下降，最后和大气压相同，打开冻干室，取出物料盘，迅速将物料刮到瓶中。整个操作过程保持干燥无菌。

四、将其余原料分组称量

a组

氯化钠 1020克无水氯化钙 30克

氯化钾 60克无水醋酸钠 7.5克

无水硫酸镁 14.7克磷酸二氢钠 23.73克

硫酸腺嘌呤 1.5克酚红 7.50毫克

硝酸铁 10毫克

b组

DL—丙氨酸 7.5克 DL—天门冬氨酸 9克

L—谷氨酰胺 15克甘氨酸 7.5克

DL—异亮氨酸 6克 DL—亮氨酸 18克

DL—甲硫氨酸 4.5克 DL—苯丙氨酸 7.5克

L—羟脯氨酸 1.5克 L—脯氨酸 6克

DL—丝氨酸 7.5克 DL—苏氨酸 9克

DL—色氨酸 3克 L—酪氨酸 6克

DL—缬氨酸 7.5克冻干粉半成品A 153.94克

L—精氨酸盐酸盐 10.5克

L—半胱氨酸盐酸盐一水物 16.5毫克

L—胱氨酸二盐酸盐 3.9克

DL—谷氨酸一水物 22.5克

L—组氨酸盐酸盐一水物 3.28克

L—赖氨酸盐酸盐 10.5克

五、干燥

1.将a组物料放进烘箱里加温105℃，干燥2小时左右；

2.取出已干燥过的a组物料与b组物料合并，再放进真空箱抽真空干燥15小时以上。

六、球磨

将上述干燥过的物料倒入球磨罐内，再加入一定量的球，进行连续10小时搅拌混合球磨，制得微粒粗细均匀粉末。

每球磨一批生产量为1.5公斤。

七、质检

每生产一批产品经检验，含量测试，合格者进入包装。

八、包装

在无菌环境中进行包装：

1.包装前严格消毒包装材料和工具；

2.包装材料为复合膜，包装规格为净重9.85克/包。

将包装好产品贮藏在干燥避光低温中。

Claims

1、一种粉末型动物细胞培养基的制备方法，依次包括下列步骤：

a、将所有原料按维生素、氨基酸、无机盐及其余化合物类别进行分组称量，其分组称量时各组原料成份及含量(单位：毫克/升)为

维生素组：

维生素C 0.05 磷酸生育酚 0.01

d—生物素 0.01 维生素D₂ 0.10

D—泛酸钙 0.01 氯化胆碱 0.50

叶酸 0.025 i—肌醇 0.05

维生素K₃ 0.01 烟酸 0.025

烟酰胺 0.025 对—氨基苯甲酸 0.05

盐酸吡哆醇 0.025 盐酸吡哆醛 0.025

核黄素 0.01 盐酸硫胺素 0.01

维生素A 0.14

氨基酸组：

DL—丙氨酸 50.00 DL—天门冬氨酸 60.00

L—精氨酸盐酸盐 70.00 DL—亮氨酸 120.00

L—谷氨酰胺 100.00 甘氨酸 50.00

L—羟脯氨酸 10.00 L—异亮氨酸 40.00

L—赖氨酸盐酸盐 70.00 DL—甲硫氨酸 30.00

L—苯丙氨酸 50.00 L—脯氨酸 40.00

DL—丝氨酸 50.00 DL—苏氨酸 60.00

DL—色氨酸 20.00 L—酪氨酸 42.56

DL—缬氨酸 50.00

L—胱氨酸二盐酸盐 26.00

L—半胱氨酸盐酸盐一水物 0.097

DL—谷氨酸(一水物) 150.00

L—组氨酸盐酸盐一水物 20.15

无机盐组：

无水氯化钙 200.00 硝酸铁 0.72

氯化钾 400.00 无水硫酸镁 97.07

氯化钠 6800.00 磷酸二氢钠二水物 158.26

其余化合物组：

腺嘌呤硫酸盐 10.00 腺嘌呤三磷酸 1.00

腺嘌呤一磷酸 0.20 胆固醇 0.20

脱氧核糖 0.50 葡萄糖 1000.00

还原谷胱甘肽 0.05 盐酸鸟嘌呤 0.30

次黄嘌呤 0.354 酚红 10.00

核糖 0.50 乙酸纳 50.00

胸腺嘧啶 0.30 吐温80 10.00

尿嘧啶 0.80 黄嘌呤 0.344

2、一种粉末型动物细胞培养基的制备方法，依次包括以下步骤：

a、将原料中微量元素按下列成份分组称量及溶解：

(1)

胆固醇 200毫克维生素A 140毫克

磷酸生育酚 10毫克维生素D₂ 100毫克

维生素K₃ 10毫克吐温80 20毫克

(2)

胸腺嘧啶 300毫克尿嘧啶 300毫克

黄嘌呤 300毫克次黄嘌呤 300毫克

(3)

叶酸 10毫克核黄素 10毫克

(4)

生物素 10毫克盐酸鸟嘌呤 300毫克

(5)

腺嘌呤三磷酸 100毫克腺苷酸 200毫克

脱氧咳糖 500毫克谷胱甘肽 50毫克

核糖 500毫克 D—泛酸钙 10毫克

维生素C 50毫克氯化胆碱 500毫克

i—肌醇 50毫克烟酸 25毫克

烟酰胺 25毫克对氨基苯甲酸 50毫克

盐酸吡哆醛 25毫克盐酸吡哆醇 25毫克

盐酸硫胺素 10毫克

b、将上述各组原料混合再加 1000克葡萄糖搅拌均匀后，冷冻干燥，制得冻干粉半成品A；

c、将其余原料以及冻干粉半成品A按下列成份分组称量：

a组

氯化钠 1020克无水氯化钙 30克

氯化钾 60克无水醋酸钠 7.5克

无水硫酸镁 14.7克磷酸二氢钠 23.74克

硫酸腺嘌呤 1.5克酚红 7.50毫克

硝酸铁 108毫克

b组

DL—丙氨酸 7.5克 DL—天门冬氨酸 9克

L—谷氨酰胺 15克甘氨酸 7.5克

DL—异亮氨酸 6克 DL—亮氨酸 18克

DL—甲硫氨酸 4.5克 DL—苯丙氨酸 7.5克

L—羟脯氨酸 1.5克 L—脯氨酸 6克

DL—丝氨酸 7.5克 DL—苏氨酸 9克

DL—色氨酸 3克 L—酪氨酸 6克

DL—缬氨酸 7.5克冻干粉半成品A 153.94克

L—精氨酸盐酸盐 10.5克

L—半胱氨酸盐酸盐一水物 16.5毫克

L—胱氨酸二盐酸盐 3.9克

DL—谷氨酸一水物 22.5克

L—组氨酸盐酸盐—水物 3.28克

L—赖氨酸盐酸盐 10.5克

e、最后将上述物料混合球磨，制得成品后包装。