CN1261271A - 多肽、蛋白和核酸的稳定的药用施用形式 - Google Patents

多肽、蛋白和核酸的稳定的药用施用形式 Download PDF

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Abstract

本发明是关于生物分子的能稳定储存的冻干药用制备物的,其中生物分子选自由蛋白,肽,核酸和碳水化合物组成的一组分子,并另加入一种或几种碱性的D－或L－氨基酸,同时加入一种或几种氨基二羧酸,羟基羧酸,或双羧基酸或它们的生理上可耐受的盐。冻干物中的辅剂为完全或部分不定形形式。

Description

多肽、蛋白和核酸的稳定的药用施用形式
本发明是关于药用或诊断用的冻干组分，包括蛋白，肽，核酸或多糖。其中使用了辅剂从而使冻干物呈现不定形状或部分不定形状。
在过去的20年中，生物技术的进步使能够大量获得的生物分子的数量大大增加。这些生物分子在药物治疗中的应用是尤为活跃的一个领域。例如，一些蛋白被用于调节独特的细胞类型，核酸被用于调节基团表达，多糖被用于疫苗。由于冷冻保存的空间经常是有限的，如果制备物能在室温保存是在实践中尤为有利的。
进而，对于温度敏感的制备物需要在从冰箱中取出到药用(如注射)之间的时间内严格监控，因为降解反应可产生付产物，这会使其作用范围产生不利变化。很难确保对制备物保存条件的连续监测，这在普通的医院里和对人的临床研究中施用药用制备物是尤难做到。
所有的生物分子都或多或少地能被水解。水解是天然代谢的一部分，并且，例如，对于防止高分子毒性物质在体内的积累是必须的。
进而，文献中还描述了多种其它能不同程度地影响生物分子的降解反应。对于肽或蛋白而言，这样的降解反应以聚集，变性，异构化或氧化还原的形式发生。对于核酸而言则如脱氨作用或加入亲核体导致核酸的降解。
对于，如，肽或蛋白的药用或诊断用制备物的稳定冻干物的制备，目前还没有现成的方法可指导从多种可能的辅助物质和添加剂选出可靠的辅助物质以确保相应的活性物质形成稳定的制剂。选自合适的辅助物质以得到足够稳定的施用制剂，从而，如，保证充分和储存稳定性或延迟或防止前述的降解反应，这种选择通常是根据经验进行的。
已知许多蛋白的储存稳定性随着水分的除去而提高。除去水分的合适的方法为冻干与真空干燥。然后这些技术过程的应用也可能导致降解反应物，如，在冻干中冰冻是必需的，然而许多蛋白对冰冻过程不够稳定。当生物多聚物的水溶液冷却时，大部分水结晶而生物多聚物保持不定形状态。这将导致生物多聚物的分子环境的改变，从而也造成生物多聚物的空间结构或构象发生变化。这可能另一方面通过，如，增加个别功能基团的反应性或通过使相邻的生物多聚物未折叠的链片段聚集从而消减降解反应。并且，干燥时环绕蛋白质的水层的除去可能导致蛋白链的化学反应，如氧化，适当的添加剂可防止或减轻这些降解反应的程度。
在冻干或真空干燥时，辅助物质的一个重要功能是为生物多聚物提供一个稳定的不定形环境，并在进一步冷却时固化成玻璃态。这种转化是在一个很窄的温度范围内以质变的方式发生的，其特征为玻璃态温度Tg′。分子的运动性以及反应性在低于此温度时大大降低。在非常适用于冻干的配方中，Tg′越高越好，并通常高于-40℃。不定形结构的存在可以用，如差式热量扫描法(DSC)，X-光衍射检测或光学及电子显微法检测。
为了制造足够稳定的冻干施用药剂，有必要选用在冰冻时不结晶或仅部分结晶的辅助物质。这样在冷干过程中保护生物分子的辅助物质名为：“冷冻保护剂”，在主干燥期冰晶体升华而在后干燥期结合在不定形相及分生物分子上的水被除去。后干燥期通常需要更强烈的条件(更高的温度或更强的真空度)。Tg′随着冻干物质中的水分的减少而升高。为了减短干燥期的时间，冻干室中板温度渐渐升高，但必须保持在Tg′以下。
在干燥期中，辅助物质维持着包埋多聚物的玻璃态。并且，在后干燥期中水分子的除去导致了生物分子中形成氢键的自由价。这增加了生物分子的反应性。加入适当的起稳定作用的辅助物质的目的是形成氢键从而为生物分子提供  水取代(Wasserersatz)环境。为此引入“冷冻保护剂“这个术语。
储存中许可温度的上限是由玻璃态转变温度Tg决定的，高于此温度分子的运动性大大增加。这导致结晶过程(特征为结晶温度Tk)或化学反应。宏观上这经常导致所谓的冻干饼的塌垮(特征为塌垮温度Tc)，这里由于辅助物质的分子彼此结合并进而伴随着辅助物质基架的比表面积减小造成的。
冻干物中的水使Tg减小；在优良的配方中，冻干后的残留水量低于3％。然后水的含量在较长的储存过程中可能有所增加。为了保留充分安全的余地，玻璃态冻干物的储存温度应低于Tg最高20℃。
WO 93/00807描述了一种在冻干中起稳定作用的双成分系统，包含一种结晶保护剂(如聚乙二醇，PVP或淀粉/或一种冻干保护剂(如蔗糖，多羟基醇或氨基酸)用于在冻干中起稳定作用。
众所周知玻璃态形成的倾向随着分子量的增加而增加。因此使用多聚物如PVP，蛋白(尤其是血清白蛋白)或多糖(Dextran)以形成稳定的玻璃态基架。
然而，已知象血清白蛋白这样的保护蛋白在注射后是不利的，因为它们能诱导抗体的形成，这不利于它们在非肠道施用制剂中的应用。并且原材料不同的不同批次的保护蛋白引入了不确定性，因为这些差异会负面影响加工能力以及生产出的产品批次的质量。
进而，用作辅助物质的多糖在血液循环中可具有致热原性效应。多糖的另一缺点是它们经常需要溶胀，在冻干物复原时很难快速形成清亮的溶液。并且，这种材料通常是由不同链长的组分组成的，不同批次之间更难保持一致。后一点对于合成的多聚物如PVP(聚乙烯吡咯烷酮)。
从前生物分子冻干中用于形成玻璃态的小分子物质几乎全是多烃基复合物如糖类(蔗糖、海藻糖，葡萄糖)或糖醇(甘露醇)，然而，加入甘露醇只能形成亚稳玻璃态，在储存中会形成结晶。
还原糖如葡萄糖或麦芽糖可能导致基团反应或氧化还原反应并与氨基(如，蛋白中的，形成Amadori产物，并且美拉德反应(MaillardReaction)可使制备物变成褐色。非还原糖或三糖可能水解从而一方面形成还原糖，另一方面可潜在地损坏辅助物质基架的物理特性。已知糖醇如甘露醇能催化水解反应，比如，在乙酸盐存在的情况下。并且它们有结晶的倾向。尽管如此，甘露醇/基氨酸/(优选地磷酸，去污剂)复合物经常用作冻干蛋白的辅助物质基质(如，EP 0 597 101，WO89/09614)。
制备足够干的糖制备物中的其它缺点或问题是干燥时间大量延长，这是由于所使用的生物材料的稳定性决定了只可能输入很少的热量。过长的处理时间在商业上是不利的，并且增加了加工中的危险，如真空室的泄露，冷却系统可能出故障，等等。
人们很惊奇地发现，某些辅助物质的连用适合用于生物分子冻干中形成玻璃态。因此本发明是关于包含，以下成分的冻干制备物：
(a)选自蛋白，肽，核酸和碳水化合物组成的一类生物分子；
(b)一种或多种碱性D-氨基酸或L-氨基酸；和
(c)一种或多种氨基二羧酸，羟基羧酸，羟基二羧酸，或双羧基酸或生理上可耐受的盐。其中此处的出现在冻干物质的辅助物质至少部分是不定形状态。也可选择加入一种或几种中性氨基酸使之易于干燥并改善冻干饼的形态结构。
辅剂的选择使得冻干物中的辅剂或者是完全不定形的或者是至少部分不定形的。与结晶成分相反，这样的冻干物具有高于储存温度的玻璃态转变温度(Tg)。辅剂的适当复合物为包含(A)组和(B)组中至少一种物质的混合物，其中(A)是碱性D-氨基酸或L-氨基酸，而(B)是氨基二羧酸，尤其是酸性的D-氨基酸或L-氨基酸，氨基羧基酸，单羧基酸，双羧基酸，或羟基二羧酸或生理可耐受的盐。这样的混合物适用于生物分子冻干中的玻璃态形成物质。这样的优点是这样制备的冻干物在很长的一段时期内稳定。所需的稳定期的长短决定了所用的生物分子的稳定性，优选地至少为一年，具体而言是在冷冻温度或室温一至两年。这可允许减少使用或完全避免使用上述较不稳定的类别的物质，从而生产药用施用制备物时，使用上述类别的物质带来的缺点可很大程度地被避免。根据本发明制备冻干物的另一优点是干燥时间大大缩短，尤其是在使用疏水氨基酸时少于30小时，优选地少于24小时，尤其优选地少于15小时。这意味着冻干过夜即可制备干燥物，而不是需要干燥几天。
选择包含碱性氨基酸以及调节pH所要求的抗衡离子，以便冻干过程中形成至少部分不定形的基架，上述基架具有大于50℃的玻璃态转变温度，优选地大于65℃，尤为优选地大于80℃，这样即可得到药用上稳定的冻干物。冷冻的溶液的玻璃态转变温度如果大于-40℃对于生产过程是有利的。
为了调节pH值，也可另外使用生理上可耐受的酸或碱及其盐，合适的酸为无机或有机酸，如磷酸，醋酸等。优选使用自由酸或碱以便冻干物中的盐浓度尽可能低。对于一些蛋白和肽而言，如果磷酸的含量大于5mM在制备待冻干的溶液时会发现蛋白在磷酸精氨酸中聚集。当使用精氨酸柠檬酸(c＝10mM)时也会发现类似的现象。令人惊奇的是，当使用单羧基本或双羧基酸代替精氨酸的磷酸盐作为抗衡离子时可减少聚集或很大程度上避免。使用氨基二羧酸(例如，酸性的D-氨基酸或L-氨基酸)或双羧基酸时冻干物具有尤其稳定的玻璃态。使用碱性氨基酸时，可选择加入浓度小于5mM的磷酸以在pH 5-7之间微调值。
进而，根据本发明的施用形式还具有这样的优点。即玻璃态转变温度以及冻干饼的外观进一步得以改善，这在另加入中性氨基酸时尤为显著，纵然中性氨基酸部分结晶时也是如此。这种氨基酸的量可在很大范围内变动(辅剂总量的5-50％)。
根据本发明的施用形式的优点在于室温长时间保存时它们是稳定的。这样纵然在冷藏环节出现中断时也能保证药用制备物的安全使用。
本发明中的合适的添加剂或辅剂在一个优选的实施例中是碱性，酸性与及至少一种中性氨基酸的复合物。这些复合物的成分在生理上是可高度耐受的，具有良好的冻干特性并改善冻干生物多聚物的热稳定性。并且用水溶解冻干物时能迅速得到清亮的溶液。
在本发明的意义上合适的碱性氨基酸是生理可耐受的，具有碱性侧链的氨基酸，如组氨酸、赖氨酸、精氨酸、鸟氨酸，或瓜氨酸。相应地，合适的中性氨基酸是生理上可耐受的，具有疏水性或亲水性侧链的氨基酸，如苯丙氨酸，甘氨酸，亮氨酸，或异亮氨酸，合适的酸为相应的氨基二羧酸，羟基羧酸，羟基二羧酸，双羧基酸，或它们的生理上可耐受的盐，如天冬氨酸或谷氨酸。如果这些酸具有手性中心，可以使用消旋体或甚至光学活性衍生物。
根据本发明的添加剂的量优选地选择使得冻干物中(c)组(氨基二羧酸，羟基羧酸，或双羧基酸)与(a)组的D-或L-碱性氨基酸的重量比在0.1∶1到2∶1的范围内。从0.1∶1到1∶1的范围，尤其是0.5∶1是尤为有利的。
在本发明的意义上，许多蛋白与多肽可考虑用作根据本发明的用于生产药用施用形式的活性物质，如免疫调节因子，淋巴因子，单核因子，细胞因子，酶，抗体，生长因子，生长抑制因子，血液蛋白，激素，疫苗，血液凝集因子和相应的前体蛋白，以及它们的突变蛋白和片段。肽或蛋白的分子量在0.5～500KD，优选地在2.0～200KD之间。例子如以下的蛋白或肽：心钠素或ANP(cf.WO.85/33768)，尿舒张肽(cf.WO 85/02850)，BNP(脑钠尿肽)，耳素(Auriculin)，干扰素，集落刺激因子，白介素(IL-1、IL-1α、IL-1β、IL-2、IL-3、IL-4，等等)。巨噬细胞刺激因子，B细胞因子，尿激酶，纤溶酶原激活剂，TNF，NGF，促红细胞生成素，EGF，hGH，BMP(骨形态发生因子)，降钙素，胰岛素或松弛素。
核酸如质粒，DNA片段或RNA链也适于发明形式的施用。
根据本发明冻干的药用施用形式特别适合于以液体形式通过非肠道途径施用。
以下的实施例用于示明本发明，1并在随后加以简述。作为生物分子冻干的玻璃态形成剂，这些配方已被发现很大程度上提高玻璃态转变温度，防止生物分子的聚集，改善冻干饼的外观，并有利于冻干的生物分子的热稳定性，列出的配方表明，只有根据本发明的混合物能得到既定的效果，即它们能在一较短的冻干过程中得到全部或不定形结构的蛋白制剂。
在随后的例子中的浓度指的是冻干前的溶液的浓度。实施例1：
配方1 初始溶液的浓度
L-精氨酸  20mg/ml
天门冬氨酸  10mg/ml
吐温80  0.1mg/ml
G-CSF  0.35mg/ml
溶液的pH值用磷酸调至pH 7.4。
2g  L-精氨酸和1g  L-天冬氨酸溶于50ml水中，用移液器往此溶液中加入35mg G-CSF(溶于30ml 10mM磷酸缓冲液中)并搅拌5分钟，然后用移液器加入100μl吐温80(10％的水溶液)并连续搅拌20分钟。用磷酸将pH值调至7.4并定量至100ml。将溶液过滤通过滤膜(PVDF滤膜0.22μm)并分装到玻璃瓶中，每瓶1ml。盖了合适的塞子后冻干，干燥总共进行40小时。然后密封并储存在不同的温度直到分析。通过DSC发现冻干饼的玻璃态转变温度为95℃。26个星期之后记录了不同储存条件的冻干物样品的X-射线衍射谱。这些衍射谱表明纵然在60℃储藏的样品仍是不定形的。实施例2(对照实验)
配方2 初始溶液的浓度
L-缬氨酸 20mg/ml
甘氨酸 20mg/ml
吐温80 0.1mg/ml
G-CSF 0.35mg/ml
溶液用NaOH调至pH 7.4
2g缬氨酸和2g甘氨酸溶于50ml水中。用移液器加入100μl吐温80(10％的水溶液)并继续搅拌20分钟。然后加入NaOH调pH值到pH 7.4。用移液器加入35mg G-CSF(溶于30ml 10mm的磷酸缓冲液中)并搅拌5分钟。复检pH值并定容至100ml。在装入小瓶后如实施例1从该溶液制备冻干物。在制备之后立即用DSC检测，没有发现玻璃态转变温度。X-光衍射和电镜观察表明冻干饼完全是晶体。没有检测到不定形的或部分不定形的结构。实施例3(对照实验)
配方3 初始溶液的浓度
L-缬氨酸 10mg/ml
甘氨酸 20mg/ml
吐温80 0.1mg/ml
LDH (150 U25℃)0.35mg
溶液用NaOH调pH值至7.4。1g缬氨酸和2g甘氨酸溶于70ml水中，加入100μl吐温80(10％水溶液)并搅拌20分钟。然后加入NaOH将pH值调至pH 7.0。用移液器往溶液中加入30mg(15kU)LDH(猪肌肉，溶于20ml  20mM的磷酸缓冲液中)并搅拌5分钟。复检pH值定容至100ml。装入瓶中后按实施例1制备此溶液的冻干物。这种配方也完全结晶。没有检测到不定形的结构。实施例4
配方4   总量/瓶
 L-精氨酸  20mg
 L-苯丙氨酸  10mg
 L-天冬氨酸  10mg
 吐温80  0.1mg
 LDH(猪肌肉) (150 U25℃)0.3mg
用磷酸调溶液的pH值至7.4。
2g L-精氨酸，1g天冬氨酸和1g L-苯丙氨酸溶于70ml水中，加入100μl吐温80(10％水溶液)并搅拌20分钟，加入磷酸将pH值调至7.4。用移液器往溶液中加入50mg(15kU)LDH(猪肌肉，溶于30ml 100mM磷酸缓冲液中)并搅拌5分钟。复检pH值并定容至100ml。装入瓶中后，如实施例1所描述的从上述溶液制备冻干物。分析显示部分苯丙氨酸显现晶体形式，即冻干饼是部分晶体，部分不定形的。晶体部分在储存中保持稳定。实施例5
将样品瓶在室温(RT)储存后利用RP-HPLC确定配方1和配方2中的未改变的G-CSF量：
4星期RT储存后未变化的蛋白的比率
未加辅剂冻干的大批活性物质     96.5％
L-精氨酸/磷酸/天冬氨酸/吐温80(配方1)     98.9％
L-缬氨酸/甘氨酸/吐温80(配方2)     92.0％
样品瓶在室温储存(5或13个星期)之后利用两个光学测试测定配方3和配方4的酶活。
  冻干后   5星期RT   13星期RT
未加辅剂冻干的大批活性物质     61.3％     29.1％     11.4％
L-精氨酸/磷酸/天冬氨酸/L-苯丙氨酸(配方4)     81.2％     74.3％     58.1％
L-缬氨酸/甘氨酸/吐温80(配方3)     64.1％     9.2％     ＜1％
实施例6
冻干物的制备与实施例4类似，但精氨酸为相同摩尔量的其它碱性氨基酸代替。室温储存5个星期后测定了LDH的酶活。
    No.     冰干后 室温保存5星期
L-瓜氨酸     配方5     82.2％     60.4％
L-组氨酸     配方6     65.5％     53.1％
L-赖氨酸     配方7     68.6％     56.5％
L-鸟氨酸     配方8     65.5％     46.5％
实施例7
配方 初始溶液的浓度
 L-精氨酸  20mg/ml
 L-异亮氨酸  10mg/ml
 rhNGF  0.1μg
溶液的pH值用酸调至6.3(见下文)
2g L-精氨酸溶于50ml水中并加入酸将pH值调至6.3。加入1g异亮氨酸和1mg rhNGF并用水定容至100ml。将该溶液过滤通过膜(PVDF滤膜0.22μm)并分装至玻璃瓶中每瓶1ml，盖上合适的塞子后冻干，总干燥时间约为40小时。然后用PSC测量冻干物。结果：
    No.     Tg     评价
HCl     配方9     41.4℃     -
L-乳酸     配方10     54.3℃     (+)
3-羟基丁酸     配方11     37.7℃     --
苹果酸     配方12     67.8℃     +
琥珀酸     配方13     76.1℃     +
富马酸     配方14     81.0℃     ++
马来酸     配方15     82.3℃     ++
L-谷氨酸     配方16     86.1℃     ++
实施例8(对照实验)
配方17 初始溶液的浓度
L-精氨酸  20mg/ml
尿舒张肽  1.0mg/ml
溶液的pH值用磷酸调至6.0。
2g L-精氨酸溶于50ml水中并加入磷酸调pH至6.0。用移液器加入100mg尿舒张肽(溶于30ml水中)并搅拌10分钟、60分钟之后溶液变混浊并且蛋白絮凝。此后即中止实验。实施例9(参照实验)
配方18 初始溶液的浓度
L-精氨酸  20mg/ml
尿舒张肽  1.0mg/ml
溶液的pH值用柠檬酸调至6.0。
2g L-精氨酸溶于50ml水中并加入柠檬酸调至pH值至6.0。用移液器加入100mg尿舒张肽(溶于30ml H2O)并搅拌10分钟，两小时后溶液混浊并且蛋白絮凝。此后实验终止。实施例10
根据实施例7的程序制备含有活性物质尿舒张肽的冻干物，每瓶中含有如下组分：a)配方19(对照实验)
1mg尿舒张肽
10mg甘露醇
醋酸调pH至6.3。
X-光衍射分析表明冻干物完全中晶体结构，没有可检测到不定形或部分不定形的结构。b)配方20
1mg  尿舒张肽
20mg L-精氨酸
10mg L-异亮氨酸
天冬氨酸调pH至6.3。DSC测样：
配方19：没有可检测的玻璃态转变，完全结晶。
配方20：Tg＝85.1℃，部分不定形结构。
配方10和配方20都在室温存放一年。随后的凝胶电泳表明：
配方19：双体＞1％，并可溶性聚集。
配方20：100％单体。实施例11：
用实施例7中的程序制备冻干物，每瓶中含有以下成分：a)配方21(对照实验)
1mg尿舒张肽
50mg蔗糖
10mg甘氨酸
6mg聚乙二醇6000。b)配方22
1mg  尿舒张肽
20mg L-精氨酸
10mg L-异亮氨酸
用天冬氨酸调pH值至6.3。b)配方23
4mg   尿舒张肽
20mg  L-核氨酸
10mg  L-异亮氨酸
用天冬氨酸调pH至6.3d)配方24
1mg   尿舒张肽
20mg  L-精氨酸
10mg  L-异亮氨酸
用天冬氨酸调pH至6.3b)配方25(对照实验)
1mg   尿舒张肽
25mg  蔗糖
20mg  甘氨酸
在一次胁迫测试中，所有的配方21-25被储存于不同的温度下，然后用RP-FPLC测定成分
    初始值   13星期，5℃   13星期，25℃   13星期，40℃
配方.21     99.3％     99.1％     98.8％     96.3％
配方.22     99.7％     99.3％     99.7％     99.6％
配方.23     99.6％     99.6％     99.5％     99.2％
配方.24     99.7％     99.5％     99.2％     99.4％
配方.25     99.4％     99.5％     98.2％     93.1％
实施例10和11的结果表明根据本发明的配方比根据先前工艺中的基于蔗糖或蔗糖/PEG的配方能更好地稳定肽以对抗温度胁迫。在许多配方中使用的甘露醇也不能产生足够稳定的配方。
实施例8和9表明，在缓冲体系中经常使用的酸导致一些肽的絮凝。这种现象在根据本发明的配方中所使用的酸(优选地天冬氨酸与谷氨酸)中并未观察到。实施例12
用实施例7中的程序制备冻干物，每瓶中含有以下成分：a)配方26(对照实验)
1mg    尿舒张肽
15mg   甘露酸
2mg    L-异亮氨酸
10mg   脲
0.5mg  多聚山梨酸酯
用醋酸钠缓冲液调pH值至6.8；完全结晶。b)配方27
1mg  尿舒张肽
20mg L-精氨酸
10mg D-异亮氨酸
用D-天冬氨酸调pH值至6.8。c)配方28
1mg   尿舒张肽
20mg  L-精氨酸
10mg  L-异亮氨酸
用L-天冬氨酸调pH值至6.8。d)配方29(对照实验)
1mg   尿舒张肽
20mg  L-苏氨酸
10mg  D-异亮氨酸e)配方30(对照实验)
1mg  尿舒张肽
15mg 聚乙二醇6000
5mg  苯丙氨酸
在一次胁迫实验中，这些配方储存于不同的温度中，然后用RP-HPLC确定主要降解产物的量。
  初始值   13星期，5℃   13星期，40℃     Tg
配方.26     0.2％     2.1％     6.5％      -
配方.27     0.4％     0.4％     0.5％     83.8℃
配方.28     0.2％     0.2％     0.4％     84.6℃
配方.29     0.3％     1.8％     3.5％     61.2℃
配方.30     0.3％     2.8％     4.7％      -
在本发明的配方中，降解产物的量明显地少。虽然配方29中形成了无定形的冷干饼，但不足以稳定蛋白质。实施例13
用实施例7中的程序制备冻干物，每瓶中含有以下成分：a)配方31
1mg尿舒张肽
70mg蔗糖
210mg L-苯丙氨酸b)配方32
1mg  尿舒张肽
85mg 蔗糖c)配方33
1mg  尿舒张肽
46mg 棉子糖
10mg L-苯丙氨酸d)配方34
1mg  尿舒张肽
20mg L-精氨酸
5mg  L-苯丙氨酸
用L-天冬氨酸调pH值至6.3
在一次胁迫实验中，所有的配方31-34被储存于不同的温度下，然后用1ml水溶解冻干物，1小时后用浊度计(Hach型)测量重新溶解后的溶液的浊度。高于1.0的浊度被认是不可接受的。由于辅剂是易于溶解的，在几种配方中观察到的测定是由于肽的聚集引起的。结果：
  配方号   初始值     4W.KS     4W.RT   4W.40℃   13W.KS    13W.RT     13W.40℃
    21     0.6     0.8     0.5     1.6     0.8     1.4     3.6
    25     0.7     0.5     0.4     1.2     0.8     0.9     1.4
    31     0.7     0.7     0.6     0.6     1.4     1.7     1.7
    32     0.8     0.7     1.1     1.0     1.7     1.9     1.7
    33     1.4     1.2     1.1     1.4     n.d.     n.d.     n.d.
    34     0.6     0.5     0.7     0.6     0.5     0.5     0.5
    22     0.5     0.6     0.6     0.7     0.6     0.7     0.8
KS＝冷藏温度：-8℃
RT＝室温，20-22℃
在热胁迫后，只有根据本发明的配方没有超过浊度阈值1.0。实施例14
几种配方中的尿舒张肽在如实施例11重配后用光散射测量仪(PMS)测量颗粒。结果：(列出的是每种情况下的5个瓶子的平均值)
配方号   初始值   4星期KS   4星期40℃   13星期KS   13星期40℃
  ＞5μm   ＞25μm   ＞5μm   ＞25μm   ＞5μm   ＞25μm   ＞5μm   ＞25μm   ＞5μm   ＞25μm
  26   78     4   140    21   1262   28     713     28   2560   35
  33   36     2   160     6   849   17     440     11   1398   22
  34   4     0     6     0   21   4     31     1     65   11
  22   111     0    13     1   34   3     17     0     42   7
根据本发明的配方在升高温度储存后并没有出现颗粒数的增加。实施例15
含有蛋白rhNGF的冻干物用以下组分制备a)配方35
0.025mg  rhNGF
20mg L-精氨酸
10mg L-天冬氨酸
用乙酸调pH值至6.3。b)配方36
0.025mg  rhNGF
20mg  L-精氨酸
10mg  L-天冬氨酸
10mg  L-异亮氨酸
用乙酸调pH值至6.3。c)配方37(对照实验)
0.025mg rhNGF
20mg  L-精氨酸
30mg  蔗糖
用乙酸调pH值至6.3。d)配方38(对照实验)
0.025mg  rhNGF
20mg  L-精氨酸
30mg  棉子糖
用乙酸调pH值至6.3。
与通常的程序相比，冻干时间大大缩短了：从40-50个小时缩短到15个小时。然后在独立的实验中测定了冻干物中残余的水分。结果：
配方35：4.7％/5.0％
配方36：1.0％/0.9％
配方37：5.9％/6.6％
配方38：5.6％/5.6％
本实施例表明，只有根据本发明的配方，特别是使用疏水氨基酸做为第三种成分的配方才可能缩短冻干时间。实施例16：
含蛋白质rhNGF的冻干物用如下成分制备：a)配方39
0.025mg  rhNGF
20mg  L-精氨酸
10mg  β-丙氨酸
10mg  L-天冬氨酸
用乙酸调pH值至6.3。b)配方40
0.025mg rhNGF
20mg L-精氨酸
8mg  L-天冬氨酸
10mg L-异亮氨酸
用乙酸调pH值至8.7。c)配方41
0.025mg rhNGF
20mg  L-精氨酸
12mg  L-天冬氨酸
10mg  L-异亮氨酸
用苹果酸调pH值至4.5。
用实施例15中的程序进行冻干，然后测定残余的水分。结果：
配方39：1.2％/1.4％
配方40：1.6％/1.9％
配方41：0.8％/0.9％

Claims (14)

1.冻干制备物包含：
a)选自蛋白、肽、核酸和碳水化合物的生物分子，
b)一种或几种碱性D-氨基酸或L-氨基酸和，
c)一种或几种氨基二羧酸，羟基羧酸，羟基二羧酸，或双羧基酸。
或它们的生理上可耐受的盐，其中冻干物中的辅剂呈完全或部分的不定形形式。
2.权利要求1中的冻干制备物，其中(c)中所提及的添加剂与(b)中所提及的添加剂的重量比在0.01∶1到2∶1的范围内。
3.权利要求1-2中的一项中所提及的冻干制备物，其中作为辅剂的多聚物的量(分子量大于1000 Da的复合物)占总辅剂的10％以下。
4.权利要求1-3中的一项所提及的冻干制备物，其中作为辅剂的糖占总辅剂量的10％以下。
5.权利要求1-4中的一项中所提及的冻干制备物，其中它们具有大于50℃的玻璃态转变温度。
6.权利要求1-5中所提及的冻干制备物，其中冻干之前的冷冻溶液的玻璃态转变温度大于-40℃。
7.权利要求1-6中所提及的冻干制备物，其中氨基羧基酸是天冬氨酸或谷氨酸。
8.权利要求1-7中所提及的冻干制备物，其中它们另外含有一种或几种具有疏水基团的氨基酸。
9.权利要求8中所提及的冻干制备物，包含有亮氨酸、异亮氨酸、缬氨酸或苯丙氨酸，尤其是异亮氨酸或苯丙氨酸。
10.权利要求1-9中的一项中所提及的冻干制备物，其中用水重新溶解的溶液的pH值在约3-9之间。
11.在权利要求1-10中的一项中所提及的冻干制备物，其中生物分子与辅剂的质量比小于1∶10。
12.在权利要求1-11中的一项所提及的冻干制备物，其中生物分子是源于心钠素(ANP)家族的一种肽。
13.权利要求1-12中的一项中所提及的冻干制备物的制备过程，其中生物分子是溶于或悬浮于生理上可耐受的溶剂于并且加入a)一种或几种碱性D-或L-氨基酸和b)至少一种或几种氨基羧基酸或有机或无机酸然后冻干溶液。
14.权利要求13中要求的方法，其中冻干在一磷酸盐含量少于5mm的水溶液中进行。
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