CN1072954A - 人工流产组织细胞培养基 - Google Patents
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Abstract
本发明涉及一种天然培养基，确切地说是一种人
工流产组织细胞培养基。该培养基的开发，提供了一
种可以替代牛血清，用于人体外组织细胞培养研究的
高效培养基。这种取自于人工流产抛弃物的细胞培
养基，其内含有效成分是最接近于或相同于人类生物
特征的生长激素和营养物质，因而对人体细胞的体外
培养特别有利于成功，具有明显的促进细胞分裂转化
作用。这种变废为宝的培养基，经过一系列加工处理
工艺，可以获得淡红色(或无色)的清澈的细胞培养
液。该工艺简单易行，具有开发前途。
Description
本发明涉及一种培养基，确切地说是一种人工流产组织细胞培养基。这种培养基可替代牛血清用于人体体外组织细胞的培养研究，其属于人类细胞学的培养基技术领域。
在医学遗传学研究中，要经常使用各种培养基，来进行人体细胞组织的研究。有一种天然培养基-牛血清，其是被经常用于制备体外细胞培养基的必需成分之一。这种牛血清中含细胞生长因子，对促进细胞生长发育起决定性作用。因此血清添加是否，是细胞培养成功的关键所在。然而这种牛血清的制备需要每年宰杀千万头小牛或胎牛来提取血清。这种牛血清的价格昂贵，产量稀少，而且保存、运输都不方便，尤其对于边远地区或交通不发达的农村更是存在许多困难。可是，另一方面，社会上大量存在的孕早期人工流产手术所产生的人工流产组织（以下简称EAAT），却被当作废物而抛弃。至今未见报导如何利用开发该EAAT的。
本发明的目的是要寻找一种能替代牛血清的天然培养基。该培养基要具有与人类生物特性相似的生长因子和营养物质，用于细胞培养要具有明显的促进细胞分裂转化作用。该培养基的原料来源要方便易得，制备工艺简单易行。
本发明的任务是通过对废弃物-EAAT进行一系列提取加工处理而实现的。孕早期人工流产物包括有胚胎、绒毛和蜕膜。这些人体组织细胞正处于旺盛的细胞分裂期，其中含有大量的丰富的各种促进细胞分裂的蛋白类激素和最接近于人类生物特性的各种营养物质。本发明设计的一系列加工提取工艺就是为了将上述激素和营养物质提取出来，制成天然的培养基供细胞培养用。具体工艺步骤如下：首先选取健康孕妇的孕12周以内的EAAT，经生理盐水冲洗干净，除去凝血块，保离洁净的胚胎、绒毛和蜕膜组织。称量EAAT并加等重量的生理盐水入EAAT中。其次将EAAT与生理盐水混合液经“一次捣碎”工序，将EAAT破碎成由肉眼看不见的组织小碎片、碎枝绒毛等构成的组织浆。这一工序可以采用转速为800～1200转/分的组织捣碎机，以10秒/次，共5～6次，进行破碎EAAT。也可以采用手工捣研磨碎，制成组织浆。经过“一次捣碎”的EAAT组织浆中所溶出、渗出的生长激素和营养物质等有效成分较少，必须进行“二次粉碎”，使EAAT的组织细胞充分粉碎，使各细胞中的细胞质能够流入生理盐水中，进而使细胞质内的生长激素和营养物质等有效成分充分溶入生理盐水。“二次粉碎”工序所采用措施是：将捣碎的EAAT组织浆经转速为4000转/分的匀浆机，以5～6秒/次，共5～6次，进行二次粉碎，使EAAT组织浆被进一步粉碎为微细糊状液;也可以采用超声粉碎机，以3～4秒/次，共4～5次，二次粉碎所述的粉碎效果会更好，有效成分的溶出会更多些。经过两次粉碎的EAAT糊状液，还需要在低温（0～4℃）条件下，浸泡24～48小时，使有效成分充分渗、溶出来。浸泡过后的EAAT糊状浸泡液再经“离心分离”，提取上清液。该工序，可以将浸泡液，经过滤后，再由转速为2000转/分的普通离心机，分离20分钟后，提取上清液;也可以直接将浸泡液，由转速为10000转/分的低温（0～4℃）离心机分离10分钟后，提取上清液;还可以直接将浸泡液，由转速为3500转/分的低温（0～6℃）离心机，分离20分钟后，提取上清液。经分离提取的上清液，还要进行抽滤灭菌。一般采用G6砂芯漏斗在无菌室内进行无菌抽滤操作，除去细菌等微生物（必要时，可以进行支原体处理）。经过上述一系列加工处理所获得的EAAT细胞培养基，呈淡红色清澈的液体，其PH值为6.4。该培养基可保存于-20℃冰箱内备用。本发明的“离心分离”工序后，分离吸取上清液后所得的沉渣物，还可以经过冷冻干燥处理，而制得饲料添加剂，用于饲养动物，可提高动物的产子能力。
本发明所提取的天然培养基可以用做：在使用化学成分明确的培养基时的补充基料，以提供所培养的体外细胞生长所必需的生长因子。由于该培养基取自于人体，其内含有与人类生物特性相似（相同）的生长激素和营养物质，所以用于培养体外细胞时，就显示出突出的促进细胞分裂生长作用，因此是一种高效的细胞培养基原料。该培养基，由于制备原料来源方便、廉价，制备工艺简单，因而造价较低。本发明对EAAT进行开发利用，不仅可以开发出组织细胞培养基，而且还可以进一步开发提取EAAT中的有效成分，制成营养药物应用于临床;提取后的沉渣可作为饲料添加剂用于饲养行业。本发明提供一种变废为宝的具有开发前途的产品和工艺方法。
本发明的实施例如下：
实例一、取新鲜的EAAT250克，用生理盐水冲洗4～5遍，去除血块至干净，称量洁净的EAAT为240克，再加240ml生理盐水，先由组织捣碎机（转速：800～1200转/分）捣碎次数6次，共用时间2分钟;再经超声粉碎机（300振子）粉碎4次，每次4秒;经过两次粉碎的EAAT糊状液在0～4℃的冰箱内浸泡24小时后，经高速离心机（10000转/分，温度0～4℃）分离10分钟，吸取上清液，经抽滤灭菌，在无菌室内用G6砂芯漏斗进行抽滤，制得435克/400ml的淡红色清澈的EAAT细胞培养基，测得其PH值为6.4。置于-20℃冰箱备用。
实例二、取新鲜的EAAT中的“绒毛”组织，用生理盐水洗净后，称量60克，再加60ml生理盐水，经手工捣研臼磨20分钟，使“绒毛”组织呈组织浆状;再经匀浆粉碎机（转速：4000转/分）粉碎6分钟后，置于0～4℃冰箱内浸泡48小时，再经转速为3500转/分的低温（0～6℃）离心机分离20分钟，吸取上清液，在无菌室内抽滤灭菌（G6砂芯漏斗）制得109.8克/100ml的无色清澈的EAAT细胞培养基，放入-20℃冰箱内保存备用。
使用效果实验：
将上述保存的EAAT细胞培养基逐步复温至全部溶化，先经灭活处理（56℃水浴处理30分钟）除去“补体”后，配制“人类外周血淋巴细胞染色体”细胞培养基：
一、使用EAAT细胞培养基的应用实验：
（一）、人类外周血淋巴细胞生长培养液的配制与分装：
1、培养基配方：
（1）细胞生长培养液（RPMI1640或F12）
（2）人工流产组织液（EAAT）
（3）青霉素
（4）链霉素
2、分装20瓶：
用5%NaHCO3液调节培养液的PH值至7～7.4，每瓶加培养液5ml，植物血凝素（PHA）0.25mg/ml。
（二）、培养与细胞学操作：
1、采用：取含有肝素（100单位/ml）静脉血1.0～1.5ml，每瓶加全血0.3～0.5ml（在灭菌室进行），密闭摇匀后静置37℃恒温箱培养72小时。
2、秋水仙素处理：培养70小时后每瓶加秋水仙素0.24g/ml，混匀后置37℃恒温箱继续培养2小时，终止培养收集细胞。
3、收集细胞：将培养物混匀吸至锥形刻度离心管内经15 /分离心10分钟。
4、低渗：吸弃上清液加入8ml 0.075M KCl溶液用滴管吹吸混匀，置37℃温箱内15～20分。
5、预固定：低渗后，每离心管加固定液（3∶1甲醇∶冰醋酸）1ml，用吸管吹打混匀5分钟后经1500转/分离心10分钟吸弃上清液。
6、固定：沿试管加入固定液8ml用吸管吹打混均匀，静置30分钟再以1500转/分离心吸弃上清液。用同法进行第二次固定处理，最后视细胞量多少加适量固定液制成细胞悬液。
7、制片：将上述细胞悬液滴至冰水玻片上，吸气过火，气干。
8、用显微镜观察计算细胞分裂指数。
二、以同样方法，采用小牛血清设立对照组。
三、实验结果：实验结果表明：本发明的培养基，具有明显的促进淋巴细胞分裂转化作用，细胞分裂指数明显高于小牛血清组（见附表）。
t＝6.41 P＜0.0005
Claims (5)
1、一种人工流产组织细胞培养基，其特征在于：该细胞培养基是取健康孕妇的孕12周以内的人工流产组织(EAAT)，经生理盐水冲洗干净后称量→将等重量的生理盐水加入到洁净的EAAT中→一次捣碎→二次粉碎→浸泡24～48小时(0～4℃)→离心分离→提取上清液→抽滤灭菌→得淡红色，清澈的PH值6.4的滤液→EAAT细胞培养基(保存于-20℃冰箱内备用)。
2、按照权利要求1所述人工流产组织细胞培养基，其特征在于：所述的“一次捣碎”，是将EAAT置于转速为800～1200转/分的组织捣碎机中，破碎EAAT，以10秒/次，共5～6次，将EAAT破碎成由肉眼看不见的组织小碎片、碎枝、绒毛等构成的组织浆;也可以采用手工捣研磨碎，制成组织浆。
3、按照权利要求1所述人工流产组织细胞培养基，其特征在于：所述的“二次粉碎”，是将捣碎的组织浆，经转速为4000转/分的匀浆机，以5～6秒/次，共5～6次，二次粉碎成微细糊状液;也可以采用超声粉碎机，以3～4秒/次，共4～5次，二次粉碎成微细糊状液。
4、按照权利要求1所述人工流产组织细胞培养基，其特征在于：所述的“离心分离”，是将浸泡液，经过滤后，再由转速为2000转/分的普通离心机分离20分钟;也可以直接将浸泡液，由转速为10000转/分的低温（0～4℃）离心机，分离10分钟;还可以直接将浸泡液，由转速为3500转/分的低温（0～6℃）离心机，分离20分钟。
5、按照权利要求1所述人工流产组织细胞培养基，其特征在于：所述的提取上清液，其后分离所得的沉渣物，可以经冷冻干燥处理制成饲料添加剂。
Priority Applications (1)
| Application Number | Priority Date | Filing Date | Title |
|---|---|---|---|
| CN92106771A CN1072954A (zh) | 1992-10-28 | 1992-10-28 | 人工流产组织细胞培养基 |
Applications Claiming Priority (1)
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|---|---|---|---|
| CN92106771A CN1072954A (zh) | 1992-10-28 | 1992-10-28 | 人工流产组织细胞培养基 |
Publications (1)
| Publication Number | Publication Date |
|---|---|
| CN1072954A true CN1072954A (zh) | 1993-06-09 |
Family
ID=4942407
Family Applications (1)
| Application Number | Title | Priority Date | Filing Date |
|---|---|---|---|
| CN92106771A Pending CN1072954A (zh) | 1992-10-28 | 1992-10-28 | 人工流产组织细胞培养基 |
Country Status (1)
| Country | Link |
|---|---|
| CN (1) | CN1072954A (zh) |
Cited By (2)
| Publication number | Priority date | Publication date | Assignee | Title |
|---|---|---|---|---|
| CN1049246C (zh) * | 1993-09-03 | 2000-02-09 | 上海康达氨基酸厂 | 一种粉末型动物细胞培养基的制备方法 |
| CN109355248A (zh) * | 2018-10-30 | 2019-02-19 | 中国科学院苏州生物医学工程技术研究所 | 家畜组织细胞制备动物细胞培养液的方法及其制得的动物细胞培养液的应用 |
-
1992
- 1992-10-28 CN CN92106771A patent/CN1072954A/zh active Pending
Cited By (2)
| Publication number | Priority date | Publication date | Assignee | Title |
|---|---|---|---|---|
| CN1049246C (zh) * | 1993-09-03 | 2000-02-09 | 上海康达氨基酸厂 | 一种粉末型动物细胞培养基的制备方法 |
| CN109355248A (zh) * | 2018-10-30 | 2019-02-19 | 中国科学院苏州生物医学工程技术研究所 | 家畜组织细胞制备动物细胞培养液的方法及其制得的动物细胞培养液的应用 |
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