CN110305857A - 小鼠皮肤消化复合酶及从小鼠皮肤中分离微量免疫细胞Treg细胞的方法 - Google Patents
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Abstract
本发明属于医学领域，涉及一种小鼠皮肤消化复合酶及从小鼠皮肤中分离微量免疫细胞Treg细胞的方法；所述小鼠皮肤消化复合酶是由RPMI培养基、终浓度是1％的HEPES缓冲液、终浓度是10％的胎牛血清、终浓度是1％的青霉素/链霉素双抗溶液、终浓度是2mg/ml的11型胶原酶、终浓度是0.5mg/ml的透明质酸酶以及终浓度是2mg/ml的脱氧核糖核酸酶制备而成。本发明能够从限定大小的小鼠皮肤组织中高效地获得微量的免疫细胞Treg细胞，从而便于对皮肤特有的Treg细胞进行细胞学和分子学研究，也能够为皮肤中分离其它微量细胞提供一定借鉴。
Description
技术领域
本发明属于医学领域，涉及一种消化复合酶及基于该消化酶的细胞分离方法，尤其涉及一种小鼠皮肤消化复合酶及从小鼠皮肤中分离微量免疫细胞Treg细胞的方法。
背景技术
接触性皮炎、湿疹、银屑病、蜂窝织炎、真菌感染和脓肿以及非黑色素瘤皮肤癌等皮肤疾病是全球50种最常见的疾病之一，研究和阐明不同皮肤疾病的的分子和细胞机制是开发有效的针对性治疗策略的必要途径。小鼠模型是研究疾病的发生发展及靶向治疗的重要工具，特别是在皮肤疾病研究领域中，高效地分离皮肤中的微量细胞亚群是亟待解决的技术问题。
调节性T细胞(regulatory T cells，Treg)是属于CD4+T细胞的细胞亚群，具有负调节机体免疫反应的淋巴细胞，通常起着维持自身耐受和避免免疫反应过渡损伤机体的重要作用，但也参与肿瘤细胞逃避机体免疫监视和慢性感染。由于Treg细胞具有抑制炎症反应的强大功能，目前国内外正在积极开发多种治疗方法用来增加Treg细胞活性，从而有助于改善患者自体免疫状态、治疗慢性炎症疾病和帮助器官移植后恢复。国外已有文献报道Treg细胞在免疫介导的皮肤疾病如白癜风、银屑病、红斑狼疮以及黑素瘤等肿瘤性疾病等的发病机制中都有十分重要的调控作用，但是在小鼠皮肤中Treg细胞所占总细胞比例仅约1～3％，主要分布在真皮及真表皮交界处。因此高效地将小鼠皮肤组织中少量的Treg细胞进行深入研究是目前存在的一个主要难关。与提取角质形成细胞、纤维母细胞等细胞不同，Treg细胞比例极低，并且主要存在于组织结构较为紧密的毛囊处、真表皮交界处及真皮层，其周围有纤维蛋白、胶原蛋白等各种组织结构包裹，需要从小鼠皮肤组织进行分离，并且高效地将其分离出来十分困难。
2014年发表的关于提取小鼠皮肤免疫细胞亚群相关机制研究中，报道了利用小鼠皮肤组织制备皮肤组织单细胞悬液的方法，但检测得到的细胞数量较少，技术不尽成熟，并且在后续的研究中仍然沿用较为低效的方法。为此，有必要研发一种高效分离小鼠皮肤组织中微量细胞的方法，以期弥补小鼠模型中皮肤疾病研究技术的缺陷。
发明内容
为了解决背景技术中存在的上述技术问题，本发明提供了一种能够从限定大小的小鼠皮肤组织中高效地获得微量的免疫细胞Treg细胞，从而便于对皮肤特有的Treg细胞进行细胞学和分子学研究，也能够为皮肤中分离其它微量细胞提供一定借鉴的小鼠皮肤消化复合酶及从小鼠皮肤中分离微量免疫细胞Treg细胞的方法。
为了实现上述目的，本发明采用如下技术方案：
一种小鼠皮肤消化复合酶，其特征在于：所述小鼠皮肤消化复合酶是由RPMI(Roswell Park Memorial Institute)培养基、终浓度是1％的HEPES(4-(2-hydroxyethyl)-1-piperazineethanesulfonic acid)缓冲液、终浓度是10％的胎牛血清、终浓度是1％的青霉素/链霉素双抗溶液、终浓度是2mg/ml的11型胶原酶(Collegenase11)、终浓度是0.5mg/ml的透明质酸酶(hyaluronidase，HAase)以及终浓度是2mg/ml的脱氧核糖核酸酶(deoxyribonuclease，DNase)制备而成。
一种从小鼠皮肤中分离微量免疫细胞Treg细胞(regulatory T cells，Treg)的方法，其特征在于：所述从小鼠皮肤中分离微量免疫细胞Treg细胞的方法包括以下步骤：
1)使用RPMI培养基配制小鼠皮肤消化复合酶溶液；
2)对野生型C57BL/6小鼠进行安乐死，去除背部长毛及绒毛，用眼科剪剪下小鼠皮肤，并刮去游离脂肪层，得到处理后的皮肤组织；
3)将步骤2)得到的处理后的皮肤组织置于干净培养皿中，机械粉碎或用剪刀剪碎至2mm2大小，收集入离心管中，加入步骤1)中配制的小鼠皮肤消化复合酶溶液，所述小鼠皮肤消化复合酶溶液的加入量是每平方厘米处理后的皮肤组织加入小鼠皮肤消化复合酶溶液80μL，置于台式轨道摇床中进行消化处理；
4)采用PBS(磷酸盐缓冲生理盐水Phosphate buffered saline)中止消化，并充分淋洗固态物，并对淋洗液进行过滤、离心，得到上清液以及沉淀；
5)丢弃步骤4)所得上清液，使用PBS重悬步骤4)得到的沉淀，得到悬浊液，取悬浊液滴于细胞计数板中进行计数，剩余悬浊液再次过滤，过滤后所得液体即为小鼠皮肤组织单细胞悬液。
上述步骤1)中配置小鼠皮肤消化复合酶溶液的具体实现方式是：在RPMI培养基中加入1％HEPES缓冲液、10％FBS和1％双抗后得到溶液一，将Collegenase11、Hase以及DNAse均匀充分溶于溶液一中，得到小鼠皮肤消化复合酶溶液。
上述步骤2)中去除背部长毛及绒毛的具体实现方式是使用刮毛器剔除背部长毛，而后使用除毛膏涂满背部，停留5分钟后洗干净，即得到去除背部长毛及绒毛的光滑小鼠。
上述步骤3)中的消化处理的工艺参数是恒温37℃，转速为250rpm，消化不低于30分钟。
上述步骤4)中是采用70μm的尼龙网对淋洗液进行过滤，所述离心的条件是1300rpm，离心10分钟。
上述步骤5)中采用40μm细胞筛网对剩余悬浊液再次过滤。
上述从小鼠皮肤中分离微量免疫细胞Treg细胞的方法在步骤5)之后还包括：
6)将步骤5)所得小鼠皮肤组织单细胞悬液进行流式抗体染色，进行流式细胞术分析。
上述步骤6)中采用CD4-AF488(Biolegend，美国加利福尼亚州圣迭戈)、CD25-PE(Biolegend，美国加利福尼亚州圣迭戈)或Ghost Dye780-Tonbo Science(Tonbo Science，美国加利福尼亚州圣迭戈)进行流式抗体染色。
本发明的优点是：
本发明提供了一种小鼠皮肤消化复合酶及从小鼠皮肤中分离微量免疫细胞Treg细胞的方法，该小鼠皮肤消化复合酶是由RPMI(Roswell Park Memorial Institute)培养基、1％HEPES(4-(2-hydroxyethyl)-1-piperazineethanesulfonic acid)缓冲液、10％胎牛血清、1％青霉素/链霉素双抗溶液、2mg/ml 11型胶原酶(Collegenase11)、0.5mg/ml透明质酸酶(hyaluronidase，HAase)以及2mg/ml脱氧核糖核酸酶(deoxyribonuclease，DNase)制备而成。胶原酶是一种从细菌中提取出来的酶，对胶原有很强的消化作用，适于消化纤维性组织、上皮组织以及癌组织，它对细胞间质有较好的消化作用，对细胞本身影响不大，可使细胞与胶原成分脱离而不受伤害，其它酶类的加入可以得到更好的消化效果。本发明所提供的利用该消化复合酶从少量小鼠皮肤中分离微量免疫细胞Treg细胞的方法，旨在提供一种高效地分离少量小鼠皮肤组织中占有较低比例细胞群的方法，该方法包含多种酶复合消化，以国际上认可的CD4+CD25+Treg细胞为分析对象，证明该分离方法的可行性，能够从限定大小的小鼠皮肤组织中高效地获得微量的免疫细胞Treg细胞，从而便于对皮肤特有的Treg细胞进行细胞学和分子学研究，也能够为皮肤中分离其它微量细胞提供一定借鉴。
附图说明
图1是使用流式细胞术检测本发明提供的方法所得到的小鼠皮肤单细胞悬液中CD4+CD25+Treg细胞群比例；
图2是使用饼状图显示本发明提供的方法所得到的小鼠皮肤单细胞悬液中活细胞、CD4+T细胞、以及CD4+CD25+Treg细胞群比例；
图3是使用条形图显示本发明提供的方法所得到的小鼠皮肤单细胞悬液中活细胞、CD4+T细胞、以及CD4+CD25+Treg细胞群比例。
具体实施方式
本发明提供了一种小鼠皮肤消化复合酶及从小鼠皮肤中分离微量免疫细胞Treg细胞的方法，其中：小鼠皮肤消化复合酶是由RPMI(Roswell Park Memorial Institute)培养基、1％HEPES(4-(2-hydroxyethyl)-1-piperazineethanesulfonic acid)缓冲液、10％胎牛血清、1％青霉素/链霉素双抗溶液、2mg/ml11型胶原酶(Collegenase11)、0.5mg/ml透明质酸酶(hyaluronidase，HAase)以及2mg/ml脱氧核糖核酸酶(deoxyribonuclease，DNase)制备而成。胶原酶是一种从细菌中提取出来的酶，对胶原有很强的消化作用，适于消化纤维性组织、上皮组织以及癌组织，它对细胞间质有较好的消化作用，对细胞本身影响不大，可使细胞与胶原成分脱离而不受伤害，其它酶类的加入可以得到更好的消化效果。
基于如上所提供的小鼠皮肤消化复合酶，本发明还提供了一种从小鼠皮肤中分离微量免疫细胞Treg细胞的方法用于检验该复合酶的效果，该方法包括以下步骤：
1)使用RPMI培养基(HyClone Laboratories，Logan Utah)配制小鼠皮肤消化复合酶，其中加入1％HEPES缓冲液(Gibco，cat#15630080)、10％FBS(特级胎牛血清，天津灏洋华科生物技术有限公司，产品货号TBD0110HYT)、和1％双抗，而后将Collegenase11(胶原蛋白酶，2mg/ml，Sigma，cat#C9407)、HAse(0.5mg/ml，Sigma，cat#H3506)，DNAse(脱氧核糖核酸酶，2mg/ml，Sigma，cat#DN25)均匀充分溶于液体中。
2)小鼠模型使用野生型C57BL/6小鼠，进行安乐死，使用刮毛器剔除背部长毛，而后使用除毛膏涂满背部，停留5分钟，而后洗干净，将除去绒毛后的光滑小鼠皮肤用眼科剪剪下，并刮去游离脂肪层。
3)将步骤1)处理后的皮肤组织置于干净培养皿中，机械粉碎或用剪刀剪碎至2mm2大小，收集入50ml离心管管底，加入步骤1)配制的小鼠皮肤消化复合酶溶液，1cm2使用小鼠皮肤消化复合酶溶液80μL，置于台式轨道摇床(Thermo ScientificTM公司，MaxQTM4000)中，设置恒温37度，转速为250rpm，消化30分钟。
4)将步骤3)过夜反应的皮肤组织使用PBS中止消化，并充分淋洗固态物，使用70μm尼龙网对所得淋洗液进行过滤，离心(1300转，10分钟)。
5)将步骤4)所得离心上清丢弃，使用5mlPBS重悬离心沉淀，取一滴于细胞计数板中进行计数，剩余使用40μm细胞筛网再次过滤，过滤后所得液体即为小鼠皮肤组织单细胞悬液；
6)将步骤5)所得单细胞悬液进行流式常规抗体(CD4-AF488，CD25-PE，GhostDye780)染色，后进行流式细胞术分析。
实验结果：
流式细胞术分析所得小鼠皮肤单细胞悬液中CD4+CD25+Treg细胞群(已实现三次生物学重复)。
| Total | Living cells | CD4+ | CD4+CD25+ | |
| Spleen sample | 723712 | 511422 | 26428 | 18047 |
| Freq.of Total | - | 70.67％ | 3.65％ | 2.49％ |
| Freq.of Living cells | - | - | 5.17％ | 3.53％ |
| Freq.of CD4+cells | - | - | - | 68.29％ |
Claims (9)
1.一种小鼠皮肤消化复合酶，其特征在于：所述小鼠皮肤消化复合酶是由RPMI培养基、终浓度是1％的HEPES缓冲液、终浓度是10％的胎牛血清、终浓度是1％的青霉素/链霉素双抗溶液、终浓度是2mg/ml的11型胶原酶、终浓度是0.5mg/ml的透明质酸酶，以及终浓度是2mg/ml的脱氧核糖核酸酶，制备而成。
2.一种从小鼠皮肤中分离微量免疫细胞调节性T细胞的方法，其特征在于：所述从小鼠皮肤中分离微量免疫细胞Treg细胞的方法包括以下步骤：
1)使用RPMI培养基配制小鼠皮肤消化复合酶；
2)对野生型C57BL/6小鼠进行安乐死，去除背部长毛及绒毛，用眼科剪剪下小鼠皮肤，并刮去游离脂肪层，得到处理后的皮肤组织；
3)将步骤2)得到的处理后的皮肤组织置于干净培养皿中，机械粉碎或用剪刀剪碎至2mm2大小，收集入离心管中，加入步骤1)中配制的小鼠皮肤消化复合酶，所述小鼠皮肤消化复合酶的加入量是每平方厘米处理后的皮肤组织加入小鼠皮肤消化复合酶溶液80μL，置于台式轨道摇床中进行消化处理；
4)采用PBS终止消化，并充分淋洗步骤3)中所得到的消化后固态物，并对淋洗液进行过滤、离心，得到上清液以及沉淀；
5)丢弃步骤4)所得上清液，使用PBS重悬步骤4)得到的沉淀，得到悬浊液，取悬浊液滴于细胞计数板中进行计数，剩余悬浊液再次过滤，过滤后所得液体即为小鼠皮肤组织单细胞悬液。
3.根据权利要求2所述的从小鼠皮肤中分离微量免疫细胞Treg细胞的方法，其特征在于：所述步骤1)中配置小鼠皮肤消化复合酶的具体实现方式是：在RPMI培养基中加入终浓度是1％的HEPES缓冲液、终浓度是10％的FBS和终浓度是1％的青霉素/链霉素双抗后得到溶液一，将11型胶原酶、透明质酸酶以及脱氧核糖核酸酶均匀充分溶于溶液一中，得到小鼠皮肤消化复合酶。
4.根据权利要求3所述的从小鼠皮肤中分离微量免疫细胞Treg细胞的方法，其特征在于：所述步骤2)中去除背部长毛及绒毛的具体实现方式是使用刮毛器剔除背部长毛，而后使用除毛膏涂满背部，停留5分钟后洗干净，即得到去除背部长毛及绒毛的光滑小鼠。
5.根据权利要求4所述的从小鼠皮肤中分离微量免疫细胞Treg细胞的方法，其特征在于：所述步骤3)中的消化处理的工艺参数是恒温37℃，转速为250rpm，消化不低于30分钟。
6.根据权利要求5所述的从小鼠皮肤中分离微量免疫细胞Treg细胞的方法，其特征在于：所述步骤4)中是采用70μm的尼龙网对淋洗液进行过滤，所述离心的条件是1300rpm，离心10分钟。
7.根据权利要求6所述的从小鼠皮肤中分离微量免疫细胞Treg细胞的方法，其特征在于：所述步骤5)中采用40μm细胞筛网对剩余悬浊液再次过滤。
8.根据权利要求2-7任一权利要求所述的从小鼠皮肤中分离微量免疫细胞Treg细胞的方法，其特征在于：所述从小鼠皮肤中分离微量免疫细胞Treg细胞的方法在步骤5)之后还包括：
6)将步骤7)所得小鼠皮肤组织单细胞悬液进行流式抗体染色，进行流式分析。
9.根据权利要求8所述的从小鼠皮肤中分离微量免疫细胞Treg细胞的方法，其特征在于：所述步骤7)中采用CD4-AF488，CD25-PE及Ghost Dye780进行流式抗体染色。
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