CN113969304A - 细胞外囊泡在制备治疗或预防代谢性炎症综合征疾病的制剂中的应用 - Google Patents

细胞外囊泡在制备治疗或预防代谢性炎症综合征疾病的制剂中的应用 Download PDF

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Abstract

本申请公开了细胞外囊泡在制备治疗或预防代谢性炎症综合征疾病的制剂中的应用，所述代谢性炎症综合征疾病包括肥胖症，动脉粥样硬化、糖尿病中的一种或多种。本申请从表观和机理层面，公开了诱导性细胞外囊泡的多种用途。本发明还公开了凋亡囊泡的检测试剂在制备肥胖症检测试剂或试剂盒中的应用。

Description

细胞外囊泡在制备治疗或预防代谢性炎症综合征疾病的制剂 中的应用
技术领域
本发明属于生物技术领域，具体涉及细胞外囊泡在制备治疗或预防代谢性炎症综合征疾病的制剂中的应用。
背景技术
细胞外囊泡(extracellular vesicles,EVs)是细胞分泌的含有蛋白质、核酸及各种细胞因子的纳米级载体。细胞外囊泡可以通过内分泌或旁分泌的方式作用于靶细胞，在细胞间物质传递和信息交流过程中发挥了重要作用。研究发现，细胞外囊泡所介导的信息交流在机体生理或病理过程中发挥了重要的调控作用，涉及到免疫调节、肿瘤生长、血管生成、损伤修复等。目前该领域的研究主要集中在外泌体(exosomes)方向。外泌体是直径在30-150nm左右的细胞外囊泡，其内含有RNA、脂质和蛋白质等成分。外泌体广泛参与了机体的各种生理/病理性调控，能够用作多种疾病的诊断、治疗和预后评估。迄今为止，间充质干细胞(mesenchymal stem cells，MSCs)被认为是产生外泌体能力最强的细胞。众多的研究发现MSCs来源的外泌体能模拟MSCs的生物学功能，在促进细胞生长和分化，修复组织缺损等方面发挥了重要的调控作用。因此，近年来以MSCs来源的外泌体为基础的细胞囊泡疗法取得了显著的发展。然而，目前以外泌体为基础的细胞囊泡治疗仍然存在诸多问题，主要表现在外泌体的提取和纯化过程复杂，耗时长，对设备和试剂的要求较高，生理性外泌体产量较低等等，这些缺陷都限制了外泌体治疗的临床转化和应用。
发明内容
一方面，本发明提供了凋亡囊泡的检测试剂在制备肥胖检测试剂或试剂盒中的应用。
凋亡囊泡(apoptotic extracellular vesicles,apopEVs)：机体内的细胞自然凋亡过程中会产生大量的凋亡囊泡，凋亡囊泡含有种类繁多的蛋白质、脂类、核酸等信号分子，同样能够介导细胞间的物质传递和信号交流。
本发明实施例中的IEVs为诱导性细胞外囊泡的简称，可称为诱导性囊泡，也可称为诱导性细胞外囊泡(Induced extracellular vesicles,IEVs)。诱导性细胞外囊泡是指的是一种在前体细胞(例如干细胞)正常存活时，被干预或诱导，使其凋亡产生的一类亚细胞产物。通常这一类亚细胞产物，具有膜结构，表达凋亡性标志物，部分包含有遗传物质DNA。发明人发现诱导性细胞外囊泡是区分于细胞和常规细胞外囊泡(如外泌体等)的一类物质。在一些实施方式中，所述的正常存活时的细胞，例如是非凋亡的细胞、非衰老的细胞、非老化而增殖停滞的细胞、非冻存后复苏的细胞、非发生恶变而异常增殖的细胞或非出现损伤的细胞等。在一些实施方式中，所述的正常存活时的细胞取自细胞培养过程中，细胞接触融合80-100％的时候的细胞。一些实施方式中，所述的正常存活时的细胞取自对数期细胞。一些实施方式中，所述的正常存活时的细胞取自人或鼠组织来源的原代培养及其传代培养细胞。一些实施方式中，所述的正常存活时的细胞取自已确立的细胞系或细胞株。在一些实施方式中，所述的前体细胞取自早期的细胞。
正常细胞外囊泡(extracellular vesicles,EVs)指的是细胞在正常培养过程或在体内生理条件下自发分泌的纳米级大小的具有膜结构的小体，直径从40-1000nm不等，主要由微囊泡(Microvesicles，MV)和外泌体(Exosomes)组成，含有多种RNA、蛋白质等信号分子。
在一些实施方案中，本发明突破性地发现了在肥胖小鼠的白色脂肪组织中出现凋亡囊泡减少的现象，无论是在诱导肥胖组、老年肥胖组、leptin缺陷组还是Fas缺陷性肥胖组都表现出白色脂肪组织的凋亡囊泡相对减少。发明人猜测，肥胖症的产生可能与其体内凋亡囊泡减少有关。可喜的是，发明人给所述小鼠注射本发明的诱导性细胞外囊泡后，凋亡囊泡的数量恢复，并且发现所述诱导性囊泡对诱导肥胖组、老年肥胖组、leptin缺陷组还是Fas缺陷性肥胖组都有很好的治疗作用。从而使得本发明的诱导性细胞外囊泡尤其适合用于肥胖症的治疗。
在一些实施方案中，所述凋亡囊泡的检测试剂选自检测凋亡囊泡的数量、凋亡囊泡的表面标志物、凋亡囊泡蛋白总量的试剂中的一种或多种。
在一些实施方案中，所述检测试剂选自流式细胞试剂和/或试剂盒、Western blot试剂和/或试剂盒、BCA定量试剂和/或试剂盒、纳米颗粒跟踪分析试剂和/或试剂盒中的一种或多种。在一些实施方案中，Western blot可以检测凋亡囊泡的表面标志物，纳米颗粒跟踪分析可以检测凋亡囊泡的浓度，BCA法可以检测凋亡囊泡的蛋白总量。
一方面，本发明提供了一种肥胖症的检测方法，所述的方法包括，
S1.检测受试者的脂肪组织的凋亡囊泡水平；
S2.将受试者凋亡囊泡水平与正常对照样本的凋亡囊泡水平相比较；
S3.根据所述步骤S2的比较结果，受试者凋亡囊泡水平与正常对照样本的凋亡囊泡水平相比较降低，指示所述受试者患有或有风险患上肥胖症。
检测受试者的脂肪组织的凋亡囊泡水平，可以用现有技术通用的手段，也可以用上述检测试剂进行检测。
一方面，本发明提供了一种肥胖症的检测系统，所述的系统包含：
1)凋亡囊泡的检测构件；
2)数据处理构件；
3)结果输出构件；
在一些实施方案中，所述凋亡囊泡的检测构件包括流式细胞仪、western blot电泳槽及成像系统、高速离心机、酶标仪、BCA定量试剂盒、纳米颗粒跟踪分析试剂盒中的一种或多种。
在一些实施方案中，所述的数据处理构件被配置为a.接收待测样本以及正常对照样本的测试数据；b.储存待测样本以及正常对照样本的测试数据；c.比对同种类型的待样本以及正常对照样本的测试数据；d.根据比对结果，响应于受试者罹患肥胖的概率或者可能性。
在一些实施方案中，所述的结果输出构件用于输出受试者罹患肥胖的概率或者可能性。
在一些实施方案中，数据处理构件的判断标准为：根据界值判断肥胖标本和正常标本。
在一些实施方案中，脂肪标本中凋亡囊泡水平的界值为每0.05ug脂肪组织的调亡囊泡的含量为12～15*106个，所述脂肪标本的凋亡囊泡水平小于所述凋亡囊泡水平的界值则判断为肥胖标本，所述脂肪标本的凋亡囊泡水平大于等于所述凋亡囊泡水平的界值则判断为正常标本。
在一些实施方案中，检测的样本选自脂肪组织；更优选白色脂肪组织。
一方面，本申请提供了诱导性细胞外囊泡在制备治疗或预防代谢性炎症综合征的制剂中的应用；
在一些实施方案中，所述代谢性炎症综合征包括：肥胖症、动脉粥样硬化症、糖尿病中的一种或多种。
在一些实施方案中，所述肥胖症包括诱导性肥胖、衰老性肥胖和leptin缺陷性肥胖、Fas缺陷性肥胖中的至少一种。
在一些实施方案中，所述leptin缺陷性肥胖选自儿童肥胖。
在一些实施方案中，所述糖尿病选自2型糖尿病。
在一些实施方案中，所述制剂为减轻体重的制剂。
在一些实施方案中，所述制剂为抑制p-Akt，p-Erk，p-P50通路中的一种或多种的制剂。
在一些实施方案中，所述制剂为抑制脂肪间充质干细胞的脂向分化的制剂。
在一些实施方案中，所述制剂为抑制甘油三酯的合成治疗肥胖症或动脉粥样硬化的制剂。
在一些实施方案中，所述制剂为促进高胆固醇的分泌治疗动脉粥样硬化的制剂。
在一些实施方案中，所述的制剂选自药物制剂或保健品制剂。
一方面，本发明提供了一种肥胖的治疗系统，所述系统包含：
1)凋亡囊泡的检测构件；
2)数据处理构件；
3)结果输出构件；
4)向被诊断为肥胖的受试者施用诱导性细胞外囊泡；
在一些实施方案中，所述诱导性细胞外囊泡是在干细胞处于正常存活时通过外加因素诱导凋亡而产生的囊泡。
在一些实施方案中，所述诱导性细胞外囊泡是诱导干细胞凋亡产生的，所述诱导方法包括添加星形孢菌、紫外线照射、饥饿法、或热应力法。
在一些实施方案中，所述干细胞为间充质干细胞。
在一些实施方案中，所述间充质干细胞选自血液间充质干细胞、骨髓间充质干细胞、尿液间充质干细胞、口腔间充质干细胞、脂肪间充质干细胞、胎盘间充质干细胞、脐带间充质干细胞、骨膜间充质干细胞、皮肤间充质干细胞中的一种或多种。
在一些实施方案中，所述的间充质干细胞选自血液间充质干细胞、骨髓间充质干细胞、脂肪间充质干细胞、脐带间充质干细胞、口腔间充质干细胞、皮肤间充质干细胞中的一种或多种。
在一些实施方案中，所述的干细胞选自血液干细胞或骨髓间充质干细胞中的一种或两种。
在一些实施方案中，所述星形孢菌素的浓度为大于或等于1nM；优选地，为1-15000nM；优选地，为200-10000nM；优选地，为250-1000nM；优选地，为500-1000nM。除此之外，星形孢菌素的浓度还可以是280-9000nM；还可以是230-8500nM；还可以是500-1000nM；还可以是500-900nM；还可以是500-800nM。
在一些实施方案中，所述诱导性细胞外囊泡的直径为0.45μm或以下。一些实施例中，所述诱导性细胞外囊泡的直径为0.05-0.45μm。一些实施例中，所述诱导性细胞外囊泡的直径为0.1-0.45μm。一些实施例中，所述诱导性细胞外囊泡的直径为0.1-0.35μm。一些实施例中，所述诱导性细胞外囊泡的直径为0.15-0.35μm。一些实施例中，所述诱导性细胞外囊泡的直径为0.15-0.3μm。一些实施例中，所述诱导性细胞外囊泡的直径为0.15-0.2μm。一些实施例中，所述诱导性细胞外囊泡的直径为0.05-0.4μm。一些实施例中，所述诱导性细胞外囊泡的直径为0.05-0.38μm。一些实施例中，所述诱导性细胞外囊泡的直径为0.05-0.35μm。一些实施例中，所述诱导性细胞外囊泡的直径为0.05-0.32μm。一些实施例中，所述诱导性细胞外囊泡的直径为0.05-0.3μm。一些实施例中，所述诱导性细胞外囊泡的直径为0.05-0.25μm。一些实施例中，所述诱导性细胞外囊泡的直径为0.05-0.22μm。一些实施例中，所述诱导性细胞外囊泡的直径为0.15-0.22μm。一些实施例中，所述诱导性细胞外囊泡的直径还可以是0.15-0.45μm，还可以是0.2-0.3μm。
在一些实施方案中，所述诱导性细胞外囊泡具有标志物Syntaxin 4。在一些实施方案中，所述诱导性细胞外囊泡高表达标志物Syntaxin 4。在一些实施方案中，所述诱导性细胞外囊泡的标志物Syntaxin 4的表达高于MSC或外泌体。在一些实施方案中，所述标志物Syntaxin 4的表达量为来源于间充质干细胞的外泌体中Syntaxin 4的表达量的3-6倍。在一些实施方案中，所述标志物Syntaxin 4的表达量为来源于间充质干细胞的外泌体中Syntaxin 4的表达量的3.5-5倍。在一些实施方案中，所述标志物Syntaxin 4的表达量为来源于间充质干细胞的外泌体中Syntaxin 4的表达量的4.45倍。在一些实施方案中，所述标志物还包括Annexin V、Flotillin-1、Cadherin 11和Integrin alpha 5中的一种或多种。在一些实施方案中，所述标志物为Syntaxin 4、Annexin V、Flotillin-1、Cadherin 11和Integrin alpha 5的组合。在一些实施方案中，所述诱导性细胞外囊泡高表达标志物Annexin V、Flotillin-1、Cadherin 11、Integrin alpha 5。在一些实施方案中，所述诱导性细胞外囊泡的标志物Annexin V、Flotillin-1、Cadherin 11、Integrin alpha 5的表达量高于MSC或外泌体。在一些实施方案中，所述诱导性细胞外囊泡中的标志物Annexin V、Flotillin-1、Cadherin 11、Integrin alpha 5的表达量相对于来源于间充质干细胞的外泌体中标记物的表达量分别为1-2倍、2-3倍、1-3倍和3-4倍。在一些实施方案中，所述诱导性细胞外囊泡中的标志物Annexin V、Flotillin-1、Cadherin 11、Integrin alpha 5相对于来源于间充质干细胞的外泌体中标记物的表达量分别为1.5-2倍、2.5-3倍、1.5-2.5倍和3.5-4倍。在一些实施方案中，所述诱导性细胞外囊泡中的标志物Annexin V、Flotillin-1、Cadherin 11、Integrin alpha 5相对于来源于间充质干细胞的外泌体中标记物的的表达量分别为1.76倍、2.81倍、2.41倍、3.68倍。本发明中所述诱导性细胞外囊泡与外泌体有本质的不同，例如与外泌体相比，本发明所述的诱导性细胞外囊泡IEVs高表达Syntaxin 4，以及其Annexin V、Flotillin-1、Cadherin 11、Integrin alpha 5的表达量明显高于外泌体(见实施例3)。除了标志物表达有差别之外，所述诱导性细胞外囊泡IEVs在功能上或治疗效果上也呈现出有别于干细胞和其他的细胞外囊泡如外泌体的特性。在一些实施方案中，所述诱导性细胞外囊泡还表达CD29、CD44、CD73、CD166；且不表达CD34、CD45。在一些实施方案中，所述诱导性细胞外囊泡还表达CD9、CD63、CD81和C1q中的一个或多个。
在一些实施方案中，所述的药物为注射剂、口服制剂或外用制剂。
在一些实施方案中，所述药物为注射剂。
在一些实施方案中，所述药物为静脉注射剂、肌肉注射剂、皮下注射剂或鞘内注射剂。
在一些实施方案中，所述药物还包括药学上可接受的药用载体。
在一些实施方案中，所述药用载体包括稀释剂、赋形剂、填充剂、粘合剂、崩解剂、表面活性剂和润滑剂中的一种或几种。
在一些实施方案中，还提供了所述的诱导性细胞外囊泡的制备方法，包括如下步骤：
1)体外培养间充质干细胞，细胞汇合80％-90％时，PBS冲洗2-5遍；
2)将步骤1)制得的间充质干细胞加入含有500-1000nM星形孢菌素的无血清培养基，37℃孵育16-24h，收集细胞上清液；
3)将步骤2)收集的细胞上清液在4℃下500-15000g离心5-30分钟，收集上清液；
4)将步骤3)收集的细胞上清液在4℃下1500-2500g离心5-30分钟，收集上清液；
5)将步骤4)收集的细胞上清液在4℃下10000-30000g离心15-60分钟，所得沉淀物为细胞外囊泡。
在一些实施方案中，还包括细胞外囊泡的清洗步骤。
在一些实施方案中，所述清洗步骤具体为：6)将步骤5)制得的细胞外囊泡用PBS重悬，在4℃下10000-30000g离心15-60分钟，所得沉淀物为细胞外囊泡。
在一些实施方案中，所述“间充质干细胞”是指一种多能干细胞，它具有干细胞的所有共性，即自我更新和多向分化能力。所述间充质干细胞可以来源于骨髓、脂肪、血液(例如：外财血液)、滑膜、骨骼、肌肉、肺、肝、胰腺、口腔、颅颌面(例如：脱落乳牙、牙髓、牙周膜、牙龈、根尖牙乳头等)等组织以及羊水、脐带，即所述间充质干细胞选自骨髓间充质干细胞、脂肪间充质干细胞、滑膜间充质干细胞、骨骼间充质干细胞、肌肉间充质干细胞、肺间充质干细胞、肝间充质干细胞、胰腺间充质干细胞、羊水间充质干细胞、脐带间充质干细胞等。
在本发明中，所述“哺乳动物”选自小鼠、大鼠、犬、猫、兔、猴或人类。
在本发明中，所述“预防”是指当用于疾病或病症时，与未给予药物的受试者相比，所述药物能降低受试者体内的医学病症症状的频率或推迟其发病。
在本发明中，所述“治疗”是指减轻、缓解或改善疾病或病症的症状，改善潜在的代谢引起的症状，抑制疾病或症状，例如阻止疾病或病症的发展、缓解疾病或病症、引起疾病或病症的消退、缓解疾病或病症引起的病况、或阻止疾病或病症的症状。
附图说明
图1为实施例1中流式细胞检测图。
图2为实施例2制备IEVs的技术路线图。
图3为用流式细胞分析技术分析的MSCs(106个MSCs)产生的IEVs数量统计结果。
图4A-图4D为IEVs颗粒的直径检测：图4A为以Bangs Laboratories公司生产的标准化小颗粒微球分析IEVs的散射光强，显示IEVs的颗粒直径分布；图4B为透射电镜(TEM)观察的IEVs，显示IEVs的颗粒直径分布；图4C为纳米粒子跟踪分析(NTA)，显示IEVs颗粒直径分布；图4D为纳米流式检测技术对IEVs进行单囊泡水平的粒径检测，显示IEVs的颗粒直径分布。
图5A-图5K为流式细胞技术IEVs的表面膜蛋白进行分析结果。
图6A-图6D为IEVs的内容物分析：图6A为DIA定量技术对MSCs、MSCs-Exosomes、MSCs-IEVs蛋白组学定量分析结果；图6B为筛选IEVs特异性高表达的蛋白绘制的热图；图6C为差异蛋白的GO富集分析IEVs表达Annexin V，Flotillin-1，Cadherin 11，Integrinalpha 5和Syntaxin 4分子的结果；图6D为western blot验证MSCs、MSCs-Exosomes、MSCs-IEVs表达Annexin V，Flotillin-1，Cadherin 11，Integrin alpha 5和Syntaxin 4的结果。
图7A-7F为利用高脂饲料诱导小鼠肥胖的实验中，IEVs注射对肥胖的影响。
图8A-8D显示IEVs对衰老小鼠肥胖的效果。
图9A-9D，10A-10C显示IEVs对OB小鼠肥胖效果。
图11A-11D显示IEVs对Lpr小鼠肥胖的效果。
图12A-图12F为体外实验检测IEVs对脂肪细胞内甘油三酯(triglyceride，TG)合成的影响：图12A、12B显示，IEVs处理后脂肪细胞内和上清液中TG均明显减少；图12C、12D显示，IEVs处理后的脂肪细胞内的脂滴明显缩小；图12E为Western blot检测，IEVs处理后增强了抑制脂合成的p-Akt，p-Erk通路，同时抑制了促脂合成的p-P50通路；图12F为IEVs处理后，成脂相关蛋白LPL和PPARγ均明显表达减少。
图13为将PKH-26标记的IEVs(红色荧光)加入脂肪细胞中，随着时间的推移，IEVs进入脂肪细胞增多，同时脂滴变小。
图14为对比例2中IEVs和exosomes处理后脂滴明显变少，脂肪细胞变小(图14A)；脂肪细胞内(图14B)和上清液中甘油三酯均明显减少(图14C)。
图15为显示IEVs治疗后主动脉弓粥样硬化斑块面积和严重程度得到明显缓解。
图16为IEVs对动脉粥样硬化小鼠各生化指标的影响。
图17为IEVs治疗糖尿病的实验处理流程图。
图18A-18C为IEVs治疗糖尿病：高剂量IEVs控制空腹血糖效果最佳(图18A)、改善糖耐量效果最好(图18B)、高剂量IEVs能明显降低2型糖尿病小鼠的空腹血糖(18C)。
图19为IEVs治疗干燥综合症：A.IEVs治疗干燥综合症(舍格伦综合征)唾液流率的影响；B.IEVs治疗干燥综合症下颌下腺HE染色结果；C.治疗干燥综合症对B细胞的影响。
图20为IEVs在血友病A小鼠的体内促凝作用。
图21A-图21D为给血友病A小鼠注射IEVs之后各种凝血因子水平的变化情况：图21A为凝血因子VIII的变化情况；图21B为vWF因子的变化情况；图21C为组织因子(TF)的变化情况；图21D为凝血酶原的变化情况。
图22A-图22B为血友病A小鼠模型中，IEVs分别进行PS和TF的封闭之后对IEVs的体内治疗效果的影响情况。
图23为同种MSCs来源的IEVs和Exosomes对血友病A小鼠治疗效果对比。
注：所述附图中，WT为野生型小鼠；HA组为血友病A小鼠模型；HA+IEVs为血友病A小鼠模型给予IEVs治疗；HA+PS-IEVs为血友病A小鼠模型给予PS阴性IEVs；HA+TF-IEVs为血友病A小鼠模型给予TF阴性IEVs；HA+Exosomes为血友病A小鼠模型给予Exosomes治疗。
具体实施方式
以下通过具体的实施例进一步说明本发明的技术方案，具体实施例不代表对本发明保护范围的限制。其他人根据本发明理念所做出的一些非本质的修改和调整仍属于本发明的保护范围。
实施例1 BMMSCs的分离培养
依据动物伦理委员会的指导用过量CO2处死小鼠，在无菌条件下，取下胫骨和股骨，剥净附着在其上的肌肉和结缔组织，进一步分离干骺端、暴露骨髓腔，用10mL无菌注射器抽取喊体积分数为10％胎牛血清的PBS反复冲洗骨髓腔，70μm孔径细胞滤网过滤后，500g离心5min，去除上清液后收集底部的细胞沉淀，PBS重悬，再次500g离心5min，收集最终的细胞沉淀。而后对细胞进行流式分选，以CD34-和CD90+为分选标准，分选出骨髓间充质干细胞(BMMSCs)。最后以Dex(-)培养液重悬细胞并接种于10cm直径细胞培养皿，37℃、5％CO2培养。24h后，吸除上清液未贴壁细胞，PBS清洗后，加入Dex(-)培养液继续培养。1周后加入等量Dex(+)培养液，再1周后可见密集的原代BMMSCs集落。采用胰蛋白酶37℃孵育消化BMMSCs并传代扩增，之后每3日换Dex(+)培养液，长满后传代。使用P2代BMMSCs进行后续实验。
其中，Dex(-)培养液成分如表1所示，Dex(+)培养液成分如表2所示：
表1Dex(-)培养液成分表
Figure BDA0002601509160000061
表2Dex(+)培养液配方表
Figure BDA0002601509160000062
采用流式细胞术分析表面标志物的方法来评估分离的BMMSCs的纯度。对于表面标志鉴定，胰蛋白酶消化收集P2代BMMSCs后，PBS清洗1次，以5×105/mL密度重悬细胞于含3％FBS的PBS中，加入1μL PE荧光偶联的CD29、CD44、CD90、CD45和CD34抗体，空白组不加。4℃避光孵育30min，PBS清洗2遍后，上机检测。检测结果如图1所示。
实施例2 BMMSC来源的IEVs的获得
将实施例1中培养至第2代的MSCs(骨髓来源的MSCs)，用实施例1中的培养基(Dex(+)培养液)继续培养至细胞汇合80％-90％时，PBS冲洗2遍，加入含500nM STS的无血清培养基(所述培养基为在实施例1中的培养基中加入500nM STS)，37℃孵育16-24h，收集细胞上清液，4℃下800g离心10分钟，收取上清液4℃下2000g离心10分钟，再次收集上清液4℃下16000g离心30分钟，所得沉淀物为IEVs。500μl PBS重悬沉淀，4℃下16000g再次离心30分钟，即得到清洗后的IEVs。
制备路线如图2所示。
对比例1同种MSC来源的外泌体分离和提取
将实施例1中培养至第2代的MSCs(骨髓来源的MSCs,BMMSCs)，用实施例1中的培养基继续培养至细胞汇合80％-90％时，用PBS冲洗2遍，加入无血清培养基，37℃孵育48h，收集细胞上清液，用于分离和提取Exosomes。
提取步骤包括：800g离心10分钟—收集上清液—2000g离心10分钟—收集上清液—16000g离心30分钟—收集上清液—120000g离心90分钟—移除上清液，无菌PBS重悬沉淀—120000g再次离心90分钟，移除上清，收集底部的Exosomes，无菌PBS重悬。
实施例3 IEVs的分析
(1)IEVs的定量和膜蛋白的分析
利用流式细胞技术对实施例2获得的IEVs进行定量分析，测量时间点为第1h、第4h、第8h、第16h和第24h，结果显示106个MSCs在诱导至第1h、第4h、第8h、第16h和第24h后分别可以产出0.76×108个、1.29×108个、1.95×108个、2.48×108个、3.14×108个IEVs，从中可以看出，诱导至24h后，单个MSC可以产出300个IEVs(图3)。
通过Bangs Laboratories公司生产的标准化小颗粒微球(0.2μm，0.5μm，1μm)分析IEVs的散射光强，结果显示IEVs的颗粒直径都在0.2μm以下(图4A)。
透射电镜(TEM)观察的结果与流式检测结果相似，大部分囊泡的直径都在200nm及200nm以下(图4B)。
纳米粒子跟踪分析(NTA)结果与透射电镜观察结果相符，IEVs颗粒直径平均为169nm(图4C)。
利用最先进的纳米流式检测技术进行单囊泡水平的粒径检测，结果也显示IEVs的平均颗粒直径在100.63nm(图4D)。
利用流式细胞技术对实施例3提取的IEVs的表面膜蛋白进行分析，结果显示，MSCs来源的IEVs能够表达和MSCs相似的表面蛋白，即CD29，CD44，CD73，CD166阳性，CD34，CD45阴性。同时，IEVs能够表达细胞外囊泡的普遍性表面蛋白CD9，CD63，CD81和C1q(如图5A-5K)。
(2)IEVs的内容物分析
利用蛋白DIA定量技术完成MSCs，MSCs-Exosomes(对比例1提取的)，MSCs-IEVs(实施例2获得的)的蛋白组学定量分析。结果显示，MSCs-Exosomes和MSCs-IEVs的蛋白内容物表达与母细胞具有较高的重叠性，170种蛋白在IEVs中特异性高表达(图6A)。通过生物信息学分析，筛选IEVs特异性高表达的蛋白，绘制热图(图6B)，进一步结合差异蛋白的GO富集分析结果，明确IEVs能特异性高表达Annexin V，Flotillin-1，Cadherin 11，Integrin alpha5和Syntaxin 4分子(图6C)。与同种MSCs来源的Exosomes相比，IEVs的5种特征性分子的表达量均显著上调，具体为：IEVs中的标志物Annexin V、Flotillin-1、Cadherin 11、Integrin alpha 5和Syntaxin 4相对于Exosomes中相应标记物的表达量分别为1.76倍、2.81倍、2.41倍、3.68倍和4.45倍。最后利用western blot技术再次进行验证，结果与DIA定量分析结果相符(图6D)。
MSCs-Exosomes：指的是来源于MSCs的外泌体。
MSCs-IEVs：指的是来源于MSCs的IEVs。
其中所述的内容物分析中的MSCs和与提取Exosomes和IEVs的MSCs为同一细胞株。
除非另有说明，以下各实施例、对比例的IEVs均为实施例2制备得到BMMSC来源的IEVs；exosomes均为对比例1制备的。
实施例4 IEVs对诱导性小鼠肥胖的效果
利用高脂饲料(high fat diet，HFD)诱导小鼠肥胖，通过尾静脉注射BMMSCs来源的IEVs，每周注射1次，共注射4次，每次的剂量为4×106个IEVs，观察IEVs对肥胖的作用。
结果显示，本发明研究发现，肥胖小鼠存在白色脂肪组织凋亡囊泡相对减少的情况，而小鼠给予IEVs治疗后白色脂肪组织内凋亡囊泡的减少得到了明显缓解(图7E)。
另外，IEVs注射后肥胖小鼠体重明显减轻(图7A)，利用microCT重构小鼠脂肪分布(图7B粉色为构建的全身脂肪分布)，发现IEVs治疗后体脂率下降明显(图7B)，血液循环中甘油三酯含量显著减少(图7C)，白色脂肪堆积明显减少(图7D)，组织学检查可见IEVs治疗可明显缓解肥胖小鼠腹腔白色脂肪组织中脂肪细胞体积的增大(图7F)。
实施例5 IEV对衰老小鼠肥胖的效果
随着年龄的增长，机体基础代谢率的降低，脂合成和脂裂解的平衡被打破，腹腔常出现白色脂肪堆积甚至肥胖。
实验过程：C57BL6小鼠从第7个月开始每一个月尾静脉注射一次BMMSCs来源的IEVs，每次的剂量为1×106个IEVs，共注射18次。对照组每个月仅尾静脉注射同等量的PBS。处死时以8周龄的C57BL6小鼠作为正常小鼠进行对照。
衰老小鼠有体重增加和腹腔白色脂肪的堆积。实验结果显示，衰老小鼠存在白色脂肪中组织凋亡囊泡相对减少的情况，而衰老小鼠给予IEVs治疗后白色脂肪组织内凋亡囊泡的减少得到了明显缓解(图8D)。
另外，BMMSCs来源的IEVs治疗能明显抑制体重的增长(图8A)和腹腔白色脂肪的堆积(图8B)，IEVs治疗能明显抑制血液循环中甘油三酯的含量(图8C)。
实施例6 IEV对OB小鼠的效果
OB小鼠是leptin缺陷小鼠，是常用于研究肥胖的小鼠模型。
实验过程：OB小鼠体重达到45g后开始通过尾静脉注射BMMSCs来源的IEVs，每周注射1次，共注射4次，每次的剂量为4×106个IEVs。
实验结果表明，OB小鼠存在白色脂肪组织中凋亡囊泡相对减少的情况，而OB小鼠给予IEVs治疗后白色脂肪组织内凋亡囊泡的减少得到了明显缓解(图9D)。
另外，用IEVs治疗OB小鼠，发现IEVs治疗能明显抑制体重的增长(图9A)和腹腔白色脂肪的堆积(图9C)，IEVs治疗能明显抑制血液循环中甘油三酯的含量(图9B)。
接下来对6周的OB小鼠进行腹腔性腺周围脂肪局部注射BMMSCs来源的IEVs，一次剂量为2个10cm dish培养的BMMSCs 100％融合后诱导的IEVs。2周后发现局部注射IEVs后OB小鼠的体重增长率比对照组明显减少(图10A)，microCT分析体脂率发现局部注射IEVs的OB小鼠体脂率下降(图10B)，血清中甘油三酯含量明显降低(图10C)。
实施例7 IEVs对于Lpr小鼠的效果
对于凋亡障碍的Lpr小鼠，即存在Fas缺陷的小鼠也进行了研究。
实验过程：对Lpr小鼠通过尾静脉注射BMMSCs来源的IEVs，每周注射1次，共注射4次，每次的剂量为4×106个IEVs。
结果表明，Lpr小鼠存在白色脂肪组织凋亡囊泡相对减少的情况，而Lpr小鼠给予IEVs治疗后白色脂肪组织内凋亡囊泡的减少得到了明显缓解(图11D)。
另外，发明人发现，Lpr小鼠同样存在腹腔白色脂肪的堆积和血液中甘油三酯的升高。用IEVs治疗Lpr小鼠，发现IEVs治疗后能明显抑制腹腔白色脂肪的堆积(图11A，11B)，IEVs治疗能明显抑制血液循环中甘油三酯的含量(图11C)。
结合实施例4-7的结果，本发明首次突破性发现，无论是对诱导性肥胖、衰老性肥胖，还是leptin缺陷型肥胖、Fas缺陷性肥胖，凋亡囊泡在个体的白色脂肪组织中均存在相较于正常个体减少的情况，说明凋亡囊泡可以作为肥胖的指征；对这些肥胖个体给予IEVs治疗后，凋亡囊泡数量恢复，说明IEVs对肥胖有治疗作用。
实施例8 IEVs对小鼠肥胖的治疗和机制
实验过程：组织培养法获得出生1-3天内C57BL6小鼠的皮肤成纤维细胞，传代至P3代后六孔板铺板，100％融合后使用成脂诱导液诱导7天后成为脂肪细胞，加入BMMSCs来源的IEVs。
(1)IEVs加入成脂诱导液后继续培养所述脂肪细胞，3天后分别提取细胞培养液和脂肪细胞，分别获得细胞培养上清液和细胞内上清液，检测细胞培养上清液和细胞内上清液中甘油三酯的含量。结果显示，BMMSCs来源的IEVs处理所述脂肪细胞后，脂肪细胞(adipocytes)内和脂肪细胞培养上清液中甘油三酯(triglyceride，TAG)均明显减少，说明IEVs能显著抑制脂肪细胞的脂合成(图12A，12B)。IEVs处理后的脂肪细胞内的脂滴明显缩小(图12C，12D)。
注：1：1IEVs等比例是指用一个六孔板100％融合的BMMSCs收集到的IEVs处理一个六孔板内的脂肪细胞，1：2IEVs等比例是指用两个六孔板100％融合的BMMSCs收集到的IEVs处理一个六孔板内的脂肪细胞。
(2)Western blot检测发现IEVs处理所述脂肪细胞后增强了抑制脂合成的p-Akt，p-Erk通路，同时抑制了促脂合成的p-P50通路(图12E)。
(3)分别应用来源于脂肪间充质干细胞的IEVs(F-IEVs)和骨髓间充质干细胞的IEVs(B-IEVs)预处理脂肪间充质干细胞后诱导成脂分化，发现F-IEVs和B-IEVs处理组均能抑制脂肪间充质自干细胞的脂向分化，表现为成脂相关蛋白LPL和PPARγ均明显表达减少(图12F)。
注：
来源于脂肪间充质干细胞的IEVs的制备方法：与BMMSC来源的IEVs的制备方法类似。P3代脂肪间充质干细胞100％融合时，PBS冲洗2遍，加入含500nM STS的无血清培养基(所述培养基为在实施例1中的培养基中加入500nM STS)，37℃孵育16-24h，收集细胞上清液，4℃下800g离心10分钟，收取上清液4℃下2000g离心10分钟，再次收集上清液4℃下16000g离心30分钟，所得沉淀物为IEVs。500μl PBS重悬沉淀，4℃下16000g再次离心30分钟，即得到清洗后的IEVs。
F-IEVs 1：1指的是用一个六孔板100％融合的脂肪间充质干细胞收集到的IEVs处理一个六孔板内的脂肪细胞；
F-IEVs 1：5指的是用五个六孔板100％融合的脂肪间充质干细胞收集到的IEVs处理一个六孔板内的脂肪细胞；
B-IEVs 1：1指的是指用一个六孔板100％融合的BMMSCs收集到的IEVs处理一个六孔板内的脂肪细胞；
B-IEVs 1：5指的是指用五个六孔板100％融合的BMMSCs收集到的IEVs处理一个六孔板内的脂肪细胞。
(4)将PKH-26标记的IEVs(红色荧光)以1:5的比例加入脂肪细胞中，即：五个六孔板100％融合的BMMSCs收集到的IEVs染色PKH-26后，处理一个六孔板内的脂肪细胞。观察同一视野脂肪细胞脂滴的动态变化。并且随着时间的推移，IEVs进入脂肪细胞增多，同时脂滴变小(图13，图13中同一种颜色代表同一个脂肪细胞的动态变化，上下图内容一致，下图未将红色荧光标记的IEVs放入图片，以方便清晰看到脂滴的大小变化)。
对比例2同样细胞数量的IEVs(BMMSC来源的)和exosomes对脂肪细胞的脂合成和脂裂解作用对比
提取了同样细胞数量的IEVs(实施例2获得的)和exosomes(对比例1获得的)，体外比较这两者对脂肪细胞的脂合成和脂裂解的作用。结果显示，IEVs和exosomes处理后脂滴明显变少，脂肪细胞变小(图14A)。脂肪细胞内和上清液中甘油三酯均明显减少，IEVs处理组比exosomes处理组相比，脂滴减少更明显，脂肪细胞内和上清液中甘油三酯减少更加明显，有统计学差异(图14B，14C)，说明IEVs在抑制脂肪细胞的脂合成的效果优于exosomes。
实施例9 IEVs对动脉粥样硬化小鼠的效果
利用高胆固醇饲料诱导apoE-/-小鼠动脉粥样硬化，通过尾静脉注射IEVs，观察IEVs对动脉粥样硬化的作用效果。结果显示IEVs治疗后主动脉弓粥样硬化斑块面积和严重程度得到明显缓解(图15)。主动脉弓HE染色显示动脉粥样硬化小鼠主动脉泡沫样细胞大量聚集，向内膜表面隆起，周围纤维组织增多，粥样斑块突入管腔引起狭窄，IEVs治疗组斑块范围明显缩小，泡沫样细胞减少(图15A)。油红O染色脂滴显示动脉粥样硬化小鼠主动脉出现大范围脂质堆积，IEVs治疗组主动脉脂质堆积明显减小，粥样硬化纤维斑块面积明显缩小(图15B)。
实施例10 IEVs对动脉粥样硬化小鼠各生化指标的影响
分析动脉粥样硬化小鼠和IEVs治疗后的生化指标，发现IEVs治疗后动脉粥样硬化小鼠血液中甘油三酯(TAG)明显减少(图16A)，虽然IEVs治疗后血液中总胆固醇(TC)含量没有明显改变(图16B)，但是IEVs治疗后血液中高胆固醇(HDL)含量明显增高(图16C)，提示IEVs可能是通过减少脂合成和促进高胆固醇的分泌来治疗动脉粥样硬化。
实施例11 IEVs对2型糖尿病的影响
已有研究发现骨髓间充质干细胞能一定程度改善2型糖尿病的血糖和糖耐量。
发明人比较了骨髓间充质干细胞和其来源的IEVs对2型糖尿病的控制效果。如图17流程图所示，将6周野生型C57BL6小鼠开始喂食高脂饲料，小鼠10W时分别给予单次106个MSC注射、单次高剂量IEVs(8×106个，2dishes)或4次低剂量IEVs(4×106个，1dish)尾静脉注射。我们发现与MSCs组相比，高剂量IEVs控制空腹血糖效果最佳(图18A)、改善糖耐量效果最好(图18B)，进一步使用2型糖尿病模型db小鼠检测IEVs对2型糖尿病的治疗效果，与不干预组相比，高剂量IEVs能明显降低2型糖尿病小鼠的空腹血糖，具有统计学差异(图18C)。
试验例1
(1)检测步骤或方法：取8周龄舍格伦综合征(SS)模型小鼠，经尾静脉系统注射MSCs和IEVs，注射后4周取材，检测唾液流速，收集唾液腺样本行石蜡切片HE染色和B细胞标志物B220染色。
(2)结果：如图19A-图19C，结果显示，对比小鼠骨髓间充质干细胞及其来源的IEVs治疗干燥综合症(舍格伦综合征)唾液流率的影响，间充质干细胞治疗后唾液流率稍有恢复，IEVs治疗后唾液流率未见改善(*p<0.05相较于WT组，###p<0.001相较于MSCs组)。IEVs注射未改变唾液腺的炎症浸润和B细胞堆积情况。
试验例2
利用体外凝血实验检测实施例2获得的IEVs和对比例1提取Exosomes的体外促凝效果。结果如表3显示，IEVs能显著缩短大部分血浆的体外凝固时间，促凝效果好于Exosomes。
但对于因子II，V，X缺乏的血浆，IEVs无法发挥体外促凝作用，说明IEVs的体外促凝作用更多集中于凝血共同途径的上游。
表3
Figure BDA0002601509160000111
利用血友病A小鼠(凝血因子VIII缺乏)为模型，通过尾静脉注射9×108个IEVs，观察IEVs的体内促凝作用。结果如图20显示，IEVs治疗后能够显著改善血友病小鼠的出血倾向，治疗作用可以持续稳定地维持14天。
实验结果表明，IEVs能够在体外发挥显著的促凝作用。且体内注射后能够显著改善出血倾向，可用于改善血友病A导致的出血倾向。同时检测小鼠血浆中各种凝血因子的水平，发现凝血因子VIII、vWF因子、组织因子(tissue factor，TF)和凝血酶原(prothrombin)均没有发生显著变化(图21A，图21B，图21C，图21D)。
在血友病A小鼠模型中，分别注射正常IEVs，PS阴性IEVs和TF阴性IEVs，7天后进行剪尾实验，结果如图22A和图22B显示，PS和TF的封闭并没有影响IEVs的体内治疗效果，初步说明IEVs治疗血友病小鼠的机制与PS和TF无关。以往文献报道中，细胞外囊泡发挥促凝作用都高度依赖于其表面的PS和TF，而IEVs的体内实验结果与以往研究不一致，这提示在体内环境下，IEVs可能有新的作用机制发挥促凝作用。
对血友病A小鼠模型，分别进行同种MSCs来源的IEVs(实施例2获得的)和Exosomes(对比例1提取的)的注射治疗(9×108个)，结果显示，IEVs能够显著纠正小鼠的出血倾向，而Exosomes没有明显的治疗效果(图23)。

Claims (10)

1.凋亡囊泡的检测试剂在制备肥胖症检测试剂或试剂盒中的应用。
2.如权利要求1所述的应用，其特征在于，所述凋亡囊泡的检测试剂选自检测凋亡囊泡的数量、凋亡囊泡的表面标志物、凋亡囊泡蛋白总量的试剂中的一种或多种；
优选地，所述检测试剂选自流式细胞试剂和/或试剂盒、Western blot试剂和/或试剂盒、BCA定量试剂和/或试剂盒、纳米颗粒跟踪分析试剂和/或试剂盒中的一种或多种。
3.一种肥胖症的检测方法，其特征在于，所述的方法包括，
S1.检测受试者的样本的凋亡囊泡水平；
S2.将受试者凋亡囊泡水平与正常对照样本的凋亡囊泡水平相比较；
S3.根据所述步骤S2的比较结果，受试者凋亡囊泡水平与正常对照样本的凋亡囊泡水平相比较降低，指示所述受试者患有或有风险患上肥胖症。
4.一种肥胖症的检测系统，其特征在于，所述的系统包含：
1)凋亡囊泡的检测构件；
2)数据处理构件；
3)结果输出构件；
优选地，所述凋亡囊泡的检测构件包括流式细胞仪、western blot电泳槽及成像系统、高速离心机、酶标仪、BCA定量试剂盒、纳米颗粒跟踪分析试剂盒中的一种或多种；
优选地，所述的数据处理构件被配置为a.接收待测样本以及正常对照样本的测试数据；b.储存待测样本以及正常对照样本的测试数据；c.比对同种类型的待样本以及正常对照样本的测试数据；d.根据比对结果，响应于受试者罹患肥胖症的概率或者可能性；
优选地，所述的结果输出构件用于输出受试者罹患肥胖症的概率或者可能性；
优选地，数据处理构件的判断标准为：根据界值判断肥胖症标本和正常标本；
优选地，脂肪标本中凋亡囊泡水平的界值为每0.05ug脂肪组织的调亡囊泡的含量为12～15*106个，所述脂肪标本的凋亡囊泡水平小于所述凋亡囊泡水平的界值则判断为肥胖症标本，所述脂肪标本的凋亡囊泡水平大于等于所述凋亡囊泡水平的界值则判断为正常标本。
5.如权利要求1或2所述的应用，或权利要求3所述的检测方法，或权利要求4的检测系统，其特征在于，检测的样本选自脂肪组织；更优选白色脂肪组织。
6.诱导性细胞外囊泡在制备治疗或预防代谢性炎症综合征的制剂中的应用；
优选地，所述代谢性炎症综合征包括：肥胖症、动脉粥样硬化症、糖尿病中的一种或多种；
优选地，所述肥胖症包括诱导性肥胖、衰老性肥胖和leptin缺陷性肥胖、Fas缺陷性肥胖中的至少一种；
优选地，所述leptin缺陷性肥胖选自儿童肥胖；
优选地，所述糖尿病选自2型糖尿病；
优选地，所述制剂为减轻体重的制剂；
优选地，所述制剂为抑制p-Akt，p-Erk，p-P50通路中的一种或多种的制剂；
优选地，所述制剂为抑制脂肪间充质干细胞的脂向分化的制剂；
优选地，所述制剂为抑制甘油三酯的合成治疗肥胖症或动脉粥样硬化的制剂；
优选地，所述制剂为促进高胆固醇的分泌治疗动脉粥样硬化的制剂；
优选地，所述的制剂选自药物制剂或保健品制剂。
7.一种肥胖症的治疗系统，其特征在于，所述系统包含：
1)凋亡囊泡的检测构件；
2)数据处理构件；
3)结果输出构件；
4)向被诊断为肥胖症的受试者施用诱导性细胞外囊泡；
优选地，所述凋亡囊泡的检测构件包括流式细胞仪、western blot电泳槽及成像系统、高速离心机、酶标仪、BCA定量试剂盒、纳米颗粒跟踪分析试剂盒中的一种或多种；
优选地，所述的数据处理构件被配置为a.接收待测样本以及正常对照样本的测试数据；b.储存待测样本以及正常对照样本的测试数据；c.比对同种类型的待样本以及正常对照样本的测试数据；d.根据比对结果，响应于受试者罹患肥胖症的概率或者可能性；
优选地，所述的结果输出构件用于输出受试者罹患肥胖症的概率或者可能性；
优选地，数据处理构件的判断标准为：根据界值判断肥胖症标本和正常标本；
优选地，脂肪标本中凋亡囊泡水平的界值为每0.05ug脂肪组织的凋亡囊泡的含量为12～15*106个，所述脂肪标本的凋亡囊泡水平小于所述凋亡囊泡水平的界值则判断为肥胖症标本，所述脂肪标本的凋亡囊泡水平大于等于所述凋亡囊泡水平的界值则判断为正常标本。
8.如权利要求6所述的应用，其特征在于，所述诱导性细胞外囊泡是在干细胞处于正常存活时通过外加因素诱导凋亡而产生的囊泡；
优选地，所述诱导性细胞外囊泡是诱导干细胞凋亡产生的，所述诱导方法包括添加星形孢菌、紫外线照射、饥饿法、或热应力法；
优选地，所述干细胞为间充质干细胞；
优选地，所述间充质干细胞选自血液间充质干细胞、骨髓间充质干细胞、尿液间充质干细胞、口腔间充质干细胞、脂肪间充质干细胞、胎盘间充质干细胞、脐带间充质干细胞、骨膜间充质干细胞、皮肤间充质干细胞中的一种或多种；
优选地，所述的间充质干细胞选自血液间充质干细胞、骨髓间充质干细胞、脂肪间充质干细胞、脐带间充质干细胞、口腔间充质干细胞、皮肤间充质干细胞中的一种或多种；
优选地，所述的干细胞选自血液干细胞或骨髓间充质干细胞中的一种或两种。
9.如权利要求8所述的应用，其特征在于，所述星形孢菌素的浓度大于或等于1nM；
优选地，为1-15000nM；
优选地，为200-10000nM；优选地，为250-1000nM；优选地，为500-1000nM。
10.如权利要求6、8-9任一所述应用，其特征在于，所述诱导性细胞外囊泡的直径为0.45μm或以下；
优选地，所述诱导性细胞外囊泡的直径为0.05-0.45μm；
优选地，所述诱导性细胞外囊泡的直径为0.1-0.45μm；
优选地，所述诱导性细胞外囊泡的直径为0.1-0.35μm；
优选地，所述诱导性细胞外囊泡的直径为0.15-0.35μm；
优选地，所述诱导性细胞外囊泡的直径为0.15-0.3μm；
优选地，所述诱导性细胞外囊泡的直径为0.15-0.2μm。
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