CN113209133B - 囊泡在制备用于治疗或预防肝脏疾病药物中的应用 - Google Patents

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Abstract

本发明属于生物医药领域，涉及一种诱导性囊泡在制备用于治疗或预防肝脏疾病药物中的应用，所述疾病不包括硫代乙酰胺诱导的损伤性肝纤维化。本发明所述的诱导性囊泡能够靶向肝脏，明显地富集于肝脏，能够维持肝稳态、促进肝部分切除术(Partial hepatectomy,PHx)后组织再生、预防对乙酰氨基酚(Acetaminophen,APAP)诱导的急性肝衰竭、预防非酒精性脂肪性肝炎、治疗非酒精性脂肪性肝病(Non‑alcoholic fatty liver disease,NAFLD)和治疗自身免疫性肝炎和肝纤维化。适用于多种类型的肝脏疾病的预防和治疗，且所述囊泡可以通过皮肤和毛发排出，在体内具有安全性，具有良好的应用前景。

Description

囊泡在制备用于治疗或预防肝脏疾病药物中的应用
技术领域
本发明属于生物医药领域，涉及囊泡在制备用于治疗或预防肝脏疾病药物中的应用。
背景技术
中国是肝病大国，因急性药物损伤性肝衰竭、慢性脂肪肝和肝炎、纤维化等进展所致终末期肝病患者年新增500万，更由于疾病肝脏的再生能力不足、健康供肝有限，肝病成为高发病率、难以治愈的疾病。因此，针对肝稳态调控机理研究新的肝疾病防治方法和策略是亟需解决的重大医学和科学问题。
发明内容
本发明提供了囊泡在在制备用于治疗或预防肝脏疾病药物中的应用。其中的囊泡为诱导性囊泡。
本发明实施例中的IEVs为诱导性囊泡的简称，可称为诱导性囊泡，也可称为诱导性细胞外囊泡(Induced extracellular vesicles,IEVs)。
发明人研究过程中，偶然发现，在IEVs的表面具有GalNAc糖蛋白。
在采用被认为是较为准确的标记和检测囊泡类物质的方法，对IEVs在小鼠的器官/组织的分布进行检测时，发明人发现IEVs呈现出在肝脏中惊人的富集程度。在一些实施例中，在注射IEVs 48小时后，IEVs在肝脏中的摄取总量达到注射总量的25.7％±2.4％、平均每克肝组织摄入量达到注射平均量的16.9％±1.6％；对比骨、胰腺、牙齿、肌肉、脑和脂肪器官/组织更是分别为骨摄取总量的61.0±14.2倍、平均量的14.1±3.3倍，为胰摄取总量的133.8±24.8倍、平均量的15.8±2.9倍，为牙摄取总量的145.7±11.5倍、平均量的21.1±1.7倍，为肌摄取总量的272.5±51.0倍、平均量的39.4±7.4倍，为脑摄取总量的108.1±16.1倍、平均量的41.2±6.2倍，为脂肪摄取总量的642.3±256.7倍、平均量的54.9±22.0倍。
发明人猜测，诱导性囊泡的肝脏靶向特性(具体为肝细胞的摄取)可能与其表面带有的GalNAc有关。肝细胞表达特异性的脱唾液酸糖蛋白受体(asialoglycoproteinreceptor,ASGPR)，介导含有N-乙酰半乳糖胺(N-acetylgalactosaminyl,GalNAc)等残基的糖蛋白偶合物内吞，是其调控机体代谢的重要途径。
可喜的是，经过进一步的研究，发明人发现IEVs对多种肝脏疾病有很好的治疗效果。一方面是IEVs对肝脏具有的治疗能力，一方面是其又刚好大量富集于肝脏，使得其尤其适合治疗肝脏有关的疾病。
一些实施例中，所述较为准确标记和检测囊泡类物质的方法为64Cu同位素标记追踪法。
一些实施例中，本发明提供了一种囊泡在制备用于治疗或预防肝脏疾病药物中的应用，所述囊泡是诱导性囊泡，所述疾病不包括硫代乙酰胺诱导的损伤性肝纤维化。
一些实施例中，所述囊泡用于制备保肝或护肝的药物。
一些实施例中，所述药物用于维持肝稳态。
一些实施例中，所述药物用于维持肝的糖代谢或脂代谢的稳态。
一些实施例中，所述药物用于维持肝糖原、肝乳酸、血糖、血乳酸、肝甘油三酯、肝胆固醇、血甘油三酯以及血胆固醇中的一个或多个水平的稳态。
一些实施例中，所述药物用于维持肝组织结构稳态。
一些实施例中，所述药物用于维持肝实质细胞的细胞器或细胞骨架的稳态。
一些实施例中，所述药物用于促进肝再生。
一些实施例中，所述药物用于促进肝部分切除术(Partial hepatectomy,PHx)后的组织再生。
肝部分切除术是将肝脏的局部性病变，包括肝肿瘤、肝外伤、肝脓肿、肝内胆管结石、肝囊肿等等，应用外科技术，施行肝段、肝叶及半肝切除，而保留足以维持功能的正常肝组织。同时也用于部分肝移植过程中的肝捐献。肝部分切除术后出现肝组织再生过程。
一些实施例中，所述药物用于预防或治疗肝衰竭。
一些实施方式中，所述的肝衰竭包括急性肝衰竭或慢性肝衰竭。
一些实施例中，所述药物用于预防对乙酰氨基酚诱导的急性肝衰竭。
一些实施例中，所述药物用于治疗肝损伤。
一些实施例中，所述药物用于治疗脂肪性肝病。
脂肪性肝病一般指脂肪肝，脂肪肝(fatty liver)是指由于各种原因引起的肝细胞内脂肪堆积过多的病变，是一种常见的肝脏病理改变，而非一种独立的疾病。脂肪性肝病正严重威胁国人的健康，成为仅次于病毒性肝炎的第二大肝病，也是脂肪性肝炎的前驱疾病，发病率在不断升高，且发病年龄日趋年轻化。正常人肝组织中含有少量的脂肪，如甘油三酯、磷脂、糖脂和胆固醇等，其重量约为肝重量的3％～5％，如果肝内脂肪蓄积太多，超过肝重量的5％或在组织学上肝细胞50％以上有脂肪变性时，就可称为脂肪肝。在脂肪性肝病阶段进行有效治疗将有助于控制肝病不进展至更为严重的脂肪性肝炎阶段。
脂肪性肝炎是脂肪性肝病的进展性病变，除具有显著肝细胞脂肪变外，还具有肝细胞损伤(如气球样变性、细胞浆内有玻璃样小体等)、炎性细胞浸润、肝血窦周围纤维组织增生、胆汁淤积等病理特征。脂肪性肝病一旦进展为脂肪性肝炎，肝病理严重程度增加，难以逆转或治愈，其亦可继续进展，导致肝脏纤维化、肝硬化、门静脉高压、肝癌和肝衰竭，已成为成人肝移植的首位原因。
在一些实施方式中，所述的脂肪性肝病为非酒精性脂肪性肝病(Non-alcoholicfatty liver disease,NAFLD)。
非酒精性脂肪性肝病(NAFLD)是指除外酒精和其他明确的损肝因素所致的肝细胞内脂肪过度沉积为主要特征的临床病理综合征，与胰岛素抵抗和遗传易感性密切相关的获得性代谢应激性肝损伤，是脂肪性肝病的一种，主要包括单纯性脂肪肝(SFL)。随着肥胖及其相关代谢综合征全球化的流行趋势，非酒精性脂肪性肝病现已成为欧美等发达国家和我国富裕地区慢性肝病的重要病因，普通成人NAFLD患病率10％～30％，其中10％～20％为NASH(非酒精性脂肪性肝炎(Non-alcoholic steatohepatitis,NASH))，后者10年内肝硬化发生率高达25％。
一些实施例中，所述药物用于治疗自身免疫性肝炎或自身免疫性肝纤维化。
一些实施例中，所述药物用于预防非酒精性脂肪性肝炎。
一些实施例中，所述囊泡的来源包括干细胞。
一些实施例中，所述干细胞为间充质干细胞。
一些实施例中，所述细胞可以是原代培养的细胞，也可以是已有的或已确立的细胞系。
一些实施例中，所述细胞系指的是是指永生化的细胞培养物，在适当的新鲜培养基和空间下可以无限增殖。
一些实施例中，所述细胞可以是确立的细胞株。
一些实施例中，所述诱导性囊泡是在干细胞处于正常存活时通过外加因素诱导凋亡而产生的囊泡。
一些实施例中，所述诱导性囊泡是诱导干细胞凋亡产生的，所述的诱导方法包括但不限于星形孢菌素、紫外线照射、饥饿法、或热应力法。
一些实施例中，所述干细胞为间充质干细胞。
一些实施例中，所述间充质干细胞来源包括骨髓、尿液、口腔、脂肪、胎盘、脐带、骨膜、肌腱，但又不限于此。
一些实施例中，所述诱导性囊泡是通过添加星形孢菌素诱导间充质干细胞凋亡产生。
一些实施例中，所述星形孢菌素的浓度为1nM-10000nM。一些实施例中，所述星形孢菌素的浓度为100nM-10000nM。一些实施例中，所述星形孢菌素的浓度为500nM-
10000nM。一些实施例中，所述星形孢菌素的浓度可以是500-1000nM，也可以是500-
900nM，还可以为500-800nM。
一些实施例中，所述诱导性囊泡表面带有N-乙酰半乳糖胺(N-acetylgalactosaminyl,GalNAc)。
一些实施例中，所述诱导性囊泡表面富集N-乙酰半乳糖胺。
在一些实施例中，所述诱导性囊泡具有标志物Syntaxin 4。在一些实施例中，所述诱导性囊泡高表达标志物Syntaxin 4。在一些实施例中，所述诱导性囊泡对标志物Syntaxin 4的表达高于MSCs或外泌体。在一些实施例中，所述标志物Syntaxin 4的表达量为来源于间充质干细胞的外泌体中Syntaxin 4的表达量的3-6倍。在一些实施例中，所述标志物Syntaxin 4的表达量为来源于间充质干细胞的外泌体中Syntaxin 4的表达量的3.5-5倍。在一些实施例中，所述标志物Syntaxin 4的表达量为来源于间充质干细胞的外泌体中Syntaxin 4的表达量的4.45倍。在一些实施例中，所述标志物还包括Annexin V、Flotillin-1、Cadherin 11和Integrin alpha 5中的一种或多种。在一些实施例中，所述标志物为Syntaxin 4、Annexin V、Flotillin-1、Cadherin 11和Integrin alpha 5的组合。在一些实施例中，所述诱导性囊泡高表达标志物Annexin V、Flotillin-1、Cadherin 11、Integrin alpha5。在一些实施例中，所述诱导性囊泡对标志物Annexin V、Flotillin-1、Cadherin 11、Integrin alpha 5的表达量高于MSCs或外泌体。在一些实施例中，所述诱导性囊泡中的标志物Annexin V、Flotillin-1、Cadherin 11、Integrin alpha 5的表达量相对于来源于间充质干细胞的外泌体中标记物的表达量分别为1-2倍、2-3倍、1-3倍和3-4倍。一些实施例中，所述诱导性囊泡中的标志物Annexin V、Flotillin-1、Cadherin 11、Integrin alpha 5的表达量分别为1.5-2倍、2.5-3倍、1.5-2.5倍和3.5-4倍。在一些实施例中，所述囊泡中的标志物Annexin V、Flotillin-1、Cadherin 11、Integrin alpha 5的表达量分别为1.76倍、2.81倍、2.41倍、3.68倍。
本发明中所述诱导性囊泡与外泌体有本质的不同，例如与外泌体相比，本发明所述的诱导性囊泡IEVs高表达Syntaxin 4，以及其Annexin V、Flotillin-1、Cadherin 11、Integrin alpha 5的表达量明显高于外泌体(见实施例3)。除了具有的标志物有差别之外，所述诱导性囊泡IEVs在功能上或治疗效果上也呈现出有别于干细胞和其他的细胞外囊泡(如外泌体)的特性。例如IEVs能显著缩短大部分血浆的体外凝固时间，促凝效果好于外泌体(见试验例4)。例如，间充质干细胞可以治疗损伤性肝纤维化，然而，诱导性囊泡对这些疾病并不能实现治疗效果(见试验例1)。例如MSCs能够治疗干燥综合征，而本发明所述的诱导性囊泡对干燥综合征无治疗效果(见试验例2)。例如IEVs治疗血友病小鼠的机制与PS和TF无关，而以往文献报道中，细胞外囊泡发挥促凝作用都高度依赖于其表面的PS和TF(见试验例3)。
在一些实施例中，所述诱导性囊泡还表达CD29、CD44、CD73、CD166；且不表达CD34、CD45。在一些实施例中，所述诱导性囊泡还表达CD9、CD63、CD81和C1q中的一个或多个。
一些实施例中，本发明提供了一种组合物，包含诱导性囊泡和治疗或预防肝脏疾病的药物。
在一些实施例中，所述诱导性囊泡的直径可以为0.03-10μm。在一些实施例中，所述诱导性囊泡的直径可以为0.03-6μm；可以是0.03-4.5μm。
在一些实施例中，所述诱导性囊泡的制备方法包括步骤：(1)培养间充质干细胞；(2)收集间充质干细胞的培养基上清；(3)从步骤(2)中的培养基上清中分离出囊泡。
在一些实施例中，所述步骤(1)中的培养间充质干细胞的步骤包括：(4)从组织中分离间充质干细胞；(5)添加培养基培养间充质干细胞；所述间充质干细胞的培养基中接触凋亡诱导剂。
在一些实施例中，所述步骤(3)中，分离囊泡的方法包括选用超速离心的方法分离所述囊泡。
在一些实施例中，所述超速离心的方法分离所述囊泡的步骤包括：(a)将收集到的培养上清进行第一次离心，取上清；(b)将步骤(a)中收集到的上清进行第二次离心，取上清；(c)将步骤(b)中收到的上清进行第三次离心，取沉淀；(d)将步骤(c)中收到的沉淀进行第四次离心，取沉淀。
在一些实施例中，所述第一次离心为500-1500g离心5-30分钟；或者所述第一次离心为500-1000g离心5-20分钟；或者所述第一次离心为500-900g离心5-15分钟。在一些实施例中，所述第二次离心为1000-3000g离心5-30分钟；或者所述第二次离心为1500-2500g离心5-20分钟；或者所述第二次离心为1500-2200g离心5-15分钟。在一些实施例中，所述第三次离心为10000-30000g离心15-60分钟；或者所述第三次离心为12000-25000g离心20-60分钟；或者所述第三次离心为12000-20000g离心20-40分钟。在一些实施例中，所述第四次离心为10000-30000g离心15-60分钟，或者所述第四次离心为12000-25000g离心20-60分钟；或者所述第四次离心为12000-20000g离心20-40分钟。
在一些实施例中，所述间充质干细胞的代数可以为第2～5代，但又不限于此。
在一些实施例中，所述间充质干细胞来源于哺乳动物，但又不限于此。
在一些实施例中，所述哺乳动物选自人或鼠，但又不限于此。
在一些实施例中，所述间充质干细胞来源于骨髓。
在一些实施方式中，将所述诱导性囊泡用于疾病治疗的过程中，可以将所述诱导性囊泡任选地通过选自由静脉内注射、肌肉注射、皮下注射、鞘内注射或输注以及器官内输注所组成的组中的途径进行给药。例如，作为例子，对于静脉注射，可以通过尾静脉注射。器官内输注包括输注至解剖学空间中，例如，作为例子，胆囊、胃肠腔、食道、肺系统(通过吸入)和/或膀胱。
作为例子，对于胃肠腔输注中腹腔注射，与尾静脉注射相比，腹腔注射也可以获得同等良好的治疗效果。腹腔注射的安全性和可操作性要优于尾静脉注射。
附图说明
图1A-1E为分离的BMMSCs的表面标志物的流式检测结果。
图2为实施例2的操作流程图。
图3为用流式细胞分析技术分析的MSCs(106个MSCs)产生的IEVs数量统计结果。
图4A-图4F为IEVs颗粒的直径检测：图4A为流式检测IEVs的颗粒直径分布图；图4B为侧向散射光(SSC)分析IEVs的散射光强，显示IEVs颗粒直径分布；图4C为以BangsLaboratories公司生产的标准化小颗粒微球分析IEVs的散射光强，显示IEVs的颗粒直径分布；图4D为透射电镜(TEM)观察的IEVs，显示IEVs的颗粒直径分布；图4E为纳米粒子跟踪分析(NTA)，显示IEVs颗粒直径分布；图4F为纳米流式检测技术对IEVs进行单囊泡水平的粒径检测，显示IEVs的颗粒直径分布。
图5A-图5K为流式细胞技术IEVs的表面膜蛋白进行分析结果。
图6A-图6G为IEVs的内容物分析：图6A为DIA定量技术对MSCs、MSCs-Exosomes、MSCs-IEVs蛋白组学定量分析结果；图6B为筛选IEVs特异性高表达的蛋白绘制的热图；图6C为差异蛋白的GO富集分析IEVs表达Annexin V，Flotillin-1，Cadherin 11，Integrinalpha 5和Syntaxin 4分子的结果；图6D为western blot验证MSCs、MSCs-Exosomes、MSCs-IEVs表达Annexin V，Flotillin-1，Cadherin 11，Integrin alpha 5和Syntaxin 4的结果；图6E为偶联FITC荧光物质的Gal和GalNAc的特异性凝集素对IEVs进行染色，染色后进行荧光图片观察和流式分析，结果显示61.8％的IEVs表面带有Gal；图6F为偶联FITC荧光物质的Gal和GalNAc的特异性凝集素对IEVs进行染色，染色后进行荧光图片观察和流式分析，结果显示高达93.3％的IEVs表面带有GalNAc；图6G显示通过CellMask膜染料标记IEVs、外泌体(Exos)和MSCs膜成分，并进行偶联FITC荧光物质的GalNAc的特异性凝集素染色，使用荧光检测仪读数发现，IEVs单位膜表面的GalNAc荧光强度显著高于Exos和MSCs。
图7A-D为MSCs来源IEVs注射后小鼠后，富集于肝脏：A.铜64同位素标记IEVs，静脉输注后小鼠活体示踪；B.注射后48小时各组织器官总放射强度检测；C.注射后48小时各组织器官平均放射强度检测；D.IEVs与exosomes被细胞摄取的差异性检测，其中IEVs主要被肝细胞摄取而非肝巨噬细胞。
图8为IEVs维持肝糖、脂代谢功能稳态：A.肝糖原含量检测；B.肝乳酸含量检测；C.血糖水平检测；D.血乳酸水平检测；E.肝甘油三酯含量检测；F.肝胆固醇含量检测；G.血甘油三酯水平检测；H.血胆固醇水平检测；WT，野生型C57小鼠；Fasmut，Fas基因突变的凋亡缺陷小鼠，产EVs(正常细胞外囊泡)缺乏；小鼠鼠龄8周，IEVs注射后1周取材。
图9为IEVs维持肝组织结构稳态：A.HE染色和F-actin免疫荧光染色；B.肝实质细胞核比例测算；C.肝实质细胞染色质含量采用流式细胞术测算；小鼠鼠龄8周，IEVs注射后1周取材。
图10为IEVs维持肝实质细胞的细胞器和细胞骨架稳态：A.IEVs与高尔基体共染；B.IEVs与微管细胞骨架共染；体外肝实质细胞培养，IEVs处理72h。
图11为IEVs促进肝部分切除术(Partial hepatectomy,PHx)后组织再生：A.完整肝脏大体图；B.切除肝左叶和中叶后(70％PHx)；C.正常肝再生72h；D.IEVs注射后肝再生72h；E.肝重占体重比例统计；小鼠鼠龄8周，IEVs在PHx手术前24h注射。
图12为IEVs预防对乙酰氨基酚(Acetaminophen,APAP)诱导的急性肝衰竭：A.1g/kg APAP腹腔注射后存活率检测；NAC，抗氧化剂，APAP注射前24h注射；IEVs预防注射于APAP注射前24h；IEVs治疗注射于APAP注射后6h；B.HE染色和血清肝损伤指标检测(丙氨酸氨基转移酶、天冬氨酸氨基转移酶)；IEVs为预防性注射。
图13为IEVs治疗非酒精性脂肪性肝病(Non-alcoholic fatty liver disease,NAFLD)；A.过碘酸-希夫(PAS)反应示肝糖原染色；B.油红染色示脂肪肝；HFD，高脂饲料；小鼠自6周龄起饲喂HFD，IEVs于10周龄时注射1次，14周龄取材。
图14为IEVs治疗自身免疫性肝炎和肝纤维化：A.HE染色示淋巴细胞浸润；B.Masson氏染色示胶原纤维沉积；Casp3+/-,Caspase 3基因杂合缺陷小鼠，呈现自身免疫症状；小鼠鼠龄8周，IEVs注射后1月取材。
图15A-E为MSCs来源IEVs预防AMLN饲料(高反式脂肪、高果糖、高胆固醇饲料)喂养的脂肪性肝炎(NASH)数据。小鼠体型和体重统计数据；B.肝病理组织学切片；C.血清肝损伤指标检测(丙氨酸氨基转移酶、天冬氨酸氨基转移酶)；D.血清和肝甘油三酯水平检测；E.血清和肝胆固醇水平检测。小鼠自6周龄起饲喂AMLN，IEVs于10周龄时注射1次，32周龄取材。
图16为MSCs来源IEVs治疗硫代乙酸铵诱导的损伤性肝纤维化数据。A.肝病理组织学切片；B.脂肪性肝病评分。
图17为IEVs治疗干燥综合症：A.IEVs治疗干燥综合症(舍格伦综合征)唾液流率的影响；B.IEVs治疗干燥综合症下颌下腺HE染色结果；C.治疗干燥综合症对B细胞的影响。
图18为IEVs在血友病A小鼠的体内促凝作用。
图19A-图19D为给血友病A小鼠注射IEVs之后各种凝血因子水平的变化情况：图19A为凝血因子VIII的变化情况；图19B为vWF因子的变化情况；图19C为组织因子(TF)的变化情况；图19D为凝血酶原的变化情况。
图20A-图20B为血友病A小鼠模型中，IEVs分别进行PS和TF的封闭之后对IEVs的体内治疗效果的影响情况。
图21为同种MSCs来源的IEVs和Exosomes对血友病A小鼠治疗效果对比。注：所述附图中，WT为野生型小鼠；HA组为血友病A小鼠模型；HA+IEVs为血友病A小鼠模型给予IEVs治疗；HA+PS-IEVs为血友病A小鼠模型给予PS阴性IEVs；HA+TF-IEVs为血友病A小鼠模型给予TF阴性IEVs；HA+Exosomes为血友病A小鼠模型给予Exosomes治疗。
图22A-22C显示IEVs可经皮肤和毛发排出：图22A为IEVs在皮肤表面的动态代谢示意图。图22B显示随着时间推移，IEVs逐渐从皮下组织向真皮层和表皮移动。图22C显示第7天时在小鼠体表拔下的毛发中发现毛囊中存在PKH26-IEVs。
具体实施方式
以下通过具体的实施例进一步说明本发明的技术方案，具体实施例不代表对本发明保护范围的限制。其他人根据本发明理念所做出的一些非本质的修改和调整仍属于本发明的保护范围。
本发明实施例中的IEVs为诱导性囊泡的简称，可称为诱导性囊泡，也可称为诱导性细胞外囊泡(Induced extracellular vesicles,IEVs)，IEV同IEVs。诱导性细胞外囊泡是指的是一种在前体细胞(例如干细胞)正常存活时，被干预或诱导，使其凋亡产生的一类亚细胞产物。通常这一类亚细胞产物，具有膜结构，表达凋亡性标志物，部分包含有遗传物质DNA。发明人发现诱导性细胞外囊泡是区分于细胞和常规细胞外囊泡(如外泌体等)的一类物质。在一些实施方式中，所述的正常存活时的细胞，例如是非凋亡的细胞、非衰老的细胞、非老化而增殖停滞的细胞、非冻存后复苏的细胞、非发生恶变而异常增殖的细胞或非出现损伤的细胞等。在一些实施方式中，所述的正常存活时的细胞取自细胞培养过程中，细胞接触融合80-100％的时候的细胞。一些实施方式中，所述的正常存活时的细胞取自对数期细胞。一些实施方式中，所述的正常存活时的细胞取自人或鼠组织来源的原代培养及其传代培养细胞。一些实施方式中，所述的正常存活时的细胞取自已确立的细胞系或细胞株。在一些实施方式中，所述的前体细胞取自早期的细胞。
正常细胞外囊泡(EVs)指的是细胞在正常培养过程或在体内生理条件下自发分泌的纳米级大小的具有膜结构的小体，直径从40-1000nm不等，主要由微囊泡(Microvesicles,MV)和外泌体(Exosomes)组成，含有多种RNA、蛋白质等信号分子。
本发明中的STS为星形孢菌素。
本发明中Exosomes指的是外泌体。
BMMSCs(Bone marrow mesenchymal stem cells)指的是骨髓间充质干细胞。
“包含”或“包括”旨在表示组合物(例如介质)和方法包括所列举的要素，但不排除其他要素。当用于定义组合物和方法时，“基本上由……组成”意味着排除对于所述目的的组合具有任何重要意义的其他要素。因此，基本上由本文定义的元素组成的组合物不排除不会实质上影响要求保护的本发明的基本和新颖特征的其他材料或步骤。“由……组成”是指排除其他组成部分的微量元素和实质性的方法步骤。由这些过渡术语中的每一个定义的实施方案都在本发明的范围内。
如本文所用，术语“高表达”等旨在包括将核酸或蛋白质的表达增加至高于目前已有囊泡(例如外泌体)所含有的水平。
在本发明中，“组合物”中的组分可以是混合的形式存在，也可以被分开包装。分开的包装的组分也可以含有其各自的佐剂。所述的佐剂是指在药学中，可辅助药物疗效的手段。对于组合物中的组分在分开包装的情况下，各个分开包装的组分可以是同时施用或者是以任意的前后顺序施用，其中患者先用一种药物治疗，然后再给以另一种药物。所述的患者是指哺乳动物受治疗者，尤其是人类。
在本发明中，所述的“组合物”还可以是一种组分被另外一种组分包裹的形式存在。在一些实施方式中，在组合物中，所述的诱导性囊泡作为药物载体，将治疗或预防肝脏疾病的药物包裹在所述诱导性囊泡中，所述诱导性囊泡具有肝脏靶向性，从而将其所载的药物呈递至肝脏，从而达到治疗肝脏疾病的作用。
本发明中，相应的试剂来源如下：青霉素/链霉素溶液(BIOSOURCE；P303-100)；
谷氨酰胺(BIOSOURCE；P300-100)；地塞米松磷酸钠(Sigma；D-8893)；α-MEM(Gibco；12571-063)；2-ME(GIBCO；21985-023)。
本文实施例中，采用64Cu同位素标记追踪IEVs生物学分布，具体为：收集的IEVs在HEPES缓冲液作用下与NOTA螯合剂结合，并加入64CuCl2室温反应1h，离心层析去除游离同位素和螯合剂。在柠檬酸溶液环境下进行瞬时薄层色谱分析检测标记效率后，经尾静脉注射入小鼠体内，注射后采用PET实时追踪IEVs生物学分布。处死小鼠分离多组织后，采用便携式γ计数器检测放射强度。传统对于MSCs和EVs的标记方法主要采用PKH等膜荧光染料，但此种荧光染料插入膜的同时，对于膜脂质有损害，且染色易沾染、易淬灭，应用于体内追踪的灵敏度和特异性有待加强。同位素标记方法的原理是基于膜表面的蛋白质氨基等基团的化学反应，及基于放射强度检测的追踪方法，结合无毒性、无沾染泄漏，检测精度更高、更为灵敏。然而，以往的同位素标记主要在Liposome中成功完成，是因为Liposome合成过程中可方便添加NOTA等金属同位素的螯合剂，但对于EVs这种生物活性囊泡并未建立有效方法。
本文中，F4/80为成熟小鼠巨噬细胞标志物mouse EGF-like module-containingmucin-like hormone receptor-ike 1(小鼠含生长因子样模体粘液样激素样受体,EMR1)，是一种细胞表面糖蛋白，是EGFTM7蛋白家族的一员，与人的EMR1蛋白有68％氨基酸一致性。研究发现，在巨噬细胞的成熟和活化过程中，F4/80蛋白的表达发生明显变化。F4/80蛋白表达于多种成熟的巨噬细胞中，如枯否细胞、朗格汉斯细胞、小神经胶质细胞以及位于腹膜、肠固有层、脾脏红髓、肺、胸踪、骨髓基质中的巨噬细胞。
实施例1 MSCs的分离培养
依据动物伦理委员会的指导用过量CO2处死小鼠，在无菌条件下，取下胫骨和股骨，剥净附着在其上的肌肉和结缔组织，进一步分离干骺端、暴露骨髓腔，用10mL无菌注射器抽取含体积分数为10％胎牛血清的PBS反复冲洗骨髓腔，70μm孔径细胞滤网过滤后，500g离心5min，去除上清液后收集底部的细胞沉淀，PBS重悬，再次500g离心5min，收集最终的细胞沉淀。而后对细胞进行流式分选，以CD34-和CD90+为分选标准，分选出BMMSCs。最后以Dex(-)培养液重悬细胞并接种于10cm直径细胞培养皿，37℃、5％CO2培养。24h后，吸除上清液未贴壁细胞，PBS清洗后，加入Dex(-)培养液继续培养。1周后加入等量Dex(+)培养液，再1周后可见密集的原代BMMSCs集落。采用胰蛋白酶37℃孵育消化BMMSCs并传代扩增，之后每3日换Dex(+)培养液，长满后传代。使用P2代BMMSCs进行后续实验。
其中，Dex(-)培养液成分如表1所示，Dex(+)培养液成分如表2所示：
表1 Dex(-)培养液成分表
Figure BDA0002908219880000101
Figure BDA0002908219880000111
表2 Dex(+)培养液配方表
Figure BDA0002908219880000112
采用流式细胞术分析表面标志物的方法来评估分离的BMMSCs的纯度。对于表面标志鉴定，胰蛋白酶消化收集P2代BMMSCs后，PBS清洗1次，以5×105/mL密度重悬细胞于含3％FBS的PBS中，加入1μL PE荧光偶联的CD29、CD44、CD90、CD45和CD34抗体，空白组不加。4℃避光孵育30min，PBS清洗2遍后，上机检测。流式检测结果如图1A-1E所示，可知，分离的细胞为BMMSCs(骨髓间充质干细胞)。
实施例2诱导性囊泡(IEVs)的获得
将实施例1中培养至第2代的MSCs(骨髓来源的MSCs)，用实施例1中的培养基(Dex(+)培养液)继续培养至细胞汇合80％-90％时，用PBS冲洗2遍，加入含500nM STS的无血清培养基(α-MEM培养基)诱导凋亡，37℃孵育24h，收集细胞上清液，用于分离和提取IEVs。
从收集的培养基上清中进行IEVs的分离与提取，操作流程如图2所示，具体步骤包括：800g离心10分钟—收集上清液—2000g离心10分钟—收集上清液—16000g离心30分钟—移除上清液，无菌PBS重悬IEVs—16000g离心30分钟—移除上清液，300-500ul无菌PBS重悬IEVs。
对比例1同种MSCs来源的外泌体分离和提取
将实施例1中培养至第2代的MSCs(骨髓来源的MSCs)，用实施例1中的培养基继续培养至细胞汇合80％-90％时，用PBS冲洗2遍，加入无血清培养基，37℃孵育48h，收集细胞上清液，用于分离和提取Exosomes。
提取步骤包括：800g离心10分钟—收集上清液—2000g离心10分钟—收集上清液—16000g离心30分钟—收集上清液—120000g离心90分钟—移除上清液，无菌PBS重悬沉淀—120000g再次离心90分钟，移除上清，收集底部的Exosomes，无菌PBS重悬。
实施例3 IEVs的分析
(1)IEVs的定量和膜蛋白的分析
利用流式细胞技术对实施例2获得的IEVs进行定量分析，测量时间点为第1h、第4h、第8h、第16h和第24h，结果显示106个MSCs在诱导至第1h、第4h、第8h、第16h和第24h后分别可以产出0.76×108个、1.29×108个、1.95×108个、2.48×108个、3.14×108个IEVs，从中可以看出，诱导至24h后，单个MSCs可以产出300个IEVs(图3)。
此外，流式检测发现IEVs的颗粒直径分布都集中在1μm以下，占94.97％(图4A)。
侧向散射光(SSC)分析结果同样显示IEVs散射光强集中在1μm以下范围(图4B)。
进一步的，通过Bangs Laboratories公司生产的标准化小颗粒微球(0.2μm，0.5μm，1μm)分析IEVs的散射光强，结果显示IEVs的颗粒直径都在0.2μm以下(图4C)。
透射电镜(TEM)观察的结果与流式检测结果相似，大部分囊泡的直径都在200nm及200nm以下(图4D)。
纳米粒子跟踪分析(NTA)结果与透射电镜观察结果相符，IEVs颗粒直径平均为169nm(图4E)。
利用最先进的纳米流式检测技术进行单囊泡水平的粒径检测，结果也显示IEVs的平均颗粒直径在100.63nm(图4F)。
利用流式细胞技术对实施例3提取的IEVs的表面膜蛋白进行分析，结果显示，MSCs来源的IEVs能够表达和MSCs相似的表面蛋白，即CD29，CD44，CD73，CD166阳性，CD34，CD45阴性。同时，IEVs能够表达细胞外囊泡的普遍性表面蛋白CD9,CD63,CD81和C1q(如图5A-5K)。
(2)IEVs的内容物分析
利用蛋白DIA定量技术完成MSCs，MSCs-Exosomes(对比例1提取的)，MSCs-IEVs(实施例2获得的)的蛋白组学定量分析。结果显示，MSCs-Exosomes和MSCs-IEVs的蛋白内容物表达与母细胞具有较高的重叠性，170种蛋白在IEVs中特异性高表达(图6A)。通过生物信息学分析，筛选IEVs特异性高表达的蛋白，绘制热图(图6B)，进一步结合差异蛋白的GO富集分析结果，明确IEVs能特异性高表达Annexin V，Flotillin-1，Cadherin 11，Integrin alpha5和Syntaxin 4分子(图6C)。与同种MSCs来源的Exosomes相比，IEVs的5种特征性分子的表达量均显著上调，具体为：IEVs中的标志物Annexin V、Flotillin-1、Cadherin 11、Integrin alpha 5和Syntaxin 4相对于Exosomes中相应标记物的表达量分别为1.76倍、2.81倍、2.41倍、3.68倍和4.45倍。最后利用western blot技术再次进行验证，结果与DIA定量分析结果相符(图6D)。
MSCs-Exosomes：指的是来源于MSCs的外泌体。
MSCs-IEVs：指的是来源于MSCs的IEVs。
其中所述的内容物分析中的MSCs和与提取Exosomes和IEVs的MSCs为同一细胞株。
(3)IEVs的表面糖基物质分析
利用偶联FITC荧光物质的半乳糖(Gal)和N-乙酰半乳糖胺(GalNAc)的特异性凝集素对实施例2获得的IEVs进行染色，染色后进行荧光图片观察和流式分析，结果显示61.8％的IEVs表面带有Gal(图6E)，高达93.3％的IEVs表面带有GalNAc(图6F)。
进一步的，通过CellMask膜染料标记IEVs、外泌体(Exos)和MSCs膜成分，并进行偶联FITC荧光物质的Gal和GalNAc的特异性凝集素染色。使用荧光检测仪读数发现，IEVs单位膜表面的GalNAc荧光强度显著高于Exos和MSCs(图6G)。
实施例4 IEVs在体内富集情况
对于每20g小鼠体重，以1×107个MSCs来源的IEVs(实施例2制备)重悬于200μLPBS+20μL肝素钠溶液(0.2％w/v)中。混匀，冰上放置，30min内经尾静脉注射完毕。接着对注射的IEVs的小鼠进行应用分析。
(1)检测步骤或方法：IEVs制备后与NOTA螯合剂结合，加入放射性同位素64CuCl2进行标记，经尾静脉注射入小鼠体内，正电子发射断层扫描(PET)实时监测同位素标记的IEVs在体内的分布，注射48h后分离组织进行放射剂量读取检测。IEVs制备后经PKH26标记膜，经尾静脉注射后72h取材，肝组织行冰冻切片、免疫荧光染色，检测肝细胞与肝巨噬细胞与IEVs的共定位情况。
(2)结果：如图7A-7D和表3，结果显示，所述MSCs来源的IEVs显著富集于肝组织。其中IEVs主要被肝细胞摄取，而外泌体虽也可迁移至肝脏但主要被肝巨噬细胞摄取。其中，干细胞注射后的富集：静脉注射后首先经心脏进入肺循环，大量阻塞于肺部毛细血管中，进入肝组织极少(Lee et al.,Cell Stem Cell,2009)。外泌体富集于肝脏的情况类似于IEVs，但推测由于其表面表达GalNAc较少，故被肝巨噬细胞吞噬而裂解，而非主要被肝细胞摄取而发挥生物学作用。
表3 IEVs在体内富集情况
Figure BDA0002908219880000141
实施例5 IEVs维持肝稳态的研究
对于每20g小鼠体重，以1×107个MSCs来源的IEVs(实施例2制备)重悬于200μLPBS+20μL肝素钠溶液(0.2％w/v)中。混匀，冰上放置，30min内经尾静脉注射完毕。接着对注射的IEVs的小鼠进行应用分析。
1、IEVs维持肝糖、脂代谢功能稳态
(1)检测步骤或方法：取8周龄野生型(WT)和Fas基因突变(Fasmut)致内源IEVs分泌缺陷小鼠经尾静脉注射IEVs，每周1次，注射第3次后7日(总时间为1月)取材，收集肝组织并以100mg组织：900mL PBS研磨，离心提取组织上清；分离收集血清。采用试剂盒分别检测肝糖原、乳酸、甘油三酯和胆固醇含量，以及血糖、乳酸、甘油三酯和胆固醇水平。
(2)结果：如图8，结果显示，与WT小鼠相比，Fasmut小鼠糖代谢指标(糖、乳酸含量)明显降低，而脂代谢指标(甘油三酯、胆固醇)明显升高，肝和血中趋势一致。IEVs注射能够显著恢复Fasmut小鼠的糖脂代谢平衡，但对于正常的WT小鼠无效应，表现出对于稳态的维持作用。
2、IEVs维持肝组织结构稳态
(1)检测步骤或方法：取8周龄WT和Fasmut小鼠经尾静脉注射IEVs，每周1次，注射第3次后7日(总时间为1月)取材。收集肝组织经梯度乙醇脱水、石蜡包埋，行HE染色观察组织形态；经蔗糖处理后行冰冻切片，经F-actin染色标记肝组织轮廓，结合DAPI标记细胞核DNA，计数单核/双核细胞比例；分离肝细胞进行碘化丙啶(PI)染色，流式分析染色质二倍体(2N)、四倍体(4N)、八倍体(8N)比例。
(2)结果：如图9，结果显示，内源IEVs分泌缺陷的Fasmut小鼠出现肝组织结构紊乱，其中双核和4N肝细胞比例明显升高，IEVs注射可显著恢复肝组织结构和倍体稳态。
3、IEVs维持肝实质细胞的细胞器和细胞骨架稳态
(1)检测步骤或方法：经门静脉逆向灌流法分离培养小鼠肝细胞，肝细胞分别来源自8周龄WT和Fasmut小鼠，其中Fasmut小鼠来源的肝细胞接受IEVs体外处理，剂量为1×106个MSCs来源的IEVs处理2×105个肝细胞，处理时间为3日。处理结束时，肝细胞用多聚甲醛固定，经免疫荧光染色高尔基体和微管标志物，选取双核肝细胞进行激光共聚焦显微镜观察。
(2)结果：如图10，结果显示，内源IEVs分泌缺陷的Fasmut小鼠双核肝细胞出现高尔基体离散、核周微管细胞骨架空腔，IEVs处理可帮助高尔基体细胞器进行组装重建，诱导核周微管重塑和其介导的细胞分裂。
实施例6 IEVs促进肝部分切除术(Partial hepatectomy,PHx)后组织再生
对于每20g小鼠体重，以1×107个MSCs来源的IEVs(实施例2制备)重悬于200μLPBS+20μL肝素钠溶液(0.2％w/v)中。混匀，冰上放置，30min内经尾静脉注射完毕。接着对注射的IEVs的小鼠进行应用分析。
1、检测步骤或方法：选取8周龄WT小鼠，IEVs尾静脉输注后24h，异氟烷麻醉状态下打开腹腔，依序行肝中叶和左叶结扎和切除(切除组织重量为全肝的70％)，缝合伤口，72h后取材观察肝脏再生情况。
2、结果：如图11，结果显示，相比于正常肝脏，70％PHx术后仅剩余肝右叶和尾叶，IEVs注射显著促进小鼠肝切除72h后肝组织再生。
实施例7 IEVs预防对乙酰氨基酚(Acetaminophen,APAP)诱导的急性肝衰竭
对于每20g小鼠体重，以1×107个MSCs来源的IEVs(实施例2制备)重悬于200μLPBS+20μL肝素钠溶液(0.2％w/v)中。混匀，冰上放置，30min内经尾静脉注射完毕。接着对注射的IEVs的小鼠进行应用分析。
1、检测步骤或方法：选取8周龄WT小鼠，经腹腔注射剂量为1g/kg的APAP。抗氧化剂NAC注射剂量为1200mg/kg，IEVs预防性输注为APAP注射前24h，IEVs治疗性输注为APAP注射后12h。实验中观察统计致死率，APAP注射后24h取材，肝组织梯度乙醇脱水、石蜡包埋，行HE染色；分离血清，试剂盒检测丙氨酸氨基转移酶(ALT)和天冬氨酸氨基转移酶(AST)浓度。
2、结果：如图12，结果显示，APAP注射诱发致死性急性肝衰竭，抗氧化剂NAC不能挽救，而IEVs预防性注射可维持小鼠生命、IEVs治疗性注射可延长小鼠存活。肝组织切片染色和血清转氨酶浓度分析证实IEVs可显著维持肝组织完整性、减轻肝组织损伤。
实施例8 IEVs治疗非酒精性脂肪性肝病(Non-alcoholic fatty liver disease,NAFLD)
对于每20g小鼠体重，以1×107个MSCs来源的IEVs(实施例2制备)重悬于200μLPBS+20μL肝素钠溶液(0.2％w/v)中。混匀，冰上放置，30min内经尾静脉注射完毕。接着对注射的IEVs的小鼠进行应用分析。
1、检测步骤或方法：选取6周龄WT雄性小鼠喂养高脂饲料(HFD)，为期8周。在喂养第4周时经尾静脉注射IEVs，实验结束后取材，肝组织石蜡切片行过碘酸-希夫(PAS)染色显示肝糖原，冰冻切片行油红染色显示肝脂肪。
2、结果：如图13，结果显示，HFD显著引发肝脏糖原和脂肪堆积，表现出NAFLD的典型症状。IEVs注射可显著缓解NAFLD。
实施例9 IEVs治疗自身免疫性肝炎和肝纤维化
对于每20g小鼠体重，以1×107个MSCs来源的IEVs(实施例2制备)重悬于200μLPBS+20μL肝素钠溶液(0.2％w/v)中。混匀，冰上放置，30min内经尾静脉注射完毕。接着对注射的IEVs的小鼠进行应用分析。
1、检测步骤或方法：取8周龄WT和Caspase 3杂合子(Casp3+/-)小鼠，其中Casp3+/-小鼠接受IEVs注射，每周1次，共3次，最后一次注射后7日取材，肝组织石蜡切片行HE和Masson’s染色。
2、结果：如图14，结果显示，Casp3+/-小鼠出现肝组织炎性淋巴细胞大量浸润、肝血窦周围纤维胶原沉积，IEVs注射可显著缓解肝炎和肝纤维化症状。
实施例10 IEVs预防非酒精性脂肪性肝炎(Non-alcoholic steatohepatitis,NASH)
对于每20g小鼠体重，以1×107个MSCs来源的IEVs(实施例2制备)重悬于200μLPBS+20μL肝素钠溶液(0.2％w/v)中。混匀，冰上放置，30min内经尾静脉注射完毕。接着对注射的IEVs的小鼠进行应用分析。
1、检测步骤或方法：选取6周龄WT雄性小鼠喂养AMLN饲料(高反式脂肪、高果糖、高胆固醇饲料)，为期26周。在喂养第4周时经尾静脉注射IEVs。实验结束前小鼠麻醉下拍照、称重；取材，肝组织梯度乙醇脱水、石蜡包埋，行HE染色；分离血清，试剂盒检测丙氨酸氨基转移酶(ALT)和天冬氨酸氨基转移酶(AST)浓度；分离血清、研磨肝脏离心取上清，试剂盒检测甘油三酯和胆固醇浓度。
2、结果：如图15A-E，结果显示，AMLN喂养小鼠出现体重增高，肝组织炎性淋巴细胞大量浸润、肝实质脂肪化、肝血窦周围纤维胶原沉积，血清肝损伤指标升高，血、肝脂代谢指标紊乱，IEVs注射可显著缓解脂肪肝、肝损伤、肝炎和肝纤维化症状。
试验例1
MSCs和外泌体能够治疗四氯化碳或硫代乙酰胺(Thioacetamide,TAA)诱导的损伤性肝纤维化(Mehrabani et al.,Arch Razi Inst,2019；Sabry et al.,Int J StemCells,2019；Rong et al.,Stem Cell Res Ther,2019)。
(1)检测步骤或方法：取8周龄C57小鼠，腹腔注射100mg/kg的TAA，每周3次，持续8周，造损伤性肝纤维化模型。TAA造模期间每2周经尾静脉输注IEVs，8周后取材，肝组织石蜡切片、HE染色。
(2)结果：如图16所示，TAA注射诱导肝脏损伤、肝血窦周围组织破坏、玻璃样变纤维化形成，IEVs注射未有明显治疗效应。
试验例2
(1)检测步骤或方法：取8周龄舍格伦综合征(SS)模型小鼠，经尾静脉系统注射MSCs和IEVs，注射后4周取材，检测唾液流速，收集唾液腺样本行石蜡切片HE染色和B细胞标志物B220染色。
(2)结果：如图17A-图17C，结果显示，对比小鼠骨髓间充质干细胞及其来源的IEVs治疗干燥综合症(舍格伦综合征)唾液流率的影响，间充质干细胞治疗后唾液流率稍有恢复，IEVs治疗后唾液流率未见改善(*p<0.05相较于WT组，###p<0.001相较于MSCs组)。IEVs注射未改变唾液腺的炎症浸润和B细胞堆积情况。
试验例3
利用体外凝血实验检测实施例2获得的IEVs和对比例1提取Exosomes的体外促凝效果。结果如表4显示，IEVs能显著缩短大部分血浆的体外凝固时间，促凝效果好于Exosomes。
但对于因子II，V，X缺乏的血浆，IEVs无法发挥体外促凝作用，说明IEVs的体外促凝作用更多集中于凝血共同途径的上游。
表4
Figure BDA0002908219880000181
利用血友病A小鼠(凝血因子VIII缺乏)为模型，通过尾静脉注射9×108个IEVs，观察IEVs的体内促凝作用。结果如图18显示，IEVs治疗后能够显著改善血友病小鼠的出血倾向，治疗作用可以持续稳定地维持14天。
实验结果表明，IEVs能够在体外发挥显著的促凝作用。且体内注射后能够显著改善出血倾向，可用于改善血友病A导致的出血倾向。同时检测小鼠血浆中各种凝血因子的水平，发现凝血因子VIII、vWF因子、组织因子(tissue factor，TF)和凝血酶原(prothrombin)均没有发生显著变化(图19A，图19B，图19C，图19D)。
在血友病A小鼠模型中，分别注射正常IEVs，PS阴性IEVs和TF阴性IEVs，7天后进行剪尾实验，结果如图20A和图20B显示，PS和TF的封闭并没有影响IEVs的体内治疗效果，初步说明IEVs治疗血友病小鼠的机制与PS和TF无关。以往文献报道中，细胞外囊泡发挥促凝作用都高度依赖于其表面的PS和TF，而IEVs的体内实验结果与以往研究不一致，这提示在体内环境下，IEVs可能有新的作用机制发挥促凝作用。
对血友病A小鼠模型，分别进行同种MSCs来源的IEVs(实施例2获得的)和Exosomes(对比例1提取的)的注射治疗(9×108个)，结果显示，IEVs能够显著纠正小鼠的出血倾向，而Exosomes没有明显的治疗效果(图21)。
实施例11 IEVs可经皮肤和毛发排出
取4×106的实施例2制备的IEVs用DIR标记，200微升PBS重悬，通过尾静脉系统性注射于裸鼠BALB/c-nu/nu体内，观察1，3，7天后用活体成像仪器检测IEVs在皮肤表面的分布，结果如图22A-22C所示。
图22A显示IEVs可到达皮肤表面，在第3天时数量最多，第7天基本消失，显示IEVs在皮肤表面的动态代谢过程(图22A)。免疫荧光结果显示PKH26-IEV系统性注射C57小鼠后，随着时间推移，逐渐从皮下组织向真皮层和表皮移动。第7天在皮肤表面角质层观测到IEVs大量存在，提示系统性注射的IEVs可以随着皮肤角质层的脱落而排泄出去(图22B)。同时，第7天时在小鼠体表拔下的毛发中发现毛囊中存在PKH26-IEV，说明系统性注射的IEVs还可随着毛发的脱落而代谢出去(图22C)。
本实施例表明IEVs可以通过皮肤和毛发排出，说明注射或增加IEVs在体内的含量具有安全性。

Claims (21)

1.囊泡在制备用于治疗或预防肝脏疾病药物中的应用，其特征在于，所述囊泡是诱导性囊泡，所述诱导性囊泡是在间充质干细胞处于正常存活时通过外加因素诱导凋亡而产生的囊泡；所述疾病不包括硫代乙酰胺诱导的损伤性肝纤维化；所述药物为用于促进肝再生、预防肝衰竭、治疗肝损伤、治疗非酒精性脂肪性肝病、治疗自身免疫性肝炎或自身免疫性肝纤维化或预防非酒精性脂肪性肝炎；所述诱导性囊泡中的Annexin V，Flotillin-1，Cadherin 11，Integrin alpha 5和Syntaxin 4的表达量高于同种间充质干细胞来源的外泌体。
2.如权利要求1所述的应用，其特征在于，所述药物用于维持肝稳态。
3.如权利要求2所述的应用，其特征在于，所述药物用于维持肝的糖代谢或脂代谢的稳态。
4. 如权利要求3所述的应用，其特征在于，所述药物用于维持肝糖原、肝乳酸、血糖、血乳酸、 肝甘油三酯、肝胆固醇、血甘油三酯以及血胆固醇中的一个或多个水平的稳态。
5.如权利要求2所述的应用，其特征在于，所述药物用于维持肝组织结构稳态。
6.如权利要求5所述的应用，其特征在于，所述药物用于维持肝实质细胞的细胞器或细胞骨架的稳态。
7.如权利要求1所述的应用，其特征在于，所述药物用于促进肝部分切除术后的组织再生。
8.如权利要求1所述的应用，其特征在于，所述的肝衰竭包括急性肝衰竭或慢性肝衰竭。
9.如权利要求1所述的应用，其特征在于，所述药物用于预防对乙酰氨基酚诱导的急性肝衰竭。
10.如权利要求1所述的应用，其特征在于，所述诱导的方法包括添加星形孢菌素、紫外线照射、饥饿法、或热应力法。
11.如权利要求1-10任一所述的应用，其特征在于，所述间充质干细胞来源包括骨髓、尿液、口腔、脂肪、胎盘、脐带、骨膜、肌腱。
12.如权利要求1-10任一所述的应用，其特征在于，所述间充质干细胞来源于哺乳动物。
13.如权利要求12所述的应用，其特征在于，所述哺乳动物选自人或鼠。
14.如权利要求1-10任一所述的应用，其特征在于，所述诱导性囊泡的直径为0.03-10μm。
15.如权利要求1-10任一所述的应用，其特征在于，所述诱导性囊泡的直径为0.03-6 μm。
16.如权利要求1-10任一所述的应用，其特征在于，所述诱导性囊泡的直径为0.03-4.5μm。
17.如权利要求1-10任一所述的应用，其特征在于，所述的药物选自注射剂、口服制剂或外用制剂。
18.如权利要求1-10任一所述的应用，其特征在于，所述药物为注射剂。
19.如权利要求1-10任一所述的应用，其特征在于，所述药物选自静脉注射剂、肌肉注射剂、皮下注射剂或鞘内注射剂。
20.如权利要求1-10任一所述的应用，其特征在于，所述药物还包括药学上可接受的药用载体。
21.如权利要求20所述的应用，其特征在于，所述药用载体包括稀释剂、赋形剂、填充剂、粘合剂、崩解剂、表面活性剂和润滑剂中的一种或几种。
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