CN114306238A - 囊泡在制备治疗肺部疾病的药物中的应用 - Google Patents
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Abstract
本发明属于生物医药领域，涉及一种囊泡在制备治疗肺部疾病的药物中的应用。所述囊泡为诱导性囊泡，能够用于治疗/预防多种肺部疾病或病症。急性肺损伤或急性呼吸窘迫综合症的治疗目前缺乏明确的方法及针对性的药物，本发明所述的诱导性囊泡对其具有较好的治疗效果。其中急性肺损伤或急性呼吸窘迫综合症也是新型冠状病毒肺炎重症患者的重要临床表现及致死原因之一，因而所述的诱导性囊泡对于治疗2019冠状病毒肺炎具有极大的应用前景。
Description
技术领域
本发明属于生物医药领域，涉及一种囊泡在制备治疗肺部疾病的药物中的应用。
背景技术
急性肺损伤(Acute lung injury，ALI)是由直接肺部损伤或间接全身性损伤所导致的急性低氧性呼吸功能不全，其特征在于炎症及肺通透性改变导致肺泡水肿，低氧血症，呼吸窘迫，器官衰竭。ALI病程发展迅速，致死率高，约占重症监护患者死亡率的30％；同时，ALI也是新型冠状病毒肺炎重症患者的重要临床表现及致死原因之一。迄今为止，ALI的治疗缺乏明确的方法及针对性的药物。
发明内容
一些实施方案中，本发明提供了一种诱导性囊泡在制备用于治疗/预防肺部疾病或病症药物中的应用。
一些实施方案中，所述肺部疾病包括急性炎症引发的肺部疾病。
一些实施方案中，所述肺部疾病或病症包括哮喘、急性支气管炎、肺气肿、慢性阻塞性肺病、吸烟者的疾病、反应性气道疾病、囊性纤维化、支气管扩张、卡塔格内综合征、肺膨胀不全、肺炎、原发性血小板增多症、军团病、鹦鹉热、纤维化尘病、肺部的超敏反应性疾病、肺的自发性渗透性疾病、呼吸窘迫综合征、肺部肿瘤以及由有机灰尘、刺激性气体和化学物质引起的疾病、急性肺损伤。
一些实施方案中，所述肺部疾病为急性呼吸窘迫综合征、急性肺损伤或肺纤维化。
一些实施方案中，所述疾病或病症是由细菌、病毒或真菌感染引起的感染。
一些实施方案中，所述病毒包括2019冠状病毒。
一些实施方案中，所述细菌包括肺炎链球菌，金黄色葡萄球菌。
一些实施方案中，本发明提供了一种组合物，所述组合物包含诱导性囊泡，所述组合物还包含肺部疾病或病症的预防或治疗剂，所述预防或治疗剂选自抗细菌剂、抗病毒剂、抗真菌剂、抗肿瘤剂、抗组胺剂、蛋白质、酶、激素、非甾体抗炎性物质、细胞因子、类固醇、尼古丁和胰岛素中的一种或多种。
一些实施方案中，所述肺部疾病为急性呼吸窘迫综合征、急性肺损伤或肺纤维化。
一些实施方案中，所述治疗剂为抗病毒剂。一些实施方案中，所述病毒包括2019冠状病毒。
一些实施方案中，本发明提供了一种药品套装，包含：(a)诱导性囊泡；(b)肺部疾病或病症预防或治疗剂；在所述的药品套装中诱导性囊泡和所述肺部疾病或病症预防或治疗剂被分开包装。
一些实施方案中，本发明提供了一种药物组合物在制备用于治疗或预防肺部疾病或病症的药物中的应用，所述药物组合物包含诱导性囊泡。
一些实施方案中，所述诱导性囊泡是在干细胞处于正常存活时通过外加因素诱导凋亡而产生的囊泡。
一些实施方案中，所述诱导性囊泡是诱导干细胞凋亡产生的，所述诱导方法包括添加星形孢菌、紫外线照射、饥饿法、或热应力法。
一些实施方案中，所述干细胞为间充质干细胞。
一些实施方案中，所述诱导性囊泡也可以来源于P62-P8代，但又不限于此。
一些实施方案中，所述间充质干细胞来源包括骨髓、牙髓、尿液、口腔、脂肪、胎盘、脐带、骨膜、肌腱或外周血。
一些实施方案中，所述间充质干细胞为骨髓间充质干细胞。
一些实施方案中，所述间充质干细胞来源于哺乳动物，但又不限于此。
一些实施方案中，所述哺乳动物选自灵长类动物或鼠，但又不限于此。
一些实施方案中，所述灵长类动物为人。
在一些实施方案中，所述诱导性囊泡的制备方法包括步骤：(1)培养间充质干细胞；(2)收集间充质干细胞的培养基上清；(3)从步骤(2)中的培养基上清中分离出囊泡。
在一些实施方案中，所述步骤(1)中的培养间充质干细胞的步骤包括：(4)从组织中分离间充质干细胞；(5)添加培养基培养间充质干细胞；所述间充质干细胞的培养基中接触凋亡诱导剂。
在一些实施方案中，所述步骤(3)中，分离囊泡的方法包括选用超速离心的方法分离所述囊泡。
在一些实施方案中，所述超速离心的方法分离所述囊泡的步骤包括：(a)将收集到的培养上清进行第一次离心，取上清；(b)将步骤(a)中收集到的上清进行第二次离心，取上清；(c)将步骤(b)中收到的上清进行第三次离心，取沉淀；(d)将步骤(c)中收到的沉淀进行第四次离心，取沉淀，即得。
一些实施方案中，所述的药物选自注射剂、雾化吸入剂、喷雾剂、口服制剂或外用制剂。
一些实施方案中，所述药物为注射剂。
在一些实施方式中，将所述诱导性囊泡用于疾病治疗的过程中，可以将所述诱导性囊泡任选地通过选自由静脉内注射、肌肉注射、皮下注射、气管滴注、鞘内注射或输注以及器官内输注所组成的组中的途径进行给药。例如，作为例子，对于静脉注射，可以通过尾静脉注射。器官内输注包括输注至解剖学空间中，例如，作为例子，胆囊、胃肠腔、食道、肺系统(通过吸入)和/或膀胱。
一些实施方案中，所述药物还包括药学上可接受的药用载体。
一些实施方案中，所述药用载体包括稀释剂、赋形剂、填充剂、粘合剂、崩解剂、表面活性剂和润滑剂中的一种或几种。
本发明中所述诱导性囊泡与现有的细胞外囊泡(例如外泌体等)有本质的不同，如与外泌体相比，本发明所述的诱导性囊泡IEVs高表达Syntaxin 4，以及其Annexin V、Flotillin-1、Cadherin 11、Integrin alpha 5的表达量明显高于外泌体(见实施例4)。除了具有的标志物有差别之外，所述诱导性囊泡IEVs在功能上或治疗效果上也呈现出有别于干细胞和其他的细胞外囊泡(如外泌体)的特性。例如IEVs能显著缩短大部分血浆的体外凝固时间，促凝效果好于外泌体(见试验例4)。例如IEVs治疗血友病小鼠的机制与PS和TF无关，而以往文献报道中，细胞外囊泡发挥促凝作用都高度依赖于其表面的PS和TF(见试验例4)。
另外，发明人在一些研究中发现，本发明所述的诱导性囊泡与其来源的母细胞之间的治疗效果也不具有互推性。例如间充质干细胞可以治疗非酒精性脂肪性肝炎和损伤性肝纤维化，然而，诱导性囊泡对这些疾病并不能实现治疗效果(见试验例1、2)。例如MSCs能够治疗干燥综合征，而本发明所述的诱导性囊泡对干燥综合征无治疗效果(见试验例3)。也就是说，某种干细胞能够治疗某种疾病，并不能够必然地推断出其产生的诱导性囊泡(IEVs)也一定能够这种疾病。
有研究表明肺内皮组细胞来源的外泌体可以通过修复肺上皮细胞间的连接来缓解肺损伤(Yue,Zhou,Pengfei,et al.Exosomes from endothelial progenitor cellsimprove outcomes of the lipopolysaccharide-induced acute lung injury.[J].Critical Care,2019.)；间充质干细胞来源的外泌体可以通过调控巨噬细胞极化来减少促炎因子的释放及抗炎因子的增加(Li,JW,Wei,L,Han,Z,Chen,Z.Mesenchymal stromalcells-derived exosomes alleviate ischemia/reperfusion injury in mouse lung bytransporting anti-apoptotic mir-21-5p.Eur J Pharmacol.2019；852:68–76.)。而发明人在一些实验研究中发现，LPS刺激后，小鼠肺部中性粒细胞数量显著增多，气管滴注本发明获得的诱导性囊泡治疗后中性粒细胞数量显著降低。本发明的诱导性细胞外囊泡可以直接作用于肺损伤过程中大量浸润的中性粒细胞，减少其趋化并促进中性粒细胞的凋亡。
附图说明
图1A-1E为分离的BMMSCs的表面标志物的流式检测结果。
图2为各组小鼠肺组织HE染色切片图。A为正常对照组(Control组)HE切片；B为模型组(LPS组)HE切片；C为尾静脉注射治疗组(LPS+IEVs-S组)HE切片；D为IEVs经气管滴注治疗组(LPS+IEVs-L组)HE切片；E为hBMMSC尾静脉治疗组(LPS+hBMMSC组)5×HE切片；F为hBMMSC尾静脉治疗组(LPS+hBMMSC组)10×HE切片。
图3为小鼠肺湿/干重比值(n＝4－5个/组，P<0.05有统计学差异，**：P<0.01；***:P<0.001)。
图4为小鼠BALF总蛋白含量测定(n＝4－5个/组，P<0.05有统计学差异，**：P<0.01；***:P<0.001；****:P<0.0001)。
图5为小鼠肺组织中性粒细胞流式检测结果。
图6为小鼠肺组织中性粒细胞免疫组化及免疫荧光检测结果。
图7为IEVs NTA检测的粒径图。
图8为IEVs形态透射电镜检测图。
图9A-图9D为IEVs的内容物分析：图9A为DIA定量技术对MSCs、MSCs-Exosomes、MSCs-IEVs蛋白组学定量分析结果；图9B为筛选IEVs特异性高表达的蛋白绘制的热图；图9C为差异蛋白的GO富集分析IEVs表达Annexin V，Flotillin-1，Cadherin 11，Integrinalpha 5和Syntaxin 4分子的结果；图9D为western blot验证MSCs、MSCs-Exosomes、MSCs-IEVs表达Annexin V，Flotillin-1，Cadherin 11，Integrin alpha 5和Syntaxin 4的结果。
图10为MSCs来源IEVs治疗蛋氨酸-胆碱饲料喂养的脂肪性肝病数据。A.肝病理组织学切片；B.脂肪性肝病评分。
图11为MSCs来源IEVs治疗硫代乙酸铵诱导的损伤性肝纤维化数据。A.肝病理组织学切片；B.脂肪性肝病评分。
图12为IEVs治疗干燥综合症：A.IEVs治疗干燥综合症(舍格伦综合征)唾液流率的影响；B.IEVs治疗干燥综合症下颌下腺HE染色结果；C.治疗干燥综合症对B细胞的影响。
图13为IEVs在血友病A小鼠的体内促凝作用。
图14A-图14D为给血友病A小鼠注射IEVs之后各种凝血因子水平的变化情况：图14A为凝血因子VIII的变化情况；图14B为vWF因子的变化情况；图14C为组织因子(TF)的变化情况；图14D为凝血酶原的变化情况。
图15A-图15B为血友病A小鼠模型中，IEVs分别进行PS和TF的封闭之后对IEVs的体内治疗效果的影响情况。
图16为同种MSCs来源的IEVs和Exosomes对血友病A小鼠治疗效果对比。
具体实施方式
以下通过具体的实施例进一步说明本发明的技术方案，具体实施例不代表对本发明保护范围的限制。其他人根据本发明理念所做出的一些非本质的修改和调整仍属于本发明的保护范围。
本发明实施例中的IEVs为诱导性囊泡的简称，可称为诱导性囊泡，也可称为诱导性细胞外囊泡(Induced extracellular vesicles,IEVs)。诱导性细胞外囊泡是指的是一种在前体细胞(例如干细胞)正常存活时，被干预或诱导，使其凋亡产生的一类亚细胞产物。通常这一类亚细胞产物，具有膜结构，表达凋亡性标志物，部分包含有遗传物质DNA。发明人发现诱导性细胞外囊泡是区分于细胞和常规细胞外囊泡(如外泌体等)的一类物质。在一些实施方式中，所述的正常存活时的细胞，例如是非凋亡的细胞、非衰老的细胞、非老化而增殖停滞的细胞、非冻存后复苏的细胞、非发生恶变而异常增殖的细胞或非出现损伤的细胞等。在一些实施方式中，所述的正常存活时的细胞取自细胞培养过程中，细胞接触融合80-100％的时候的细胞。一些实施方式中，所述的正常存活时的细胞取自对数期细胞。一些实施方式中，所述的正常存活时的细胞取自人或鼠组织来源的原代培养及其传代培养细胞。一些实施方式中，所述的正常存活时的细胞取自已确立的细胞系或细胞株。在一些实施方式中，所述的前体细胞取自早期的细胞。
本发明中的STS为星形孢菌素。
在一些实施例中，所述诱导性囊泡也可以来源于P2-P8代的hBMMSC。
文中“/”该符号指的是可以选择其一，例如“治疗或/预防”指的是可以为治疗，可以为预防。
在一些实施方案中，在一些实施方案中，分离所述诱导性囊泡的方法包括选用超速离心的方法分离所述囊泡。所述超速离心包括四次离心。
在一些实施方案中，所述第一次离心为500-1500g离心5-30分钟；或者所述第一次离心为500-1000g离心5-20分钟；或者所述第一次离心为500-900g离心5-15分钟。在一些实施方案中，所述第二次离心为1000-3000g离心5-30分钟；或者所述第二次离心为1500-2500g离心5-20分钟；或者所述第二次离心为1500-2200g离心5-15分钟。在一些实施方案中，在一些实施方案中，所述第二次离心为1700-2200g离心5-18分钟。在一些实施方案中，所述第二次离心为1990-2100g离心8-15分钟。在一些实施方案中，将所述第二次离心得到的上清进行第三次离心，所述第三次离心为10000-30000g离心15-60分钟；在一些实施方案中，所述第三次离心为15500-19000g离心20-40分钟。在一些实施方案中，所述第三次离心为15500-17000g离心20-40分钟。在一些实施方案中，所述第四次离心为10000-18000g离心15-60分钟。在一些实施方案中，所述第四次离心为10000-17500g离心15-60分钟。在一些实施方案中，所述第四次离心为10000-17000g离心15-60分钟。在一些实施方案中，所述第四次离心为11000-17000g离心15-60分钟。在一些实施方案中，所述第四次离心为12000-17000g离心15-60分钟。在一些实施方案中，所述第四次离心为10000-18000g离心20-60分钟。在一些实施方案中，所述第四次离心为10000-18000g离心20-50分钟。
在一些实施例中，所述诱导性囊泡的直径可以为0.03-6μM；可以是0.03-4.5μM；还可以是0.03-1μM；0.04-1μM，还可以是0.05-1μM，还可以是0.1-1μM，还可以是0.15-1μM，还可以是0.15-0.45μM，还可以是0.15-0.3μM，还可以是0.2-0.3μM。
在一些实施方式中，所述诱导性囊泡具有标志物Syntaxin 4。在一些实施例中，所述诱导性囊泡高表达标志物Syntaxin 4。在一些实施例中，所述诱导性囊泡对标志物Syntaxin 4的表达高于MSCs或外泌体。在一些实施例中，所述标志物Syntaxin 4的表达量为来源于间充质干细胞的外泌体中Syntaxin 4的表达量的3-6倍。在一些实施例中，所述标志物Syntaxin 4的表达量为来源于间充质干细胞的外泌体中Syntaxin 4的表达量的3.5-5倍。在一些实施例中，所述标志物Syntaxin 4的表达量为来源于间充质干细胞的外泌体中Syntaxin 4的表达量的4.45倍。在一些实施例中，所述标志物还包括Annexin V、Flotillin-1、Cadherin 11和Integrin alpha 5中的一种或多种。在一些实施例中，所述标志物为Syntaxin 4、Annexin V、Flotillin-1、Cadherin 11和Integrin alpha 5的组合。在一些实施例中，所述诱导性囊泡高表达标志物Annexin V、Flotillin-1、Cadherin 11、Integrin alpha 5。在一些实施例中，所述诱导性囊泡对标志物Annexin V、Flotillin-1、Cadherin 11、Integrin alpha 5的表达量高于MSCs或外泌体。在一些实施例中，所述诱导性囊泡中的标志物Annexin V、Flotillin-1、Cadherin 11、Integrin alpha 5的表达量相对于来源于间充质干细胞的外泌体中标记物的表达量分别为1-2倍、2-3倍、1-3倍和3-4倍。一些实施例中，所述诱导性囊泡中的标志物Annexin V、Flotillin-1、Cadherin 11、Integrin alpha 5的表达量分别为1.5-2倍、2.5-3倍、1.5-2.5倍和3.5-4倍。在一些实施例中，所述囊泡中的标志物Annexin V、Flotillin-1、Cadherin 11、Integrin alpha 5的表达量分别为1.76倍、2.81倍、2.41倍、3.68倍。
实施例1 MSCs的分离培养
依据动物伦理委员会的指导用过量CO2处死小鼠，在无菌条件下，取下胫骨和股骨，剥净附着在其上的肌肉和结缔组织，进一步分离干骺端、暴露骨髓腔，用10mL无菌注射器抽取含体积分数为10％胎牛血清的PBS反复冲洗骨髓腔，70μm孔径细胞滤网过滤后，500g离心5min，去除上清液后收集底部的细胞沉淀，PBS重悬，再次500g离心5min，收集最终的细胞沉淀。而后对细胞进行流式分选，以CD34-和CD90+为分选标准，分选出BMMSCs。最后以Dex(-)培养液重悬细胞并接种于10cm直径细胞培养皿，37℃、5％CO2培养。24h后，吸除上清液未贴壁细胞，PBS清洗后，加入Dex(-)培养液继续培养。1周后加入等量Dex(+)培养液，再1周后可见密集的原代BMMSCs集落。采用胰蛋白酶37℃孵育消化BMMSCs并传代扩增，之后每3日换Dex(+)培养液，长满后传代。其中，Dex(-)培养液成分如表1所示，Dex(+)培养液成分如表2所示：
表1 Dex(-)培养液成分表
表2 Dex(+)培养液配方表
采用流式细胞术分析表面标志物的方法来评估分离的BMMSCs的纯度。对于表面标志鉴定，胰蛋白酶消化收集P2代BMMSCs后，PBS清洗1次，以5×105/mL密度重悬细胞于含3％FBS的PBS中，加入1μL PE荧光偶联的CD29、CD44、CD90、CD45和CD34抗体，空白组不加。4℃避光孵育30min，PBS清洗2遍后，上机检测。流式检测结果如图1A-1E所示，可知，分离的细胞为BMMSCs(骨髓间充质干细胞)。
实施例2诱导性囊泡(IEVs)的获得
采用实施例1培养的汇合率90-100％的P5代的hBMMSC，PBS洗涤，加入含有星形孢菌素500nM(STS)的无血清培养基(α-MEM培养基)诱导凋亡，9小时后收集培养液，800g离心10分钟，收集上清，2000g离心10分钟，收集上清，16000g离心30分钟，弃上清，1mL的PBS重悬，16000g离心30分钟，再次弃上清，得IEVs。
实施例3 IEVs治疗急性肺损伤
1、ALI小鼠模型构建及治疗分组
(1)实验动物：C57BL/6小鼠，性别不限，8-12周龄，体重约18g-22g，SPF级。
(2)疾病模型构建及治疗分组：取8-12周龄C57BL/6小鼠，随机分为5组，每组3-5只，分别是正常对照组(Control组)，模型组(LPS组)，IEVs(实施例2制备的IEVs)经气管滴注治疗组(LPS+IEVs-L组)、尾静脉注射治疗组(LPS+IEVs-S组)、hBMMSC尾静脉治疗组(LPS+hBMMSC组)。术前6小时禁食禁水，麻醉使用4％水合氯醛10mL/kg。模型组及治疗组先气管滴注给予30μL LPS(5mg/kg)，2小时后，三个治疗组小鼠分别经气管滴注30μL的hBMMSC-IEVs(约3×108个/只)，尾静脉注射200μL的hBMMSC-IEVs(约3×108个/只)、尾静脉注射200μL的hBMMSC细胞(约1×106个/只)，造模24小时后处死小鼠。
注：本发明中，按照实施例2获得的IEVs，一个1个BMMSCs约产生300个IEVs。
其中，hBMMSC细胞PBS悬液的制备方法如下：采用汇合率90-100％的P5-P8的hBMMSC，PBS洗涤，胰蛋白酶消化，1500rpm，离心5分钟，收集细胞沉淀，PBS洗涤，再次离心，收集细胞沉淀，PBS重悬，hBMMSC细胞悬液在使用前4℃保存。
2、IEVs治疗急性肺损伤的有效性评价
(1)肺组织的HE染色
HE染色切片可见Control组肺组织切片肺泡组织结构完整，未见明显充血及炎性细胞浸润(图2A)；LPS组可见肺泡组织结构破坏严重，充血水肿明显，大量炎性细胞浸润，肺泡间隔明显增厚且结构紊乱(图2B)；LPS+IEVs-L及LPS+IEVs-S组，小鼠肺组织的充血及炎症浸润明显减轻，肺组织渗出减少，肺泡间隔增厚和结构紊乱也有明显改善，同时两个IEVs治疗组肺中央区及周围区组织病理变化均明显改善，疗效相似(图2C，2D),LPS+hBMMSC组小鼠肺组织的炎症浸润减轻，肺组织渗出减少，肺泡间隔增厚和结构紊乱也稍有改善，肺中央区组织病理变化改善，但边缘肺组织炎症改善不明显(图2E，F)。
(2)肺的湿/干重比
称量肺湿重，烤箱烤干到恒重称量得到肺干重。根据公式计算肺部W/D值。如图3所示，结果表明，LPS刺激显著增加了小鼠肺湿/干重比值，而经气管滴注或尾静脉输注的IEVs治疗显著降低了这一比值，各个治疗组之间未见显著性差异。
(3)肺泡灌洗液(BALF)中总蛋白浓度的测定
采用BCA法，测定BALF离心所得上清中的总蛋白浓度，酶标仪测定其在570nm的OD值后换算成蛋白浓度。
ARDS伴随着蛋白质等大分子物质渗出，BALF中总蛋白浓度是反映ARDS中肺损伤的一项重要指标，结果如图4所示：LPS刺激显著增加了BALF总蛋白浓度，而两种IEVs治疗方式均显著降低了BALF总蛋白浓度。
3、IEVs治疗急性肺损伤的机制研究
(1)肺组织中性粒细胞流式检测
小鼠处死后，摘取肺组织，用酶消化法收集小鼠肺组织细胞(所述细胞被分散为单个细胞)，100μL PBS重悬细胞(1×105个)，使用CD11b、ly6G抗体冰上染色15分钟，加400μLPBS，1500rmp离心弃上清，100ul PBS重悬，流式上机检测。
如图5，实验结果显示，LPS刺激后，小鼠肺部中性粒细胞数量(CD11b+ly6G+双阳细胞)显著增多，气管滴注IEVs治疗后中性粒细胞数量显著降低。
(2)肺组织中性粒细胞免疫组织化学及免疫荧光染色
取小鼠肺组织制备石蜡切片和冰冻切片，用ly6G进行免疫组化及免疫荧光染色。如图6，实验结果显示，LPS刺激后，小鼠肺部中性粒细胞数量(ly6G阳性细胞)显著增多，气管滴注IEVs治疗后中性粒细胞数量显著降低。
以上结果显示，IEVs可能是通过调控中性粒细胞从而发挥治疗ALI作用。
实施例4诱导性囊泡(IEVs)的分析
1、NTA检测
PBS重悬实施例2的IEVs沉淀，稀释后用zetaview仪器检测IEVs浓度和粒径。
检测结果如图7所示，IEVs颗粒直径平均为(144.3nm)。
2、电镜检测
用戊二醛磷酸缓冲液固定实施例2的IEVs沉淀，常规脱水、浸透、包埋、染色，制成超薄切片，在电镜下观察并记录IEVs形态和结构。
透射电镜观察，如图8所示，大部分囊泡的直径都在200nm及200nm以下以下。
3、IEVs的内容物分析
利用蛋白DIA定量技术完成MSCs，MSCs-Exosomes，MSCs-IEVs的蛋白组学定量分析。结果显示，MSCs-Exosomes和MSCs-IEVs的蛋白内容物表达与母细胞具有较高的重叠性，170种蛋白在IEVs中特异性高表达(图9A)。通过生物信息学分析，筛选IEVs特异性高表达的蛋白，绘制热图(图9B)，进一步结合差异蛋白的GO富集分析结果，明确IEVs能特异性高表达Annexin V，Flotillin-1，Cadherin 11，Integrin alpha 5和Syntaxin 4分子(图9C)。与同种MSCs来源的Exosomes相比，IEVs的5种特征性分子的表达量均显著上调，具体为：IEVs中的标志物Annexin V、Flotillin-1、Cadherin 11、Integrin alpha 5和Syntaxin 4相对于Exosomes中相应标记物的表达量分别为1.76倍、2.81倍、2.41倍、3.68倍和4.45倍。最后利用western blot技术再次进行验证，结果与DIA定量分析结果相符(图9D)。
MSCs-Exosomes：指的是来源于MSCs的外泌体。
MSCs-IEVs：指的是来源于MSCs的IEVs，具体获得方法：除了细胞代数为P2，其余步骤同实施例2。
其中，所述的内容物分析中MSCs和与提取Exosomes和IEVs的MSCs为同一细胞株。
MSCs-Exosomes的分离与提取方法：将实施例1中培养至第2代的BMMSCs，用实施例1中的培养基(Dex(+)培养液)继续培养至细胞汇合80％-90％时，用PBS冲洗2遍，加入无血清培养基(α-MEM培养基)，37℃孵育48h，收集细胞上清液，用于分离和提取Exosomes。提取步骤包括：800g离心10分钟—收集上清液—2000g离心10分钟—收集上清液—16000g离心30分钟—收集上清液—120000g离心90分钟—移除上清液，无菌PBS重悬沉淀—120000g再次离心90分钟，移除上清，收集底部的Exosomes，无菌PBS重悬。
试验例1
MSCs能够治疗非酒精性脂肪性肝炎(Non-alcoholic steatohepatitis,NASH)(Ezquer et al.,J Hepatol,2011；Winkler et al.,Methods Mol Biol,2014)。
(1)检测步骤或方法：取8周龄雄性C57小鼠，饲喂正常饲料(Normal chow diet,NCD)或蛋氨酸-胆碱缺乏饲料(Methionine and choline deficient diet,MCD)，MCD喂养期间每2周经尾静脉输注IEVs，喂养8周后取材，肝组织石蜡切片、HE染色。
(2)结果：如图10所示，IEVs治疗MCD诱导的非酒精性脂肪性肝炎(Non-alcoholicsteatohepatitis,NASH)无效果。肝脏在MCD喂养后出现脂肪化、炎症，IEVs注射未能缓解。
试验例2
MSCs和外泌体能够治疗四氯化碳或硫代乙酰胺(Thioacetamide,TAA)诱导的损伤性肝纤维化(Mehrabani et al.,Arch Razi Inst,2019；Sabry et al.,Int J StemCells,2019；Rong et al.,Stem Cell Res Ther,2019)。
(1)检测步骤或方法：取8周龄C57小鼠，腹腔注射100mg/kg的TAA，每周3次，持续8周，造损伤性肝纤维化模型。TAA造模期间每2周经尾静脉输注IEVs，8周后取材，肝组织石蜡切片、HE染色。
(2)结果：如图11所示，TAA注射诱导肝脏损伤、肝血窦周围组织破坏、玻璃样变纤维化形成，IEVs注射未有明显治疗效应。
试验例3
(1)检测步骤或方法：取8周龄舍格伦综合征(SS)模型小鼠，经尾静脉系统注射MSCs和IEVs，注射后4周取材，检测唾液流速，收集唾液腺样本行石蜡切片HE染色和B细胞标志物B220染色。
(2)结果：如图12A-图12C，结果显示，对比小鼠骨髓间充质干细胞及其来源的IEVs治疗干燥综合症(舍格伦综合征)唾液流率的影响，间充质干细胞治疗后唾液流率稍有恢复，IEVs治疗后唾液流率未见改善(*p<0.05相较于WT组，###p<0.001相较于MSCs组)。IEVs注射未改变唾液腺的炎症浸润和B细胞堆积情况。
试验例4
利用体外凝血实验检测实施例2获得的IEVs和实施例4提取Exosomes的体外促凝效果。结果如表3显示，IEVs能显著缩短大部分血浆的体外凝固时间，促凝效果好于Exosomes。
但对于因子II，V，X缺乏的血浆，IEVs无法发挥体外促凝作用，说明IEVs的体外促凝作用更多集中于凝血共同途径的上游。
表3
利用血友病A小鼠(凝血因子VIII缺乏)为模型，通过尾静脉注射9×108个IEVs，观察IEVs的体内促凝作用。结果如图13显示，IEVs治疗后能够显著改善血友病小鼠的出血倾向，治疗作用可以持续稳定地维持14天。
实验结果表明，IEVs能够在体外发挥显著的促凝作用。且体内注射后能够显著改善出血倾向，可用于改善血友病A导致的出血倾向。同时检测小鼠血浆中各种凝血因子的水平，发现凝血因子VIII、vWF因子、组织因子(tissue factor，TF)和凝血酶原(prothrombin)均没有发生显著变化(图14A，图14B，图14C，图14D)。
在血友病A小鼠模型中，分别注射正常IEVs，PS阴性IEVs和TF阴性IEVs，7天后进行剪尾实验，结果如图15A和图15B显示，PS和TF的封闭并没有影响IEVs的体内治疗效果，初步说明IEVs治疗血友病小鼠的机制与PS和TF无关。以往文献报道中，细胞外囊泡发挥促凝作用都高度依赖于其表面的PS和TF，而IEVs的体内实验结果与以往研究不一致，这提示在体内环境下，IEVs可能有新的作用机制发挥促凝作用。
对血友病A小鼠模型，分别进行同种MSCs来源的IEVs(实施例2获得的)和Exosomes(实施例4提取的)的注射治疗(9×108个)，结果显示，IEVs能够显著纠正小鼠的出血倾向，而Exosomes没有明显的治疗效果(图16)。
Claims (10)
1.诱导性囊泡在制备用于治疗/预防肺部疾病或病症药物中的应用。
2.如权利要求1所述的应用，其特征在于，所述肺部疾病或病症包括急性炎症引发的肺部疾病；
优选地，所述肺部疾病或病症为急性呼吸窘迫综合征、急性肺损伤或肺纤维化。
3.如权利要求1所述的应用，其特征在于，所述疾病或病症是由细菌、病毒或真菌感染引起的肺部疾病或病症；
优选地，所述病毒包括2019冠状病毒；
优选地，所述细菌包括肺炎链球菌，金黄色葡萄球菌。
4.一种组合物，其特征在于，所述组合物包含诱导性囊泡，所述组合物还包含肺部疾病或病症的预防或治疗剂，所述预防或治疗剂选自抗细菌剂、抗病毒剂、抗真菌剂、抗肿瘤剂、抗组胺剂、蛋白质、酶、激素、非甾体抗炎性物质、细胞因子、类固醇、尼古丁和胰岛素中的一种或多种；
优选地，所述肺部疾病为急性呼吸窘迫综合征、急性肺损伤或肺纤维化；
优选地，所述治疗剂为抗病毒剂；
更为优选地，所述病毒包括2019冠状病毒。
5.一种药品套装，其特征在于，包含：(a)诱导性囊泡；(b)肺部疾病或病症预防或治疗剂；在所述的药品套装中诱导性囊泡和所述肺部疾病或病症预防或治疗剂被分开包装；
优选地，所述预防或治疗剂选自抗细菌剂、抗病毒剂、抗真菌剂、抗肿瘤剂、抗组胺剂、蛋白质、酶、激素、非甾体抗炎性物质、细胞因子、类固醇、尼古丁和胰岛素中的一种或多种；
优选地，所述肺部疾病为急性呼吸窘迫综合征、急性肺损伤或肺纤维化。
优选地，所述治疗剂为抗病毒剂；
更为优选地，所述病毒包括2019冠状病毒。
6.一种药物组合物在制备用于治疗或预防肺部疾病或病症的药物中的应用，所述药物组合物包含诱导性囊泡；
优选地，所述组合物还包含治疗剂，所述治疗剂选自抗细菌剂、抗病毒剂、抗真菌剂、抗肿瘤剂、抗组胺剂、蛋白质、酶、激素、非甾体抗炎性物质、细胞因子、类固醇、尼古丁和胰岛素中的一种或多种；
优选地，所述肺部疾病为急性呼吸窘迫综合征、急性肺损伤或肺纤维化。
优选地，所述治疗剂为抗病毒剂；
更为优选地，所述病毒包括2019冠状病毒。
7.如权利要求1-3任一所述的应用或权利要求4所述的药物组合物或权利要求5所述的药品套装或权利要求6所述的应用，其特征在于，所述诱导性囊泡是在干细胞处于正常存活时通过外加因素诱导凋亡而产生的囊泡；
优选地，所述诱导性囊泡是诱导干细胞凋亡产生的，所述诱导方法包括添加星形孢菌、紫外线照射、饥饿法、或热应力法；
更为优选地，所述干细胞为间充质干细胞；
更为优选地，所述间充质干细胞来源包括骨髓、牙髓、尿液、口腔、脂肪、胎盘、脐带、骨膜、肌腱或外周血；
优选地，所述间充质干细胞为骨髓间充质干细胞；
优选地，所述间充质干细胞来源于哺乳动物；
优选地，所述哺乳动物选自灵长类动物或鼠；
优选地，所述灵长类动物为人。
8.如权利要求1-3任一所述的应用或权利要求4所述的药物组合物或权利要求5所述的药品套装或权利要求6所述的应用，其特征在于，所述诱导性囊泡的直径为0.03-10μM；
优选地，所述诱导性囊泡的直径为0.03-6μM；
更为优选地，所述诱导性囊泡的直径为0.03-4.5μM；
更为优选地，所述诱导性囊泡的直径为0.03-1μM。
9.如权利要求1-3任一所述的应用或权利要求4所述的药物组合物或权利要求5所述的药品套装或权利要求6所述的应用，其特征在于，所述的药物选自注射剂、雾化吸入剂、喷雾剂、口服制剂或外用制剂。
10.如权利要求1-3任一所述的应用或权利要求4所述的药物组合物或权利要求5所述的药品套装或权利要求6所述的应用，其特征在于，所述药物为注射剂；
优选地，所述药物选自静脉注射剂、肌肉注射剂、皮下注射剂或气管滴注或鞘内注射剂；
或优选地，所述药物还包括药学上可接受的药用载体；
更为优选地，所述药用载体包括稀释剂、赋形剂、填充剂、粘合剂、崩解剂、表面活性剂和润滑剂中的一种或几种。
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Cited By (2)
| Publication number | Priority date | Publication date | Assignee | Title |
|---|---|---|---|---|
| WO2022257849A1 (zh) * | 2021-06-10 | 2022-12-15 | 中山大学 | 一种工程化囊泡的制备方法及其应用 |
| WO2023123216A1 (zh) * | 2021-12-30 | 2023-07-06 | 中山大学 | 囊泡在制备治疗肺部疾病的药物中的应用 |
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Legal Events
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| PB01 | Publication | ||
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| SE01 | Entry into force of request for substantive examination | ||
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