CN114344348B - 骨碎补细胞外囊泡在制备治疗骨科疾病的药物中的应用 - Google Patents

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Abstract

本发明涉及骨碎补细胞外囊泡在制备治疗骨科疾病的药物中的应用。本发明创造性地从中药骨碎补中提取细胞外囊泡，并对其功能进行研究，发现其能够促进骨髓间充质干细胞增殖分化，并具有骨靶向性，而且含有多种与骨碎补相同的功效成分，证明了其具有治疗骨科疾病的潜力，可应用于制备治疗骨科疾病的药物。

Description

骨碎补细胞外囊泡在制备治疗骨科疾病的药物中的应用
技术领域
本发明属于生物医药技术领域，涉及骨碎补细胞外囊泡在制备治疗骨科疾病的药物中的应用。
背景技术
骨碎补，属于槲蕨植物的根茎部分，全年均可采挖，具有止痛、强骨的功效，是临床上治疗骨质疏松(OP)的常用中药。骨碎补内主要含有黄酮类化合物，现代药理研究表明其具有抗OP、抗炎和修复骨损伤等作用。多个研究发现骨碎补可通过调节骨代谢相关细胞来促进骨形成或抑制骨吸收，从而达到抗OP的作用。例如，骨碎补具有促进BMSCs(骨髓间充质干细胞)增殖及成骨分化的作用，并且骨碎补具有中药类雌激素的作用，可通过ER(雌激素受体)途径影响骨代谢相关细胞的功能来抗OP。目前骨碎补主要以整体入药或者单体进行治疗，存在口服生物利用度低、体内无选择性分布等缺点，在临床上限制了它的发挥，所以寻找一种更有效发挥中药骨碎补作用的方式有利于中药现代化系统的建立。
外泌体是由许多不同类型细胞分泌的具有双分子磷脂结构的细胞外囊泡，广泛存在于各种体液中，内含多种生物成分包括mRNA、miRNA、蛋白质和脂质等，可参与细胞间的物质交换从而影响细胞的功能。近年来，随着分离技术及外泌体的快速发展，已有不少人能从植物中分离出粒径在30-500nm左右的EVs，这些植物源性EVs具有靶向性及生物活性，可以进行不同物种间的信息传递，从而调节机体的生物功能。例如，人参源性纳米样颗粒可靶向肝脏和脾脏，通过促进肿瘤相关巨噬细胞表型M2向M1极化，从而促进黑素瘤细胞的凋亡。然而目前还未见文献报道骨碎补源的细胞外囊泡，因此，从中药骨碎补中提取细胞外囊泡是否可行，提取出的骨碎补细胞外囊泡(DREVs)是否具有生物活性或中药骨碎补的相关功能还未可知。
因此，如何提供一种从中药骨碎补中提取细胞外囊泡的方法，并深入研究提取到的骨碎补细胞外囊泡的功能，以发掘其在治疗骨科疾病方面的应用潜力，成为了本领域亟待解决的问题。
发明内容
针对现有技术的不足，本发明的目的在于提供骨碎补细胞外囊泡在制备治疗骨科疾病的药物中的应用。
为达到此发明目的，本发明采用以下技术方案：
第一方面，本发明提供骨碎补细胞外囊泡在制备治疗骨科疾病的药物中的应用。
本发明创造性地从中药骨碎补中提取细胞外囊泡，并对其功能进行研究，发现其能够促进骨髓间充质干细胞增殖分化，具有体内骨靶向性，且含有多种与骨碎补相同的功效成分，证明了其具有治疗骨科疾病的潜力，可应用于制备治疗骨科疾病的药物。
优选地，所述所述骨碎补细胞外囊泡中含有柚皮苷、圣草酚、肉桂酸、柚皮素、樱桃甙、咖啡酸、芥子酸、阿福豆苷、开环异落叶松树脂酚、芸香柚皮苷和山柰酚。
优选地，所述骨碎补细胞外囊泡是由包括如下步骤的提取方法提取得到的：
(1)将骨碎补榨汁，过滤，收集滤液，离心除去杂质，收集上清液；
(2)将上清液以100000-200000g的速度离心60-120min，收集沉淀，即得所述骨碎补细胞外囊泡。
上述100000-200000g中的具体数值例如100000g、110000g、120000g、130000g、140000g、150000g、160000g、170000g、180000g、190000g、200000g等。
上述60-120min中的具体数值例如60min、65min、70min、75min、80min、85min、90min、95min、100min、105min、110min、115min、120min等。
优选地，步骤(1)所述离心包括至少三次离心。
优选地，步骤(1)所述离心包括三次离心，第一次离心的速度为100-500g，第二次离心的速度为1000-3000g，第三次离心的速度为8000-20000g。
上述100-500g中的具体数值例如100g、150g、200g、250g、300g、350g、400g、450g、500g等。
上述1000-3000g中的具体数值例如1000g、1200g、1500g、1700g、2000g、2200g、2500g、2700g、3000g等。
上述8000-12000g中的具体数值例如8000g、8500g、9000g、9500g、10000g、10500g、11000g、11500g、12000g等。
优选地，步骤(1)所述离心的时间各自独立地为5-30min，例如5min、10min、15min、20min、25min、30min等。
优选地，所述骨科疾病的类型包括骨质疏松、骨折或骨性关节炎中的任意一种。
优选地，所述药物的剂型包括片剂、冲剂、胶囊剂、溶液剂、气雾剂、喷雾剂、软膏剂或膜剂中的任意一种。
优选地，所述药物还包括药学上可接受的辅料。
优选地，所述辅料包括稀释剂、调味剂、粘合剂或填充剂中的任意一种或至少两种的组合，所述至少两种的组合例如稀释剂和调味剂的组合、粘合剂和填充剂的组合、调味剂和粘合剂的组合等，其他任意的组合方式均可。
第二方面，本发明提供骨碎补细胞外囊泡在制备骨靶向制剂中的应用。
本发明创造性地发现骨碎补细胞外囊泡在动物体内具有骨靶向性，这一发现可进一步应用于骨靶向制剂的制备中，以进行骨科疾病发病机制的研究和相关病症的治疗。
优选地，所述骨靶向制剂还包括其他治疗骨科疾病的药物，所述其他治疗骨科疾病的药物负载于骨碎补细胞外囊泡中。
所述其他治疗骨科疾病的药物例如钙制剂、雌激素类药物、降钙素、二磷酸盐类药物、特立帕肽等。
第三方面，本发明提供骨碎补细胞外囊泡在制备骨髓间充质干细胞增殖促进剂中的应用。
第四方面，本发明提供骨碎补细胞外囊泡在制备骨髓间充质干细胞成骨分化促进剂中的应用。
本发明创造性地从中药骨碎补中提取细胞外囊泡，并对其功能进行研究，发现其能够促进骨髓间充质干细胞增殖以及成骨分化。骨髓原始间充质干细胞是骨髓基质干细胞，是人们在哺乳动物的骨髓基质中发现的一种具有分化形成骨、软骨、脂肪、神经及成肌细胞的多种分化潜能的细胞亚群。它们对骨髓中的造血干细胞(HSC)不仅有机械支持作用，还能分泌多种生长因子(如IL-6，IL-11，LIF，M-CSF及SCF等)来支持造血。可应用于造血干细胞移植、组织损伤的修复、自身免疫性疾病的治疗等，还可作为基因治疗的载体。因此本发明这一发现可进一步被应用于造血干细胞移植、组织损伤的修复、自身免疫性疾病、基因治疗等相关机制的研究以及相关药物或载体的研发中。
第五方面，本发明提供骨碎补细胞外囊泡在制备雌激素受体信号通路激动剂中的应用。
本发明创造性地从中药骨碎补中提取细胞外囊泡，并对其功能进行研究，发现其能够可使ER(雌激素受体)通路的相关基因(ERα和ERβ)mRNA表达上调，从而实现对ER通路的调控，可用于制备雌激素受体信号通路激动剂。
本发明所述的数值范围不仅包括上述列举的点值，还包括没有列举出的上述数值范围之间的任意的点值，限于篇幅及出于简明的考虑，本发明不再穷尽列举所述范围包括的具体点值。
相对于现有技术，本发明具有以下有益效果：
本发明创造性地从中药骨碎补中提取细胞外囊泡，并对其功能进行研究，发现其能够促进骨髓间充质干细胞增殖分化，并具有骨靶向性，而且含有多种与骨碎补相同的功效成分，证明了其具有治疗骨科疾病的潜力，可应用于制备治疗骨科疾病的药物。因此本发明创造性地提出骨碎补细胞外囊泡在制备骨髓间充质干细胞增殖促进剂中的应用、骨碎补细胞外囊泡在制备骨靶向制剂中的应用以及骨碎补细胞外囊泡在制备治疗骨科疾病的药物中的应用。
目前还未见文献报道有关骨碎补中的细胞外囊泡的提取方法和功能研究，本发明首次对骨碎补中的细胞外囊泡进行提取并进行深入研究。为植物源性细胞外囊泡的研究以及骨科疾病的研究与治疗提供了新的策略。
附图说明
图1是DREVs在透射电镜下的观察图。
图2是不同Triton X-100浓度处理下DREVs的粒子数变化结果图。
图3是DREVs内的RNA、蛋白质和脂质检测结果图；其中图D是DREV RNA检测结果图；图E是DREV蛋白质检测结果图；图F是DREV脂质检测结果图。
图4是不同浓度的DREVs对h-BMSCs的增殖影响结果图。
图5是DREVs影响ALP的表达的结果图。
图6是DREVs影响BMP2的表达的结果图。
图7是探究DREVs被h-BMSCs内化吸收的结果图。
图8是DREVs在小鼠体内的骨靶向性测试结果图，其中图A是采用尾静脉注射时DREVs在小鼠体内的骨靶向性测试结果图；图B是采用腹腔注射时DREVs在小鼠体内的骨靶向性测试结果图；图C是尾静脉注射DiR-DREVs后小鼠骨内的荧光量随时间变化图；图D是腹腔注射DiR-DREVs后小鼠骨内的荧光量随时间变化图。
图9是DREVs对ER通路的调控的测试结果图，其中图A是DREVs影响ERα的表达的结果图；图B是DREVs影响ERβ的表达的结果图。
具体实施方式
下面通过具体实施方式来进一步说明本发明的技术方案。本领域技术人员应该明了，所述实施例仅仅是帮助理解本发明，不应视为对本发明的具体限制。
下述实施例所涉及的骨碎补购自广东省肇庆市，经广州中医药大学第三附属医院中药房鉴定为槲蕨植物Drynariafortunei(Kunze)J.Sm的根茎。
实施例1
DREVs的提取
本实施例提供一种骨碎补细胞外囊泡的提取方法，包括步骤如下：
将新鲜的骨碎补取500g使用无菌水彻底清洗，切成小块后进行榨汁，过滤后取上清液收集于干净的50mL离心管中，在4℃条件下以300g离心10分钟，用于除去漂浮细胞，使用50mL离心管收集上清后，在4℃条件下以2000g离心20分钟，用于除去死亡细胞、脱落的囊泡等；使用50mL离心管收集上清后，在4℃条件下以10000g离心30分钟，以除去死亡细胞、脱落囊泡和凋亡小体等；将上清收集于差速超高速离心机专用离心管中，在4℃条件下以135000g离心70分钟，弃上清，用已预冷的1×PBS缓冲液重悬沉淀后，使用0.22μm一次性针头过滤器进行过滤，最后用已灭菌的EP管收集DREVs，保存于-80℃冰箱内备用。
实施例2
DREVs的表征
对实施例1提取得到的骨碎补细胞外囊泡的形态、粒径以及内容物进行表征。
在透射电镜下观察骨碎补细胞外囊泡的形态，可以观察到DREVs的形状呈圆形或者椭圆形，具有典型的杯状囊泡结构以及完整的细胞膜结构，粒径大小在0-300nm之间(见图1，比例尺为200nm)，符合文献报道的细胞外囊泡粒径范围，证明了细胞外囊泡的成功提取。
利用纳米粒子示踪分析仪对DREVs的粒径分布进行分析，结果发现：其粒径大小分布在0-300nm之间(与透射电镜观察结果相同)，浓度为1.04×109个粒子/mL，进一步证明了细胞外囊泡的成功提取。
分别使用不同浓度的损害膜完整性的表面活性剂Triton X-100(TX100)对其进行膜溶解，然后利用纳米流式检测仪测试其粒子数变化。结果显示：随着Triton X-100浓度的升高，DREVs的粒子数逐渐下降。与未使用Triton X-100组相比，使用0.1％Triton X-100组的DREVs粒子数明显下降，且差异具有统计学意义(图2，P<0.001，图中纵坐标为Triton X-100处理后DREVs粒子数占未处理的DREVs粒子数的百分比)。此结果证明了提取到的DREVs具有完整的膜结构，即证明了细胞外囊泡的成功提取。
分别使用琼脂糖凝胶电泳、考马斯亮蓝染色以及TLC(薄层色谱，Thin LayerChromatography)的方法对DREVs内RNA、蛋白质和脂质进行检测，结果见图3(D、E、F)，其中图中M条带表示蛋白质Marker条带。结果显示：DREVs内含有对核糖核酸酶(RNase)降解敏感的大分子量RNA、分子量为15-25kDa左右的蛋白质以及不同种类的脂质。
实施例3
探究DREVs对h-BMSCs的增殖及分化的促进作用
为了解DREVs的生物活性，使用CCK8法检测DREVs对h-BMSCs(人骨髓间充质干细胞)的增殖情况的影响。
实验方法为：用DMEM-F12培养基+10％胎牛血清(FBS)+1％抗青-链霉素，在37℃，5％CO2(标准大气压)培养h-BMSCs。当贴壁细胞密度达80％-90％时，用胰蛋白酶消化细胞，收集细胞并计数。按细胞密度为3×103个/cm2接种于96孔板中。通过BCA试剂盒检测DREVS的蛋白含量，取不同浓度的DREVs与h-BMSCs细胞共培养，做好各组浓度的标记，可分为4组，分别为15μg/mL DREVs、20μg/mL DREVs、30μg/mL DREVs，以及不添加DREVs的对照组。分别于培养12h、24h、48h后按照CCK-8试剂盒说明书中操作测定450nm处的吸光度。
结果如图4所示，在培养48h后，与对照组相比，15μg/mL、20μg/mL和30μg/mL的DREVs均促进了h-BMSCs增殖，且差异具有统计学意义(P<0.05)，其中20μg/mL的DREVs促进增殖的效果最好，为最佳浓度。在培养24h后，15μg/ml DREVs组与20μg/ml DREVs组间存在差异，且差异具有统计学意义(P<0.05)。
使用qRT-PCR检测DREVs对h-BMSCs的成骨分化的影响。
实验方法如下：
纯化培养h-BMSCS细胞，长至合适的密度后，用胰蛋白酶消化细胞，收集细胞并计数。以细胞密度为2×105个/m2接种于6孔板，将6孔板放入培养箱培养，当细胞密度长至80％时，吸尽孔中液体，换成相应组别的成骨分化诱导培养基，分为2组，分别为对照组：h-BMSCs加入成骨诱导液诱导分化；以及实验组：20μg/mL DREVs刺激h-BMSCs并加入成骨诱导液诱导分化。此后每3天更换1次对应组别的成骨分化诱导培养基。在成骨诱导分化0、1、3、6、9天时，使用TRIzol裂解液分别收集细胞放于已灭菌的EP管中，做好标记，并进行qRT-PCR检测成骨分化相关基因(ALP和BMP2)的表达。
相关基因的引物序列如下：
ALP序列：
SEQ ID NO.1：ACCACCACGAGAGTGAACCA(5'->3')
SEQ ID NO.2：CGTTGTCTGAGTACCAGTCCC(3'->5')
BMP2序列：
SEQ ID NO.3：ACTACCAGAAACGAGTGGGAA(5'->3')
SEQ ID NO.4：GCATCTGTTCTCGGAAAACCT(3'->5')
GAPDH序列：
SEQ ID NO.5：ACAACTTTGGTATCGTGGAAGG(5'->3')
SEQ ID NO.6：GCCATCACGCCACAGTTTC(3'->5')
扩增反应的程序：温度和时间为95℃10分钟(预变性)；温度和时间为95℃10秒(变性)，温度和时间为60℃15秒(退火、收集荧光)，温度和时间为72℃20秒(延伸)，一共40个循环；熔解曲线：温度和时间为95℃15秒，温度和时间为60℃1分钟，温度和时间为95℃15秒，温度和时间为60℃15秒。
扩增反应实验结束后，观察扩增曲线和溶解曲线是否处于正常曲线，正常曲线下，通过熔解曲线分析检测不同产物的特异性。内参基因为GAPDH基因，每个样品重复检测3遍以减少系统误差，采用比较Ct法明确各样品基因的相对定量(Relative Quantity，RQ)。将所得每个样品基因的Ct值进行分析，结果采用各样品基因与内参GAPDH基因比较的相对水平表示，最终采用2-ΔΔCT公式计算各样品基因的相对表达水平。
结果显示，与对照组对比，20μg/ml DREVs可上调h-BMSCs成骨分化过程中成骨表型基因ALP的表达，且第1、3、6天的差异结果分别具有统计学意义(图5，纵坐标为基因的相对表达水平，P<0.05)。与对照组对比，20μg/ml DREVs可上调h-BMSCs成骨分化过程中成骨表型基因BMP2的表达，且第1、3、6、9天的差异结果分别具有统计学意义(图6，纵坐标为基因的相对表达水平，P<0.05)。
考虑到EVs要发挥作用首先需要被靶细胞所摄取，然后才能影响靶细胞的相关功能。因此，为证明DREVs可被h-BMSCs内化吸收，使用亲脂性荧光染料Dil染料(红色)对DREVs进行标记，将已标记的DREVs与h-BMSCs进行共培养。6小时后，使用细胞核染料Hoechst33342(蓝色)对h-BMSCs进行细胞核的染色，以观察Dil-DREVs被内化吸收后的具体定位。结果显示，在荧光显微镜下，细胞核呈蓝色荧光，Dil-DREVs呈红色荧光，Dil-DREVs大部分位于h-BMSCs的细胞质内(图7)，证明了DREVs可被h-BMSCs内化吸收。
实施例4
探究DREVs在动物体内的骨靶向性
制备DiR-DREVs溶液：取DREVs 200μL置于已灭菌的EP管内，做好标记，根据制造商说明书的要求，加入DiR染色液5μL，最后加入PBS缓冲液稀释至1000μL，混合均匀，避光染色20分钟。20分钟后，在4℃条件下以135000×g离心70分钟，弃上清，用PBS缓冲液重悬沉淀后，重复离心2-3次以洗涤多余的染液最后一次离心后，使用100μL PBS缓冲液重悬沉淀，即得DiR-DREVs溶液，保存于-80℃冰箱内备用。
分别使用不同给药途径(尾静脉注射与腹腔注射)注射100μL DiR-DREVs溶液到雌性C57BL/6J小鼠体内，同时以给予100μL 1×PBS作为空白对照组，以给予100μL经PBS稀释后的DiR染液(DiR染液浓度为20μL/mL)作为阳性对照组，分别在给药后6小时、24小时、48小时和72小时进行荧光成像。
结果显示，在尾静脉注射组中，给予PBS的小鼠无论在任何时间点均未能检测到信号；给予DiR染液的小鼠检测到的荧光信号大部分位于肝、脾和肺脏，而在骨、心脏和肾脏内未能检测到信号；给予DiR-DREVs的小鼠检测到的荧光信号也同样大部分位于肝脏、脾脏和肺脏，在心脏和肾脏内未能检测到信号，但是在6、24、48和72小时的小鼠中，可以明显在骨内检测到相应的信号(图8中的图A)。在腹腔注射组中，给予PBS的小鼠无论在任何时间点均未能检测到信号；给予DiR染液的小鼠检测到的荧光信号大部分位于肝脏和脾脏中，少部分位于肺脏，在某个时间点可在肾脏中检测到少量的信号，在骨和心脏内未能检测到信号；给予DiR-DREVs的小鼠检测到的荧光信号也同样大部分位于肝脏和脾脏中，偶能在肺脏中检测到少量的信号，在心脏和肾脏内未能检测到信号，但是在6、24、48和72小时的小鼠中，均可在骨内检测到相应的信号(图8中的图B)。
然后利用Living Imaging软件将各组小鼠的各脏器部分的荧光区域进行定量，得到相应的数值(具体的数据见表1和表2)。
表1尾静脉注射DiR-DREVs后体内脏器的荧光量(×1010)
Figure BDA0003506946540000121
表2腹腔注射DiR-DREVs后体内脏器的荧光量(×1010)
Figure BDA0003506946540000122
结果显示，在尾静脉DiR-DREVs组中，无论是在哪个时间点，肝脏是DiR-DREVs分布最多的部位；尾静脉注射DiR-DREVs后骨内的荧光量呈现一个逐渐上升然后下降的趋势，在48小时荧光量最高(图8中的图C)。同样，在腹腔DiR-DREVs组中，无论是在哪个时间点，肝脏是DiR-DREVs分布最多的部位；腹腔注射DiR-DREVs后骨内的荧光量呈现一个逐渐上升然后下降的趋势，在48小时荧光量最高(图8中的图D)。尾静脉注射DiR-DREVs组各脏器荧光量明显高于腹腔注射DiR-DREVs组。
上述结果表明：DREVs在体内具有骨靶向性，且给药方式对于其骨靶向性有一定的影响。
实施例5
DREVs的代谢组学分析
对DREVs进行代谢组学的分析，实验方法为如下：
1、DREVs样品的前处理
(1)将DREVs样品进行冻干；
(2)加入400μL甲醇使用漩涡振荡器涡旋30秒，超声3分钟，然后加入两个小钢珠，在-20℃放置2分钟预冷，加入到研磨机内以60Hz研磨2分钟；
(3)在4℃的条件下以13000rpm离心10分钟，取350μL处理后的样品装入至LC-MS进样小瓶中，然后使用冷冻浓缩离心干燥器干燥；
(4)用300μL甲醇-水(甲醇与水的体积比＝1:4)进行复溶，涡旋30秒，超声3分钟，随后-20℃下静置2小时；
(5)在4℃的条件下以13000rpm离心10分钟，用注射器吸取100μL的上清液，使用0.22μm的有机相针孔过滤器过滤后，转移至LC进样小瓶中，在-80℃的条件下保存，直到进行LC-MS分析；
(6)质控样本(QC)是由所有样品的提取液等体积混合制备而成，QC的体积与样品的体积相同。
2、DREVs样品的上机检测
将DREVs样品上机，利用超高效液相串联QE高分辨质谱仪组成的液质联用系统检测DREVs样品的非靶向代谢组学数据。色谱条件：色谱柱为ACQUITY UPLC HSS T3(100mm×2.1mm，1.8μm)；流动相为A-水(含0.1％甲酸)，B-乙晴(含0.1％甲酸)，流速为0.35mL/min，进样的体积为2μL。质谱条件：离子源为ESI；样品质谱信号采集分别采用正负离子扫描模式。
3、数据的处理及分析
基于超高效液相串联高分辨质谱仪的非靶向代谢组学数据，利用代谢组学数据处理软件Progenesis Q1 v2.3，对原始数据进行定性以及相对定量的分析，并对原始数据进行标准化预处理，最后对数据进行总体的分析。我们通过中药综合数据库(TCMID，http://19.3.41.228：8000/tcmid/)、中药系统药理学数据库与分析平台(TCMSP，https://icmspw.com/tcmsp.php)以及中医药证候关联数据库(SymMap，http://www.ymmap.org)检索骨碎补的有效成分，将获得的DREVs代谢组学成分与骨碎补成分进行交集，获得两者间的共同成分。
实验结果如下：
DREVs中一共鉴定出3075个代谢物，其中黄酮类和异黄酮类代谢物一共有86个。将3075个代谢物进行Super Class的分类，结果显示其包括脂类和类脂分子(29％)、有机氧化合物(10％)、有机酸及其衍生物(9％)、有机杂环化合物(9％)、苯丙素和聚酮化合物(7％)以及苯环型化合物(7％)等。然后再进行Class的分类，结果显示其包括脂肪酰基(15％)、有机氧化合物(11％)、羧酸及其衍生物(8％)、异戊烯醇脂质(8％)、甘油磷脂(7％)、苯及其取代衍生物(4％)以及黄酮类(3％)等。
为探讨DREVs内含的代谢物是否具有来源中药的某些成分，通过TCMSP、TCMID以及SysMap数据库检索到骨碎补的有效成分共115个，将这115个骨碎补有效成分与DREVs的代谢成分进行交集分析，获得11个共有的成分，按成分在DREVs的相对含量从大到小进行排序，依次为柚皮苷(黄酮类)、圣草酚(黄酮类)、肉桂酸(肉桂酸及其衍生物)、柚皮素(黄酮类)、樱桃甙(聚酮化合物)、咖啡酸(肉桂酸及其衍生物)、芥子酸(肉桂酸及其衍生物)、阿福豆苷(聚酮化合物)、开环异落叶松树脂酚(二苯丁烷木质素)、芸香柚皮苷(黄酮类)以及山柰酚(黄酮类)。其中共有成分中含量最高的成分为柚皮苷，其相对含量为6204781，在黄酮类和异黄酮类代谢成分中排名第一位，在所有的DREVs代谢成分中排第二十三位。
上述结果说明，DREVs中含有与骨碎补相关的一些有效成分，因此DREVs可发挥与骨碎补类似的功效，具有治疗骨质疏松等疾病的潜力。
实施例6
探究DREVs对ER通路的调控
将20μg/mL DREVs与h-BMSCs分别共培养，使用qRT-PCR检测ER(雌激素受体)通路的相关基因(ERα和ERβ)mRNA表达的变化情况。
实验方法如下：
纯化培养h-BMSCs细胞，长至合适的密度后，用胰蛋白酶消化细胞，收集细胞并计数。按细胞密度为2×105个/cm2接种于6孔板，将6孔板放入培养箱继续培养，当细胞密度长至80％时，取20μg/ml DREVs与h-BMSCs细胞共培养，记为实验组，另设空白组不加入DREVs。分别刺激24h，48h后，使用TRI2ol裂解液收集细胞放于已灭菌的EP管中，做好标记，并进行qRT-PCR检测ER通路相关基因(ERα和ERβ)mRNA的表达。
相关基因的引物序列如下：
GAPDH序列：
SEQ ID NO.5：ACAACTTTGGTATCGTGGAAGG(5'->3')
SEQ ID NO.6：GCCATCACGCCACAGTTTC(3'->5')
ERα序列：
SEQ ID NO.7：GGGAAGTATGGCTATGGAATCTG(5'->3')
SEQ ID NO.8：TGGCTGGACACATATAGTCGTT(3'->5')
ERβ序列：
SEQ ID NO.9：TTCAAAGAGGGATGCTCACTTC(5'->3')
SEQ ID NO.10：CCTTCACACGACCAGACTCC(3'->5')
扩增反应方法同实施例3。
实验结果见图9。
如图所示：与对照组相比，20μg/mL DREVs组的ERα的相对表达量均呈现上调的趋势，且在48h的差异具有统计学意义(图9中的图A，P<0.05)；与对照组相比，20μg/mL DREVs组的ERβ的相对表达量均呈现显著上调的趋势，且在24h和48h的差异均具有统计学意义(图9中的图B，P<0.05)；而且在48h中各组ERβ的表达量均小于24h中相应组ERβ的表达量。
上述结果说明DREVs可使ER(雌激素受体)通路的相关基因(ERα和ERβ)mRNA表达上调，从而实现对ER通路的调控。已有研究表明骨碎补可进行ER通路的调控，因此本实施例进一步证明了DREVs具有骨碎补的相关功能。
申请人声明，本发明通过上述实施例来说明本发明的骨碎补细胞外囊泡在制备治疗骨科疾病的药物中的应用，但本发明并不局限于上述实施例，即不意味着本发明必须依赖上述实施例才能实施。所属技术领域的技术人员应该明了，对本发明的任何改进，对本发明产品各原料的等效替换及辅助成分的添加、具体方式的选择等，均落在本发明的保护范围和公开范围之内。
以上详细描述了本发明的优选实施方式，但是，本发明并不限于上述实施方式中的具体细节，在本发明的技术构思范围内，可以对本发明的技术方案进行多种简单变型，这些简单变型均属于本发明的保护范围。
另外需要说明的是，在上述具体实施方式中所描述的各个具体技术特征，在不矛盾的情况下，可以通过任何合适的方式进行组合，为了避免不必要的重复，本发明对各种可能的组合方式不再另行说明。
SEQUENCE LISTING
<110> 广州中医药大学第三附属医院
<120> 骨碎补细胞外囊泡在制备治疗骨科疾病的药物中的应用
<130> 2022-1-27
<160> 10
<170> PatentIn version 3.3
<210> 1
<211> 20
<212> DNA
<213> 人工序列
<400> 1
accaccacga gagtgaacca 20
<210> 2
<211> 21
<212> DNA
<213> 人工序列
<400> 2
cgttgtctga gtaccagtcc c 21
<210> 3
<211> 21
<212> DNA
<213> 人工序列
<400> 3
actaccagaa acgagtggga a 21
<210> 4
<211> 21
<212> DNA
<213> 人工序列
<400> 4
gcatctgttc tcggaaaacc t 21
<210> 5
<211> 22
<212> DNA
<213> 人工序列
<400> 5
acaactttgg tatcgtggaa gg 22
<210> 6
<211> 19
<212> DNA
<213> 人工序列
<400> 6
gccatcacgc cacagtttc 19
<210> 7
<211> 23
<212> DNA
<213> 人工序列
<400> 7
gggaagtatg gctatggaat ctg 23
<210> 8
<211> 22
<212> DNA
<213> 人工序列
<400> 8
tggctggaca catatagtcg tt 22
<210> 9
<211> 22
<212> DNA
<213> 人工序列
<400> 9
ttcaaagagg gatgctcact tc 22
<210> 10
<211> 20
<212> DNA
<213> 人工序列
<400> 10
ccttcacacg accagactcc 20

Claims (1)

1.骨碎补细胞外囊泡在制备骨靶向制剂中的应用，其特征在于，所述骨碎补细胞外囊泡中含有柚皮苷、圣草酚、肉桂酸、柚皮素、樱桃甙、咖啡酸、芥子酸、阿福豆苷、开环异落叶松树脂酚、芸香柚皮苷和山柰酚；
所述骨碎补细胞外囊泡是由包括如下步骤的提取方法提取得到的：
（1）将新鲜的骨碎补榨汁，过滤，收集滤液，离心除去杂质，收集上清液，所述离心包括三次离心，第一次离心的速度为100-500 g，第二次离心的速度为1000-3000 g，第三次离心的速度为8000-12000 g，所述离心的时间各自独立地为5-30 min；
（2）将上清液以100000-200000 g的速度离心60-120 min，收集沉淀，即得所述骨碎补细胞外囊泡。
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