CN115737728A - 一种三叶青提取物的应用 - Google Patents

Abstract

本申请提供一种三叶青提取物的应用，属于含有葡萄科派生物的药物制剂技术领域。三叶青提取物用于抗炎抗癌的质量标志物为绿原酸、奎宁酸、山奈酚‑3‑O芸香糖苷、牡荆素阿拉伯糖苷。本申请实现了三叶青提取物在抗癌抗炎应用中的定性操作，将活性成分与抗癌抗炎效果直接关联，实现质量控制的精准进行。

Description

一种三叶青提取物的应用

技术领域

本申请涉及一种三叶青提取物的应用，属于含有葡萄科派生物的药物制剂技术领域。

背景技术

三叶青（Tetrastigma hemsleyanum Diels et Gilg）属葡萄科崖爬藤属植物三叶青爬藤的块根，现代药理学认为药用植物三叶青具有黄酮、苯丙素、多糖等多种成分，有抗炎、抗癌、镇痛解毒等功效。三叶青的药用价值广泛被认可，并被浙江省纳为“新浙八味”，应用时多与其他物质混合形成复合物料（如：CN109170592A、CN107334807A）。而三叶青的提取物则多以乙醇提取物（如CN105012551A、CN105055682A、CN105031072A）或水提物（如：CN105061616A、CN106520901A）或乙醇-水混合提取物的形式存在，但三叶青药效物质基础尚不清楚，与药效关联的质量标志物至今不明晰，没有科学、普适、可测的质量控制体系，对有效成分没有明确的规定，不能有效判别质量，更做不到优质优价，极大地制约着三叶青产业的发展，同时，三叶青以黄酮苷和苯丙素类成分居多，乙醇的引入还存在极性物质溶出不完全的问题，水提物存在极性过大，黄酮苷和苯丙素类成分溶出率不高的问题。

中药作为一个多成分、多靶点、多途径协同效用的复杂系统，无法提取和纯化某单一化学成分，且有可能会出现中药材的活性成分减少，药效作用减弱等反面问题。因此部分文献对三叶青指纹图谱进行了研究，如：程林等.三叶青的高效液相色谱指纹图谱研究[J].浙江中医杂志，2013，48（04）: 296-298.、张煜炯等.聚类分析和主成分分析法研究三叶青氯仿部位HPLC指纹图谱[J].中成药，2016，38（3）: 607-612.、李士敏等.基于多模式识别结合指纹图谱的三叶青产地鉴别比较研究[J].中草药，2020，51（1）:197-203.、范世明等.三叶青叶指纹图谱研究及8种酚类成分含量测定[J].中国中药杂志，2016，041（021）: 3975-3981.、金晓怀.闽北三叶青中芦丁含量的测定及其指纹图谱分析 [D].福建农林大学、2019.，但所得到的中药指纹图谱仅能对中药的活性成分进行鉴定和分析，研究重心在于其成分及药理作用，这些只能与中药的药效作用进行间接性地分析和关联，无法对中药材的药效质量进行正确针对性的评价。

因此，挖掘药用植物三叶青质量标志物、建立其质量评价方法及探究其药效成分作用机制的研究迫在眉睫。

发明内容

有鉴于此，本申请提供一种三叶青提取物的应用，给出用于抗炎抗癌的药用效果相关的质量标志物，实现三叶青药材的质量普适、可测性控制。

具体地，本申请是通过以下方案实现的：

一种三叶青提取物的应用，所述三叶青提取物用于抗炎抗癌的质量标志物为绿原酸、奎宁酸、山奈酚-3-O芸香糖苷、牡荆素阿拉伯糖苷。

代谢过程中生成的各种自由基会造成细胞氧化损伤，以至于引起癌症、炎症等疾病。上述对质量标志物通过清除细胞组织中的自由基，达到降低氧化损伤的效果，对炎症、癌症等疾病的治疗产生药效作用，通过对质量标志物的确定，也为建立三叶青科学的质量控制与三叶青品种选育方法提供了定性的依据。

进一步的，作为优选：

所述三叶提取物用于对抗HepG2肝癌细胞引发的癌症，相应的质量标志物还包括有儿茶素，即质量标志物为绿原酸、奎宁酸、儿茶素、山奈酚-3-O芸香糖苷、牡荆素阿拉伯糖苷。上述质量标志物通过下调HepG2细胞的线粒体膜蛋白Bcl-2，上调促凋亡因子Bax，从而细胞色素C得到释放，致使凋亡因子Ca spase-3得到激活从而细胞生长周期阻滞，导致细胞凋亡，达到抗癌效果。

所述三叶提取物用于对抗huh7肝癌细胞引发的癌症，相应的质量标志物还包括有亚麻酸，即质量标志物为绿原酸、奎宁酸、山奈酚-3-O芸香糖苷、亚麻酸，同时，上述质量标志物通过将血液中因子SOD活性提高的方式，将MDA的含量减少，并减弱血液内因子LN、HA的表达量的异常增高趋势，实现保肝和抗肝纤维化的效果，最终达到抗癌效果。

所述三叶提取物用于对抗RAW264.7巨噬细胞引发的炎症，相应的质量标志物还包括有槲皮素、芦丁、亚麻酸，即质量标志物为绿原酸、槲皮素、奎宁酸、山奈酚-3-O芸香糖苷、芦丁、牡荆素阿拉伯糖苷、亚麻酸。上述质量标志物对脂多糖诱导的γ-干扰素和炎性因子表达量产生影响，并通过使巨噬细胞的吞噬功能增强，从而增加与抑制癌细胞增殖相关的因子 TIMP-2表达量，达到抗炎效果。

三叶青与HepG2、huh7癌症模型和LPS诱导的RAW264.7细胞炎症模型治疗效果均相关的成分有三种：绿原酸、奎宁酸、山奈酚-3-O-芸香糖苷；三叶青与HepG2癌症模型及LPS诱导的细胞炎症模型两种具有治疗效果的成分有一种：牡荆素阿拉伯糖苷，故三叶青甲醇提取物质量标志物选择绿原酸、奎宁酸、山奈酚-3-O-芸香糖苷、牡荆素阿拉伯糖苷四种化合物。

所述三叶青提取物为甲醇提取物，提取过程和参数设置如下：取三叶青原料，烘干并制成粉末，按照1:10～40的料液比投入80 %甲醇溶液，超声处理20～80 min，得提取液，抽滤旋蒸蒸发，冷冻干燥，即得提取物。更优选的：所述三叶青提取物的原料取自三叶青的块根、须根或/和叶片。三叶青须根中的大部分活性成分与块根的成分类似，而其三叶青叶片的活性成分含量高于块根和须根，这为三叶青全株入药提供了可能性。所述烘干温度50～100 ℃，烘干时间10～20 h。

优选工艺：按料液比1:20，向三叶青粉末加入80 %甲醇，于200 W的功率下超声处理30 min，处理两次，合并提取液，抽滤，旋蒸蒸发，冷冻干燥，即得三叶青提取物。

附图说明

图1为本申请的应用路线图；

图2为块根部位三叶青甲醇提取物的化学成分的结构鉴定离子流图；

图 3为须根部位三叶青甲醇提取物的化学成分的结构鉴定离子流图；

图 4为叶片部位三叶青甲醇提取物的化学成分的结构鉴定离子流图；

图 5为三叶青提取物对RAW264.7巨噬细胞的细胞毒性，*P<0.005，**P<0.001；

图 6为LPS对RAW264.7巨噬细胞的细胞毒性，*P<0.005，**P<0.001；

图7为LPS诱导的细胞形态变化（200X），a为正常生长细胞，b为形态发生变化细胞；

图 8为LPS诱导RAW264.7细胞后促炎症因子的表达量，*P<0.005，**P<0.001；

图 9为三叶青对LPS诱导的细胞模型炎症因子水平的影响，*P<0.005，**P<0.001。

具体实施方式

1、下述实施例中的测定和实验方法：

（1）三叶青提取物总酚多糖黄酮含量的测定：

利用80 %甲醇对三叶青（根部和叶片）进行提取，测定提取物的总酚多糖黄酮含量。

（2）不同部位三叶青提取物的UPLC-Q-TOF-MS/MS半定量分析：

建立基于UPLC-Q-TOF-MS/MS的快速检测法来鉴定三叶青（根部和叶片）提取物中的化学成分，通过质谱分析鉴定三叶青不同部位的甲醇提取物的主要活性成分，考察不同部位三叶青活性成分差异。

（3）三叶青提取物抑制癌细胞增殖活性的测定：

通过HepG2和huh7细胞构建细胞模型探究三叶青活性成分的抗肿瘤效果，确定提取物对HepG2和huh7细胞的抗癌效果，结合UPLC-Q-TOF-MS/MS半定量分析，探究三叶青提取物体外抗癌活性的药效成分（群）及其协同作用；通过主成分分析（PCA）和偏最小二乘法（PLS）等化学统计学方法，进行谱效相关性（即中药指纹图谱与药效的分析）研究，找出与三叶青抗肝癌活性相关的化学物质基础。

（4）三叶青提取物减少炎症模型损伤的测定：

通过脂多糖（LPS）诱导的RAW264.7细胞建立炎症模型探究三叶青活性成分的抗炎效果（QPCR法），检测白细胞介素-1β（IL-1β）、白细胞介素-6（IL-6）、肿瘤坏死因子-α（TNF-α）的表达水平。基于UPLC-Q-TOF-MS/MS快速检测法鉴定的三叶青提取物中的化学成分，结合不同提取物细胞抗炎差异，进行谱效相关性研究，找出与三叶青抗炎药效相关的化学物质基础。

2、下述实施例中用到的实验材料：

2.1、三叶青药材：

于浙江省某三叶青种植基地采挖3年生三叶青植株，且所有样品均为三叶青正品。

2.2、试剂

青霉素-链霉素（100X）、DMEM/F12、PBS、胎牛血清、DMSO、胰蛋白酶采购于ThermoFisher Scientific；RNA提取试剂盒选购于CLPBIO公司；LPS购于sigma生物公司；CCK-8试剂购于南京诺唯赞公司；DEPC水（DNase、RNase free）采购于碧云天公司；反转录试剂盒、荧光定量PCR试剂盒选购于TOYOBO公司；RNA-Quick Purification Kit采购于上海奕杉生物科技有限公司；色谱级甲醇、乙腈购于德国默克公司；其他化学试剂均为上海生工生物公司产品。

表1：DMEM/F12培养基配方

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4 ℃储存备用，分装避免污染。

表2：细胞冻存液配方（现用现配）

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表3：反转录反应液配方

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表3中，总体系为10μL，RNA在体系中添加的最终浓度为0.5pmol/μL，现配现用。

表4：实施例中涉及的仪器

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表5：RTPCR反应液配方（总体系为20μL，现用现配）

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表6：引物序列（引物设计由有康生物公司完成，放于4℃冰箱备用）

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实施例1

本实施例对三叶青不同部位的提取物制备及UPLC-Q-TOF-MS/MS半定量分析进行说明。

1、实验方法

1.1、三叶青不同部位的提取物制备：

制备过程：三叶青块根、须根或叶片→60 ℃烘干（12 h）→粉末→准确称取三叶青粉末30.0 g→1:20料液比加入80 %甲醇→超声30 min（60 ℃，功率200 W，2次，合并提取液）→抽滤→旋蒸蒸发→冷冻干燥→4 ℃备用。提取率12%-24%。

1.2、黄酮含量的测定

标准：采用亚硝酸钠硝酸铝比色法，以芦丁为标准测定黄酮类化合物的含量，并根据标准曲线计算三叶青提取物的黄酮含量。黄酮含量的标准曲线为 y=0.0029x+0.0588，线性范围为 10~400 μg，R²为0.9997，其中x是指甲醇提取物中总黄酮成分含量，y是指510 nm下测得的吸光度。

方法：取0.01 g的三叶青提取物浸膏用1ml 80 %乙醇复溶，首先将60 μL 5 %NaNO₂溶液加入待测液中，摇匀，静置5 min；然后加入同5 % NaNO₂溶液体积的10 % Al（NO₃）₃溶液，混匀静置相同时间，再将0.8 mL的10 % NaOH溶液加入待测液，混匀后加入80 %乙醇使待测液体积为2 mL，静置15 min。96孔板中每孔加入200 μL，每孔设三个浓度重复。在酶标仪510 nm吸光度下测得其数值，从而计算出三叶青甲醇提取物的总黄酮成分的含量。

1.3、总酚含量的测定

标准：用没食子酸为总酚标准品使用福林酚比色法制作标准曲线，并根据标准曲线计算三叶青提取物的总多酚含量。测得总多酚含量的标准曲线为 y=0.0113x+0.0659，线性范围为10~400 μg，R²为0.9985，其中x是指甲醇提取物中总酚成分含量，y是指740 nm下测得的吸光度。

方法：取0.01 g三叶青提取物浸膏，加入1.4 mL ddH₂O，溶解为待测液，首先加入1mL Folin-Cioealte显色剂，然后再将0.3 mL 20 % Na₂CO₃溶液加入到待测液中，摇匀，于黑暗处静置25 min左右。将待测液加入到96孔板中（200 μL/孔），每孔设三个浓度重复。每组浓度设 6个重复。在酶标仪740 nm吸光度下测得其数值，从而计算出三叶青甲醇提取物的总酚成分的含量。

1.4、多糖含量的测定

标准：用葡萄糖为多糖标准品使用苯酚—硫酸法制作标准曲线，并根据标准曲线计算三叶青提取物的多糖含量。测得多糖的标准曲线为y=0.0052x+0.0417，线性范围为10~400 μg，R²为0.9926，其中x是指甲醇提取物中多糖成分含量，y是指490 nm下测得的吸光度。

方法：称取三叶青提取物浸膏0.01 g，用1 ml的80 %乙醇复溶，首先将0.2 mL的5%苯酚溶液加入待测液中，摇匀后紧接着加入1 mL浓硫酸，混匀后置于沸水中，20 min后快速将其放于冰中冷却。5 min后将待测液加入96孔板中（200μL/孔），每孔设三个浓度重复。每组浓度设6个重复。在酶标仪490 nm吸光度下测得其数值，从而计算出三叶青甲醇提取物的多糖成分的含量。

1.5、不同部位的三叶青提取物 UPLC-Q-TOF-MS/MS分析

采用超高液相色谱串联四级杆飞行时间质谱技术（UPLC-Q-TOF-MS/MS），测定三叶青。

（1）供试品溶液制备：准确称取0.01 g的三叶青不同部位的80 %甲醇提取物浸膏，用80 %的甲醇复溶，定容至10 mL，取 1mL溶液用0.22 μm疏水PTFE滤头过滤，即得终浓度为1 mg/mL的三叶青待测液。

（2）液相色谱的条件如下：

安捷伦BEHC18色谱柱（100 mm×2.1 mm，1.7 μm）；0.1 %甲酸水溶液（A）-100 %乙腈溶液（B），梯度洗脱（0～1 min，5 % B；1～3min，5～10 % B；3～6 min，10～20 % B；6～16min，20～70 % B；16～20 min，70～100 % B）；设置流量为0.3 mL/min；仪器柱温30 ℃；200～600 nm为检测波长；供试品溶液进样量为2μL。

（3）电喷雾电离（ESI）-MS操作条件如下：

电离模式，负（ESI-）；去溶剂气体：氮气；碰撞气体：氩气；全扫描：50至1200 da，源温度：120 ℃，去溶剂温度：450 ℃，锥电压：25 V，锁定喷雾标准：400 ng/mL亮氨酸脑啡肽（m/z 554.2615负离子喷雾模式）至 5μL/min输注。碰撞能量：30～70V。所有数据均由MassLynx 4.1（Waters，MA，USA）软件收集。

（4）UPLC-Q-TOF-MS/MS成分分析：

通过UPLC-Q-TOF-MS/MS，检测到的三叶青不同部位甲醇提取物中化学成分的保留时间和相应质谱信息，对三叶青不同部位的活性成分进行鉴定。

1.6、数据分析

三叶青不同部位提取物经非靶向UPLC-Q-TOF-MS/MS分析，确定其主峰，以主峰中的目标化合物特征离子对进行定性，确定三叶青不同部位之间主要化学成分的差异。

通过超高效液相色谱-串联四级杆-飞行时间质谱（UPLC-Q-TOF-MS/MS）分别对三叶青的块根、须根和叶进行分析，通过比较三叶青不同部位的总离子流图（图2为块根部位，图3为须根部位，图4为叶片部位），结果：三叶青块根跟须根成分差异较小，而叶与块根和须根的成分差异较大（图2、3、4）。

利用MasslynxV4.1软件处理质谱数据，结合数据库和三叶青相关成分鉴定文献推测三叶青甲醇提取物中的活性成分及其裂解方式。比对分析一共鉴定了二十种成分（生物碱一种，酚酸类及其衍生物两种，黄酮类八种，有机酸及其衍生物七种，其他成分两种）。其中，块根提取物中鉴定了十一种化学成分（表7），须根提取物中鉴定了七种有效成分（表8），叶片提取物中鉴定了八种化学成分（表9）。

表7：三叶青块根甲醇提取物的化学成分鉴定

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表8：三叶青须根甲醇提取物的化学成分鉴定

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表9：三叶青叶片甲醇提取物的化学成分鉴定

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（1）生物碱化合物

图3所示的三叶青须根提取物质谱图中，峰5（Rt=15.38）低能量通道下出现离子碎片m/z 595.2779 [M-H]^-，分析得分子式为C₃₆H₄₀O₆N₂。高能量通道下出现315.6384、436.9046、564.3305二级质谱离子碎片，通过式（1）所示化学成分的裂解规律分析得m/z564.3305（-H₂O-CH₂）和m/z 315.6384（-C₁₈H₁₆NO₂）为裂解片段，图3中的峰5鉴定为小檗碱。

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（2）酚酸类及其衍生物

在本案例中，一共鉴定了两种酚酸类化合物。在图4的三叶青叶片提取物质谱中，峰3鉴定为咖啡酰奎宁酸，推测断键方式如式（2）所示，支链键断裂，从而得到碎片信息m/z191.0571和m/z 135.0434（在断键基础上减一分子的CO₂）；峰7（Rt=13.13）在低能量通道下出现离子碎片m/z 331.2419 [M-H]^-。匹配可知其化学成分分子式为C₁₃H₁₆O₁₀。高能量通道下出现150.1308、166.9923、216.9664、235.9230、236.4937等二级质谱碎片，分析化合物裂解规律可知m/z 316.9438（-OH-H）和m/z 252.5116（含O键断裂-3H₂O-CH₂）为裂解片段，见式（3），图4中的峰7鉴定为葡萄糖没食子鞣苷。

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（3）黄酮类化合物

一共鉴定了八种黄酮类化合物。保留时间为4.554 min时，图2的三叶青块根提取物质谱信息出现特征碎片m/z 577.1237 [M-H]^-，匹配出分子式是C₁₅H₁₄O₆，通过式（4）的断键方式进一步确认该化合物结构，在二级质谱信息中出现m/z 289.0559（母核）和m/z187.1281质谱特征峰碎片，峰2（Rt=4.58 min）是原花青素B；同样，峰3（Rt=5.18 min）在一级质谱信息中出现m/z 289.0559 [M-H]^-特征碎片，通过数据库匹配出分子式是C₁₅H₁₄O₆，在二级质谱信息中得到245.0761，135.7907等质谱特征峰碎片，进一步确认该化合物结构，确定该化合物为儿茶素。其中m/z 245.0761（-CH₂OH），m/z 135.7907为儿茶素裂解产生的二级质谱碎片，见式（5）；Rt为19.739 min时的峰11在一级质谱信息中出现m/z 253.2133 [M-H]^-特征碎片，匹配得到该化合物分子式是C₁₅H₁₀O₄，在二级质谱中出现199.1302质谱特征峰碎片，分析确认该化合物结构，确定该化合物为大豆苷元，m/z 199.1302为大豆苷元中间环发生逆Diels-Alder反应（RDA）产生的碎片，见式（6）。

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图3的三叶青须根提取物质谱图中一共鉴定了3种黄酮类化合物，通过分析化合物的裂解方式和数据库匹配，峰2鉴定为山奈酚-3-O-芸香糖苷；峰3鉴定为异牡荆黄素；峰6鉴定为牡荆素阿拉伯糖苷。在二级质谱图中，峰2（断裂方式如式（7）所示）除m/z 593.1585[M-H]^-外通过裂解还产生了m/z 446.8507（含O键断裂）和m/z 316.9593（含O键断裂）。峰3除产生m/z 431.0978 [M-H]^- 碎片信息外还通过裂解还产生了m/z 328.543（-C₄H₈O₃）和m/z240.1222（断裂方式如式（8）所示）。峰6除产生m/z 563.3201 [M-H]^-碎片信息外，还通过裂解还产生了 m/z 504.3054、m/z 457.1142和m/z 344.0299（断裂方式如式（9）所示）。

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图4的三叶青叶片部位提取物质谱图中一共鉴定了4种黄酮类化合物，分析化合物裂解方式和数据库匹配，峰4鉴定为东方素-2-O-鼠李糖苷）；峰5鉴定为槲皮素-3-葡萄糖苷；峰6鉴定为异牡荆黄素；峰8鉴定为为牡荆素阿拉伯糖苷。在二级质谱图中，峰4除m/z593.1266[M-H]^- 外，通过裂解（式（10）所示）还产生了m/z 327.2149（含O键断裂）和m/z298.5513（-3H）。峰5除产生m/z 463.0838 [M-H]^-碎片信息外，在二级质谱中得到271.0215、300.0252、431.0978碎片信息，分析裂解方式（见式（11）所示），匹配m/z431.0978（-CO₂-H₂O）、m/z 300.0252（含O支链断裂）和m/z 271.0215（含O环断裂），确定该化合物为槲皮素-3-葡萄糖苷。在二级质谱图中，峰6除m/z 431.0887[M-H]^- 外通过裂解还产生了m/z 341.0542（含O环断裂）和m/z 311.0600（含O环断裂），此外在m/z 341.0542这种结构的基础上支链断裂产生m/z 283.0058碎片信息，见式（12）所示。峰8裂解方式与须根的峰6一致。

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（4）有机酸类化合物

在三叶青不同部位的提取物的质谱图中一共鉴定了7种有机酸类化合物。图2的三叶青块根提取物，峰1在质谱信息在保留时间（Rt）为1.22 min时，低能量通道下出现m/z191.0149 [M-H]^-，高能量通道下出现148.9128、128.0399、124.0609、96.9550二级质谱峰碎片（如式（13）所示），通过碎片信息进一步确认该化学成分的结构，通过匹配该化合物的分子式为C₇H₁₂O₆，确定峰1为奎宁酸，其中m/z 148.9128为m/z 192.0634 （奎宁酸）脱去一分子CO₂所产生的碎片，m/z 128.0339为奎宁酸脱去一分子CO₂和一分子H₂O所产生的碎片。峰4（Rt=8.60）在低能量通道下出现特征碎片m/z 187.0922 [M-H]^-。在二级质谱中得到103.2266、125.4862、175.4758、187.0922碎片信息。匹配确定峰4对应的化合物为壬二酸（C₉H₁₆O₄），其中m/z 125.4862为壬二酸脱去一分子CO₂一分子H₂O产生的离子碎片（如式（14）所示）。峰6（Rt=11.32 min）出现m/z 346.2719[M-H]^-特征碎片，匹配出分子式是C₁₉H₃₈O₅，通过数据库分析和断键方式（如式（15）所示）进一步确认，该化合物结构可匹配到m/z199.7040（-nCH₂-H），m/z 305.2848（-2CH₂-H），m/z 329.2253（-CH₂-H），故确定峰6是三羟基十八碳烯酸。在峰8（RT=15.00 min）的质谱信息中得到m/z 311.2141[M-H]^-特征碎片。在二级质谱中出现169.3720、189.7128、208.9777、275.0788质谱峰碎片，通过化合物的裂解方式（如式（16）所示），确认m/z 275.0788是m/z 312.1937脱去两分子H₂O产生的质谱碎片，数据库匹配出分子式为C₁₇H₂₈O₅，故确定峰8为二氢青蒿素乙醚。在峰9（Rt=16.60 min）的质谱信息中出现m/z 295.2165 [M-H]^-特征碎片，通过数据库匹配出分子式为C₁₈H₃₂O₃。在二级质谱图中，峰9除m/z 295.2165 [M-H]^-外，通过裂解（如式（17）所示）还产生了m/z 277.206（-H₂O），推测峰9处的化合物为9-羟基-10,12-十八碳二烯酸。在峰10（RT=19.25 min）的质谱信息中出现m/z 277.2060 [M-H]^-特征碎片，通过数据库匹配出分子式为C₁₈H₃₀O₂。在二级质谱中出现128.6873、197.7024、248.9557质谱峰特征碎片能进一步确认该化合物结构，其中m/z 248.9557为m/z 277.2060脱去两分子CH₂所产生的碎片，m/z 128.6873为m/z278.2246脱去数分子CH₂所产生的碎片（如式（18）所示）。确定该化合物为亚麻酸。在三叶青须根提取物中同样鉴定出峰7（RT=19.29 min）为亚麻酸。在三叶青叶提取物中保留时间为3.41 min时，峰2的质谱信息中出现m/z 308.1988 [M-H]^-特征碎片。通过数据库匹配出分子式为C₁₈H₂₈O₄，通过文献可以匹配碎片信息m/z 305.0635（M-4H），m/z 148.9501（支链断裂），如式（19）所示。推定峰2为羟基氧代十八碳三烯酸。

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……（19）

（5）其他成分

除以上成分外，三叶青块根提取物中还鉴定了其他两种成分。根据图2中峰5（RT=10.82min）的质谱信息可得到m/z 215.1233 [M-H]^-的特征碎片，分析可得分子式为C₁₀H₉O₄Na。在二级质谱信息中出现123.0120、202.8589、215.1233离子碎片，分析化合物裂解规律（见式（20）所示）可知m/z 202.8589（-CH₂）为阿魏酸钠裂解片段，据此峰5被鉴定为阿魏酸钠；同样在保留时间为13.33 min时，根据图2中峰7的质谱信息出现m/z 287.2167[M-H]^-特征碎片。二级质谱信息中出现119.2614、154.8840、174.9554、279.9259特征碎片，通过裂解方式（见式（21）所示）确认该化合物的化学结构，通过匹配该化合物的分子式为C₁₆H₃₂O₄，推测该化合物为月桂酸二甘醇酯，其中m/z 174.9554为m/z 287.2167脱去数分子CH₂所产生的碎片。

……（20）

……（21）

综上成分分析可知：除三叶青块根外，三叶青其他部位也含有大量黄酮和酚酸类成分。而目前市场上流通的均是三叶青的块根部位，人们也因此一般会使用三叶青的块根入药。但从上述成分含量分析上来看，三叶青须根和叶片的成分不低于三叶青的块根，甚至部分成分的含量高于三叶青块根的成分含量。可见本案采用块根、须根、叶片为三叶青原料是可行的。

实施例2

本实施例为三叶青提取物对于HepG2肝癌细胞的抗癌活性的测定案例，以印证本案所提供三叶青甲醇提取物应用于抗癌的效果。

1、实验方法

1.1、HepG2细胞复苏

从液氮罐中拿出装有HepG2细胞的冻存管，迅速置于温度为37 ℃的水浴锅溶解，之后将其立即放入已经灭菌过的超净台中，打开后将已溶解的细胞冻存液加入15 mL离心管，然后加入3 mL的细胞培养液吹打均匀，用离心机离心（1200 rpm，2 min）；吸弃上清，再次加入5 mL的细胞培养液吹打均匀，随后使细胞均匀铺至T25培养瓶，放入37 ℃、5 % CO₂培养箱中培养2-3天，新复苏的细胞需要隔日换液。细胞培养液由10%新生牛血清（FBS）、1 %双抗（青霉素和链霉素）及DMEM培养液配制而成。

1.2、HepG2细胞传代

吸弃细胞培养瓶里的残液，加入1 mL PBS后轻轻摇匀以便洗去残余的培养液，吸弃后加入0.5 mL的胰酶，轻轻摇匀后迅速放于培养箱静置2 min左右；通过显微镜观察细胞消化情况，消化后加入3 mL细胞培养液，吹打细胞使HepG2细胞吹散为单个细胞；移入离心管，1200 rpm离心2 min，弃去残液后加入细胞培养液按比例传代并放置培养箱培养，细胞的生长面积达到培养皿85 %以上时可进行传代。

1.3、HepG2细胞冻存

待细胞长至80 %左右时，按1.2中所述的传代方法，胰蛋白酶消化细胞2 min后，加入3 mL细胞培养液，将其吹打分散为单个细胞；将含胰酶的细胞悬液加入15 mL的无菌离心管中离心（1200 rpm，2 min）；吸弃残液后，将现配的3 mL细胞冻存液加入至离心管中，吹打均匀后分装于1.8 mL的冻存管中。通过细胞程序冻存盒在-80℃的冰箱中冷冻24 h，之后将其放入细胞液氮罐中保存。

1.4、三叶青甲醇提取物对HepG2细胞活力影响

方法：将正处于对数生长期的细胞按传代步骤操作，最后配成100 μL（细胞密度为1×10⁵ /mL）的细胞悬液加入到96孔培养板的每个孔中，96孔板四周加入100 μL的PBS，空白对照为无细胞的细胞培养液，细胞培养至贴壁后吸弃培养液，加入配置好的含三叶青提取物的培养液100 μL，终浓度为0、50、100、150、200、250、500 μg/mL，每剂量组设6个复孔，每组重复3次。空白组加100 μL培养液。于培养箱中继续培养24 h后加入10 μL CCK-8试剂，继续在培养箱中孵育2 h。于450 nm处测定三叶青提取物处理后的HepG2细胞吸光度值（OD）。计算各组对HepG2细胞增殖的影响。

评价指标：肿瘤细胞抑制率（%）=（对照组平均OD值-实验组平均 OD 值/对照组平均OD值）×100%。

2、三叶青提取物与肝癌细胞HepG2抗癌药效相关的成分分析

通过ChemDateSolution软件将三叶青提取物对HepG2肿瘤细胞的抗癌IC₅₀设为因变量，将通过unifi软件处理后得到的UPLC-Q-TOF-MS/MS峰表导入软件设为自变量，通过PCA得分表剔除异常样品，通过PLS鉴定主成分的相关度，其中R²Y为模型（校正集）的决定系数，Q²Y为交叉验证的决定系数，这两者是评价建立的模型最重要的指标。通过PLS分析得到的R²Y>0.8和Q²Y>0.6，且R²Y逐步趋向于1，说明该模型切实且可预测性好。通过PLS建模一共得到了6种相关的主成分（表10），根据实施例1的成分鉴定确定其中4种成分，分别为奎宁酸（Q²Y=0.65）、儿茶素（Q²Y=0.78）、山奈酚-3-O-芸香糖苷（Q²Y=0.85）、牡荆素阿拉伯糖苷（Q²Y=0.88），通过文献及二级碎片信息匹配进一步鉴定，保留时间为0.80 min时的主成分1（Q²Y=0.65），出现特征碎片m/z 354.0951 [M-H]^-，匹配出分子式是C₁₆H₁₈O₉，在二级质谱信息中出现 m/z 191.0511和 m/z 165.0341质谱特征峰碎片（如式（22）所示）可推测主成分1是绿原酸。这5种成分的Q²Y值均＞0.6，且接近于1，说明这三种成分与三叶青提取物对HepG2肝癌细胞的生长有抑制作用，从而也可以证明三叶青对HepG2肝癌细胞的生长有抑制作用，而其主要作用的物质有绿原酸、奎宁酸、儿茶素、山奈酚-3-O-芸香糖苷、牡荆素阿拉伯糖苷。

表10：三叶青HepG2关联的化学成分鉴定

。

……（22）

本案例中，三叶青甲醇提取物与huh7肿瘤细胞的抗癌效果相关的主要成分有6种，通过鉴定确定其中5个化学成分，即：绿原酸、奎宁酸、儿茶素、山奈酚-3-O-芸香糖苷、牡荆素阿拉伯糖苷，作为三叶青甲醇提取物对HepG2肝癌细胞的抗癌效果的质量标志物。

实施例3

本实施例为三叶青提取物对huh7肝癌细胞抗癌活性测定案例，印证并确认本案所提供三叶青甲醇提取物对huh7肝癌细胞抗癌效果的质量标志物。

实验方法如实施例2所述。

通过ChemDateSolution软件将三叶青提取物对huh7 肿瘤细胞的抗癌IC₅₀ 设为因变量，将通过unifi软件处理后得到的UPLC-Q-TOF-MS/MS峰表导入软件设为自变量，通过PCA中心化剔除异常样品。通过PLS鉴定主成分的相关度，其中R²Y为模型（校正集）的决定系数，Q²Y为交叉验证的决定系数，这两者是评价建立的模型最重要的指标。通过PLS分析得到的R²Y>0.8和Q²Y>0.8，且R²Y逐步趋向于1，说明该模型切实且可预测性好。通过PLS建模一共得到了6种相关的主成分（表11），通过实施例1、实施例2中的成分结构鉴定，确定其中4种种成分，分别为绿原酸（Q²Y=0.82）、奎宁酸（Q²Y=0.85）、亚麻酸（Q²Y=0.85）和山奈酚-3-O-芸香糖苷（Q²Y=0.86），这三种成分的Q²Y值均＞0.8，且接近于1，说明这4种成分与三叶青提取物对huh7肝癌细胞的生长有抑制作用，从而也可以证明三叶青对huh7肝癌细胞的生长有抑制作用。

表11：三叶青huh7关联的化学成分鉴定

。

本案例中，三叶青甲醇提取物与huh7肿瘤细胞的抗癌效果相关的主要成分有6种，通过鉴定确定其中4个化学成分，即：绿原酸、奎宁酸、山奈酚-3-O-芸香糖苷、亚麻酸，作为三叶青甲醇提取物对huh7 肿瘤细胞的抗癌效果的质量标志物。

实施例4

本案例以LPS诱导的RAW264.7巨噬细胞为炎症模型，通过Q-PCR测定炎性因子IL-6、TNF-α、IL-1β表达量，评价三叶青对LPS诱导的RAW264.7炎症模型的抗炎药效，并筛选与三叶青抗炎相关的活性成分，同时，通过UPLC-Q-TOF-MS/MS进行统计学方法分析筛选与炎性因子IL-6、TNF-α、IL-1β表达量相关的三叶青质谱峰，通过成分分析鉴定出有效的化学成分，确定三叶青甲醇提取物对抗炎症的质量标志物。

实验方法与实施例2相同，区别在于：

（1）三叶青甲醇提取物对RAW264.7细胞毒性：方法与实施例2相同，评价指标为：细胞活性（%）=（实验组平均OD值-空白组OD值/对照组平均OD值-空白组OD值）×100%。

（2）LPS对RAW264.7细胞毒性

方法：将正处于对数生长期的细胞按传代步骤操作，最后配成100 μL（细胞密度为1×10⁵ /mL）的细胞悬液加入到96孔培养板的每个孔中，96孔板四周加入100 μL的PBS，空白对照为无细胞的细胞培养液，细胞培养至贴壁6h后更换为新的培养基，加入含无血清LPS的培养基母液终浓度为0、0.1、1、10、100 μg/mL，每浓度加6个复孔，每组重复3次。空白对照仅加100 μL的细胞培养液。继续培养12、24 h后每孔加入10 μL CCK-8试剂，培养箱孵育2h。在酶标仪450 nm处测定其吸光度值（OD）。计算各组对RAW264.7细胞活力的影响。

评价指标：细胞活性（%）=（实验组平均OD值-空白组OD值/对照组平均OD值-空白组OD值）×100%。

CCK-8法检测三叶青甲醇提取物和LPS对RAW264.7细胞毒性影响，我们设计了终浓度为50、100、150、200、250、500 μg/mL的三叶青甲醇提取物，通过细胞培养进行CCK-8细胞活性的检测。

通过图5可发现：在0~200 μg/mL浓度范围内的三叶青甲醇提取物培养48 h后的RAW264.7细胞存活率在90%以上，且具有统计学意义（P<0.05），此浓度下的三叶青提取物对RAW264.7细胞毒性较小，因此后续选择该范围内的三叶青浓度作为LPS诱导炎症模型治疗的最佳浓度。

同样，在图6中LPS对RAW264.7细胞本身也有细胞毒性，LPS的浓度范围在0.1~10 μg/mL时，RAW264.7巨噬细胞的生存率在90%以上，在同一浓度下随着LPS诱导时间的增多，RAW264.7细胞的存活率有逐步下降的趋势。LPS诱导RAW264.7细胞时间范围在12~24 h时，RAW264.7巨噬细胞的存活率可达90%。为减少LPS本身对RAW264.7细胞死亡的影响，避免后续实验的误差，我们选择LPS浓度为1 μg/mL，诱导时间为12 h为最佳实验条件。

（3）LPS诱导的RAW264.7细胞模型的建立

将正在对数生长期的RAW264.7细胞，按1×10⁶个/孔接种于6孔培养板中，每孔2.5mL。放入CO₂培养箱培养，贴壁6h后更换为配置好的含LPS培养液，使LPS浓度为最适浓度（1μg/mL），诱导时间为最适时间（12 h），每组设2个复孔，重复3次。空白对照组加2.5 mL培养液，完全对照组加入含1×10⁶个细胞的2.5 mL培养液。吸去LPS残液后，继续加入新培养液，将其放入细胞培养箱培养24 h后，按照RNA提取试剂盒操作，提取细胞上清中的RNA，测定RNA含量；按照PCR试剂盒的操作步骤检测IL-6、TNF-α、IL-1β含量，内参基因选择为GAPDH，重复实验3次。

按照SYBR法，计算2^-△△CT值，分析LPS诱导RAW264.7细胞建立炎症模型可行性。

通过图7可以发现，在显微镜下观察正常细胞和LPS处理后的RAW264.7细胞形态，发现正常生长的细胞（图7中的a）呈现均匀，且细胞形态为完整椭圆形，LPS处理后的巨噬细胞huh7细胞，细胞形态发生变化（图7中的b），细胞状态不一，出现棱形结构，部分呈现分化状态，同时我们通过荧光定量实验测定LPS诱导后的huh7细胞中炎症因子的表达量（图8），三种炎症因子IL-1β、IL-6、TNF-α的表达量显著增加（P<0.05），其中IL-1β（R=8.35）、TNF-α（R=9.04）这两种炎症因子与正常细胞相比，表达量增多了8~9倍。通过细胞形态的变化及炎症因子表达量的增加说明LPS诱导huh7巨噬细胞的炎症模型切实可行，另一方面IL-6（R=1.62）炎症因子表达量与其他两种炎症因子相比，表达量虽有增加但增加量并不多。

（4）三叶青提取物对炎症模型促炎症因子分泌功能的影响

将正在对数生长期的RAW264.7细胞，按1×10⁶个/孔接种于6孔培养板中，每孔2.5mL。放入CO2培养箱培养，贴壁6 h后更换为配置好的含LPS培养液，使LPS浓度为（2）部分最适浓度（1 μg/mL），LPS孵育12 h后更换为配置好的三叶青提取物，使三叶青提取物终浓度为（1）部分细胞活性>90%的浓度范围（即0~200 μg/mL），每组加2.5 mL，每组设2个复孔，重复3次。空白对照组加2.5 mL培养液，完全对照组加入含1×10⁶ 个细胞的2.5 mL培养液。培养24 h后，按照RNA提取试剂盒操作，提取细胞中的RNA，测定RNA含量；按照PCR试剂盒的操作步骤，检测炎症因子IL-6、TNF-α、IL-1β含量，内参基因选择为GAPDH，重复实验3次。

按照SYBR法计算2^-△△CT值，分析LPS诱导RAW264.7细胞建立炎症模型的可行性。

本实验选择槲皮素为阳性对照，通过图9可以看到：与LPS诱导的细胞炎症因子表达量相比，槲皮素（200 μg/mL）和三叶青甲醇提取物样品（200 μg/mL）三种炎症因子表达水平均显著下降（P<0.05），说明三叶青甲醇提取物对LPS诱导的RAW264.7炎症模型有改善作用。进一步分析发现：LPS诱导的RAW264.7细胞或经处理后IL-6表达量虽有下降，但表达量均未超过1，说明LPS诱导的RAW264.7细胞炎症模型炎症因子IL-6并未有明显表达增加，针对炎症因子TNF-α表达量变化，虽然三叶青提取物样品处理后的细胞TNF-α因子表达量下降了1.84，但槲皮素处理后并没有加大数值差距（仅下降了0.16），而LPS诱导的RAW264.7细胞炎症因子IL-1β经槲皮素和三叶青分别处理后，表达量分别下降1.10和0.98，效果最好。

（5）与LPS诱导的炎症模型炎性因子IL-1β表达量相关的成分分析

通过ChemDateSolution软件，将三叶青甲醇提取物对LPS诱导的RAW264.7细胞炎症模型IL-1β因子的表达量设为因变量，将通过Unifi软件处理后得到的UPLC-Q-TOF-MS/MS峰表导入软件设为自变量，通过PCA中心化剔除异常样品。通过PLS鉴定主成分的相关度，其中R²Y为模型（校正集）的决定系数，Q²Y为交叉验证的决定系数，得到R²Y>0.6，且R²Y逐步趋向于1，说明该模型构建成功，可以进行预测。

根据PLS建模分析一共得到了7种相关主成分（表12），实施例1中的成分鉴定确定了其中5种成分：绿原酸（Q²Y=0.15）、奎宁酸（Q²Y=0.44）、山奈酚-3-O-芸香糖苷（Q²Y=0.44）、牡荆素阿拉伯糖苷（Q²Y=0.27）、亚麻酸（Q²Y=0.16）；进一步鉴定了两种成分，分别为槲皮素（Q²Y=0.36）和芦丁（Q²Y=0.43）。其中槲皮素质谱图中产生了碎片离子m/z 300.9876（-2H）、m/z 272.0685（支链断裂）和m/z 178.8363（断裂方式如式（23）所示），芦丁质谱图中除特征性碎片m/z 609.1483 [M-H]^-外还因为含O键断裂产生了碎片离子m/z 310.9286和m/z301.0255（如式（24）所示）。这7种成分与三叶青提取物对LPS诱导的RAW264.7细胞炎症模型有改善作用，从而也证明了三叶青甲醇提取物具有抗炎药效。

表12：与LPS诱导的炎症模型炎性因子IL-1β表达量相关的成分分析

。

……（23）

……（24）

本实施例中，三叶青提取物干预LPS成功诱导的RAW264.7细胞炎症模型，通过炎性因子IL-1β、IL-6、TNF-α的表达量来验证三叶青提取物的抗炎效果：经三叶青甲醇提取物处理后的LPS诱导炎症模型炎性因子IL-1β与LPS诱导的细胞炎症模型相比表达量显著降低，而与阳性对照槲皮素相比，其他两种炎性因子IL-6、TNF-α表达量及变化并不明显。

为进一步探究三叶青甲醇提取物对LPS诱导的细胞炎症模型改善效果相关的有效化学成分，我们运用UPLC-Q-TOF-MS/MS技术结合ChemDateSolution软件的统计学方法将与抗炎药效相关的三叶青甲醇提取物的化学成分峰进行了建模分析。结果表明：三叶青甲醇提取物与LPS诱导巨噬细胞RAW264.7炎症模型炎性因子IL-1β表达量相关的主要成分有7种，通过进一步结构鉴定这7种成分分别为：绿原酸、奎宁酸、槲皮素、山奈酚-3-O-芸香糖苷、芦丁、牡荆素阿拉伯糖苷、亚麻酸，该七种成分即为三叶青甲醇提取物对抗炎症的质量标志物。

综上：

（1）通过UPLC-Q-TOF-MS/MS对三叶青不同部位提取物进行成分鉴定：从三叶青块根鉴定了11种活性成分，为儿茶素、9-羟基-10,12-十八碳二烯酸、原花青素B等；须根鉴定了7种有效成分，为含山奈酚-3-O-芸香糖苷、异牡荆黄素、葡萄糖没食子鞣苷、牡荆素阿拉伯糖苷等；叶片鉴定了8种化学成分，为东方素-2-O-鼠李糖苷、槲皮素-3-葡萄糖苷、异牡荆黄素等，三叶青的不同部位均含有黄酮酚酸有机酸等成分，印证了三叶青可以全株入药。

（2）建立了HepG2癌症模型，通过CCK-8法分析了三叶青的抗癌药效：三叶青甲醇提取物浓度与肝癌细胞HepG2的存活率成负相关，有显著的抗癌药效；相关主要成分有6种，其中5个为绿原酸、奎宁酸、儿茶素、山奈酚-3-O-芸香糖苷、牡荆素阿拉伯糖苷。

（3）建立了huh7肝癌细胞模型，通过CCK-8法分析抗癌药效：三叶青甲醇提取物浓度与肝癌细胞huh7的存活率成负相关，对肝癌细胞huh7的生长均有抑制效果，有显著的抗癌药效；相关主要成分有6种，其中4个为绿原酸、奎宁酸、山奈酚-3-O-芸香糖苷、亚麻酸；同一浓度下，三叶青甲醇提取物对HepG2细胞生长的抑制率较huh7肝癌细胞高。

（4）建立了LPS诱导的RAW264.7巨噬细胞炎症模型，三叶青甲醇提取物对LPS诱导的炎症模型有改善效果：相关主要成分有7种，为绿原酸、槲皮素、奎宁酸、山奈酚-3-O-芸香糖苷、芦丁、牡荆素阿拉伯糖苷、亚麻酸。

Claims (8)

1.一种三叶青提取物的应用，其特征在于：所述三叶青提取物用于抗炎抗癌的质量标志物为绿原酸、奎宁酸、山奈酚-3-O芸香糖苷、牡荆素阿拉伯糖苷。

2.根据权利要求1所述的一种三叶青提取物的应用，其特征在于：所述抗癌是指HepG2肝癌细胞抗癌，相应的质量标志物为绿原酸、奎宁酸、儿茶素、山奈酚-3-O芸香糖苷、牡荆素阿拉伯糖苷。

3.根据权利要求1所述的一种三叶青提取物的应用，其特征在于：所述三叶提取物用于对抗RAW264.7巨噬细胞引发的炎症，相应的质量标志物为绿原酸、槲皮素、奎宁酸、山奈酚-3-O芸香糖苷、芦丁、牡荆素阿拉伯糖苷、亚麻酸。

4.一种三叶青提取物的应用，其特征在于：所述三叶提取物用于对抗huh7肝癌细胞引发的癌症，相应的质量标志物为绿原酸、奎宁酸、山奈酚-3-O芸香糖苷、亚麻酸。

5.根据权利要求1或4所述的一种三叶青提取物的应用，其特征在于，所述三叶青提取物为甲醇提取物，提取过程和参数设置如下：取三叶青原料，烘干并制成粉末，按照1:10～40的料液比投入80 %甲醇溶液，超声处理20～80 min，得提取液，抽滤旋蒸蒸发，冷冻干燥，即得提取物。

6.根据权利要求5所述的一种三叶青提取物的应用，其特征在于：所述三叶青提取物的原料取自三叶青的块根、须根或/和叶片。

7.根据权利要求5所述的一种三叶青提取物的应用，其特征在于：所述烘干温度50～100 ℃，烘干时间10～20 h。

8.根据权利要求5所述的一种三叶青提取物的应用，其特征在于：三叶青原料烘干磨粉，按照料液比1:20加入80 %甲醇，于200 W的功率下超声处理两次，每次30 min，合并提取液，抽滤，旋蒸蒸发，冷冻干燥，即得三叶青提取物。

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