CN111333662A - 3,4’-o-二甲基逆没食子酸、其衍生物及其制药用途 - Google Patents

3,4’-o-二甲基逆没食子酸、其衍生物及其制药用途 Download PDF

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Abstract

本发明涉及3,4'‑O‑二甲基逆没食子酸、其衍生物及其制药用途，包括3,4'‑O‑二甲基逆没食子酸及其衍生物；所述衍生物是3,4'‑O‑二甲基逆没食子酸‑4‑O‑α‑D‑葡萄糖苷。本发明还涉及到含有3,4'‑O‑二甲基逆没食子酸和/或3,4'‑O‑二甲基逆没食子酸‑4‑O‑α‑D‑葡萄糖苷制备的药物或用途。本发明发现前述两种地榆活性成分能够通过调控巨核细胞分化作用与多个基因及信号通路有关，其中与NF‑E2启动子去甲基化最为密切。

Description

3,4’-O-二甲基逆没食子酸、其衍生物及其制药用途
技术领域
本发明涉及天然活性成分，特别是从地榆中提取得到的活性成分。该活性成分在制药中的用途，特别是该活性成分在治疗血小板减少症的药物中的用途。
背景技术
血小板减少症与一些疾病密切相关，包括感染，恶性肿瘤，自身免疫性疾病，肝病，弥散性血管内凝血，药物，妊娠和凝血功能障碍，是临床常见的血液系统疾病。血小板产生不足、脾脏对血小板的阻留、血小板破坏或利用增加等因素都会引起血小板减少症的发生。血小板减少症患者更容易发生自发性出血，即粘膜，颅内，胃肠道和泌尿生殖器出血，严重时甚至危及生命。
血小板减少症的大多数传统治疗方式主要是减少血小板破坏和输送血小板，通常采用激素、免疫球蛋白、免疫抑制剂、血小板输注、脾脏切除手术等方法进行治疗，一般可以起到一定的缓解病情的作用。然而，这些选择并不总是有效，并且可能与严重的副作用相关。
血小板是巨核细胞的胞质，血小板的形成可以分为两个阶段：第一个阶段是巨核细胞分化成熟，第二阶段是成熟巨核细胞向血小板转化。目前诱导巨核细胞分化是临床治疗与血小板疾病相关的疾病的主要策略之一。
传统中药在治疗血液系统疾病方面具有多靶点调节的优势。地榆(Sanguisorbaeradix)是蔷薇科植物地榆Sanguisorba officinalis L.及长叶地榆Sanguisorbaofficinalis L.var.longifolia(Bert.)
Figure BDA0002444401370000011
et Li的干燥根，长叶地榆习称“绵地榆”。地榆始载于《神农本草经》，其药性苦、酸涩、微寒，归肝及大肠经，功效为凉血止血，解毒敛疮，止痢。在中国具有悠久的药用历史，中医临床上常用于便血、痔血、吐血、咯血、衄血、崩漏等多种出血症的止血。
我们在之前发表的论文“Two Ellagic Acids Isolated from Roots ofSanguisorba officinalis L.Promote Hematopoietic Progenitor Cell Proliferationand Megakaryocyte Differentiation”中，研究了地榆活性成分的分离提取，得到两种逆没食子酸，经过鉴定为3,3’,4’-O-三甲基逆没食子酸-4-O-β-D-木糖苷和3,3’,4’-O-三甲基逆没食子酸。经过测试发现相应的化合物具有诱导HEL细胞巨核细胞分化的功效。
参考文献：Molecules 2014,19,5448-5458；doi:10.3390/molecules19045448
中国专利CN 108714149 A公开采用地榆提取活性成分用于制备抗肿瘤的药物，主要发现3,3’,4’-三甲基逆没食子酸具有抑制血管新生和/或细胞毒作用的抗肿瘤活性，但是三甲基逆没食子酸抗肿瘤应用过程中需要采用50-200mg/kg的剂量才能够达到抗肿瘤活性，且只有剂量200mg/kg才能够取得接近5-FU的抗肿瘤活性，因此三甲基逆没食子酸化合物的药物活性相对较低。
综上，现有研究发现的两种逆没食子酸化合物活性较低，需要较高浓度才能够达到诱导功效，因此如何进一步分析研究得到具有更高活性的天然活性成分是目前亟需解决的问题。
发明内容
本发明的目的在于：针对现有技术存在的血小板减少症严重危害生命健康，而传统治疗手段主要通过直接手术方式输入血小板效果不佳且存在严重副作用的问题，而以往研究发现的3,3’,4’-O-三甲基逆没食子酸具有一定的诱导分化功效，但是活性偏低，药物应用潜力较低的不足。为此，本发明提供一种治疗血小板减少症状的天然活性成分及其在制备药物中的应用。
为了实现上述目的，本发明采用的技术方案为：
3,4’-O-二甲基逆没食子酸及其衍生物；所述衍生物是3,4’-O-二甲基逆没食子酸-4-O-α-D-葡萄糖苷；
所述3,4’-O-二甲基逆没食子酸的结构式如下式I：
Figure BDA0002444401370000031
所述3,4’-O-二甲基逆没食子酸-4-O-α-D-葡萄糖苷的结构式如下式II：
Figure BDA0002444401370000032
本发明所述的3,4’-O-二甲基逆没食子酸(也可以称之为3,4’-O-二甲基鞣花酸)、3,4’-O-二甲基逆没食子酸-4-O-α-D-葡萄糖苷(也可以称之为3,4’-O-二甲基鞣花酸-4-O-α-D-葡萄糖苷)是从地榆中提取得到的两种天然活性成分，相应的活性成分经过细胞实验发现具有促进巨核细胞分化作用，具有治疗血小板减少症的潜力。
本发明的另一目的是提供一种药物，所述药物含有上述二甲基逆没食子酸和逆没食子酸葡萄糖苷衍生物，具体如下。或者提供上述式I、式II化合物的制药用途。
3,4’-O-二甲基逆没食子酸和/或3,4-O-二甲基逆没食子酸-4-O-α-D-葡萄糖苷在制备药物中的用途。
所述3,4’-O-二甲基逆没食子酸的结构式如下：
Figure BDA0002444401370000041
所述3,4’-O-二甲基逆没食子酸-4-O-α-D-葡萄糖苷的结构式如下：
Figure BDA0002444401370000042
本发明所述药物含有上述二甲基逆没食子酸和逆没食子酸葡萄糖苷衍生物，二甲基逆没食子酸可以是药物中的唯一/唯二活性成分，也可以是作为药物中的必要活性成分之一。必要的情况下可以将上述式I、式II化合物和其他活性成分配合形成组合物用于制备药物。
即，3,4’-O-二甲基逆没食子酸和/或3,4’-O-二甲基逆没食子酸-4-O-α-D-葡萄糖苷作为唯一/唯二活性成分或者必要活性成分之一/之二。
进一步，3,4’-O-二甲基逆没食子酸和/或3,4’-O-二甲基逆没食子酸-4-O-α-D-葡萄糖苷在制备用于治疗血小板减少症药物中的用途。
作为本发明的优选方案，3,4’-O-二甲基逆没食子酸和/或3,4’-O-二甲基逆没食子酸-4-O-α-D-葡萄糖苷通过促进巨核细胞分化发挥治疗血小板减少症的作用。
作为本发明的优选方案，3,4’-O-二甲基逆没食子酸和/或3,4’-O-二甲基逆没食子酸-4-O-α-D-葡萄糖苷通过上调NF-E2的表达促进巨核细胞分化。
作为本发明的优选方案，3,4’-O-二甲基逆没食子酸和/或3,4’-O-二甲基逆没食子酸-4-O-α-D-葡萄糖苷通过上调NF-E2、SATA3、CKS1B、IL6R、IL-11Rα、TPM4、IL16、RPL5、KLF9、NF-E4中至少一种的表达发挥作用。
作为本发明的优选方案，3,4’-O-二甲基逆没食子酸和/或3,4’-O-二甲基逆没食子酸-4-O-α-D-葡萄糖苷通过下调GSK3β、NEK6、KIF2A及MAP4中至少一种的表达发挥作用。
进一步，所述3,4’-O-二甲基逆没食子酸和/或3,4’-O-二甲基逆没食子酸-4-O-α-D-葡萄糖苷是从以下植物中至少一种提取得到的：湖北大戟Euphorbia hylonoma Hand-Mazz、非洲芒果Irvingia gabonensis、Phyllagathis rotundifolia、Potentillacandicans、火殃勒Euphorbia antiquorum L.、Eucalyptusglobulus Labill、羽叶蓼Polygonum runcinatum Buch、Sapum sebiferun(L.)Roxb.、大戟Euphorbia pekinensisRupr、余甘子Phyllanthus emblica L.、准噶尔大戟Euphorbia soongarica Boiss、十齿花Dipentodon sinicus、海桑Sonneratia caseolaris。
进一步，所述药物可以根据需要添加应用必要的药学可接受的辅料成分。
综上所述，由于采用了上述技术方案，本发明的有益效果是：
1、本发明地榆活性成分采用天然地榆提取分离得到，能显著促进巨核细胞分化，具有作为治疗血小板减少症药物活性成分的潜力。
2、本发明使用3,4’-O-二甲基逆没食子酸和/或3,4’-O-二甲基逆没食子酸-4-O-α-D-葡萄糖苷进行药物制备，充分发挥其药用价值。
3、本发明使用的3,4’-O-二甲基逆没食子酸和/或其衍生物糖苷能够调控巨核细胞分化作用与多个基因及信号通路有关，其中与NF-E2启动子去甲基化最为密切。
4、本发明使用的3,4’-O-二甲基逆没食子酸能够上调NF-E2、SATA3、CKS1B、IL6R、IL-11Rα、TPM4、IL16、RPL5、KLF9、NF-E4中至少一种的表达，下调GSK3β、NEK6、KIF2A及MAP4中至少一种的表达，具有深层次基础调节作用，具有作为治疗血小板减少症药物活性成分的潜力。
附图说明：
图1地榆成分对HEL细胞分化的影响。
图2是DMAG促进HEL分化的时间浓度关系。
图3是统计分析DMAG促进HEL细胞大细胞生成的时间浓度关系(n＝3，*表示与对照组比较P<0.05)。
图4是DMAG对HEL细胞凋亡的影响。
图5统计分析DMAG对HEL细胞凋亡的影响(n＝3)。
图6是DMAG对HEL细胞的细胞毒性(n＝9，***表示与正常对照组比较P<0.001)。
图7是DMAG对HEL细胞形态的影响。
图8是DMAG对HEL细胞CD41、CD42b表达的影响。
图9统计分析DMAG对HEL细胞CD41、CD42b的表达影响(n＝3，***表示与对照组比较P<0.001)。
图10是DMAG对HEL细胞DNA倍性的影响。
图11统计分析DMAG对HEL细胞DNA倍性的影响(n＝3，与对照组比较，*表示P<0.05，***表示P<0.001)。
图12是qRT-PCR验证差异mRNA表达(n＝3，*表示P<0.05，**表示P<0.01，***表示P<0.001)。
图13差异表达lncRNA的靶基因与差异表达的mRNA的交集。
图14是qRT-PCR、Western Blot验证巨核细胞分化关键基因表达(n＝3，**表示与对照组比较P＜0.01，***表示与对照组比较P<0.001)。
图15是DMAG对NF-E2启动子甲基化水平的影响。
图16是DMAG、TMEA与受体S1PR，CXCR4分子对接图。
具体实施方式
下面对本发明作详细的说明。为了使本发明的目的、技术方案及优点更加清楚明白，以下实施例对本发明进行进一步详细说明。应当理解，此处所描述的具体实施例仅用以解释本发明，并不用于限定本发明。
实施例1提取分离3,4’-O-二甲基逆没食子酸和3,4’-O-二甲基逆没食子酸-4-O-α-D-葡萄糖苷
按照发明人已经发表的文章“Two Ellagic Acids Isolated from Roots ofSanguisorba officinalis L.Promote Hematopoietic Progenitor Cell Proliferationand Megakaryocyte Differentiation”或者CN 108714149 A公开的地榆活性成分提取方法，进行地榆活性成分分离纯化处理，得到多种地榆天然活性成分。
或者采用以下方法分离得到：
将500g干燥的地榆根粉碎，用10倍重量的75v％乙醇回流提取3次(3×5L，每次1h)，合并提取液，蒸发浓缩，得到乙醇提取物。加水重悬，60℃孵育30分钟。然后，用乙酸乙酯(500mL)萃取三次。减压蒸干，得到乙酸乙酯提取物。将乙酸乙酯提取物(5.0g)溶于甲醇，用AKTA柱色谱仪进行分离，使用Kromasil C18柱(250mm×20mm，5μm)，pH＝3.0盐酸(溶剂A)和甲醇(溶剂B)进行洗脱；流速：10mL/min；检测波长254nm。梯度洗脱程序如下：初始洗脱浓度为20％溶剂B，在35分钟内溶剂B增加到60％，然后在10分钟内溶剂B升至100％，保持10分钟。通过制备型HPLC进行分离纯化分别得到多个化合物成分。
经核磁共振1H-NMR和13C-NMR、红外光谱、HPLC-MS进行检验分析，确定分离得到的各种成分如下表所示。
表1地榆活性成分
编号 化学名
1 3,4’-O-二甲基逆没食子酸
2 3,4’-O-二甲基逆没食子酸-4-O-α-D-葡萄糖苷
3 3-O-甲基没食子酸甲酯
4 3-O-甲基逆没食子酸
5 地榆皂苷II
6 没食子儿茶素
7 没食子酸
8 1,2,3,4,6-O-五没食子酰葡萄糖
9 地榆皂苷I
上述表格中地榆活性成分当中，1#为3,4’-O-二甲基逆没食子酸，分子结构如下所示。
Figure BDA0002444401370000071
3,4’-O-二甲基逆没食子酸。
2#为3,4’-O-二甲基逆没食子酸-4-O-α-D-葡萄糖苷，命名为DMAG，分子结构如下所示：
Figure BDA0002444401370000081
3,4’-O-二甲基逆没食子酸-4-O-α-D-葡萄糖苷
将分离得到的各种地榆单体成分进行称重，加入DMSO配置为10mg/mL的储液并做好标记，临用前用RPMI 1640培养基稀释至400μg/mL的工作液。
实验用细胞准备：按照常规细胞培养方法，进行细胞复苏、换液、传代、冻存，得到待实验的细胞样品，备用。
实施例2地榆成分体外促巨核细胞分化活性成分的筛选
取将实施例1制备得到的地榆成分储液(10mg/mL)，用RPMI 1640培养基稀释为400μg/mL备用。取6孔板，每孔加药200μL，每个药物组3个复孔，溶剂对照组加等体积的DMSO。选取对数生长期的HEL细胞混匀，细胞计数后备用。其后取计数后的细胞悬液，调整细胞密度，以细胞密度为2×104个/孔接种于6孔板，每孔1.8mL细胞悬液，使药物终浓度为40μg/mL。在5％CO2，相对饱和湿度95％，37℃孵箱中培养6天。
检测：每天倒置相差显微镜下观察孔板内细胞分化的形态学改变(巨核细胞分化，其细胞体积变大)并拍照。为防止细胞状态变差，拍照应及时完成。
检测结果：巨核细胞分化后，呈细胞核多倍体状态，且细胞大小增加。为了筛选出地榆成分中具有促进HEL细胞分化的活性单体，使用不同地榆成分(40μg/mL)干预HEL细胞6天，每天显微镜下观察细胞状况。结果显示，显微镜下肉眼观察到样品2#干预后，HEL细胞形态不变，细胞大小明显增加，分化效果明显。而样品1#、3#、4#、5#、6#、7#、8#无明显的促分化效果，并且细胞形态不规则，出现很多细胞碎片，活细胞量少。样品9#细胞形态也无明显变化，无明显促分化效果。结果表明样品2#(DMAG)能够促进HEL细胞分化，如图1所示。
实施例3 DMAG体外促巨核细胞分化的时间浓度变化研究
取已配制好的DMAG储液(10mg/mL)，用RPMI 1640培养基稀释为400、200、100、50μg/mL备用。取6孔板，每孔加药200μL，每个药物组3个复孔，溶剂对照组加等体积的DMSO。选取对数生长期的HEL细胞混匀，细胞计数后备用。其后取计数后的细胞悬液，调整细胞密度，以细胞密度为2×104个/孔接种于6孔板，每孔1.8mL细胞悬液，使药物终浓度为40、20、10、5μg/mL。在5％CO2，相对饱和湿度95％，37℃孵箱中培养6天。
检测：每2天倒置相差显微镜下观察孔板内细胞分化的形态学改变(巨核细胞分化，其细胞体积变大)并拍照。拍照后收集全部细胞，离心去上清，用1mL PBS清洗3遍，转移至流式上样管中上机检测，观察药物组与对照组之间FSC、SSC变化。
检测结果：
1.细胞形态学变化：显微镜下观察结果显示，随着时间的增加，对照组细胞数量逐渐增加，细胞形态无明显变化。第4天时，DMAG药物各浓度组出现大细胞，但量极少。第6天时，DMAG 10、20、40μg/mL组，大细胞数目相对对照组增多，并且呈浓度依赖性。DMAG 40μg/mL组大细胞数目最多，20μg/mL组次之，10μg/mL组最少。表明DMAG 40μg/mL时，促分化效果最佳。结果如图2所示。
2.DMAG促进HEL细胞分化的时间浓度影响：为了明确DMAG干预HEL细胞的时间依赖及浓度依赖关系，使用不同浓度的DMAG(5、10、20、40μg/mL)干预HEL细胞，干预时间分别为1、2、3、4、5、6天，每天显微镜下观察细胞形态变化及使用流式检测细胞大小变化。流式细胞术可以根据FSC、SSC检测细胞大小及细胞复杂程度。FSC对应的是细胞的相对大小，FSC的值越大表示细胞越大，SSC对应的是细胞内部复杂程度，SSC的值越大说明细胞内部的颗粒越多。流式细胞术检测结果显示，第6天时，20、40μg/mL的DMAG均可促进HEL细胞增大。假设对照组的大细胞比例为1％，则20、40μg/mL组的大细胞比例分别为3.37±0.06％，3.66±0.09％，与对照组比较，差异有统计学意义(P<0.05)。DMAG 40μg/mL组大细胞比例变化最明显。结果如图3所示。
实施例4 DMAG对巨核细胞凋亡的影响
取已配制好的DMAG储液(10mg/mL)，用RPMI 1640培养基稀释为400μg/mL备用。取6孔板，每孔加药200μL，每个药物组3个复孔，溶剂对照组加等体积的DMSO。选取对数生长期的HEL细胞混匀，细胞计数后备用。其后取计数后的细胞悬液，调整细胞密度，以细胞密度为2×104个/孔接种于6孔板，每孔1.8mL细胞悬液，使药物终浓度为40μg/mL。在5％CO2，相对饱和湿度95％，37℃孵箱中培养6天。
检测：培养6天后，收集所有细胞。1000r/min离心5min后去上清，使用预冷的1mLPBS清洗细胞2次，加入1mL PBS重悬细胞，然后细胞计数，调整细胞密度为1×106个/mL，取100μL细胞悬液于EP管中，每管加入5μL Annexin V-FITC和5μL PI染液，用枪头轻轻吹匀，动作轻柔，以免细胞受损，室温避光孵育15min。15min后将EP管中的液体转移至流式检测管中，再加入400μL PBS，混匀。冰上送检。采用流式细胞术检测细胞凋亡，实验重复三次。Annexin V-FITC/PI双染结果根据4个不同的象限划分，Q1区：PI(+)AnnexinV(-)，为机械性死亡细胞区；Q2区：Pl(+)AnnexinV(+)，为晚期凋亡细胞区；Q3区：PI(-)AnnexinV(+)，为早期凋亡区；Q3区：PI(-)AnnexinV(-)，为活细胞区。
检测结果：DMAG(40μg/mL)干预HEL细胞6天后，AnnexinV-FITC/PI双染法检测显示，对照组与DMAG(40μg/mL)组凋亡率分别为1.17±0.32％、1.19±0.99％(图4-5)，表明DMAG对HEL细胞的凋亡无影响。
实施例5 DMAG的细胞毒性研究
取已配制好的DMAG储液(10mg/mL)，用RPMI 1640培养基稀释为400μg/mL备用。取96孔板，每孔加药20μL，每个组3个复孔，溶剂对照组加等体积的DMSO，最大酶活性对照组加等体积的DMSO。选取对数生长期的HEL细胞混匀，细胞计数后备用。其后取计数后的细胞悬液，调整细胞密度，以细胞密度为4000个/孔接种于96孔板，每孔180μL细胞悬液，使药物终浓度为40μg/mL。在5％CO2，相对饱和湿度95％，37℃孵箱中培养1、2、3、4、5、6天。由于血清含有乳酸脱氢酶，所以使用热灭活后的血清配置1％FBS的培养基用于培养细胞。
检测：LDH试剂盒用于检测以LDH释放为指标的细胞毒性：
(1)LDH检测工作液配制：首先将10×INT溶液稀释为1×，现配现用。然后将乳酸溶液：INT溶液(1×)：酶溶液按体积比为1：1：1避光混匀备用。
(2)到达预定检测时间点提前1小时，在最大酶活性对照组中加入20μL LDH释放试剂然后反复吹打数次使细胞破裂，然后继续在细胞培养箱中孵育。到达预定时间后，将96孔板取出放入孔板离心机中以400g速度离心5min。离心后，小心吸取孔中的上清液100μL，加入到新的96孔板中，随即用多模式微孔检测仪在450nm波长下检测96孔板各孔的吸光度OD值，根据OD值用GraphPad软件绘制细胞毒性-时间曲线，实验重复三次
DMAG细胞毒性检测结果：DMAG(40μg/mL)分别干预HEL细胞1、2、3、4、5、6天，通过LDH法对DMAG的毒性进行检测。结果显示，随着时间的增加，对照组细胞释放到细胞外的乳酸脱氢酶(LDH)量逐渐增加，但显著低于最大酶活性对照组(P<0.001)。与对照组相比，DMAG药物组从第1天到第6天，LDH释放量略低于对照组，但无显著性差异(P>0.05)(图6)，该结果提示DMAG对细胞无毒性。
通过LDH法检测细胞毒性、流式检测细胞凋亡，观察到DMAG对HEL细胞无细胞毒性以及对HEL细胞凋亡无明显影响。上述结果表明，DMAG促进分化，不影响凋亡以及无细胞毒性。
实施例6 DMAG促进巨核细胞分化的抗原表达变化
取已配制好的DMAG储液(10mg/mL)，用RPMI 1640培养基稀释为400μg/mL备用。取6孔板，每孔加药200μL，每个药物组3个复孔，溶剂对照组加等体积的DMSO。选取对数生长期的HEL细胞混匀，细胞计数后备用。其后取计数后的细胞悬液，调整细胞密度，以细胞密度为2×104个/孔接种于6孔板，每孔1.8mL细胞悬液，使药物终浓度为40μg/mL。在5％CO2，相对饱和湿度95％，37℃孵箱中培养6天。
检测：培养6天后，收集所有细胞。1000r/min离心5min后去上清，使用预冷的1mLPBS清洗细胞3次。细胞计数，调整细胞密度为1×106个/mL。根据FITC-CD41 antibody和PE-CD42b antibody试剂说明书，取100μL细胞悬液于EP管中，加入10μL FITC-CD41染液和10μLPE-CD42b染液，用枪头轻轻混匀，室温避光孵育15min。15min后将EP管中的液体转移至流式检测管中，再加入400μL PBS，混匀。冰上送检。采用流式细胞术检测细胞凋亡，实验重复三次。
FITC-CD41/PE-CD42b双染结果判定：Q2区：FITC-CD41(+)PE-CD42b(+)，为双染细胞区；Q4区：FITC-CD41(-)PE-CD42b(-)，为活细胞区。
为了进一步探究DMAG促进HEL细胞分化的作用，利用Giemsa染色观察DMAG干预后细胞形态学变化，采用流式细胞术检测HEL细胞表面抗原CD41/CD42b表达以及DNA的倍性变化。
1.DMAG促进巨核细胞分化的形态学变化：用DMAG(40μg/mL)处理细胞后第6天，显微镜下观察HEL细胞形态，Gimsa染色结果显示：与对照组相比，DMAG药物组中HEL细胞的多倍体数目增多，其中，少量细胞达到16N或者更高倍数(图7)，表明DMAG可促进HEL细胞倍性增加。
2.DMAG促进巨核细胞分化后细胞表面抗原表达变化：流式细胞术FITC-CD41/PE-CD42b双染法检测结果显示，对照组和药物组CD41(+)/CD42b(+)表达值分别为1.25％±0.13％和2.94％±0.16％。与对照组相比，DMAG药物组CD41(+)/CD42b(+)表达率显著升高，具有统计学意义(P<0.001)(图8-9)。该结果表明，DMAG可以显著刺激HEL细胞表面抗原CD41/CD42b的表达。
3.DMAG促进巨核细胞多倍性发生：应用流式细胞术检测细胞倍性，结果显示：DMAG刺激HEL细胞6天后，与对照组相比，药物组中倍性>2N及>4N的细胞数量多于对照组。对照组细胞倍性>2N的比例是17.12±1.96％，DMAG药物组为36.10±0.72％，与对照组相比，DMAG药物组DNA倍性>2N比例明显高于对照组，差异具有统计学意义(P<0.001)。对照组细胞倍性>4N的比例是1.24±0.14％，DMAG药物组为3.99±0.42％，与对照组相比，DMAG药物组DNA倍性>4N比例明显高于对照组，差异具有统计学意义(P<0.05)(图10-11)。
巨核细胞生成是一个复杂的过程，在巨核细胞生成的早期阶段，巨核系祖细胞是二倍体，具有增殖能力，并且表达巨核细胞早期谱系的相关标记；在后期阶段，巨核细胞停止分裂，但能继续复制DNA，进而成为多倍性(DNA>2N)，这一过程伴随着更多的巨核细胞特异性标志物的表达和细胞核复杂化，细胞大小增加。CD41是巨核细胞的特异性表面抗原，表达于巨核细胞分化全过程；CD42b是巨核细胞特异性表面抗原，其表达倾向于分化程度更高，更成熟的巨核细胞，它的表达预示着巨核系的终端成熟[38]。为了进一步探究DMAG促进HEL细胞分化的效果，利用Giemsa染色观察DMAG干预后细胞形态学变化，然后采用流式细胞术检测HEL细胞表面抗原CD41/CD42b表达以及DNA倍性变化。结果发现，DMAG干预后，HEL细胞体积增加，细胞核增多，表面抗原CD41(+)/CD42b(+)表达以及DNA倍性增加，表明DMAG可促进HEL分化成熟。
实施例7
采用qRT-PCR以及Western Blot等技术手段初步探究DMAG促进巨核细胞分化的分子机制。
qRT-PCR验证差异mRNA表达
NF-E2、GATA-1、GATA-2及FLI1是巨核系分化的关键转录因子，我们使用qRT-PCR对以上基因的表达进行检测。结果显示，与对照组相比，DMAG干预后NF-E2的表达显著上调，第4天时，上调最明显；GATA-1表达在第1、6、10天时与对照组无明显差异，于第2、4、8天时明显高于对照组；GATA-2表达在第4天时高于对照组，其后随着时间的延长表达下降，低于对照组；FLI1表达在第6天时高于对照组(图12)。
lncRNA表达谱与mRNA表达谱的关联分析
lncRNA能通过co-location或co-expression调控靶基因(mRNA)的表达。我们通过对差异表达lncRNA的靶基因与差异表达的mRNA进行交集分析，将lncRNA与mRNA的关系关联起来。当lncRNA的靶基因同时也是显著差异的mRNA时，该差异mRNA受到lncRNA直接或间接调控作用的可能性更大。结果显示，上调表达的lncRNA对应的靶基因(up_lncRNA-target)与上调表达的mRNA(up_mRNA)有12个基因的交集。上调表达的lncRNA对应的靶基因与下调表达的mRNA有20个基因的交集。下调表达的lncRNA对应的靶基因与上调表达的mRNA有14个基因的交集。下调表达的lncRNA对应的靶基因与下调表达的mRNA有28个基因的交集(图13)。
实施例8
Giemsa染色观察细胞形态
加药干预方法同实施例6，培养6天后，收集所有细胞。1000r/min离心5min后去上清，使用预冷的1mL PBS清洗细胞3次。然后进行Giemsa染色：Giemsa染色液提前用PH 6.8的PBS将Giemsa母液按1：2比例稀释，现配现用；离心后去除细胞上清液，加入2mL甲醇，轻轻混匀，放入4℃冰箱固定10min；取10μL细胞悬液,在载玻片上均匀涂片，自然风干；吸取200μLGiemsa染色液，滴在细胞载玻片上，使染色液均匀覆盖所有细胞，静置染色1min 40s；染色结束后，用纯水轻轻冲洗载玻片，直到浮渣尽去；冷风快速吹干，中性树胶封片，自然晾干后显微镜观察拍照。
qRT-PCR及Western Blot验证差异mRNA及
Western blot检测细胞NF-E2蛋白表达
1.细胞总蛋白的提取：制备细胞悬液方法同方法同实施例6加药干预，收集细胞，转移至EP管，4℃低温离心去上清。随后用预冷的1mL PBS清洗2次，离心尽去PBS。各EP管加入配好的裂解液(1％蛋白酶抑制剂、1％磷酸酶抑制剂，98％RIPA裂解液)，裂解30min后，将EP管转移到4℃冷冻高速离心机中，12000r/min离心20min。离心后取上清液于新的EP管中，留少量样品用BCA法测定蛋白浓度，按照体积比往其余的样品中加入5×SDS上样缓冲液，95℃煮沸5min使蛋白质变性，并保存于-20℃冰箱。
2.BCA法检测蛋白浓度：首先根据BCA试剂盒说明书，配制终浓度为0.5mg/mL蛋白标准BSA溶液，放置于-20℃冰箱内保存。然后将BCA试剂A、B(A：B比例为50:1)混匀备用。最后检测蛋白浓度：a.在96孔板中用标准品稀释液将蛋白标准品稀释成终浓度为0.5、0.4、0.3、0.2、0.1、0.05、0.025、0mg/mL的梯度浓度标准品，总体积20μL。b.提取的蛋白样品用超纯水稀释20或40倍，稀释取出20μL样品加到96孔板中。c.往上述各孔中加入200μL BCA工作液枪头轻轻混匀，于37℃孵箱中孵育30min。d.用多模式微孔检测仪在562nm波长下检测各孔吸光度OD值。e.根据吸光度值及标准品浓度绘制出标准曲线，计算样品的蛋白浓度。
3.SDS-PAGE：
参考文献方法进行分析，文献：Aurelie de Thonel,Julie Vandekerckhove,David Lanneau,et al.HSP27 controls GATA-1 protein level during erythroid celldifferentiation.Blood,116(1):85-96。
分析up_lncRNA-target vs up_mRNA关联组的lncRNA及对应的mRNA结果发现，lncRNA DIL(DMAG induced lncRNA)的潜在靶基因是NF-E2。其后使用qRT-PCR验证，结果发现，DMAG显著诱导lncRNA DIL及其潜在靶基因NF-E2的转录(图14左A)，随后通过WesternBlot对NF-E2的翻译水平进行检测，结果显示，DMAG以浓度依赖性的方式诱导NF-E2蛋白的翻译(图14中B)。由于lncRNA DIL在DMAG处理后表达水平升高倍数异常明显，其潜在靶基因NF-E2亦在巨核细胞分化和血小板生成中发挥关键作用，提示DMAG极有可能通过lncRNADIL上调NF-E2的表达继而促进巨核细胞分化和血小板生成(图14右C)。
03 DMAG诱导NF-E2启动子去甲基化
lncRNA可通过调控基因启动子区域的甲基化或去甲基化水平，改变基因的表达从而调节细胞分化。在造血谱系分化过程中，造血转录因子启动子区域常发生去甲基化从而开启基因表达，发挥促造血功能。我们通过MethPrimer软件分析了NF-E2的启动子，发现存在CpG岛(-237～-137bp)(图15A)，通过BSP技术分析了对照组和DMAG处理组NF-E2启动子CpG岛的甲基化水平。结果显示，DMAG显著诱导了NF-E2启动子的去甲基化(图15B)。
实施例9 DMAG，TMEA与受体S1PR，CXCR4分子对接结果差异比较
根据已发表文章Platelet apoptosis resistance and increased CXCR4expression in pediatric patients with chronic immune thrombocytopenicpurpura.和Sphingosine 1-phosphate release from platelets during clotformation:close correlation between platelet count and serum sphingosine 1-phosphate concentration.可知，cysteine X cysteine receptor 4(CXCR4)与sphingosine 1-phosphate receptor(S1PR)的表达与血小板减少症病理过程相关，因此比较DMAG，TMEA(3,3’,4-三-O-甲基逆没食子酸)与受体CXCR4，S1PR的分子对接结果，找出差异所在。
Figure BDA0002444401370000151
TMEA分子式
方法如下：
1.受体蛋白准备：首先从Protein Data Bank(PDB)网站下载得到两种受体的蛋白晶体结构：S1PR(3V2Y)与CXCR(3OE9),之后利用SYBYL X软件对蛋白结构进行优化，步骤如下：提取原始配体、去除水分子，修复侧链，加氢，生成对接活性口袋。
2.小分子配体准备：首先从Pubchem网站下载得到DMAG，TMEA三维分子结构文件，之后利用SYBYLX软件对其进行构象优化，得到相应mol2文件。
3.分子对接：将准备好的蛋白结构与小分子利用SYBYL X软件进行对接，得到对接结果分数，分值大于5表示蛋白与小分子显示较好的结合性能，同时分析与小分子作用的氨基酸残基，最后以配体为中心5A范围以内进行可视化处理，得到相应对接结果如图16所示。
对接结果：从结果可以看出，DMAG与TMEA无论是对S1PR受体，还是CXCR4受体，两者对接分数差值都大于1，且两者作用于同一受体时，其与之作用的氨基酸残基种类也相差较大，这表明DMAG与TMEA两者对S1PR,CXCR4受体的结合性能相差较大，且DMAG优于TMEA。DMAG、TMEA分子对接产生结合作用的氨基酸残基、对接分数结果如下表2所示。
表2分子对接氨基残基情况
Figure BDA0002444401370000161
实施例10 DMAG对辐射小鼠血小板生成的影响
具体实验方法步骤为：
1.小鼠模型建立与分组：将健康昆明小鼠，6-8周龄，饲养于SPF级动物房内，并给予辐照后的无菌饲料和无菌水，适应环境饲养一周。随机选取60只小鼠，雌雄各半，进行X射线照射1次。
2.造模条件：西南医科大学附属医院放射肿瘤科，4Gy全身单次均匀辐照。照射采集眼眶静脉血(血细胞分析稀释液160μL+眼眶静脉血40μL)后统计分析，并将血小板计数在650×103/μL至1200×103/μL之间的小鼠随机选取30只以及未辐射的小鼠6只纳入正式实验。按血小板基线水平随机将入选的照射小鼠分为模型组(生理盐水)，TPO组(3000U/kg)，地榆总提取物组(200mg/kg)，DMAG组(5mg/kg)，TMEA组(5mg/kg)以及空白对照组(生理盐水)，每组6只，雌雄各半。辐照组30只，共计36只小鼠。实验方案由西南医科大学动物使用与管理委员会批准(许可证号NO.20170341)。
3.检测指标：辐照后于第1天开始称量并记录小鼠体重，每3天记录体重1次，直至第14天。分别于第0、3、7、10、14天采集小鼠眼底静脉丛血并检测外周血象。
实验结果：如表3中所示，小鼠血小板水平的变化，显示小鼠在辐照后，血小板迅速下降，在初期下降速度低于辐照组，在辐照后第7天血小板达到最低，但TPO组和DMAG组血小板水平高于辐射组、地榆总提取组及TMEA组(***P<0.001)；随后血小板水平逐渐恢复，给药组小鼠血小板水平恢复比辐照组迅速，在辐照后第10天TPO组、地榆总提取组及DMAG组显著性升高(***P<0.001)；第14天血小板基本恢复正常水平且给药组与模型组相比均有显著性差异(**P<0.01或***P<0.001)；辐照后的小鼠再第7、10、14天和正常组相比，均有显著性差异(###P<0.001)从表34可以看出DMAG对血小板的恢复与地榆总提取物效果相当且优于相同给药剂量的TMEA组，表明DMAG对血小板生成有促进作用且优于TMEA。
表3 DMAG和TMEA对于小鼠血小板生成影响
Figure BDA0002444401370000171
通过上述实施例的也研究分析可以确定：
1.地榆逆没食子酸成分DMAG能促进巨核细胞分化，进而促进血小板生成。
2.DMAG调控巨核细胞分化作用与多个基因及信号通路有关，其中与lncRNA DIL介导NF-E2启动子去甲基化最为密切。
3.DMAG和TMEA相比，对于促进血小板生成具有更高的活性，且两者的活性差距显著。
本申请所引用的各专利、专利申请和出版文的说明全部纳入本申请参考。

Claims (8)

1.3,4'-O-二甲基逆没食子酸及其衍生物；所述衍生物是3,4'-O-二甲基逆没食子酸-4-O-α-D-葡萄糖苷；
所述3,4'-O-二甲基逆没食子酸的结构式如下式I：
Figure FDA0002444401360000011
所述3,4'-O-二甲基逆没食子酸-4-O-α-D-葡萄糖苷的结构式如下式II：
Figure FDA0002444401360000012
2.3,4'-O-二甲基逆没食子酸和/或3,4'-O-二甲基逆没食子酸-4-O-α-D-葡萄糖苷在制备药物中的用途；
所述3,4'-O-二甲基逆没食子酸的结构式如下：
Figure FDA0002444401360000021
所述3,4'-O-二甲基逆没食子酸-4-O-α-D-葡萄糖苷的结构式如下：
Figure FDA0002444401360000022
3.3,4'-O-二甲基逆没食子酸和/或3,4'-O-二甲基逆没食子酸-4-O-α-D-葡萄糖苷在制备用于治疗血小板减少症药物中的用途。
4.根据权利要求3所述用途，其特征在于，3,4'-O-二甲基逆没食子酸和/或3,4'-O-二甲基逆没食子酸-4-O-α-D-葡萄糖苷通过促进巨核细胞分化发挥治疗血小板减少症的作用。
5.根据权利要求3所述用途，其特征在于，3,4'-O-二甲基逆没食子酸和/或3,4'-O-二甲基逆没食子酸-4-O-α-D-葡萄糖苷通过上调NF-E2的表达促进巨核细胞分化发挥作用。
6.根据权利要求3或4所述用途，其特征在于，3,4'-O-二甲基逆没食子酸和/或3,4'-O-二甲基逆没食子酸-4-O-α-D-葡萄糖苷通过上调NF-E2、SATA3、CKS1B、IL6R、IL-11Rα、TPM4、IL16、RPL5、KLF9、NF-E4中至少一种的表达发挥作用。
7.根据权利要求3或4所述用途，其特征在于，3,4'-O-二甲基逆没食子酸和/或3,4'-O-二甲基逆没食子酸-4-O-α-D-葡萄糖苷通过下调GSK3β、NEK6、KIF2A及MAP4中至少一种的表达发挥作用。
8.根据权利要求2所述药物，其特征在于，所述3,4'-O-二甲基逆没食子酸和/或3,4'-O-二甲基逆没食子酸-4-O-α-D-葡萄糖苷是从以下植物中至少一种提取得到的：湖北大戟Euphorbia hylonoma Hand-Mazz、非洲芒果Irvingia gabonensis、Phyllagathisrotundifolia、Potentilla candicans、火殃勒Euphorbia antiquorum L.、Eucalyptusglobulus Labill、羽叶蓼Polygonum runcinatum Buch、Sapum sebiferun(L.)Roxb.、大戟Euphorbia pekinensis Rupr、余甘子Phyllanthus emblica L.、准噶尔大戟Euphorbia soongarica Boiss、十齿花Dipentodon sinicus、海桑Sonneratiacaseolaris。
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Citations (3)

* Cited by examiner, † Cited by third party
Publication number Priority date Publication date Assignee Title
CN105012294A (zh) * 2015-06-18 2015-11-04 苏州禾研生物技术有限公司 鞣花酸化合物在制备治疗高尿酸血症药物中的新用途
CN108714149A (zh) * 2018-05-14 2018-10-30 西南医科大学 地榆活性成分在制备抗肿瘤的药物中的用途
WO2020012175A1 (en) * 2018-07-10 2020-01-16 Nuchido Limited Compositions that protect cells from oxidative and mitochondrial stress

Patent Citations (3)

* Cited by examiner, † Cited by third party
Publication number Priority date Publication date Assignee Title
CN105012294A (zh) * 2015-06-18 2015-11-04 苏州禾研生物技术有限公司 鞣花酸化合物在制备治疗高尿酸血症药物中的新用途
CN108714149A (zh) * 2018-05-14 2018-10-30 西南医科大学 地榆活性成分在制备抗肿瘤的药物中的用途
WO2020012175A1 (en) * 2018-07-10 2020-01-16 Nuchido Limited Compositions that protect cells from oxidative and mitochondrial stress

Non-Patent Citations (1)

* Cited by examiner, † Cited by third party
Title
XIAOPING GAO ET AL.: "Two Ellagic Acids Isolated from Roots of Sanguisorba officinalis L. Promote Hematopoietic Progenitor Cell Proliferation and Megakaryocyte Differentiation", 《MOLECULES》 *

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