CN107583054A - 隐丹参酮药物组合物及其在制备治疗慢性粒细胞白血病药物中的应用 - Google Patents

Abstract

本发明公开了一种隐丹参酮药物组合物及其在制备治疗慢性粒细胞白血病药物中的应用，所述隐丹参酮药物组合物包括隐丹参酮和酪氨酸激酶抑制剂，采用隐丹参酮处理可显著降低慢性粒细胞白血病K562和多药耐药株K562/ADM细胞中Bcr‑Abl基因的蛋白表达水平，提高酪氨酸激酶抑制剂的细胞增殖抑制率，隐丹参酮联合酪氨酸激酶抑制剂可显著提高白血病细胞K562和K562/ADM的细胞凋亡率。采用本发明药物组合物可以提高酪氨酸激酶的化疗敏感性，减少患者的化疗药物用量，降低对人体的毒副作用，为临床上治疗CML提供新的治疗方案。

Description

隐丹参酮药物组合物及其在制备治疗慢性粒细胞白血病药物 中的应用

技术领域

本发明属于医药生物领域，具体涉及一种隐丹参酮药物组合物及其在制备治疗慢性粒细胞白血病药物中的应用。

背景技术

慢性粒细胞白血病(chronic myeloid leukemia,CML)是一种起源于多能造血干细胞的恶性肿瘤，其最主要的遗传学特征是出现染色体的易位，形成费城染色体，继而编码Bcr-Abl融合蛋白，该蛋白具有高度的酪氨酸激酶活性，在CML的病程发展过程中发挥了重要的调控功能。CML在我国发病率占成人新诊断白血病的15％以上，其特点为髓细胞的加速且失控地增长，以及髓细胞在血液中的过度积累。

酪氨酸激酶抑制剂(TKI)的问世为CML的治疗带来了革命性的变革，可有效提高CML患者的生存周期，已成为慢性期患者的一线治疗用药。目前临床治疗CML的一线药物伊马替尼(imatinib)、达沙替尼(dasatinib)、尼罗替尼(nilotinib)均是Bcr-abl的酪氨酸激酶抑制剂，初次治疗后细胞遗传学缓解率均可达80％以上。但随着临床应用的增加，日益严重的耐药现象严重影响了TKI药物的治疗效果，尤其当患者进入加速期和急变期后，细胞将会获得更强的耐药潜能。TKI等药物不能清除骨髓内残留的白血病干细胞，可在体内形成微小残留病灶，致使患者存在复发的风险。研究表明，CML患者获得完全分子学反应后，停用伊马替尼两年内的复发率高达61％，因此需要长期服药，治疗费用昂贵，且存在较大毒副作用。鉴于CML患者的耐药和复发已经制约了TKI的进一步临床应用，深入研究CML耐药的分子机制，靶向开发新的药物和治疗策略提高化疗的敏感性，改善TKI的治疗效果是当前的研究热点之一。

随着肿瘤耐药现象的普遍出现，传统的中草药在肿瘤治疗中的功效日益引起研究者的重视，中医药在肿瘤治疗中疗效确切，在综合治疗中具有独特的优势和地位。白血病为邪毒内侵，损伤脏腑骨髓而致，在中医中可归于“虚劳”、“症瘕”、“积聚”和“痰核”等范畴，其病症的形成与瘀血密切相关。《内经》指出：“邪之所凑其气必虚”，白血病的内因是正气不足，或先天已有胎毒内伏，复感瘟毒，邪毒侵袭，内表入里，直中骨髓，伤精耗血而发病。近代医家认为，白血病属于中医温病范畴，其伏邪为热毒，为温热毒邪伏于少阴。邪伏于里，自内达外，发则里热炽盛，火邪灼伤津液，酿液为痰，痰阻气机，气行不畅，气滞则血瘀。由此可见，白病的发病过程是因虚致病、因病致虚、虚实相兼的复杂病理过程，邪实与本虚、邪毒入血、瘀滞伤髓是白血病发病的主要病因病机。多数白血病患者有高黏血症的临床表现，气滞血瘀贯穿于白血病的各个病理阶段和发病过程，化痰活血祛瘀疗法在临床应用广泛，并获得满意疗效。“痰瘀互结”是白血病耐药的重要病机，“痰饮”、“瘀血”既是病理产物，又是新的致病因素，二者关系密切，有着共同来源，在形成过程中常互为因果，在致病时又相互为用。因此，从活血化瘀类中药中开发抗白血病药物具有广阔的应用前景。

丹参为我国传统的常用中药，具有活血、化瘀、益气等显著功效，《神农本草经》载：“丹参，味苦微寒。主心腹邪气，肠鸣幽幽如走水，寒热积聚，破症除瘕，止烦满，益气”。现代药理研究证实，丹参作用广泛，临床应用广泛，常用于心血管系统疾病、消化系统疾病、肾脏疾病和血液系统疾病的治疗。

近年来研究发现，丹参中的脂溶性丹参酮类物质可显著抑制肿瘤细胞的生长，是一类极具药物研发前景的活性化合物。隐丹参酮从丹参中分离获得的一种脂溶性丹参酮类化合物，体外试验表明，其对金葡菌及其耐药菌株、链球菌、分枝杆菌等病原菌有较强的抑制作用。研究发现，隐丹参酮在体外对多种的实体肿瘤中由显著的抗肿瘤效果，显示了良好的药物开发前景。但隐丹参酮对慢性粒细胞白血病的体内外的作用仍未见系统研究，隐丹参酮对耐药慢性粒细胞白血病患者的作用尚未明确，隐丹参酮与酪氨酸激酶抑制剂联合用药的治疗效果未见相关报道，其作用的分子机制未见研究报道。

发明内容

针对现有技术中酪氨酸激酶抑制剂在治疗慢性粒细胞白血病中的耐药现象及患者复发率高的缺陷，本发明的目的是提供一种隐丹参酮药物组合物及其在制备治疗慢性粒细胞白血病药物中的应用，该组合物提高酪氨酸激酶抑制剂的细胞增殖抑制率，隐丹参酮联合酪氨酸激酶抑制剂伊马替尼可显著提高白血病细胞K562和K562/ADM的细胞凋亡率。

本发明采用的技术方案如下：

一种隐丹参酮药物组合物，包括隐丹参酮和酪氨酸激酶抑制剂；

所述隐丹参酮包括隐丹参酮、其可药用的盐或酯、选择性取代的类似物和隐丹参酮衍生物及其衍生物在药学上可接受的盐或盐的溶剂化物中的一种或多种前述化合物的组合；

所述酪氨酸激酶抑制剂包括酪氨酸激酶抑制剂、其可药用的盐或酯、选择性取代的类似物和酪氨酸激酶抑制剂衍生物及其衍生物在药学上可接受的盐或盐的溶剂化物中的一种或多种前述化合物的组合。

所述隐丹参酮根据现有技术从丹参等植物中提取或化学合成，隐丹参酮的英文名为Cryptotanshinone，CAS NO.35825-57-1，分子式为C₁₉H₂₀O₃，分子量：296.35，其化学结构式如下：

所述的酪氨酸激酶抑制剂包括伊马替尼、尼洛替尼和达沙替尼中的至少一种。

优选地，所述隐丹参酮药物组合物包括质量比为1：0.05-5的隐丹参酮和伊马替尼，隐丹参酮联合伊马替尼处理，可显著提高慢性粒细胞白血病细胞的凋亡率，可有效抑制慢性粒细胞白血病细胞皮下移植瘤模型的体内生长速度，两者联合给药组的抑瘤率高达60.2％，显著高于伊马替尼单独给药处理组。

优选地，所述隐丹参酮药物组合物包括质量比为1000：0.5-5的隐丹参酮和尼洛替尼。

优选地，所述隐丹参酮药物组合物包括质量比为1000：0.05-0.2的隐丹参酮和达沙替尼。

优选地，所述隐丹参酮药物组合物还包括可接受的药用载体制成各种药学上可接受的制剂。

所述的药用载体包括缓释剂、赋形剂、添加剂、粘合剂、吸收促进剂、吸附载体、表面活性剂或润滑剂等。

所述的隐丹参酮药物组合物按照常规药物配制技术制成各种药学上可接受的制剂，包括针或冻干粉针制剂、丸剂、汤剂、片剂、颗粒剂、硬胶囊、软胶囊、控释、缓释制剂、注射剂或口服制剂。

本发明隐丹参酮药物组合物的制备方法不做严格限制，如可以被制成针剂形式，例如用生理盐水或含有葡萄糖和其他辅剂的水溶液通过常规方法进行制备。诸如片剂和胶囊之类的药物组合物，可通过常规方法进行制备。药物组合物如针剂、溶液、片剂和胶囊宜在无菌条件下制造。

本发明还提供了一种上所述的隐丹参酮药物组合物在制备治疗慢性粒细胞白血病药物中的应用。本发明采用隐丹参酮与酪氨酸激酶抑制剂联合处理白血病细胞，结果显示隐丹参酮对酪氨酸激酶抑制剂有显著的协同增效作用。

所述的慢性粒细胞白血病包括Bcr-abl野生型慢性粒细胞白血病和多药耐药的慢性粒细胞白血病。隐丹参酮可通过促进Bcr-abl蛋白的降解，提高慢性粒细胞白血病细胞对酪氨酸激酶抑制剂的敏感性，提高酪氨酸激酶抑制剂的抗白血病效果；隐丹参酮联合酪氨酸激酶抑制剂处理，可显著提高慢性粒细胞白血病细胞的凋亡率，可有效抑制慢性粒细胞白血病细胞皮下移植瘤模型的体内生长速度，显著高于酪氨酸激酶抑制剂单独给药处理组。

与现有技术相比，本发明具有以下有益效果：

(1)在慢性粒细胞白血病治疗领域，本发明隐丹参酮与酪氨酸激酶抑制剂联合应用可产生显著的协同增效作用，该药物组合物可显著提高慢性粒细胞白血病细胞对酪氨酸激酶抑制剂的敏感性。

(2)隐丹参酮联合伊马替尼给药后，体外可有效增加慢性粒细胞白血病细胞的凋亡率，体内对慢性粒细胞白血病细胞的皮下移植瘤的抑制作用要显著优于单独给药组。

(3)隐丹参酮为丹参中提取的单体化合物，具有毒性低、费用低廉等优点，是一种理想的新型白血病治疗增敏药，本发明隐丹参酮药物组合物可以提高酪氨酸激酶的化疗敏感性，为慢性粒细胞白血病的治疗提供了新的联合给药治疗方案，可减少酪氨酸激酶抑制剂的给药剂量，降低毒副作用和治疗费用，在白血病的治疗方面具有中药的意义和广阔的应用前景。

附图说明

图1为隐丹参酮联合酪氨酸激酶抑制剂对慢性粒细胞白血病K562细胞和多药耐药株K562/ADM细胞增殖的影响；

图2为隐丹参酮对慢性粒细胞白血病细胞K562和K562/ADM细胞中Bcr-abl基因mRNA和蛋白表达水平的影响；

图3为隐丹参酮联合伊马替尼对慢性粒细胞白血病细胞K562和K562/ADM细胞凋亡的影响；

图4为隐丹参酮联合伊马替尼体内抗慢性粒细胞白血病效果的研究结果。

具体实施方式

下面结合附图和具体实施方式对本发明做进一步的详细说明。

实施例1

隐丹参酮联合酪氨酸激酶抑制剂伊马替尼、尼洛替尼和达沙替尼抗白血病效果研究

细胞培养：人慢性髓系白血病细胞株K562购买自中国科学院上海细胞生物学研究所，多药耐药株K562/ADM通过极限梯度稀释法自主建立获得，其对伊马替尼的耐药倍数在20以上，对尼洛替尼和达沙替尼的耐药倍数在15以上。K562和K562/ADM细胞培养在含有10％的胎牛血清、青霉素100U/ml和链霉素100μg/ml的RPIM 1640培养基中，在于37℃、5％CO₂培养箱中传代培养，每两天换液一次。

药物母液配制：

隐丹参酮利用DMSO配制成10mM的工作母液，保存于-20℃备用，使用前用RPIM1640培养液调至所需浓度。伊马替尼利用DMSO配制为5mM的工作母液，使用前用RPIM 1640培养液调至所需浓度。达沙替尼利用DMSO配制为2μM的工作母液，使用前用RPIM 1640培养液调至所需浓度。尼洛替尼利用DMSO配制为50μM的工作母液，使用前用RPIM1640培养液调至所需浓度。

细胞生长的抑制实验：

(1)获取细胞

将K562和K562/ADM细胞培养至对数生长期细胞收集后，利用RPIM1640培养基调整细胞密度至2×10⁵/mL后，以每孔100μL的体积转入96孔培养板中。

(2)加药处理

将K562和K562/ADM细胞培养至对数生长期细胞收集后，利用RPIM1640培养基调整细胞密度至2×10⁵/mL后转入96孔培养板中，每孔100μL，空白对照组细胞中加入只含有DMSO的新鲜培养基100μL，药物处理组中加入隐丹参酮、伊马替尼、达沙替尼、尼洛替尼、隐丹参酮/伊马替尼、隐丹参酮/达沙替尼和隐丹参酮/尼洛替尼的混合培养基100μL。具体的加药处理过程、稀释倍数、加药体积如下：

在K562细胞中，空白对照组(Control)中加入含有体积分数为千分之一DMSO的新鲜RPIM 1640培养液100μL；

隐丹参酮单独给药组(CPT)中药物的终浓度为10μM，取配置好的10mM的隐丹参酮工作母液，利用RPIM 1640培养液稀释至10μM的工作浓度(稀释1000倍)，吹打混匀后，取100μL加入96孔培养板中的隐丹参酮药物组；

伊马替尼单独给药组(imatinib)中药物的终浓度为0.5μM，取配置好的5mM的伊马替尼工作母液，利用RPIM 1640培养液稀释至0.5μM的工作浓度(稀释10000倍)，吹打混匀后，取100μL加入96孔培养板中的伊马替尼给药组；

达沙替尼单独给药组(Dasatinib)中药物的终浓度为0.5nM，取配置好的2μM的达沙替尼工作母液，利用RPIM 1640培养液稀释至0.5nM的工作浓度(稀释4000倍)，吹打混匀后，取100μL加入96孔培养板中的伊马替尼给药组；

尼洛替尼单独给药组(Nilotinib)中药物的终浓度为5nM，取配置好的50μM的尼洛替尼工作母液，利用RPIM 1640培养液稀释至5nM的工作浓度(稀释10000倍)，吹打混匀后，取100μL加入96孔培养板中的尼洛替尼给药组；

隐丹参酮/伊马替尼联合给药组(imatinib+CPT)中，隐丹参酮的终浓度为10μM，伊马替尼的终浓度为0.5μM，取配置好的10mM的隐丹参酮工作母液和5mM的伊马替尼工作母液，利用RPIM 1640培养液稀释至工作浓度(其中隐丹参酮稀释1000倍，伊马替尼稀释10000倍)，吹打混匀后，取100μL加入96孔培养板中的隐丹参酮/伊马替尼联合给药组；

隐丹参酮/达沙替尼联合给药组(Dasatinib+CPT)中，隐丹参酮的终浓度为10μM，达沙替尼的终浓度为0.5nM，取配置好的10mM的隐丹参酮工作母液和2μM的达沙替尼工作母液，利用RPIM 1640培养液稀释至工作浓度(其中隐丹参酮稀释1000倍，达沙替尼稀释4000倍)，吹打混匀后，取100μL加入96孔培养板中的隐丹参酮/伊马替尼联合给药组；

隐丹参酮/尼洛替尼联合给药组(Nilotinib+CPT)中，隐丹参酮的终浓度为10μM，尼洛替尼的终浓度为5nM，取配置好的10mM的隐丹参酮工作母液和50μM的尼洛替尼工作母液，利用RPIM 1640培养液稀释至工作浓度(其中隐丹参酮稀释1000倍，尼洛替尼稀释10000倍)，吹打混匀后，取100μL加入96孔培养板中的隐丹参酮/尼洛替尼联合给药组。

在多药耐药株K562/ADM细胞中，空白对照组中加入含有体积分数为千分之一DMSO的新鲜RPIM 1640培养液100μL；

隐丹参酮单独给药组中药物的终浓度为10μM，取配置好的10mM的隐丹参酮工作母液，利用RPIM 1640培养液稀释至10μM的工作浓度(稀释1000倍)，吹打混匀后，取100μL加入96孔培养板中的隐丹参酮药物组；

伊马替尼单独给药组中药物的终浓度为2μM，取配置好的5mM的伊马替尼工作母液，利用RPIM 1640培养液稀释至2μM的工作浓度(稀释2500倍)，吹打混匀后，取100μL加入96孔培养板中的伊马替尼给药组；

达沙替尼单独给药组中药物的终浓度为2nM，取配置好的2μM的达沙替尼工作母液，利用RPIM 1640培养液稀释至2nM的工作浓度(稀释1000倍)，吹打混匀后，取100μL加入96孔培养板中的伊马替尼给药组；

尼洛替尼单独给药组中药物的终浓度为50nM，取配置好的50μM的尼洛替尼工作母液，利用RPIM 1640培养液稀释至50nM的工作浓度(稀释1000倍)，吹打混匀后，取100μL加入96孔培养板中的尼洛替尼给药组；

隐丹参酮/伊马替尼联合给药组中，隐丹参酮的终浓度为10μM，伊马替尼的终浓度为2μM，取配置好的10mM的隐丹参酮工作母液和5mM的伊马替尼工作母液，利用RPIM 1640培养液稀释至工作浓度(其中隐丹参酮稀释1000倍，伊马替尼稀释2500倍)，吹打混匀后，取100μL加入96孔培养板中的隐丹参酮/伊马替尼联合给药组；

隐丹参酮/达沙替尼联合给药组中，隐丹参酮的终浓度为10μM，达沙替尼的终浓度为2nM，取配置好的10mM的隐丹参酮工作母液和2μM的达沙替尼工作母液，利用RPIM 1640培养液稀释至工作浓度(其中隐丹参酮稀释1000倍，达沙替尼稀释1000倍)，吹打混匀后，取100μL加入96孔培养板中的隐丹参酮/伊马替尼联合给药组；

隐丹参酮/尼洛替尼联合给药组中，隐丹参酮的终浓度为10μM，尼洛替尼的终浓度为50nM，取配置好的10mM的隐丹参酮工作母液和50μM的尼洛替尼工作母液，利用RPIM 1640培养液稀释至工作浓度(其中隐丹参酮稀释1000倍，尼洛替尼稀释1000倍)，吹打混匀后，取100μL加入96孔培养板中的隐丹参酮/尼洛替尼联合给药组。

每个药物浓度设定5个复孔，加药处理完成后，晃动96孔培养板以混匀，置于37℃恒温培养箱中处理24h。取出96孔培养板，在每孔加入20μL的MTT溶液(5mg/ml)后置于37℃培养箱静置中4h，小心吸取上清液后加入150μl的DMSO溶液，室温震荡5min促进结晶沉淀物的溶解，利用酶标仪在490nm波长下测定每孔的吸光值，每组实验结果重复3次。

细胞增殖抑制率按照空白对照组吸收值减去药物处理组吸收值后除以空白组吸收值的百分率表示，反映的是各孔中细胞的存活率，据此可算出各孔细胞在药物作用下的增殖抑制情况。

隐丹参酮联合酪氨酸激酶抑制剂伊马替尼、达沙替尼和尼洛替尼对慢性粒细胞白血病K562细胞和多药耐药株K562/ADM细胞增殖的影响如图1所示，其中，A：隐丹参酮联合伊马替尼对K562细胞增殖的影响；B：隐丹参酮联合达沙替尼对K562细胞增殖的影响；C：隐丹参酮联合尼洛替尼对K562细胞增殖的影响；D：隐丹参酮联合伊马替尼对K562/ADM细胞增殖的影响；E：隐丹参酮联合达沙替尼对K562/ADM细胞增殖的影响；F：隐丹参酮联合尼洛替尼对K562/ADM细胞增殖的影响。由图1结果可知，隐丹参酮可以显著提高酪氨酸激酶抑制剂伊马替尼、达沙替尼和尼洛替尼对白血病细胞K562和K562/ADM细胞的增殖抑制效果。在K562细胞中，10μM的隐丹参酮联合0.5μM伊马替尼、0.5nM达沙替尼和5nM尼洛替尼对细胞的抑制率可达到54.92％、65.65％和50.07％。在多药耐药株K562/ADM细胞中，10μM的隐丹参酮联合2μM伊马替尼、2nM达沙替尼和50nM尼洛替尼对细胞的增殖抑制率可达68.33％、60.42％和50.59％，均显著高于酪氨酸激酶抑制剂单独给药组和隐丹参酮单独给药组。

根据药物的协同指数计算公式CDI＝AB/(A×B)(Kong R,Sun B,Jiang H,Pan S,Chen H,Wang S,Krissansen GW,Sun X(2012)Downregulation of nuclear factor-kappaB p65subunit by small interfering RNA synergizes with gemcitabine toinhibit the growth of pancreatic cancer.Cancer Lett 291(1):90-98)，计算隐丹参酮与酪氨酸激酶抑制剂伊马替尼、达沙替尼和尼洛替尼的协同指数，在K562细胞中隐丹参酮与伊马替尼、达沙替尼和尼洛替尼的协同指数分别是0.542、0.429和0.649，在K562/ADM细胞中隐丹参酮与伊马替尼、达沙替尼和尼洛替尼的协同指数分别是0.364、0.484和0.618，协同指数远小于1，该结果说明隐丹参酮与酪氨酸激酶抑制剂伊马替尼、达沙替尼、尼洛替尼有显著的协同作用。隐丹参酮可有效提高伊马替尼、达沙替尼、尼洛替尼的抗白血病效果，在白血病治疗领域，具有广阔的应用前景。

实施例2

隐丹参酮协同伊马替尼抗白血病的分子机制研究

为进一步明确隐丹参酮在白血病治疗中的应用前景，本发明对隐丹参酮提高伊马替尼化疗敏感性的作用机制进行了研究，检测了隐丹参酮处理后，与白血病凋亡密切相关的Bcr-abl信号通路的活性变化情况。

取对数生长期的白血病细胞K562和多药耐药株K562/ADM细胞，调整细胞密度至5×10⁵/mL后，按每孔2mL接种于6孔板中培养过夜后，加入含有不同浓度的隐丹参酮培养液(5μM、10μM、15μM和20μM)处理24h，对照组(Control)加入新鲜培养液。其中隐丹参酮母液浓度为10mM，利用DMSO配制，利用RPIM 1640培养液稀释至工作浓度，稀释倍数分别为2000倍、1000倍、667倍和500倍。

采用相对定量PCR技术和Western blot技术检测了隐丹参酮处理后Bcr-abl基因在mRNA和蛋白表达水平的变化：收集各组细胞后，加入TRIZol试剂提取各组细胞总RNA，用紫外分光光度仪测定RNA浓度及纯度，利用Takara反转录试剂盒获得各组cDNA。Real-timePCR采用SYBRGreen I荧光染料法，测定隐丹参酮加入后K562细胞和K562/ADM细胞中Bcr-abl基因表达水平的变化，以GAPDH基因为内参，各个基因的引物序列如表1所示。

表1

反应体系体积为25μL，包括：2×SYBR Primer Ex Taq 12.5μL，上下游引物(10μmol/L)各1μL，cDNA模板2μL，无菌水8.5μL，反应条件为ABI 7900定量PCR仪默认标准程序。获取溶解曲线以确认PCR反应的特异性，根据实时荧光定量扩增曲线获取目的基因和内参基因的Ct值，以目的基因表达的相对定量值(RQ值)进行统计学分析。

药物处理完毕后，离心收集细胞后利用PBS清洗1次，加入适量的RIPA裂解液提取总蛋白，BCA测定蛋白浓度后，利用SDS-PAGE凝胶电泳进行分离，然后转印到PVDF膜上，用含5％脱脂奶粉的TBST溶液封闭1h，一抗孵育过夜，再用TBST漂洗3次后，加入辣根酶标记的二抗，室温作用2h，用显色剂ECL试剂盒显色，检测药物处理后目的蛋白条带Bcr-abl的变化情况，以β-Actin蛋白作为内参。

结果如图2所示，其中，A：隐丹参酮对白血病细胞K562和K562/ADM细胞中Bcr-abl基因在mRNA表达水平的影响；B：隐丹参酮对白血病细胞K562和K562/ADM细胞中Bcr-abl基因在蛋白表达水平的影响。隐丹参酮的加入对Bcr-abl基因蛋白表达水平的影响较大，而对Bcr-abl基因的mRNA表达水平影响不大，隐丹参酮显著抑制了K562和K562/ADM细胞中Bcr-abl的蛋白表达水平，且呈现明显的剂量依赖性。在K562细胞中，5μM的隐丹参酮处理24h后，bcr-abl的蛋白表达水平降低了约30％，而当隐丹参酮浓度增加为10μM时，其表达水平可降低56％。在K562/ADM细胞中，10μM的隐丹参酮处理后bcr-abl的蛋白表达水平只有对照细胞的24％。该结果提示隐丹参酮提高伊马替尼药效的机制可能是通过抑制CML细胞中bcr-abl信号通路的活性。

实施例3

隐丹参酮联合伊马替尼对白血病细胞凋亡的影响

为进一步明确隐丹参酮联合酪氨酸激酶抑制剂的抗白血病效果，本发明检测了隐丹参酮联合伊马替尼对白血病细胞K562和多药耐药株K562/ADM细胞凋亡率的影响。

细胞凋亡率的实验采用Annexin V-FITC/PI双染法检测细胞凋亡率。取对数生长期K562和K562/ADM细胞，调整细胞悬液密度至5×10⁵个/ml，然后以5ml接种于直径60mm培养皿内。在K562细胞中分别加入不含药物(Control)、含有10μM的隐丹参酮(10μM CPT)、含有0.5μM的伊马替尼(0.5μM imatinib)、含有10μM的隐丹参酮和0.5μM的伊马替尼的新鲜培养基(imatinib+CPT)；在K562/ADM细胞中，分别加入不含药物(Control)、含有10μM的隐丹参酮(10μM CPT)、含有2μM的伊马替尼(2μM imatinib)、含有10μM的隐丹参酮和2μM的伊马替尼的新鲜培养基(imatinib+CPT)。药物处理时间为24h，处理完毕后，离心收集各组细胞并用预冷的PBS洗一次。

用稀释好的结合缓冲液重悬各组细胞，调整细胞密度为1×10⁶个/ml。取100μl的细胞悬液于5ml流式管中，加入5μl Annexin V-FITC和10μl10mg/L的碘化丙啶(PI)溶液，混匀后室温避光孵育15min，然后加入400μl稀释好的结合缓冲液，用流式细胞仪进行细胞凋亡百分率的检测，观察药物对细胞凋亡的诱导作用。结果如图3所示，其中，A：隐丹参酮联合伊马替尼对K562细胞凋亡的影响；B：隐丹参酮联合伊马替尼对K562/ADM细胞凋亡的影响。由图3中结果可知，隐丹参酮的加入可有效的提高伊马替尼诱导细胞凋亡的效果，隐丹参酮和伊马替尼联合处理后，可显著的增加K562细胞和K562/ADM细胞的凋亡率。不加药物处理的K562细胞早期凋亡率为5.2％，伊马替尼和隐丹参酮单独处理后细胞的早期凋亡率分别为7.8％和6.5％，而隐丹参酮和伊马替尼联合处理组的细胞早期凋亡率高达17.2％，远高于伊马替尼单独给药组。在慢性粒细胞白血病多药耐药株K562/ADM细胞中，隐丹参酮和伊马替尼协同诱导细胞凋亡的效果要更为显著，伊马替尼和隐丹参酮单独处理后细胞的早期凋亡率为6.4％和5.2％，两者联合处理后细胞的早期凋亡率则提高为18.6％，是伊马替尼单独给药处理组的2.9倍。与此同时，联合药物处理后细胞的晚期凋亡率要显著的高于单独药物处理组，该结果与实施例1中，MTT的检测结果一致，进一步明确了隐丹参酮对酪氨酸激酶抑制剂伊马替尼疗效的提高作用。

实施例4

隐丹参酮联合伊马替尼的体内抗白血病效果研究

体内检测隐丹参酮联合伊马替尼的抗白血病效果，将慢性粒细胞白血病细胞K562按照按5×10⁵个细胞接种于随机分组的裸鼠皮下，建立裸鼠的K562细胞皮下移植瘤模型，将荷瘤小鼠模型随机分成4组，分别为对照组(Control，生理盐水)，伊马替尼组(imatinib，50mg/kg，p.o.)，隐丹参酮组(CPT，10mg/kg，p.o.)，隐丹参酮和伊马替尼协同组(imatinib+CPT，50mg/kg imatinib+10mg/kg CPT，p.o.)，其中伊马替尼采用生理盐水溶解，隐丹参酮利用生理盐水+10％乙醇+10％的蓖麻油的混合乳剂配制，充分混匀制成隐丹参酮的混悬液。每4天测量小鼠成瘤长径a(mm)及短径b(mm)，计算肿瘤体积V＝π/6×ab²(mm³)，连续给药3周后，取小鼠皮下瘤称重。

结果如图4所示，其中，其中，A：隐丹参酮和伊马替尼单独或者联合处理后，K562细胞皮下移植瘤体内生长的变化情况；B：隐丹参酮和伊马替尼单独或者联合处理对K562细胞体内肿瘤体积的影响；C：隐丹参酮和伊马替尼单独或者联合处理对K562细胞体内肿瘤重量的影响。结果表明，隐丹参酮单独使用对肿瘤的体积和重量均没有明显抑制作用，但可显著的提高伊马替尼的体内抑瘤效果。经测量肿瘤体积，伊马替尼给药3周后的体积抑瘤率为仅为14.8％，而隐丹参酮与伊马替尼联合给药后，肿瘤体积的抑瘤率为64.8％。剥取瘤块后进行称重，结果表明伊马替尼单独给药组的抑瘤率为23.08％，隐丹参酮和伊马替尼联合给药组的抑瘤率高达60.2％，是伊马替尼单独给药组的2.6倍。上述结果证明，隐丹参酮可作为一种CML的化疗增敏剂，用于后续的开发。

Claims (8)

1.一种隐丹参酮药物组合物，其特征在于，包括隐丹参酮和酪氨酸激酶抑制剂；

所述隐丹参酮包括隐丹参酮、其可药用的盐或酯、选择性取代的类似物和隐丹参酮衍生物及其衍生物在药学上可接受的盐或盐的溶剂化物中的一种或多种前述化合物的组合；

所述酪氨酸激酶抑制剂包括酪氨酸激酶抑制剂、其可药用的盐或酯、选择性取代的类似物和酪氨酸激酶抑制剂衍生物及其衍生物在药学上可接受的盐或盐的溶剂化物中的一种或多种前述化合物的组合。

2.根据权利要求1所述的隐丹参酮药物组合物，其特征在于，所述的酪氨酸激酶抑制剂包括伊马替尼、尼洛替尼和达沙替尼中的至少一种。

3.根据权利要求2所述的隐丹参酮药物组合物，其特征在于，所述隐丹参酮药物组合物包括质量比为1：0.05-5的隐丹参酮和伊马替尼。

4.根据权利要求2所述的隐丹参酮药物组合物，其特征在于，所述隐丹参酮药物组合物包括质量比为1000：0.5-5的隐丹参酮和尼洛替尼。

5.根据权利要求2所述的隐丹参酮药物组合物，其特征在于，所述隐丹参酮药物组合物包括质量比为1000：0.05-0.2的隐丹参酮和达沙替尼。

6.根据权利要求1所述的隐丹参酮药物组合物，其特征在于，所述隐丹参酮药物组合物还包括可接受的药用载体制成各种药学上可接受的制剂。

7.一种根据权利要求1～6任一项所述的隐丹参酮药物组合物在制备治疗慢性粒细胞白血病药物中的应用。

8.根据权利要求7所述的隐丹参酮药物组合物在制备治疗慢性粒细胞白血病药物中的应用，其特征在于，所述的慢性粒细胞白血病包括Bcr-abl野生型慢性粒细胞白血病和多药耐药的慢性粒细胞白血病。