CN104161759A - 阿那格雷及其衍生物的抗肿瘤用途 - Google Patents

阿那格雷及其衍生物的抗肿瘤用途 Download PDF

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Abstract

本发明提供了阿那格雷及其衍生物的抗肿瘤用途，具体地，本发明提供了阿那格雷及其衍生物在制备治疗或抑制肿瘤的药物或药物组合物的用途。本发明的化合物用于制备抗肿瘤药物，具有用量少，安全性好等特点，十分适合用于抗肿瘤药物的开发和生产。

Description

阿那格雷及其衍生物的抗肿瘤用途
技术领域
本发明涉及药物领域，具体地，本发明提供了药物阿那格雷及其衍生物在的抗肿瘤的用途
背景技术
癌症已经成为威胁人类健康的第二大疾病，而目前人类依旧没有很好的办法治疗癌症。已知人类基因组共有30,000个基因，已知的药物作用靶点约有200个，从基因组推测的理论靶点约2000个，而临床上已有药物约为10,000种，包括1200种不同的结构类型。因此，目前已经拥有大量的化合物来针对人体内各种功能和结构各异的靶点蛋白，且这些已经上市的药物具有已被证明的安全性和良好的生物利用度。
阿那格雷（Anagrelide）又称安归宁，其结构式为6,7-二氯-1,5-二氢咪唑并[2,1-b]喹唑啉-2(3H)酮，1997年3月在美国上市，作为磷酸二酯酶抑制剂，用于治疗抗血小板增多症。早在1979年，美国科学家J.S.Fleming和J.P.Buyniski发现，新型小分子化合物BL-4162A（Anagrelide）在动物试验中表现出显著的抗血栓功能。随后的研究发现，Anagrelide能抑制磷酸二酯酶(PDE)的活性，提高细胞内cAMP的含量，从而影响血细胞的增殖、成熟、分化等功能。然而，阿那格雷（Anagrelide）在治疗肿瘤中的作用和应用尚未见报道。因此，本领域尚没有阿那格雷或其衍生物在肿瘤治疗方面的应用。
鉴于目前尚缺乏令人满意的有效治疗肿瘤的方法，因此本领域迫切需要开发新的治疗肿瘤的药物。
发明内容
本发明提供了一种药物阿那格雷（Anagrelide）及其衍生物在用于肿瘤治疗中的新用途。
本发明的第一方面，一种式I化合物，其光学异构体，或其药学上可接受的盐或前药的用途，用于制备治疗或抑制肿瘤和/或抑制肿瘤细胞生长的药物或药物组合物；
(I)
其中，
R1、R2、R3、R4、R5、R6、R7和R8各自独立地选自下组：氢原子、卤素原子、氨基、羟基、氰基、醛基、硝基、羧基、取代或未取代的C1～C10烷基、取代或未取代的C3～C10环烷基、取代或未取代的C2～C10烯基、取代或未取代的C2～C10炔基、取代或未取代的C6～C10芳基、取代或未取代的C1～C10杂芳基、取代或未取代的C1～C10烷氧基、取代或未取代的C6～C10芳基-氧基、取代或未取代的C1～C10杂芳基-氧基、取代或未取代的C1～C10酰基、取代或未取代的C1～C10酯基、取代或未取代的C1～C10磺酰基；
或R1和R2共同构成，和/或R3和R4共同构成选自下组的基团：取代或未取代的C3～C20环烷基、取代或未取代的C1～C20杂环烷基、=O；
R9选自下组：氢原子、氧原子、取代或未取代的C1～C10烷基、取代或未取代的C3～C10环烷基、取代或未取代的C6～C10芳基、取代或未取代的C1～C10杂芳基、取代或未取代的C1～C10烷氧基、取代或未取代的C6～C10芳基-氧基、取代或未取代的酰基、取代或未取代的C1～C10磺酰基；
其中，所述取代指基团上的一个或多个氢原子被选自下组的取代基取代：C1～C10烷基、C3～C10环烷基、C1～C10烷氧基、卤素、羟基、羧基、C1～C10醛基、C2～C10酰基、C2～C10酯基、氨基、苯基；
所述的苯基包括未取代的苯基或具有1-3个取代基的取代苯基，所述取代基选自：卤素、C1-C10烷基、氰基、OH、硝基、C3～C10环烷基、C1～C10烷氧基、氨基。
在另一优选例中，所述R1、R2、R3、R4、R5、R6、R7和R8各自独立地选自下组：氢原子、卤素原子、氨基、羟基、氰基、硝基、氨基、醛基、羧基、取代或未取代的C1～C5烷基、取代或未取代的C3～C6环烷基、取代或未取代的C2～C5烯基、取代或未取代的C2～C5炔基、取代或未取代的C6～C10芳基、取代或未取代的C1～C6杂芳基、取代或未取代的C1～C5烷氧基、取代或未取代的C6～C10芳基-氧基、取代或未取代的C1～C6杂芳基-氧基、取代或未取代的-CO-C1～C5烷基、取代或未取代的C1～C5烷基-COO-、取代或未取代的C1～C5磺酰基；或R1和R2、R3和R4共同构成选自下组的基团：取代或未取代的C3～C10环烷基、取代或未取代的C1～C10杂环烷基、羰基；
R9选自下组：氢原子、氧原子、取代或未取代的C1～C5烷基、取代或未取代的C3～C6环烷基、取代或未取代的C6～C10芳基、取代或未取代的C1～C10杂芳基、取代或未取代的C1～C5烷氧基、取代或未取代的C6～C10芳基-氧基、取代或未取代的-CO-C1～C5烷基、取代或未取代的C1～C5磺酰基；
其中，所述取代的定义如上所述。
在另一优选例中，R1～R8各自独立地选自下组：氢原子、卤素原子、氰基、取代或未取代的C1～C5烷基、取代或未取代的C3～C6环烷基；
或R1和R2共同构成，和/或R3和R4共同构成选自下组的基团：取代或未取代的C1～C5环烷基、取代或未取代的C1～C5杂环烷基、羰基；
R9选自下组：氢原子、取代或未取代的C1～C5烷基、取代或未取代的C3～C6环烷基；
其中，所述取代的定义如上所述。
在另一优选例中，所述的R1～R9中的1～8个为氢原子，较佳地2～7个为氢原子。
在另一优选例中，所述的R1～R8中的1～8个为卤素原子。
在另一优选例中，所述的R1～R8中的1～8个为卤素原子，且其他R1～R8均为氢原子。
在另一优选例中，所述的式I化合物具有如式II所示的结构：
（II）
在另一优选例中，所述的药学上可接受的盐为选自下组的盐：盐酸盐、醋酸盐、磷酸盐，或其组合。
在另一优选例中，所述的药物组合物包括：(a)治疗有效量的阿那格雷；和(b)药学上可接受的载体。
在另一优选例中，所述阿那格雷的有效浓度为0.01nM/L-1mM/L，较佳地为0.1nM/L-500μM/L，最佳地为1nM/L-100μM/L。
在另一优选例中，所述药物组合物中阿那格雷的含量为0.01－99wt%，较佳地为0.1-90wt％。
在另一优选例中，所述药物或药物组合物还用于诱导肿瘤细胞凋亡。
在另一优选例中，所述药物或药物组合物还用于干扰肿瘤细胞增殖。
在另一优选例中，所述药物或药物组合物还用于调控肿瘤细胞的细胞周期；和/或
所述药物或药物组合物还用于阻滞细胞周期。
在另一优选例中，所述药物或药物组合物用于诱导肿瘤细胞产生G1、G2周期阻滞。
在另一优选例中，所述药物或药物组合物还用于抑制肿瘤细胞的转移。
在另一优选例中，所述的肿瘤或肿瘤细胞选自：肝癌、宫颈癌、神经胶质瘤、结肠癌、肾癌、乳腺癌、肺癌、前列腺癌、胰腺癌、皮肤癌、鼻咽癌、食道癌、胃癌、卵巢癌、黑色素瘤。
在另一优选例中，所述的肿瘤细胞选自下组：Hela、H4、FHCC98、SMMC7721、BEL7404、A498、SW1116、MDA-MB-231、MDA-MB-468、DU145、U87-MG、Wi38、H1299，或其组合。
在另一优选例中，所述肿瘤细胞选自下组：Hela、H4、FHCC98、SMMC7721、或其组合。
本发明的第二方面，提供了一种细胞周期阻滞剂，所述阻滞剂包含有效量的所述的式I化合物，或其药学上可接受的盐或前药，或其药物组合物。
在另一优选例中，所述的式I化合物为阿那格雷。
在另一优选例中，所述阻滞剂被用于诱导肿瘤细胞产生G1、G2周期阻滞。
在另一优选例中，所述阻滞剂还包含载体。
在另一优选例中，所述载体为药学上可接受的载体。
本发明的第三方面，提供了一种体外非治疗性调节细胞周期的方法，所述方法包括步骤：在含有有效量的所述式I化合物，或其药学上可接受的盐或前药，或其药物组合物的培养体系中培养所述细胞。
在另一优选例中，所述的式I化合物为阿那格雷。
在另一优选例中，在含有有效量阿那格雷盐酸盐的培养体系中培养所述细胞。
在另一优选例中，所述细胞为肿瘤细胞，较佳地所述肿瘤细胞选自：肝癌、宫颈癌、神经胶质瘤、结肠癌、肾癌、乳腺癌、肺癌、前列腺癌、胰腺癌、皮肤癌、鼻咽癌、食道癌、胃癌、卵巢癌、黑色素瘤。
在另一优选例中，所述肿瘤细胞选自下组：Hela、H4、FHCC98、SMMC7721、BEL7404、A498、SW1116、MDA-MB-231、MDA-MB-468、DU145、U87-MG、Wi38、H1299细胞，或其组合；更佳地选自下组：Hela、H4、FHCC98、SMMC7721细胞，或其组合。
在另一优选例中，所述式I化合物或其药学上可接受的盐或前药的有效浓度为0.01nM/L-1mM/L，较佳地为0.1nM/L-500μM/L，最佳地为1nM/L-100μM/L。
在另一优选例中，所述式I化合物的作用时间为2～96h。
在另一优选例中，所述式I化合物的作用时间为1～30天。
本发明的第四方面，提供了一种体外非治疗性抑制细胞生长或诱导细胞凋亡的方法，所述方法包括步骤：在含有有效量的所述式I化合物，或其药学上可接受的盐或前药，或其药物组合物的培养体系中配所述细胞。
在另一优选例中，所述的式I化合物为阿那格雷。
在另一优选例中，所述细胞为肿瘤细胞。
在另一优选例中，所述式I化合物的有效浓度为0.01nM/L-1mM/L，较佳地为0.1nM/L-500μM，最佳地为1nM/L-100μM。
在另一优选例中，当作用于生物体体外时，所述式I化合物的作用时间为2～96h。
在另一优选例中，当作用于生物体体内时，所述式I化合物的作用时间为1～360天，较佳地为1～180天，更佳地为1～60天，最佳地为1～30天。
本发明的第五方面，提供了一种制备抗肿瘤药物的方法，所述方法包括：将治疗有效量的所述式I化合物或其药学上可接受的盐或前药与药学上可接受的载体混合，从而形成药物组合物。
在另一优选例中，所述的式I化合物为阿那格雷。
在另一优选例中，所述药物组合物还包括选自下组的组分：肿瘤抑制剂、肿瘤凋亡诱导剂，或其组合。
本发明的第六方面，提供了一种治疗肿瘤的方法，所述方法包括：对需要治疗的对象施用治疗有效量的所述式I化合物，其光学异构体，或其药学上可接受的盐或前药，或其药物组合物。
本发明的第七方面，提供了一种用于治疗或抑制肿瘤的药物组合物，所述的药物组合物含有(a)药学上可接受的载体和(b)式I化合物，其光学异构体，或其药学上可接受的盐或前药，
(I)
式中，各基团的定义如上所述。
在另一优选例中，所述的药物组合物的剂型为口服剂型、注射剂型。
本发明的第八方面，提供了一种式I化合物，其光学异构体，或其药学上可接受的盐或前药用于制备组合物的用途，所述组合物用于(i)抑制肿瘤细胞生长；(ii)诱导肿瘤细胞凋亡；(iii)干扰肿瘤细胞增殖；(iv)调控肿瘤细胞的细胞周期；(v)诱导肿瘤细胞产生G1、G2周期阻滞；和/或(vi)抑制肿瘤细胞的转移。
在另一优选例中，所述的组合物为药物组合物。
应理解，在本发明范围内中，本发明的上述各技术特征和在下文(如实施例)中具体描述的各技术特征之间都可以互相组合，从而构成新的或优选的技术方案。限于篇幅，在此不再一一累述。
附图说明
图1显示了Anagrelide的化学结构示意图；
图2显示了Anagrelide对肿瘤细胞的生长抑制瘤谱，其中：
图2A显示了Anagrelide1μM的生长抑制瘤谱；
图2B显示了Anagrelide50μM的生长抑制瘤谱；
图3显示了细胞实时检测结果及Anagrelide对不同细胞株的IC50值；细胞3000个/100uL点板，培养过夜后加入100nM Anagrelide，使用罗氏公司细胞实时监控仪监测细胞生长状况。红色线条为DMSO对照组，绿色线条为加药组。
图4显示了流式细胞仪检测100nM Anagrelide作用于细胞24小时后细胞周期的分布图；
图5显示了流式细胞仪检测结果的统计图；
图6显示了药物浓度100nM，H4、FHCC98细胞不同时间点给药后收样，Western Blot检测PARP剪切的结果图。
图7显示了Anagrelide对肿瘤细胞迁移的影响
图8显示了Anagrelide对肿瘤荷瘤裸鼠体重的影响；
图9显示了Anagrelide对荷瘤裸鼠肿瘤体积的影响；
图10显示了Anagrelide对荷瘤裸鼠肿瘤重量的影响；
图11显示了Anagrelide对荷瘤裸鼠血常规检测的影响；其中，
图11A显示了Anagrelide对白细胞的影响；
图11B显示了Anagrelide对红细胞的影响；
图11C显示了Anagrelide对血红蛋白的影响；
图11D显示了Anagrelide对血小板的影响。
其中，图8-11中，model表示模型动物组，Anagrelide I表示给药剂量10mg/kg的给药组I，Anagrelide II表示给药剂量30mg/kg的给药组II。
具体实施方式
本发明人经过长期而深入的研究，通过对大量化合物的筛选，首次意外地发现市售的常规用于抗血小板增多症治疗的药物阿那格雷可用于治疗肿瘤，能够起到抑制肿瘤细胞生长，改变细胞周期的作用，具有抑制肿瘤细胞生长和诱导肿瘤细胞死亡的优异效果。基于上述发现，发明人完成了本发明。
术语
如本文所用，术语“取代”指基团上的一个或多个氢原子被选自下组的取代基取代：指基团上的一个或多个氢原子被选自下组的取代基取代：C1～C10烷基、C3～C10环烷基、C1～C10烷氧基、卤素、羟基、羧基（-COOH）、C1～C10醛基、C2～C10酰基、C2～C10酯基、氨基、苯基；所述的苯基包括未取代的苯基或具有1-3个取代基的取代苯基，所述取代基选自：卤素、C1-C10烷基、氰基、OH、硝基、C3～C10环烷基、C1～C10烷氧基、氨基。
术语“C1～C10烷基”指具有1～10个碳原子的直链或支链烷基，例如甲基、乙基、丙基、异丙基、丁基、异丁基、仲丁基、叔丁基、或类似基团。
术语“C3～C10环烷基”指具有3～10个碳原子的环烷基，例如环丙基、环丁基、环戊基、环庚基、或类似基团。
术语“C2～C10烯基”指具有1～10个碳原子的烯基，例如乙烯基、丙烯基、异丙烯基、丁烯基、异丁烯基、仲丁烯基、叔丁烯基、或类似基团。
术语“C2～C10炔基”指具有1～10个碳原子的炔基，例如乙炔基、丙炔基、异丙炔基、丁炔基、异丁炔基、仲丁炔基、叔丁炔基、或类似基团。
术语“C6～C10芳基”指具有6～10个碳原子的芳基，包括单环或二环芳基，例如苯基、萘基，或类似基团。
术语“C1～C10杂芳基”指具有1～10个碳原子的杂芳基，例如吡咯基、吡啶基、呋喃基，或类似基团。
术语“C1～C10烷氧基”指具有1-10个碳原子的直链或支链烷氧基，例如甲氧基、乙氧基、丙氧基、异丙氧基、丁氧基、异丁氧基、仲丁氧基、叔丁氧基、或类似基团。
术语“C6～C10芳基-氧基”指具有6-10个碳原子的直链或支链芳基-氧基，例如苯基-氧基、萘基-氧基，或类似基团。
术语“C1～C10杂芳基-氧基”指具有1-10个碳原子的直链或支链杂芳基-氧基，例如吡啶基-氧基、呋喃基-氧基，或类似基团。
术语“C1～C10酰基”指具有“-CO-烷基”结构，优选为具有“-CO-C1～C10烷基”结构的基团，例如甲基酰基、乙基酰基、丙基酰基、异丙基酰基、丁基酰基、异丁基酰基、仲丁基酰基、叔丁基酰基、或类似基团。
术语“C1～C10酯基”指具有烷基-COO-结构，优选为具有C1～C10烷基-COO-结构的基团，例如CH3COO-、C2H5COO-、C3H8COO-、：(CH3)2CHCOO-、nC4H9COO-、tC4H9COO-，或类似基团。
术语“C1～C10磺酰基”指具有“-SO2-烷基”结构，优选为具有“-SO2-C1～C10烷基”结构的基团，例如甲基磺酰基、乙基磺酰基、丙基磺酰基、异丙基磺酰基、丁基磺酰基、异丁基磺酰基、仲丁基磺酰基、叔丁基磺酰基、或类似基团。
术语“C1～C20杂环烷基”指具有1～20个碳原子的杂环烷基，如环氧乙基、四氢呋喃基、四氢吡咯基，或类似基团。
术语“卤素”指F、Cl、Br和I。
阿那格雷及其用途
如本文所用，术语“阿那格雷”、“Anagrelide”、“安归宁”、“ANA”可互换使用，均指具有如下式所示结构的化合物，或其药学上可接受的盐或前药，或其制剂形式：
（II）
在本发明的优选例中，所述的阿那格雷为6,7-二氯-1,5-二氢咪唑并[2,1-b]喹唑啉-2(3H)酮。
目前，在临床上阿那格雷作为磷酸二酯酶抑制剂，用于治疗抗血小板增多症。本发明提供了阿那格雷或其药学上可接受的制剂在抑制肿瘤方面的新用途，具体地，本发明提供的新用途包括
(a)作为抗肿瘤药物，用于肿瘤或癌症的治疗或抑制；
(b)在体外或体内选择性地用于抑制肿瘤细胞增殖，或者诱导细胞凋亡；
(c)在体外或体内选择性地调控肿瘤细胞的周期，诱导细胞产生G1周期阻滞和G2周期阻滞。
(d)在体外或体内选择性地用于抑制肿瘤细胞迁移。
所述的阿那格雷或其药物组合物可以在较低浓度下作用，较佳地，所述阿那格雷可以在≤1mM/L的浓度下作用于对象细胞，并产生所需的作用。
阿那格雷衍生物的用途
本发明还提供了一类阿那格雷的衍生物，其光学异构体，或其药学上可接受的盐或前药的用途。其中，所述的衍生物具有如下式I所示结构：
（I）
其中，
R1～R8各自独立地选自下组：氢原子、卤素原子、氨基、羟基、氰基、醛基、硝基、羧基（-COOH）、取代或未取代的C1～C10烷基、取代或未取代的C3～C10环烷基、取代或未取代的C2～C10烯基、取代或未取代的C2～C10炔基、取代或未取代的C6～C10芳基、取代或未取代的C1～C10杂芳基（如取代或未取代的5元或6元杂环、8元至10元杂芳二环环系）、取代或未取代的C1～C10烷氧基、取代或未取代的C6～C10芳基-氧基、取代或未取代的C1～C10杂芳基-氧基、取代或未取代的酰基（优选为-CO-C1～C10烷基）、取代或未取代的酯基（优选为C1～C10烷基-COO-）、取代或未取代的C1～C10磺酰基（-SO2-C1～C10烷基）；
或R1和R2、R3和R4共同构成选自下组的基团：取代或未取代的C3～C20环烷基(优选为C3～C10环烷基)、取代或未取代的C1～C20杂环烷基（优选为取代或未取代的5元或6元杂环、8元至12元杂芳二环环系）、羰基(=O)；
R9选自下组：氢原子、氧原子、取代或未取代的C1～C10烷基、取代或未取代的C3～C10环烷基、取代或未取代的C6～C10芳基、取代或未取代的C1～C10杂芳基、取代或未取代的C1～C10烷氧基、取代或未取代的C6～C10芳基-氧基、取代或未取代的酰基（优选为-CO-C1～C10烷基）、取代或未取代的C1～C10磺酰基；
其中，取代指基团上的一个或多个氢原子被选自下组的取代基取代：C1～C10烷基、C3～C10环烷基、C1～C10烷氧基、卤素、羟基、羧基（-COOH）、C1～C10醛基、C2～C10酰基、C2～C10酯基、氨基、苯基；
所述的苯基包括未取代的苯基或具有1-3个取代基的取代苯基，所述取代基选自：卤素、C1-C10烷基、氰基、OH、硝基、C3～C10环烷基、C1～C10烷氧基、氨基。
在另一优选例中，所述R1～R8各自独立地选自下组：氢原子、卤素原子、氨基、羟基、氰基、硝基、氨基、醛基、羧基、取代或未取代的C1～C5烷基、取代或未取代的C3～C6环烷基、取代或未取代的C2～C5烯基、取代或未取代的C2～C5炔基、取代或未取代的C6～C10芳基、取代或未取代的C1～C6杂芳基、取代或未取代的C1～C5烷氧基、取代或未取代的C6～C10芳基-氧基、取代或未取代的C1～C6杂芳基-氧基、取代或未取代的-CO-C1～C5烷基、取代或未取代的C1～C5烷基-COO-、取代或未取代的C1～C5磺酰基；或R1和R2、R3和R4共同构成选自下组的基团：取代或未取代的C3～C10环烷基、取代或未取代的C1～C10杂环烷基、羰基；
R9选自下组：氢原子、氧原子、取代或未取代的C1～C5烷基、取代或未取代的C3～C6环烷基、取代或未取代的C6～C10芳基、取代或未取代的C1～C10杂芳基、取代或未取代的C1～C5烷氧基、取代或未取代的C6～C10芳基-氧基、取代或未取代的-CO-C1～C5烷基、取代或未取代的C1～C5磺酰基；
其中，取代的定义如上所述。
在另一优选例中，R1～R8各自独立地选自下组：氢原子、卤素原子、氰基、取代或未取代的C1～C5烷基、取代或未取代的C3～C6环烷基；
或R1和R2、R3和R4共同构成选自下组的基团：取代或未取代的C1～C5环烷基、取代或未取代的C1～C5杂环烷基、羰基；
R9选自下组：氢原子、取代或未取代的C1～C5烷基、取代或未取代的C3～C6环烷基；
其中，取代的定义如上所述。
在另一优选例中，所述的R1～R9中的1～8个为氢原子，较佳地2～7个为氢原子。
在另一优选例中，所述的R1～R8中的1～8个为卤素原子。
在另一优选例中，所述的R1～R8中的1～8个为卤素原子，且其他的R1～R8均为氢原子。
在另一优选例中，所述的式I化合物具有如式II所示的结构：
II
在另一优选例中，所述的药学上可接受的盐为选自下组的盐：盐酸盐、醋酸盐、磷酸盐，或其组合。
本发明提供了式I化合物，其药学上可接受的盐或前药，及其药学上可接受的制剂在抑制肿瘤方面的新用途，具体地，本发明提供的新用途包括：
(a)作为抗肿瘤药物，用于肿瘤或癌症的治疗或抑制；
(b)在体外或体内选择性地用于抑制肿瘤细胞增殖，或者诱导细胞凋亡；
(c)在体外或体内选择性地调控肿瘤细胞的周期，诱导细胞产生G1周期阻滞和G2周期阻滞。
(d)在体外或体内选择性地用于抑制肿瘤细胞迁移。
药学上可接受的盐或前药
如本文所用，术语“药学上可接受的盐”指本发明化合物与药学上可接受的无机酸和有机酸所形成的盐，无机酸包括：盐酸、氢溴酸、磷酸、硝酸、硫酸；有机酸包括：甲酸、乙酸、丙酸、丁二酸、萘二磺酸(1,5)、亚细亚酸、草酸、酒石酸、乳酸、水杨酸、苯甲酸、戊酸、二乙基乙酸、丙二酸、琥珀酸、富马酸、庚二酸、己二酸、马来酸、苹果酸、氨基磺酸、苯丙酸、葡糖酸、抗坏血酸、烟酸、异烟酸、甲磺酸、对甲苯磺酸、柠檬酸，以及氨基酸。
如本文所用，术语“药学上可接受的前药”指在体外无活性，但能够在生物体内转化为式I所示活性物质，从而发挥其药理作用的化合物。
药物组合物
本发明还提供了一种药物组合物，其具有显著的抗肿瘤功效，其中含有治疗有效量的所述式I化合物或其药学上可接受的盐，以及一种或多种药学上可接受的载体。在本发明的另一优选例中，所述的药物组合物中含有治疗有效量的阿那格雷盐酸盐，以及一种或多种药学上可接受的载体。
可将化合物本身或其药学上可接受的盐与可药用赋形剂、稀释剂等的混合物以片剂、胶囊、颗粒剂、散剂或糖浆剂的形式口服给药或以注射剂的形式非口服给药。该药物组合物优选含有重量比为0.01%-99%的本发明的式I化合物或其药学上可接受的盐作为活性成分，更优选含有重量比为0.1%-90%的活性成分。
上述制剂可通过常规制药方法制备。可用的药用辅剂的例子包括赋形剂(例如糖类衍生物如乳糖、蔗糖、葡萄糖、甘露糖醇和山梨糖醇；淀粉衍生物如玉米淀粉、土豆淀粉、糊精和羧甲基淀粉；纤维素衍生物如结晶纤维素、羟丙基纤维素、羧甲基纤维素、羧甲基纤维素钙、羧甲基纤维素钠；阿拉伯胶；右旋糖酐；硅酸盐衍生物如偏硅酸镁铝；磷酸盐衍生物如磷酸钙；碳酸盐衍生物如碳酸钙；硫酸盐衍生物如硫酸钙等)、粘合剂(例如明胶、聚乙烯吡咯烷酮和聚乙二醇)、崩解剂(例如纤维素衍生物如羧甲基纤维素钠、聚乙烯吡咯烷酮)、润滑剂(例如滑石、硬脂酸钙、硬脂酸镁、鲸蜡、硼酸、苯甲酸钠、亮氨酸)、稳定剂(对羟基苯甲酸甲酯、对羟基苯甲酸丙酯等)、矫味剂(例如常用的甜味剂、酸味剂和香料等)、稀释剂和注射液用溶剂(例如水、乙醇和甘油等)。
本发明的化合物、其药学上可接受的盐或前药，或其药物组合物的给药量随患者的年龄、性别、种族、病情等的不同而不同。一般成人的日给药量为大约10mg-2000mg，优选50mg-1000mg。
细胞周期调控
本发明提供了一种调控细胞周期剂的方法，所述方法包括，对对象细胞施用有效量的式I化合物或包括式I化合物的药物组合物。
较佳地，所述的式I化合物可以用于阻滞细胞周期，如用于诱导细胞产生G1、G2周期阻滞，从而调控细胞的细胞周期，或改变细胞分裂的进程。
所述的式I化合物或其药物组合物可以选择性地调控部分细胞的细胞周期，而对于其他非敏感性细胞不起诱导周期阻滞的作用。在本发明的一个优选例中，所述的式I化合物或其药物组合物用于调控肿瘤细胞的细胞周期。
在另一优选例中，所述肿瘤细胞是选自下组的肿瘤细胞：Hela、H4、FHCC98、SMMC7721、BEL7404、A498、SW1116、MDA-MB-231、MDA-MB-468、DU145、U87-MG、Wi38、H1299细胞，或其组合；较佳地选自下组：Hela、H4、FHCC98、SMMC7721细胞，或其组合。
所述的式I化合物可以在较低浓度下，较佳地在≤1mM/L的浓度下作用于细胞并诱导或调控细胞的细胞周期，产生周期阻滞。在另一优选例中，所述式I化合物的有效浓度为0.01nM/L-1mM/L，较佳地为0.1nM/L-500μM/L，最佳地为1nM/L-100μM/L。
所述式I化合物的作用时间没有特别限制，如可以为2h～30天。较佳地，所述式I化合物的作用时间根据作用环境和作用对象不同而有所区别。在本发明的一个优选例中，所述式I化合物的作用时间为2～96h。在另一优选例中，所述式I化合物的作用时间为1～30天。
细胞凋亡诱导
本发明提供了一种诱导细胞凋亡或抑制细胞生长的方法，所述方法包括，对对象细胞施用有效量的式I化合物或包括式I化合物的药物组合物。
所述的式I化合物或其药物组合物可以选择性地诱导部分细胞凋亡或抑制部分细胞生长，而对于其他非敏感性细胞的生长不产生抑制作用。
在本发明的一个优选例中，所述的式I化合物或其药物组合物用于调控肿瘤细胞的细胞周期。较佳地，所述肿瘤细胞是选自下组的肿瘤细胞：Hela、H4、FHCC98、SMMC7721、BEL7404、A498、SW1116、MDA-MB-231、MDA-MB-468、DU145、U87-MG、Wi38、H1299细胞，或其组合；最优选的对象肿瘤细胞选自下组：Hela、H4、FHCC98、SMMC7721细胞，或其组合。
所述的式I化合物可以在较低浓度下，较佳地在≤100mM/L的浓度下作用于对象细胞并诱导或调控细胞的细胞周期，产生周期阻滞。
在另一优选例中，所述式I化合物的有效浓度为0.01nM/L-1mM/L，较佳地为0.1nM/L-500μM/L，最佳地为1nM/L-100μM/L。
所述式I化合物的作用时间没有特别限制，如可以为2h～30天。较佳地，所述式I化合物的作用时间根据作用环境和作用对象不同而有所区别。在本发明的一个优选例中，所述式I化合物的作用时间为2～96h。在另一优选例中，所述式I化合物的作用时间为1～30天。
抗肿瘤药物（药物组合物）及其制备
本发明提供了一种诱导细胞凋亡或抑制细胞生长的方法，所述方法包括，对对象细胞施用有效量的式I化合物或包括式I化合物的药物组合物。
在本发明的一个优选例中，所述的药物组合物包括：(a)治疗有效量的式I化合物；和(b)药学上可接受的载体。
在另一优选例中，所述的肿瘤包括：宫颈癌、神经胶质瘤、肝癌。
在另一优选例中，所述式I化合物的有效浓度为0.01nM/L-1mM/L，较佳地为0.1nM/L-500μM/L，最佳地为1nM/L-100μM/L。
本发明还提供了一种抗肿瘤药物或药物组合物的制备方法，所述方法包括：将治疗有效量的式I化合物与药学上可接受的载体混合，从而形成药物组合物。
在另一优选例中，所述药物组合物还包括选自下组的组分：肿瘤抑制剂、肿瘤凋亡诱导剂，或其组合。
对被治疗对象施用治疗有效量的式I化合物或包括式I化合物的药物组合物，可以治疗或抑制肿瘤。
本发明的主要优点包括：
(1)提供了一种毒副作用低，安全性好的新型抗肿瘤药物；
(2)提供了一种高选择性地诱导细胞凋亡的方法；
(3)提供了一种高选择性地阻滞细胞周期的方法；
(4)提供了一种高选择性地抑制细胞迁移的方法
(5)本发明的阿那格雷及其衍生物具有非常好的抗肿瘤效果。在极低剂量下（10nM/L），阿那格雷就能够很明显的抑制肿瘤细胞的生长，而对于非敏感细胞株，当浓度提高到1mM/L时，依然不会造成任何生长抑制的作用，表明其对靶点有很强的专一性和选择性，具有巨大的应用价值和临床应用的优势。
下面结合具体实施例，进一步阐述本发明。应理解，这些实施例仅用于说明本发明而不用于限制本发明的范围。下列实施例中凡未注明具体条件的实验方法之处，通常按照常规条件(例如Sambrook等人，分子克隆：实验室手册(NewYork:Cold Spring Harbor Laboratory Press,1989)中所述的条件)，或按照制造厂商所建议的条件。除非另外说明，否则百分比和份数按重量计算。
实施例1阿那格雷对肿瘤细胞的影响
1实验材料与方法
1.1药品和试剂
阿那格雷（Anagrelide）购自百灵威公司，二甲基亚砜（dimethyl sulfoxide,DMSO）溶解后配制成10mM储存液，-20℃保存。DMEM，a-MEM，PRMI1640培养基和胎牛血清购自Gibco公司（Life Technologies，Grand Island，NY，USA）。
研究中使用抗体如下：兔抗-PARP购自CST公司，鼠抗-tubulin购自Santa公司。
1.2细胞株及细胞培养
表1.人肿瘤组织细胞株来源
以上细胞株皆置于37°C含5%CO2的细胞培养箱培养，待细胞处于对数生长期时进行实验。
1.3Western blot分析
1）垂直蛋白质电泳分离：8%‐10%SDS‐聚丙烯酰胺（SDA‐PAGE）凝胶电泳分离，5%积层胶。积层胶分离电压为80V，分离胶分离电压为120V，溴酚蓝指示剂跑至底部停止；
2）转膜：半干法：转膜电压为10～15V，根据蛋白大小调整时间；
3）丽春红预染，观察转膜效果；
4）封闭：用含5%脱脂牛奶的TBST于室温置于脱色摇床振荡封闭1小时；
5）结合一抗：1:2000～1:10000稀释抗体与含5%BSA的TBST中，室温置于脱色摇床振荡结合1小时，4°C过夜。TBST洗三遍，每次10分钟；
6）结合二抗：1:5000～1:10000稀释抗体于含5%BSA的TBST中，室温置于脱色摇床振荡结合1小时。TBST洗三遍，每次10分钟。
显影ECL试剂盒底物作用2‐3分钟，化学发光检测，曝光于X胶片。
1.4MTT（噻唑蓝）比色法
处于对数生长期的细胞按合适密度接种于96孔培养板，每孔100ul，培养过夜后，加入不同浓度药物作用72h，每个浓度设三复孔。作用结束后，向每孔加入20μl/well的MTT（5mg/ml in PBS）作用3-5小时后，吸尽培养基，加入100ul/wellDMSO，避光置于脱色摇床振荡10分钟至蓝紫色结晶甲瓒（Formazan）完全溶解，用酶标仪检测OD（Optical Density）值（检测波长595nM，参考波长650nM）。空白组为不加细胞只加培养基，对照组为加入与药物同体积的DMSO，计算细胞存活率=（实验组OD值-空白组OD值）/（对照组OD-空白组OD值）。
1.5流式细胞仪检测细胞周期分布
处于对数期生长的细胞按5×105/mL浓度接种于6孔培养板，每孔1.5mL培养基，培养过夜。加入不同浓度的药物刺激一定时间后，将细胞收集到1.5mL的EP管中。用预冷的PBS冲洗细胞1～2次，加入少许PBS（200ul左右），吹匀。预冷1mL75%乙醇（PBS配制），在振荡仪上边振荡边向酒精中滴加细胞。4°C固定过夜。1000r/m离心5min后，弃上清，加入1-2mL PBS清洗两次。用0.5mLRNaseA（1.0mg/ml）PBS悬浮细胞，37°C消化1h。用0.5mL25ug/mL的PI染液重悬细胞，4°C避光30min。用300目细胞筛过滤，流式细胞仪分析细胞周期分布情况。
1.6Annexin V/PI双染法检测细胞凋亡
将处于对数生长期的细胞按5×105/mL浓度接种于6孔培养板，培养过夜。加入不同浓度药物刺激，收集细胞用凯基生物的Annexin V/PI-FITC细胞凋亡检测试剂盒检测细胞凋亡。具体步骤如下：收集细胞与1.5mL离心管，用PBS洗涤细胞两次。加入500ulBinding Buffer悬浮细胞，加入5ul Annexin V-FITC混匀后，加入5ulPI混匀。室温、避光反应15min。用流式细胞仪检测细胞凋亡。
1.7RTCA细胞实时监控仪检测细胞生长
将处于对数生长期的细胞胰酶消化后，离心并重悬，每孔3.5×104/mL接种于细胞实时监控仪配套的16孔板中，37°C孵育过夜后加药。实时监控仪自动监测细胞生长状况，根据细胞铺展后形成电阻的大小反应细胞数量。细胞指数值越大，细胞生长的越快，细胞数越多。
1.8划痕实验检测细胞迁移
将六孔板的底部用记号笔均匀的划上横线后，将处于对数生长期的细胞，按照120×104/mL个细胞点板，使细胞尽量均匀的铺满六孔板，37°C孵育过夜。换上不含血清的新鲜培养基，细胞饥饿10小时后，用枪头垂直于六孔板底的横线划痕，用无血清培养基冲洗3次，将悬浮细胞冲洗干净后，加入无血清培养基，0、2、6、12、24小时分别拍照，使用Image J计算细胞移动距离。
2实验结果
2.1阿那格雷（Anagrelide）对不同组织来源肿瘤细胞的体外抗肿瘤效果
通过对500多种FDA批准上市的非抗癌药物筛选，发现小分子化合物阿那格雷（Anagrelide）对多种组织来源的肿瘤细胞都有生长抑制的作用，其结构式为6,7-二氯-1,5-二氢咪唑并[2,1-b]喹唑啉-2(3H)酮（图1）。
选取不同组织来源的肿瘤细胞，Anagrelide浓度分别为1μM和50μM，给药72小时后MTT检测OD值，计算细胞存活率=（给药组OD-空白组OD/对照组OD-空白组OD）*100%，GraphPadPrism4软件作图。得到瘤谱如图2所示。
结果显示，对于Hela、H4、FHCC98、SMMC7721、BEL7404、A498、SW1116细胞，Anagrelide浓度为1μM时就能产生明显的抑制生长的作用；而对于MDA-MB-231、MDA-MB-468、DU145、U87-MG、Wi38、H1299细胞，Anagrelide浓度为50μM时也能抑制其生长。
2.2阿那格雷（Anagrelide）对于不同肿瘤细胞产生不同的抗肿瘤效果
为了进一步检测Angrelide对细胞生长的抑制作用，通过细胞实时监控仪，以Hela、H4、FHCC98、SMMC7721、BEL7404、A498、SW1116为例，实时监测Anagrelide给药72小时内细胞生长状况的改变(图3)。细胞3000个/100uL点板，培养过夜后加入100nM Anagrelide，实时监测细胞生长状况。红色线条为DMSO对照组，绿色线条为加药组。
结果显示，对于Hela、H4、FHCC98、SMMC7721细胞（敏感细胞），Anagrelide最终诱导细胞死亡，而对于BEL7404、A498、SW1116细胞（较为敏感细胞），给药72小时内细胞并未发生凋亡现象，但有明显的生长抑制。
通过MTT的方法，检测了Anagrelide在这7株细胞系上的IC50值，均不超过100nM(表2)。
结果表明，在极低的浓度下，本发明化合物即可对多种肿瘤细胞的生长起到抑制作用。
表2阿那格雷对不同细胞株的IC50值
细胞株 Hela H4 FHCC98 SMMC7721 Bel7404 A498 SW1116
IC50(nM) 5.121 5.433 7.076 2.006 32.76 52.99 40.58
2.3阿那格雷（Anagrelide）对肿瘤细胞周期的影响
肿瘤细胞是一类周期不受正常调控的细胞，能够无限增殖。目前临床上常用的抗肿瘤化疗药物中，已有一部分药物作为细胞周期阻滞剂来抑制肿瘤细胞生长从而达到抗肿瘤效果。
为了检测Anagrelide是否对肿瘤细胞的周期产生影响，采用PI染色和流式细胞仪，以SMMC7721，HeLa，SW1116为例，分别代表对Anagrelide最敏感、较为敏感的细胞，检测Angrelide对细胞周期的影响（图4、图5）
结果显示，对于Anagrelide处理过的SMMC7721和HeLa细胞，处于G1期和G2/M期的细胞数明显增加，而S期的细胞减少，说明细胞产生了明显的G1、G2周期阻滞，而对于较为不敏感的细胞SW1116，Anagrelide也产生了较为微弱的周期阻滞的作用。
2.4阿那格雷（Anagrelide）诱导肿瘤细胞凋亡
通过观察发现，Angrelide长时间给药后，细胞体积变小，细胞质浓缩最终死亡。因此，我们以H4、FHCC98细胞为例，通过Western Blot的方法，检测Anagrelide对凋亡通路的影响。
如图6的Werstern Blot结果所示，细胞加药处理一定时间后，检测下游PARP剪切情况，发现PARP剪切随时间的延长而逐渐增加。以上实验结果说明，Angrelide能够诱导肿瘤细胞凋亡。
H4细胞和FHCC98细胞不同时间点给药后收样，药物浓度100nM，Western Blot检测PARP剪切。
由以上实验可知，Angrelide可诱导所有的敏感细胞发生周期阻滞，对于HeLa,H4,SMMC7721,FHCC98等敏感细胞，其周期阻滞作用非常强，当细胞停滞生长一段时间后，最终发生凋亡。而SW1116、A498和Bel7404等较敏感细胞虽然尚能维持缓慢的生长，但也产生了明显的周期阻滞现象，表明Angrelide也可诱导这些肿瘤细胞的周期阻滞。
2.5阿那格雷（Anagrelide）抑制肿瘤细胞迁移
细胞迁移是肿瘤细胞的一大特征，当原发瘤生长到一定程度时，就会逐渐向周围扩散，以获取更大的空间和更多的养分维持肿瘤细胞的生长。肿瘤细胞一旦在体内扩散，就会对肿瘤的治疗带来很大的困难，因此抑制肿瘤的转移是当前抗肿瘤研究中非常重要的一个方面。
通过细胞划痕实验，以HeLa细胞为例，检测Anagrelide是否能影响肿瘤细胞迁移。
结果如图7显示，Anagrelide在100nM时就能明显抑制HeLa细胞划痕愈合的速度，表明Anagrelide能够抑制肿瘤细胞的迁移。
实施例2阿那格雷（Anagrelide）对人H4移植瘤的抑制作用
1.材料和方法
1.1材料
1.1.1供试品
名称：Anagrelide
货号：A637300
性状：白色粉末
纯度：98%
来源：百灵威(Toronto Research Chemicals Ins.)
保存：配制前-20℃保存
1.1.2阴性对照品(溶媒)
Cremophor EL：95%药用乙醇：水=12.5:12.5:75
Cremophor EL购自Sigma，货号C5135；95%药用乙醇购自上海益醇生物科技有限公司。
1.1.3实验动物
BALB/c裸鼠，雌性，体重16-17g，购自上海斯莱克实验动物有限公司（许可证号码：SCXK（沪）2012－0002），饲养环境：SPF级动物房，自由摄食，12h光照/12h黑暗。
1.2实验步骤
在无菌条件下，取处于生长增殖期的肿瘤细胞，消化后调整细胞浓度，接种于裸小鼠右侧腋窝下，每只接种体积为0.1mL。用游标卡尺测量移植瘤直径，待肿瘤生长至200-300mm3时选取荷瘤鼠，根据肿瘤大小随机分成3组（n=4只）：阴性对照组，Anagrelide I（10mg/kg）,Anagrelide II（30mg/kg）。各组按灌胃给药，给药当天记为d1，阴性对照组给予等量溶媒，以后每周测量2次肿瘤长径和短径，同时称量小鼠体重。给药第21天，处死动物，剖瘤称重。在处死动物前，摘眼球取血，测定血中白细胞数量(WBC)、红细胞数量(RBC)、血红蛋白浓度(Hb)和血小板数量（PLT）。
2实验结果
2.1阿那格雷（Anagrelide）对荷瘤裸鼠体重的影响
从各处理组动物体重变化趋势分析，Anagrelide各剂量组对动物体重的影响不大（图8），与阴性对照组无显著性差异。
2.2阿那格雷（Anagrelide）对荷瘤裸鼠肿瘤生长的影响
与溶媒对照组相比，各给药组表现出明显的抑瘤效果，且有一定的剂量浓度依赖性(图9、图10)。
试验终点时，各给药组肿瘤重量均显著小于溶媒对照组，且Anagrelide II（30mg/kg）组的肿瘤重量小于Anagrelide I（10mg/kg）组，表明Anagrelide对肿瘤重量的影响具有剂量依赖性。
2.3阿那格雷（Anagrelide）对荷瘤裸鼠血常规的影响
与溶媒对照组相比，各给药组血常规各项指标没有出现明显的降低(图11)。
讨论
阿那格雷（Anagrelide）作为抗血小板增多症的药物，已经在美国上市16年。该药上市至今，未发现任何严重的毒副作用。经过筛选本发明人首次意外地发现和证实了，Anagrelide具有很好的抗癌活性，能在很低浓度明显抑制癌细胞的细胞周期，并最终诱导癌细胞发生凋亡。
在本发明提及的所有文献都在本申请中引用作为参考，就如同每一篇文献被单独引用作为参考那样。此外应理解，在阅读了本发明的上述讲授内容之后，本领域技术人员可以对本发明作各种改动或修改，这些等价形式同样落于本申请所附权利要求书所限定的范围。

Claims (10)

1.一种式I化合物，其光学异构体，或其药学上可接受的盐或前药的用途，其特征在于，用于制备治疗或抑制肿瘤和/或抑制肿瘤细胞生长的药物或药物组合物；
(I)
其中，
R1、R2、R3、R4、R5、R6、R7和R8各自独立地选自下组：氢原子、卤素原子、氨基、羟基、氰基、醛基、硝基、羧基、取代或未取代的C1～C10烷基、取代或未取代的C3～C10环烷基、取代或未取代的C2～C10烯基、取代或未取代的C2～C10炔基、取代或未取代的C6～C10芳基、取代或未取代的C1～C10杂芳基、取代或未取代的C1～C10烷氧基、取代或未取代的C6～C10芳基-氧基、取代或未取代的C1～C10杂芳基-氧基、取代或未取代的C1～C10酰基、取代或未取代的C1～C10酯基、取代或未取代的C1～C10磺酰基；
或R1和R2共同构成，和/或R3和R4共同构成选自下组的基团：取代或未取代的C3～C20环烷基、取代或未取代的C1～C20杂环烷基、=O；
R9选自下组：氢原子、氧原子、取代或未取代的C1～C10烷基、取代或未取代的C3～C10环烷基、取代或未取代的C6～C10芳基、取代或未取代的C1～C10杂芳基、取代或未取代的C1～C10烷氧基、取代或未取代的C6～C10芳基-氧基、取代或未取代的酰基、取代或未取代的C1～C10磺酰基；
其中，所述取代指基团上的一个或多个氢原子被选自下组的取代基取代：C1～C10烷基、C3～C10环烷基、C1～C10烷氧基、卤素、羟基、羧基、C1～C10醛基、C2～C10酰基、C2～C10酯基、氨基、苯基；
所述的苯基包括未取代的苯基或具有1-3个取代基的取代苯基，所述取代基选自：卤素、C1-C10烷基、氰基、OH、硝基、C3～C10环烷基、C1～C10烷氧基、氨基。
2.如权利要求1所述的用途，其特征在于，所述药物或药物组合物还用于诱导肿瘤细胞凋亡。
3.如权利要求1所述的用途，其特征在于，所述药物或药物组合物还用于干扰肿瘤细胞增殖。
4.如权利要求1所述的用途，其特征在于，所述药物或药物组合物还用于调控肿瘤细胞的细胞周期；和/或
所述药物或药物组合物还用于阻滞细胞周期；和/或
所述药物或药物组合物还用于抑制肿瘤细胞的转移。
5.如权利要求1所述的用途，其特征在于，所述的肿瘤或肿瘤细胞选自：肝癌、宫颈癌、神经胶质瘤、结肠癌、肾癌、乳腺癌、肺癌、前列腺癌、胰腺癌、皮肤癌、鼻咽癌、食道癌、胃癌、卵巢癌、黑色素瘤。
6.一种细胞周期阻滞剂，其特征在于，包含有效量的所述的式I化合物，或其药学上可接受的盐或前药，或其药物组合物。
7.一种体外非治疗性调节细胞周期的方法，其特征在于，包括步骤：在含有有效量的所述式I化合物，或其药学上可接受的盐或前药，或其药物组合物的培养体系中培养所述细胞。
8.一种体外非治疗性抑制细胞生长或诱导细胞凋亡的方法，其特征在于，所述方法包括步骤：在含有有效量的所述式I化合物，或其药学上可接受的盐或前药，或其药物组合物的培养体系中配所述细胞。
9.一种制备抗肿瘤药物的方法，其特征在于，所述方法包括：将治疗有效量的所述式I化合物或其药学上可接受的盐或前药与药学上可接受的载体混合，从而形成药物组合物。
10.一种式I化合物，其光学异构体，或其药学上可接受的盐或前药的用途，其特征在于，用于制备组合物，所述组合物用于(i)抑制肿瘤细胞生长；(ii)诱导肿瘤细胞凋亡；(iii)干扰肿瘤细胞增殖；(iv)调控肿瘤细胞的细胞周期；(v)诱导肿瘤细胞产生G1、G2周期阻滞；和/或(vi)抑制肿瘤细胞的转移。
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