CN111743889A - 赤麻木脂素的新用途 - Google Patents

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Abstract

本发明涉及赤麻木脂素的新用途。具体的，本发明提供赤麻木脂素(式I所示化合物)制备预防和/或治疗JAK/STAT和/或NF‑κB信号通路介导的相关疾病的药物组合物或制剂的用途，本发明首次发现赤麻木脂素对JAK/STAT和NF‑κB信号通路的选择性抑制，具有通过JAK/STAT和/或NF‑κB双重信号通路治疗相关疾病的成药前景。

Description

赤麻木脂素的新用途
技术领域
本发明涉及医药领域，具体地，涉及赤麻木脂素的新用途。
背景技术
蛋白激酶(PK)介导的信号转导通路调节多种生物学过程，在人类疾病的发生发展中具有很重要的作用。其中，JAK/STAT(The Janus kinase/signal transducer andactivator of transcription)和NF-κB(nuclear factor kappa-B)信号通路几乎参与了所有炎症因子介导的信号转导，调节机体重要的生理过程，如细胞增殖、分化、凋亡、炎症和免疫效应。
在JAK/STAT信号通路中，JAK(Janus kinase)是一个非受体型酪氨酸激酶家族，在哺乳动物中有四个亚型，分别是JAK1，JAK2，JAK3(仅存在造血细胞中)和TYK2。当各种免疫和细胞因子与相应的受体结合，受体下游与受体结合的JAK激酶相互磷酸化而激活。激活的JAK磷酸化下游的信号转导子和转录激活子STAT，使其磷酸化而活化。之后，STAT形成二聚体通过核膜进入细胞核，与相应的DNA作用，调节下游基因的表达。
JAK/STAT信号通路的异常促进各种疾病的发生发展，包括炎症性疾病、皮肤病、自身免疫性疾病、代谢性疾病、心血管性疾病以及癌症等。研究表明，在免疫因子的调控下，JAK/STAT信号通路与多种炎症性疾病的发生密切相关，如中枢神经系统损伤、自身免疫性疾病及退行性病变、脑缺血、病毒感染相关性炎症等疾病。相关研究阐明了在细胞因子的调控下，信号通路中的关键激酶JAK2与神经系统炎症病变发病机制的相关关系。JAK2/STAT3也与炎症反应的氧化应激心肌缺血再灌注损伤有关。氧化应激产生的活性氧可以激活STAT3，抑制细胞凋亡的同时保护心肌，如降脂药物瑞舒伐他汀通过作用JAK2/STAT3信号通路，提高心肌梗死治疗的预后效果。
近年来研究发现，JAK1/STAT信号通路中的STAT1也与炎症性疾病和免疫性疾病的发生发展密切相关，特别是肝炎和类风湿性关节炎。STAT1可被许多的细胞因子和生长因子所激活，有学者发现STAT1在类风湿性关节炎中表达增加，其在滑膜细胞中发挥促凋亡的作用，提示STAT1可能通过诱导炎症基因表达促进滑膜炎症的发生。因此抑制JAK1/STAT1可抑制类风湿性关节炎的发生发展。
自身免疫性的炎症反应—类风湿性关节炎被称为“不死的癌症”。相关研究表明，JAK通路是类风湿关节炎疾病中重要的炎症信号传递通路，故该通路中的JAK激酶被认为是治疗类风湿关节炎的有效药物作用靶点。JAK激酶抑制剂直接作用于JAK激酶蛋白，从而影响下游STAT的磷酸化和入核调节相应基因的表达，阻止了致炎细胞因子信号的传递和放大，最终阻止炎症反应。2012年，JAK抑制剂托法替布获得美国食品和药物管理局(FDA)批准，用于治疗成人患者的对甲氨喋呤应答不充分或不耐受的中度至重度活动性类风湿性关节炎。2017年，托法替布获批成为中国首个治疗类风湿关节炎的口服JAK激酶抑制剂。随着对多种激酶在免疫效应和细胞因子介导的炎症信号通路中关键作用的认识逐渐深入，高活性和高选择性的JAK激酶选择性抑制剂已成为治疗类风湿关节炎的新策略。根据美国皮肤病学杂志最新的相关研究，JAK激酶抑制剂在银屑病、斑秃、甚至特应性皮炎方面都存在潜在的巨大治疗价值。2013年获得美国FDA批准的新型JAK激酶抑制剂Oclacitinib奥拉替尼用于控制犬类过敏性皮炎引起的瘙痒及特应性皮炎。JAK抑制剂R256被用作治疗中度至重度慢性持续性哮喘的药物。在临床前研究中，R256已被证明可以减少呼吸道炎症及改善肺功能。其他在研的JAK激酶抑制剂有Baricitinib、Decernotinib、Peficitinib等。除此之外，JAK抑制剂具有对缺血再灌注损伤心肌的保护作用和对大鼠的炎症性肠病方面具有很好的治疗作用。其他相关炎症疾病，如甲状腺炎、心肌炎、支气管炎、鼻炎等，都和JAK2/STAT3信号通道有关。因此，JAK/STAT蛋白的调控剂是临床治疗相关炎症性疾病的、更具特异性的药物。
NF-κB信号通路几乎存在于所有的动物细胞中，参与多种生理过程，特别是炎症反应和免疫性应答反应。NF-κB是细胞中重要的转录调节因子，该蛋白家族可以选择性的结合在B细胞κ-轻链增强子上调控许多基因的表达，因此调节NF-κB信号通路可以影响机体炎症、自身免疫性疾病以及癌症的发生发展过程。在这条信号通路中，当胞外的因子(促炎因子、TNF-α、抗原、化学辐射、病毒等)与细胞膜上相应的受体结合时，使得受体上的IKK(IκB激酶，inhibitor of nuclear factor kappa-B kinase)激酶磷酸化而激活，活化的IKK激活下游效应因子IκB，被泛素化修饰的IκB被蛋白酶降解，从而释放NF-κB二聚体进入细胞核，调节相应基因的表达。NF-κB二聚体的抑制蛋白家族(IκB)包含IκB蛋白(IκBα，IκBβ，IκBε)，NF-κB前体蛋白(p100，p105)，以及核IκB(IκBζ,Bcl-3,and IκBNS)。
几年来研究发现，NF-κB通过复杂的分子机制不仅参与机体的免疫调节、炎症、肿瘤过程，还参与感染、细胞周期调控以及细胞分化、凋亡等。因此NF-κB信号通路在机体的生命过程中具有非常关键的作用，过度活化的NF-κB信号通路可能导致系统性红斑狼疮、类风湿性关节炎、狼疮、败血病以及动脉粥样硬化和癌症等。所以，该通路的抑制剂可以用来治疗各种慢性炎症、自身免疫性疾病以及癌症等。已有数据证明抑制NF-κB信号通路可以缓解各种炎症性疾病，如哮喘、皮炎、肝炎、肾炎、支气管炎、胰腺炎、肠炎等。
根据研究报道，JAK/STAT和NF-κB这两种信号通路在致癌和致炎的过程中有很多交联的部分，相互影响和激活(参见，例如Atkinson,G.P.,S.E.Nozell,andE.T.Benveniste,NF-kappaB and STAT3 signaling in glioma:targets for futuretherapies.Expert Rev Neurother,2010.10(4):p.575-86.)。例如作用于细胞增殖和凋亡的共同效应子c-Myc、Bcl-2、p53、AKT，另外IL-6和COX-2因子可以同时激活NF-κB和STAT3，导致下游致炎和凋亡信号的变化，甚至STAT3可以促进NF-κB核转录。在很多癌症和炎症都同时具有JAK/STAT和NF-κB这两种信号通路的过度活化，如胃癌、肝癌、鼻咽癌、结肠癌、宫颈癌、乳腺癌、肺癌、神经胶质瘤以及炎症包括风湿性关节炎、鼻炎、肠炎、肝炎、神经炎等。因此这两种信号通路的激活促进了癌症、炎症的发生发展。但在已上市或临床试验中还未有一种药是同时作用于这两种信号通路。
赤麻木脂素(boehmenan，C40H40O12)来源于中药赤麻(学名：Boehmeria silvestrii(Pamp.)W.T.Wang)，也存在于轻木(学名：Ochroma lagopus Swartz)、红麻(学名：Hibiscuscannabinus)、雁婆麻(学名:Helicteres hirsuta)、小木通(学名：Clematis armandiiFranch.)、油桐(学名：Vernicia fordii(Hemsl.)Airy Shaw)等植物。赤麻是荨麻科苎麻属植物，功能主治为：收敛止血；清热解毒。主咯血；衄血；尿血；便血；崩漏；跌打损伤；无名肿毒；疮疡。对于赤麻木脂素的具体药物作用，目前研究较少。
发明内容
本发明的目的是提供赤麻木脂素在制备预防和/或治疗JAK/STAT和/或NF-κB信号通路介导的相关疾病的药物组合物或制剂的新用途。
本发明第一方面，提供了一种式I所示化合物、或其光学异构体、或其外消旋体、或其溶剂化物、或其药学上可接受的盐、或其前药的用途，用于制备药物组合物或制剂，所述药物组合物或制剂用于预防和/或治疗：
Figure BDA0002010800290000041
(a)JAK/STAT通路介导的疾病；和/或
(b)NF-κB通路介导的疾病；和/或
(c)JAK/STAT与NF-κB双重通路介导的疾病。
在另一优选例中，所述JAK选自：JAK1、JAK2、TYK2，或其组合。
在另一优选例中，所述STAT选自：STAT1、STAT2、STAT3、STAT4、STAT5a、STAT5b、STAT6，或其组合。
在另一优选例中，所述STAT选自：STAT1、STAT3，或其组合。
在另一优选例中，所述药物组合物或制剂通过抑制JAK磷酸化和/或抑制IKK磷酸化从而预防和/或治疗相关疾病。
在另一优选例中，所述IKK选自：IKKα、IKKβ，或其组合。
在另一优选例中，所述药物组合物或制剂通过抑制JAK磷酸化进而抑制STATs磷酸化。
在另一优选例中，所述药物组合物或制剂通过抑制IKK磷酸化进而抑制IκBα磷酸化。
在另一优选例中，所述JAK/STAT通路介导的疾病是JAK/STAT通路完全介导或部分介导的疾病。
在另一优选例中，所述JAK/STAT通路介导的疾病是JAK过度激活相关的疾病。
在另一优选例中，所述JAK/STAT通路介导的疾病选自：炎症性疾病、自身免疫性疾病、心脑血管性疾病、炎症性癌症。
在另一优选例中，JAK/STAT通路介导的疾病中，所述炎症性疾病选自：皮炎、胰腺炎、乳腺炎、结肠炎、结膜炎、角膜炎、甲状腺炎、支气管炎、鼻炎、肾炎、肝炎、酒精性脂肪肝、胃炎、肺炎和肺纤维化。
在另一优选例中，JAK/STAT通路介导的疾病中，所述自身免疫性疾病选自：狼疮、类风湿性关节炎、哮喘、风湿性心脏病。
在另一优选例中，JAK/STAT通路介导的疾病中，所述心脑血管性疾病选自：脑膜炎、脑神经炎、老年痴呆、脑脊髓炎、败血症、冠心病、脓毒症、心肌炎、心肌肥大、心力衰竭、心肌缺血、动脉粥样硬化。
在另一优选例中，JAK/STAT通路介导的疾病中，所述皮炎选自：银屑病、斑秃、反应性皮炎、湿疹、毛囊炎、疱疹、痤疮。
在另一优选例中，JAK/STAT通路介导的疾病中，所述炎症性癌症选自：乳腺癌、胃癌、肝癌、食道癌、胆囊癌、前列腺癌、神经瘤、神经胶质瘤、子宫癌、卵巢癌、阴道癌、鼻咽癌、鼻癌、淋巴癌、肾癌，较佳地，乳腺癌、胃癌、肝癌、神经胶质瘤、卵巢癌、肾癌。
在另一优选例中，所述NF-κB通路介导的疾病是NF-κB通路完全介导或部分介导的疾病。
在另一优选例中，所述NF-κB通路介导的疾病是IKK过度激活相关的疾病。
在另一优选例中，所述IKK选自：IKKα和IKKβ。
在另一优选例中，所述NF-κB通路介导的疾病选自：炎症性疾病、自身免疫性疾病、心脑血管性疾病、炎症性癌症。
在另一优选例中，NF-κB通路介导的疾病中，所述炎症性疾病选自：皮炎、胰腺炎、乳腺炎、结肠炎、结膜炎、角膜炎、甲状腺炎、支气管炎、鼻炎、肾炎、肝炎、酒精性脂肪肝、胃炎、肺炎和肺纤维化。
在另一优选例中，NF-κB通路介导的疾病中，所述自身免疫性疾病选自：狼疮、类风湿性关节炎、哮喘、风湿性心脏病。
在另一优选例中，NF-κB通路介导的疾病中，所述心脑血管性疾病选自：脑膜炎、脑神经炎、老年痴呆、脑脊髓炎、败血症、冠心病、脓毒症、心肌炎、心肌肥大、心力衰竭、心肌缺血、动脉粥样硬化。
在另一优选例中，NF-κB通路介导的疾病中，所述皮炎选自：银屑病、斑秃、反应性皮炎、湿疹、毛囊炎、疱疹、痤疮。
在另一优选例中，NF-κB通路介导的疾病中，所述炎症性癌症选自：乳腺癌、胃癌、肝癌、食道癌、胆囊癌、前列腺癌、神经瘤、神经胶质瘤、子宫癌、卵巢癌、阴道癌、鼻咽癌、鼻癌、淋巴癌、肾癌，较佳地，乳腺癌、胃癌、肝癌、神经胶质瘤、卵巢癌、肾癌。
在另一优选例中，所述JAK/STAT和NF-κB双重通路介导的疾病是JAK/STAT和NF-κB通路都参与介导的疾病，所述介导是完全介导或部分介导的疾病。
在另一优选例中，所述JAK/STAT和NF-κB双重通路介导的疾病是JAK和IKK均过度激活相关的疾病。
在另一优选例中，所述JAK/STAT和NF-κB双重通路介导的疾病选自：炎症性疾病、自身免疫性疾病、心脑血管性疾病、炎症性癌症。
在另一优选例中，JAK/STAT和NF-κB双重通路介导的疾病中，所述炎症性疾病选自：皮炎、胰腺炎、乳腺炎、结肠炎、结膜炎、角膜炎、甲状腺炎、支气管炎、鼻炎、肾炎、肝炎、酒精性脂肪肝、胃炎、肺炎和肺纤维化。
在另一优选例中，JAK/STAT和NF-κB双重通路介导的疾病中，所述自身免疫性疾病选自：狼疮、类风湿性关节炎、哮喘、风湿性心脏病。
在另一优选例中，JAK/STAT和NF-κB双重通路介导的疾病中，所述心脑血管性疾病选自：脑膜炎、脑神经炎、老年痴呆、脑脊髓炎、败血症、冠心病、脓毒症、心肌炎、心肌肥大、心力衰竭、心肌缺血、动脉粥样硬化。
在另一优选例中，JAK/STAT和NF-κB双重通路介导的疾病中，所述皮炎选自：银屑病、斑秃、反应性皮炎、湿疹、毛囊炎、疱疹、痤疮。
在另一优选例中，所述药物组合物或制剂中包括：
(a)有效治疗量的式I所示的化合物、或其光学异构体或其外消旋体、或其溶剂化物、或其药学上可接受的盐、或其前药；
(b)药学上可接受的载体。
在另一优选例中，所述式I所示的化合物、或其光学异构体或其外消旋体、或其溶剂化物、或其药学上可接受的盐、或其前药占所述药物组合物或制剂总重量的0.01-99.99wt％,较佳地0.1-90wt％，更佳地1-80wt％。
在另一优选例中，所述药物组合物或制剂的剂型包括：片剂、丸剂、胶囊剂、散剂、颗粒剂、口服液剂或粉剂；注射剂或注射用乳剂；膏剂，软膏剂，霜剂，贴剂，搽剂或植入剂；喷雾剂、滴剂或栓剂；或者，脂质体注射剂或脂质体注射用乳剂。
本发明第二方面，提供一种体外非治疗性抑制JAK磷酸化和/或IKK磷酸化的方法，所述方法包括步骤：
在式I化合物存在下，培养细胞，从而抑制JAK磷酸化和/或IKK磷酸化。
在另一优选例中，所述的细胞包括正常细胞、炎症细胞、癌细胞。
本发明第三方面，提供了一种预防和/或治疗
(a)JAK/STAT通路介导的疾病；和/或
(b)NF-κB通路介导的疾病；和/或
(c)JAK/STAT与NF-κB双重通路介导的疾病的方法，包括步骤：
向需要的对象施用如本发明第一方面所述的药物组合物或制剂。
在另一优选例中，以1毫克-100毫克活性成分/千克体重的量施用所述乳膏剂；更佳地，5毫克-50毫克/千克体重，最佳地，10毫克-20毫克/千克体重，其中所述活性成分为式I化合物。
在另一优选例中，所述的对象为人或非人哺乳动物。
应理解，在本发明范围内中，本发明的上述各技术特征和在下文(如实施例)中具体描述的各技术特征之间都可以互相组合，从而构成新的或优选的技术方案。限于篇幅，在此不再一一累述。
附图说明
图1为实施例1中体现不同浓度赤麻木脂素对细胞因子IL-6诱导的依赖于STAT3的荧光素酶活性和IFN-γ诱导的依赖于STAT1的荧光素酶活性表达抑制作用的直方图。
图2为实施例1中不同浓度的赤麻木脂素对TNF-α诱导的依赖于NF-κB信号通路的荧光素酶活性表达抑制的直方图。
图3为实施例2中不同浓度赤麻木脂素对细胞因子IL-6诱导的STAT3磷酸化和IFN-γ诱导的STAT1磷酸化的抑制。
图4为实施例2中不同浓度赤麻木脂素对细胞因子IL-6、IFN-γ和IFN-α诱导的p-JAK1、p-JAK2和p-TYK2的抑制。
图5为实施例2中不同浓度赤麻木脂素对其他酪氨酸激酶PDGFRα、PDGFRβ、EGFR、IGF1R的磷酸化的影响。
图6为实施例2中不同浓度的赤麻木脂素对TNF-α诱导的IκBα、IKK-α/β磷酸化的抑制。
具体实施方式
本发明人经过广泛而深入的研究，通过大量筛选和测试，首次令人惊讶的发现了赤麻木脂素在对JAK/STAT和/或NF-κB两条信号通道都有显著的抑制作用，而且对其他酪氨酸激酶(如，PDGFRα、PDGFRβ、EGFR、IGF1R)没有抑制作用，体现出对JAKs和IKK激酶优异的选择性抑制，具有很好的通过抑制JAK/STAT和/或NF-κB信号通道治疗相关疾病(如炎症)的成药前景。在此基础上完成了本发明。
术语
除非另有定义，否则本文中所用的全部技术术语和科学术语均具有如本发明所属领域普通技术人员通常理解的相同含义。
如本文所用，术语“包含”、“包括”、“含有”可互换使用，不仅包括封闭式定义，还包括半封闭、和开放式的定义。换言之，所述术语包括了“由……构成”、“基本上由……构成”。
如本文所用，术语“本发明化合物”、“式I所示化合物”“式I化合物”和“赤麻木脂素”可互换使用，指赤麻木脂素(式I所示化合物)、或其光学异构体或其外消旋体、或其溶剂化物、或其药学上可接受的盐、或其前药。此外，该术语还包括相应的氘代化合物。如本文所用，术语“氘(D)代”指化合物或基团中的一个或多个氢被氘所取代。氘代可以是一取代、二取代、多取代或全取代。在另一优选例中，氘在氘取代位置的氘同位素含量是大于天然氘同位素含量(0.015％)，更佳地大于50％，更佳地大于75％，更佳地大于95％，更佳地大于97％，更佳地大于99％，更佳地大于99.5％。在另一优选例中，所述化合物中,D在氢原子所在位置的同位素含量≥95％，更佳地≥99％。应理解，该术语还包括上述组分的混合物，在式I所示化合物中，如果存在手性碳原子，则手性碳原子可以为R构型，也可以为S构型，或二者的混合物。
如本文所用，术语“JAK/STAT信号通路”与“JAK/STAT信号通路”可互换使用。JAK(Janus kinase)是一个非受体型酪氨酸激酶家族，在哺乳动物中有四个亚型，分别是JAK1、JAK2、JAK3(仅存在造血细胞中)和TYK2。当各种免疫和细胞因子与相应的受体结合，受体下游与受体结合的JAK激酶相互磷酸化而激活。激活的JAK磷酸化下游的信号转导子和转录激活子STAT(signal transducer and activator of transcription)，使其磷酸化而活化。之后，STAT形成二聚体通过核膜进入细胞核，与相应的DNA作用，调节下游基因的表达。其中，所述STAT包括STAT1、STAT2、STAT3、STAT4、STAT5a、STAT5b和STAT6。
如本文所用，术语“NF-κB信号通路”与“NF-κB信号通路”可互换使用。在外界因素的刺激下，致炎因子与细胞膜上的受体结合，之后IκB的上游激酶IKK磷酸化而激活，使IκB磷酸化和泛素化，IκB被蛋白酶体识别并降解，从而使NF-κB二聚体释放出来，入核调节相应基因的表达。
如本文所用，所述的“JAK过度激活”指，与对照(或正常人群或正常细胞)中的JAK活性E0相比，某一个体或细胞中JAK的活性E1与E0的比值(E1/E0)≥1.5，较佳地≥2，更佳地≥5。在另一优选例中，所述JAK选自：JAK1、JAK2或TYK2。在另一优选例中，所述的细胞为炎症细胞或癌细胞。
如本文所用，所述的“IKK过度激活”指，与对照(或正常人群或正常细胞)中的IKK活性A0相比，某一个体或细胞中IKK的活性A1与A0的比值(A1/A0)≥1.5，较佳地≥2，更佳地≥5。在另一优选例中，所述IKK选自：IKKα、IKKβ。在另一优选例中，所述的细胞为炎症细胞或癌细胞。
赤麻木脂素
本发明首次发现了赤麻木脂素(式I化合物)在制备预防和/或治疗JAK/STAT和/或NF-κB信号通路介导的相关疾病的药物组合物或制剂的新用途。
Figure BDA0002010800290000091
在本发明中，术语“药学上可接受的盐”指本发明化合物与酸或碱所形成的适合用作药物的盐。药学上可接受的盐包括无机盐和有机盐。一类优选的盐是本发明化合物与酸形成的盐。适合形成盐的酸包括但并不限于：盐酸、氢溴酸、氢氟酸、硫酸、硝酸、磷酸等无机酸，甲酸、乙酸、丙酸、草酸、丙二酸、琥珀酸、富马酸、马来酸、乳酸、苹果酸、酒石酸、柠檬酸、苦味酸、甲磺酸、苯甲磺酸，苯磺酸等有机酸；以及天冬氨酸、谷氨酸等酸性氨基酸。一类优选的盐是本发明化合物与碱形成的盐。适合形成盐的酸包括但并不限于：氢氧化钠、氢氧化钾、碳酸钠、碳酸氢钠、磷酸钠等无机碱，氨水、三乙胺、二乙胺等有机碱。
本发明中，术语“前药”也称为前体药物、药物前体、前驱药物等，是指经过生物体内转化后才具有药理作用的化合物。前体药物本身没有生物活性或活性很低，经过体内代谢后变为有活性的物质，这一过程的目的在于增加药物的生物利用度，加强靶向性，降低药物的毒性和副作用。
本发明的式I所示化合物可采用现有技术中本领域技术人员熟知的方法进行制备，对各个步骤的反应参数没有特别限制。此外，本发明的化合物也可通过市场购买获得。典型的，本发明所述式I所示化合物从油桐中提取、分离和纯化制备所得。
本发明中，发明人对赤麻木脂素进行蛋白质印迹实验，结果发现，赤麻木脂素能够选择性抑制JAKs与IKK的磷酸化，从而抑制JAK/STAT信号通路与NF-κB信号通路，从而预防和/或治疗这两条信号通路介导的疾病。
用途
本发明的I所示化合物、或其光学异构体、或其外消旋体、或其溶剂化物、或其药学上可接受的盐、或其前药的用途，用于制备药物组合物或制剂，所述药物组合物或制剂用于预防和/或治疗：
(a)JAK/STAT通路介导的疾病；和/或
(b)NF-κB通路介导的疾病；和/或
(c)JAK/STAT与NF-κB双重通路介导的疾病。
在另一优选例中，所述JAK/STAT通路介导的疾病是JAK/STAT通路完全介导或部分介导的疾病。
在另一优选例中，所述JAK/STAT通路介导的疾病是JAK过度激活相关的疾病。
在另一优选例中，所述JAK/STAT通路介导的疾病包括(但并不限于)：炎症性疾病、自身免疫性疾病、心脑血管性疾病、炎症性癌症。
在另一优选例中，JAK/STAT通路介导的疾病中，所述炎症性疾病选自：皮炎、胰腺炎、乳腺炎、结肠炎、结膜炎、角膜炎、甲状腺炎、支气管炎、鼻炎、肾炎、肝炎、酒精性脂肪肝、胃炎、肺炎和肺纤维化。
在另一优选例中，JAK/STAT通路介导的疾病中，所述自身免疫性疾病选自：狼疮、类风湿性关节炎、哮喘、风湿性心脏病。
在另一优选例中，JAK/STAT通路介导的疾病中，所述心脑血管性疾病选自：脑膜炎、脑神经炎、老年痴呆、脑脊髓炎、败血症、冠心病、脓毒症、心肌炎、心肌肥大、心力衰竭、心肌缺血、动脉粥样硬化。
在另一优选例中，JAK/STAT通路介导的疾病中，所述皮炎选自：银屑病、斑秃、反应性皮炎、湿疹、毛囊炎、疱疹、痤疮。
在另一优选例中，JAK/STAT通路介导的疾病中，所述炎症性癌症选自：乳腺癌、胃癌、肝癌、食道癌、胆囊癌、前列腺癌、神经瘤、神经胶质瘤、子宫癌、卵巢癌、阴道癌、鼻咽癌、鼻癌、淋巴癌、肾癌，较佳地，乳腺癌、胃癌、肝癌、神经胶质瘤、卵巢癌、肾癌。
在另一优选例中，所述NF-κB通路介导的疾病选自：炎症性疾病、自身免疫性疾病、心脑血管性疾病、炎症性癌症。
在另一优选例中，所述JAK/STAT和NF-κB双重通路介导的疾病选自：炎症性疾病、自身免疫性疾病、心脑血管性疾病、炎症性癌症。
如本文所用，术语“预防”指在相关疾病之前施用治疗有效量式I所示化合物、或其光学异构体或其外消旋体、或其溶剂化物、或其药学上可接受的盐、或其前药、或其氘代化合物，从而使得所述疾病被预防，发生时间延迟、或仍然发生，但是比不施用式I所示化合物、或其光学异构体或其外消旋体、或其溶剂化物、或其药学上可接受的盐、或其前药、或其氘代化合物的程度减轻。如本文所用，术语“治疗”、指施用治疗有效量的式I所示化合物、或其光学异构体或其外消旋体、或其溶剂化物、或其药学上可接受的盐、或其前药、或其氘代化合物，从而减少、减轻或减缓疾病、障碍或病症的进展或发展。在另一实施方式中，“治疗”指减轻、减缓疾病、障碍或病症的进程，或改善疾病、障碍或病症的一种或多种体征或症状。
本发明所述的“预防”和“治疗”包括延缓和终止疾病的进展，并不需要100％抑制、消灭和逆转。在一些实施方案中，与不存在本发明所述式I所述化合物和组合物或制剂时(例如，在未暴露于在本发明式I所述化合物和组合物或制剂生物学匹配的对照受试者或标本中)观察到的水平相比，本发明所述式I所述化合物和组合物或制剂将相关疾病(如心肌炎)减轻、预防、抑制和/或逆转了例如至少约1％、10％、至少约30％、至少约50％、或至少约80％。
药物组合物和施用方法
由于本发明化合物具有优异的选择性抑制JAK/STAT和/或NF-κB信号通路的作用，因此含有本发明化合物的活性成分的药物组合物或制剂可用于预防和/或治疗JAK/STAT和/或NF-κB信号通路介导的疾病。所述药物组合物或制剂中包括：(a)有效治疗量的式I所示的化合物、或其光学异构体或其外消旋体、或其溶剂化物、或其药学上可接受的盐、或其前药；(b)药学上可接受的载体。
如本文所用，术语“有效治疗量”，是指对人和/或动物产生功能或活性的且可被人和/或动物所接受的量。本领域的普通技术人员应该理解，所述的“有效量”或“有效剂量”可随着药物组合物的形式、给药途径、所用药物的辅料、疾病的严重程度以及与其他药物联合用药等情况的不同而有所不同。
通常，药物组合物含有1-2000mg本发明化合物/剂，更佳地，含有10-200mg本发明化合物/剂。较佳地，所述的“一剂”为一个胶囊或药片。
“药学上可接受的载体”指的是：一种或多种相容性固体或液体填料或凝胶物质，它们适合于人使用，而且必须有足够的纯度和足够低的毒性。“相容性”在此指的是组合物中各组份能和本发明化合物以及它们之间相互掺和，而不明显降低化合物的药效。药学上可以接受的载体部分例子有纤维素及其衍生物(如羧甲基纤维素钠、乙基纤维素钠、纤维素乙酸酯等)、明胶、滑石、固体润滑剂(如硬脂酸、硬脂酸镁)、硫酸钙、植物油(如豆油、芝麻油、花生油、橄榄油等)、多元醇(如丙二醇、甘油、甘露醇、山梨醇等)、乳化剂(如
Figure BDA0002010800290000121
)、润湿剂(如十二烷基硫酸钠)、着色剂、调味剂、稳定剂、抗氧化剂、防腐剂、无热原水等。
本发明化合物或药物组合物的施用方式没有特别限制，代表性的施用方式包括(但并不限于)：口服、肠胃外(静脉内、肌肉内或皮下)。
用于口服给药的固体剂型包括胶囊剂、片剂、丸剂、散剂和颗粒剂。在这些固体剂型中，活性化合物与至少一种常规惰性赋形剂(或载体)混合，如柠檬酸钠或磷酸二钙，或与下述成分混合：(a)填料或增容剂，例如，淀粉、乳糖、蔗糖、葡萄糖、甘露醇和硅酸；(b)粘合剂，例如，羟甲基纤维素、藻酸盐、明胶、聚乙烯基吡咯烷酮、蔗糖和阿拉伯胶；(c)保湿剂，例如，甘油；(d)崩解剂，例如，琼脂、碳酸钙、马铃薯淀粉或木薯淀粉、藻酸、某些复合硅酸盐、和碳酸钠；(e)缓溶剂，例如石蜡；(f)吸收加速剂，例如，季胺化合物；(g)润湿剂，例如鲸蜡醇和单硬脂酸甘油酯；(h)吸附剂，例如，高岭土；和(i)润滑剂，例如，滑石、硬脂酸钙、硬脂酸镁、固体聚乙二醇、十二烷基硫酸钠，或其混合物。胶囊剂、片剂和丸剂中，剂型也可包含缓冲剂。
固体剂型如片剂、糖丸、胶囊剂、丸剂和颗粒剂可采用包衣和壳材制备，如肠衣和其它本领域公知的材料。它们可包含不透明剂，并且，这种组合物中活性化合物或化合物的释放可以延迟的方式在消化道内的某一部分中释放。可采用的包埋组分的实例是聚合物质和蜡类物质。必要时，活性化合物也可与上述赋形剂中的一种或多种形成微胶囊形式。
用于口服给药的液体剂型包括药学上可接受的乳液、溶液、悬浮液、糖浆或酊剂。除了活性化合物外，液体剂型可包含本领域中常规采用的惰性稀释剂，如水或其它溶剂，增溶剂和乳化剂，例知，乙醇、异丙醇、碳酸乙酯、乙酸乙酯、丙二醇、1,3-丁二醇、二甲基甲酰胺以及油，特别是棉籽油、花生油、玉米胚油、橄榄油、蓖麻油和芝麻油或这些物质的混合物等。
除了这些惰性稀释剂外，组合物也可包含助剂，如润湿剂、乳化剂和悬浮剂、甜味剂、矫味剂和香料。
除了活性化合物外，悬浮液可包含悬浮剂，例如，乙氧基化异十八烷醇、聚氧乙烯山梨醇和脱水山梨醇酯、微晶纤维素、甲醇铝和琼脂或这些物质的混合物等。
用于肠胃外注射的组合物可包含生理上可接受的无菌含水或无水溶液、分散液、悬浮液或乳液，和用于重新溶解成无菌的可注射溶液或分散液的无菌粉末。适宜的含水和非水载体、稀释剂、溶剂或赋形剂包括水、乙醇、多元醇及其适宜的混合物。
本发明化合物可以单独给药，或者与其他药学上可接受的化合物联合给药(如其他预防和/或治疗炎症的药物)。
本发明所述的其它预防和/或治疗炎症的药物，可以包括(但不限于)：托法替布、奥拉替尼、R256，或其组合。
使用药物组合物时，是将安全有效量的本发明化合物适用于需要治疗的哺乳动物(如人)，其中施用时剂量为药学上认为的有效给药剂量，对于60kg体重的人而言，日给药剂量通常为1～2000mg，优选20～500mg。当然，具体剂量还应考虑给药途径、病人健康状况等因素，这些都是熟练医师技能范围之内的。
体外非治疗性抑制JAK磷酸化和/或IKK磷酸化的方法
本发明提供一种体外非治疗性抑制JAK磷酸化和/或IKK磷酸化的方法，所述方法包括步骤：
在式I化合物存在下，培养细胞，从而抑制JAK磷酸化和/或IKK磷酸化。
在另一优选例中，所述的细胞包括正常细胞、炎症细胞、癌细胞。
预防和/或治疗JAK/STAT和/或NF-κB通路介导的疾病的方法
本发明第三方面还提供了一种预防和/或治疗
(a)JAK/STAT通路介导的疾病；和/或
(b)NF-κB通路介导的疾病；和/或
(c)JAK/STAT与NF-κB双重通路介导的疾病的方法，包括步骤：
向需要的对象施用如本发明第一方面所述的药物组合物或制剂。
在另一优选例中，以1毫克-100毫克活性成分/千克体重的量施用所述乳膏剂；更佳地，5毫克-50毫克/千克体重，最佳地，10毫克-20毫克/千克体重，其中所述活性成分为式I化合物。
在另一优选例中，所述的对象为人或非人哺乳动物。
代表性地，所述的非人哺乳动物包括(但并不限于)：宠物(如狗、猫)、家畜(如牛、羊、马、猪)、各种动物园动物(熊猫、大象、虎)等。
本发明的主要优点包括：
1.本发明首次令人惊讶的发现了赤麻木脂素对JAKs和IKK同时具有显著的抑制作用，可用于制备预防和/或治疗JAKs和NF-κB通路分别介导的和两者共同介导的疾病的药物，同时抑制两个通路可以提高治疗效果，为诸多相关疾病提供了更好的用药选择。
2.赤麻木脂素对其他酪氨酸激酶(如，PDGFRα、PDGFRβ、EGFR、IGF1R)没有抑制作用，对JAKs和IKK具有优异的选择性，说明其在使用时对其他细胞活动产生不良影响的可能性小，副作用小，具有很好的成药前景。
下面结合具体实施例，进一步阐述本发明。应理解，这些实施例仅用于说明本发明而不用于限制本发明的范围。下列实施例中未注明具体条件的实验方法，通常按照常规条件，或按照制造厂商所建议的条件。除非另外说明，否则百分比和份数是重量百分比和重量份数。
试剂
赤麻木脂素3-(4-Hydroxy-3-methoxyphenyl)propenoic acid 3-[2,3-dihydro-2-(4-hydroxy-3-methoxyphenyl)-3-[[[3-(4-hydroxy-3-methoxyphen yl)-1-oxo-2-propenyl]oxy]methyl]-7-methoxybenzofuran-5-yl]propyl ester
分子式：C40H40O12
Figure BDA0002010800290000151
赤麻木脂素提取于中草药植物油桐，HPLC纯度大于99％。
细胞因子IL-6、IFN-α和IFN-γ购自Peprotech公司。
抗体
抗体STAT3，p-STAT3，STAT1，p-STAT1，JAK2，p-JAK2，JAK1，p-JAK1，p-TYK2，TYK2，p-PDGFRα、p-PDGFRβ、p-EGFR，EGFR，p-IGF1R，IGF1R，p-IκBα，p-IKK-α/β均购自CST(CellSignaling Technology)公司。α-微管蛋白(α-Tubulin)抗体购自Santa CruzBiotechnology公司。HRP-conjugated抗体购自MultiSciences Biotch公司。二抗Anti-Rabbit和Anti-Mouse均购自Multi Sciences Biotech公司。
细胞系与细胞培养
稳定转染STAT3/STAT1转录因子的荧光素酶报告基因的HepG2细胞和NF-κB转录因子的荧光素酶报告基因的HEK293细胞由新加坡国立大学的傅新元教授惠赠。HepG2细胞用α-MEM培养基培养，HEK293细胞用DMEM培养基培养。所有细胞系均购自American TypeCulture Collection(ATCC)。胎牛血清购自Thermo Fisher Scientific。配制培养基时均添加0.1mg/L的青霉素和链霉素以及10％胎牛血清。细胞培养在37度、含5％二氧化碳的培养箱中。
实施例1
荧光素酶报告基因检测(Luciferase)分析
(1)将稳定转染STAT3、STAT1和NF-κB荧光素酶报告基因的细胞分别接种在96孔板中，每孔3万-4万的细胞量，100μL每孔；
(2)细胞接种后隔一天加药。先将孔内的培养基吸掉，然后将化合物赤麻木脂素10mM母液依次稀释到6个浓度(1μM、5μM、10μM、15μM、20μM、40μM)加到96孔板中，每个浓度3复孔；
(3)加药一小时后，分别加刺激因子IL-6/IFN-γ/TNF-α(10ng/ml)，10μL每孔；
(4)加刺激因子5小时后，将每孔的培养基吸除，加30μL的裂解液，放在震荡仪上600rp震动10分钟；
(5)吸取每孔20μL的液体转移至白板上，再加每孔30μL的荧光素酶底物。然后以590nm的吸光度在酶标仪(公司：BioTek美国伯腾仪器有限公司，型号：SYNERGYH1)上检测样品的荧光强度；
(6)得到的数据导出Excel表格，后用Graph pad Prism软件作图、处理数据。
如图1所示，STAT-Luciferase报告基因实验显示，化合物赤麻木脂素剂量依赖性的抑制IL-6诱导的STAT3转录因子和IFN-r诱导的STAT1转录因子的转录活性。
如图2所示，赤麻木脂素抑制TNF-α诱导的依赖于NF-κB荧光素酶活性表达的抑制，提示赤麻木脂素呈浓度依赖性的抑制NF-κB信号通路。
实施例2
蛋白免疫印迹实验(Western blotting)
(1)蛋白样品的准备
将细胞以每孔15万的量接种在24孔板内，每孔500μL培养基，细胞培养过夜，贴壁生长状态良好，按照预先设计的浓度加药(浓度梯度是1μM、5μM、10μM、20μM)，加药后1h，加刺激因子诱导10分钟后裂解细胞收样，细胞裂解液配方laemmli buffer(62.5mM Tris-HCl,2％w/v SDS,10％甘油,50mM DTT,0.01％w/v溴酚蓝)在金属浴100度煮样7分钟，冷却到室温，放在-80度冰箱储存。
(2)SDS-PAGE凝胶配制
分子量为从40到180kD的蛋白用8％的SDS-PAGE凝胶即可，按照protocol配制，放在4度冰箱保存，存放时间一般不宜超过一周。
(3)电泳
将蛋白样品从-80度冰箱拿出来放到室温解冻，之后涡旋，高速离心样品30秒，以10μL每孔上样到SDS-PAGE。
上完样后，先以80V的低电压进行电泳，大概30分钟左右，当Mark在分离层明显分开时，将电压加到120V进行电泳，到溴酚蓝线到达凝胶底部停止电泳。
(4)转膜
采用半干式转膜法进行转膜，即将凝胶上的蛋白转移到NC膜(硝酸纤维膜)上，“三明治”操作法，凝胶放在NC膜上边，再在上下各放三层滤纸。恒压转膜40分钟。转完膜之后用丽春红染色染色5-7分钟，观察转膜是否完全。
(5)牛奶封闭杂蛋白
配制5％(5mg/100ml)脱脂奶粉，溶剂是TBST(20mM Tris-HCl,pH 7.4,150mMNaCl,0.1％Tween-20),放在垂直摇床上牛奶封闭一小时。
(6)一抗孵育
一抗种类分别如表1所示，一抗的溶剂是用含5％的BSA的TBST溶液，一抗的稀释一般为1:3000(1μL/3000μL),室温条件下，一抗孵育1小时，之后放4度垂直摇床过夜。
(7)二抗孵育
孵育一抗过夜后，拿到室温垂直摇床1小时之后洗膜，用TBST溶液洗三遍，每次10分钟，之后加入二抗，室温1-2小时。二抗配置同一抗，稀释比例为1:5000(1μL/5000μL)。
(8)显影
二抗孵育1小时后，用TBST溶液洗三遍进行化学曝光显影，用Azure化学发光仪成像。
表1
实验序号 一抗(1：3000稀释) 二抗(1：5000稀释)
1 p-STAT1 Anti-Rabbit
2 STAT1 Anti-Rabbit
3 p-STAT3 Anti-Rabbit
4 STAT3 Anti-Mouse
5 p-JAK1 Anti-Rabbit
6 JAK1 Anti-Rabbit
7 p-JAK2 Anti-Rabbit
8 JAK2 Anti-Rabbit
9 p-TYK2 Anti-Rabbit
10 TYK2 Anti-Rabbit
11 p-PDGFRα Anti-Rabbit
12 p-PDGFRβ Anti-Rabbit
13 p-EGFR Anti-Rabbit
14 EGFR Anti-Rabbit
15 p-IGF1R Anti-Rabbit
16 IGF1R Anti-Rabbit
17 p-IκBα Anti-Rabbit
18 p-IKK-α/β Anti-Rabbit
如图3所示，赤麻木脂素抑制IL-6诱导的STAT3和IFN-γ诱导的STAT1的磷酸化，提示赤麻木脂素抑制STATs的转录因子的活性是由于抑制了STATs磷酸化。
如图4所示，进一步发现赤麻木脂素抑制STATs的上游激酶JAKs的磷酸化，表明化合物通过抑制激酶JAKs来抑制STATs的磷酸化，从而抑制其转录活性。
如图5所示，相同浓度下，赤麻木脂素对与细胞生长密切相关的其他酪氨酸激酶没有抑制作用，表明化合物对JAK/STAT信号通路的具有选择性抑制作用。
图6所示，进一步发现赤麻木脂素抑制TNF-α诱导的IκBα的磷酸化。进一步发现赤麻木脂素抑制上游激酶IKK-α/β磷酸化从而抑制NF-κB信号通路。
综上所述，赤麻木脂素具有同时抑制和癌症、炎症等密切相关的JAK/STAT和NF-κB信号通路的优势，研究报道同时抑制这两种信号通路不仅可以提高治疗效果，还可以减少药物的副反应，另外在相同浓度下，化合物对其他与细胞生长密切相关的酪氨酸激酶没有影响，说明化合物的具有优异的选择性抑制JAK/STAT和NF-κB信号通路的作用，具有很好的药物应用前景。
在本发明提及的所有文献都在本申请中引用作为参考，就如同每一篇文献被单独引用作为参考那样。此外应理解，在阅读了本发明的上述讲授内容之后，本领域技术人员可以对本发明作各种改动或修改，这些等价形式同样落于本申请所附权利要求书所限定的范围。

Claims (10)

1.一种式I所示化合物、或其光学异构体、或其外消旋体、或其溶剂化物、或其药学上可接受的盐、或其前药的用途，其特征在于，用于制备药物组合物或制剂，所述药物组合物或制剂用于预防和/或治疗：
Figure FDA0002010800280000011
(a)JAK/STAT通路介导的疾病；和/或
(b)NF-κB通路介导的疾病；和/或
(c)JAK/STAT与NF-κB双重通路介导的疾病。
2.如权利要求1所述的用途，其特征在于，所述JAK/STAT通路介导的疾病选自：炎症性疾病、自身免疫性疾病、心脑血管性疾病、炎症性癌症。
3.如权利要求2所述的用途，其特征在于，JAK/STAT通路介导的疾病中，所述炎症性疾病选自：皮炎、胰腺炎、乳腺炎、结肠炎、结膜炎、角膜炎、甲状腺炎、支气管炎、鼻炎、肾炎、肝炎、酒精性脂肪肝、胃炎、肺炎和肺纤维化。
4.如权利要求2所述的用途，其特征在于，JAK/STAT通路介导的疾病中，所述自身免疫性疾病选自：狼疮、类风湿性关节炎、哮喘、风湿性心脏病。
5.如权利要求2所述的用途，其特征在于，所述心脑血管性疾病选自：脑膜炎、脑神经炎、老年痴呆、脑脊髓炎、败血症、冠心病、脓毒症、心肌炎、心肌肥大、心力衰竭、心肌缺血、动脉粥样硬化。
6.如权利要求1所述的用途，其特征在于，所述NF-κB通路介导的疾病选自：炎症性疾病、自身免疫性疾病、心脑血管性疾病、炎症性癌症。
7.如权利要求1所述的用途，其特征在于，所述JAK/STAT和NF-κB双重通路介导的疾病选自：炎症性疾病、自身免疫性疾病、心脑血管性疾病、炎症性癌症。
8.如权利要求1所述的用途，其特征在于，所述药物组合物或制剂中包括：
(a)有效治疗量的式I所示的化合物、或其光学异构体或其外消旋体、或其溶剂化物、或其药学上可接受的盐、或其前药；
(b)药学上可接受的载体。
9.如权利要求1所述的用途，其特征在于，所述药物组合物或制剂的剂型包括：片剂、丸剂、胶囊剂、散剂、颗粒剂、口服液剂或粉剂；注射剂或注射用乳剂；膏剂，软膏剂，霜剂，贴剂，搽剂或植入剂；喷雾剂、滴剂或栓剂；或者，脂质体注射剂或脂质体注射用乳剂。
10.一种体外非治疗性抑制JAK磷酸化和/或IKK磷酸化的方法，所述方法包括步骤：
在式I化合物存在下，培养细胞，从而抑制JAK磷酸化和/或IKK磷酸化。
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