CN106146557A

CN106146557A - 一种具有抗肿瘤活性的磷酸酯衍生物的合成及应用

Info

Publication number: CN106146557A
Application number: CN201510134443.4A
Authority: CN
Inventors: 蔡苹
Original assignee: Beijing Jian Jiao Medical Technology Co Ltd
Current assignee: Beijing Jian Jiao Medical Technology Co Ltd
Priority date: 2015-03-26
Filing date: 2015-03-26
Publication date: 2016-11-23

Abstract

本发明提供化合物1及其药学上可接受的盐及药物组合物。本发明还提供化合物1在制备抗肿瘤药物方面的应用。化合物1具有良好的水溶性，利于改善化合物的药代动力学性质，提高生物利用度，同时也适用于制成注射剂应用于不适合口服给药的患者。

Description

一种具有抗肿瘤活性的磷酸酯衍生物的合成及应用

技术领域

本发明涉及一种聚腺苷二磷酸核糖聚合酶(Poly(ADP-ribose)polymerase，PARP)抑制剂(磷酸酯衍生物[化合物1])的制备及其应用，含有该化合物的药物组合物，以及该化合物在治疗治疗卵巢癌、三阴性乳腺癌、胃癌、小细胞肺癌、神经胶质瘤上的应用。

技术背景

聚腺苷二磷酸核糖聚合酶(Poly(ADP-ribose)polymerase，PARP)具有保持染色体结构完整性、参与DNA的复制和转录、维持基因组稳定性等重要作用。PARP-1和PARP-2是PARP蛋白家族中最重要的两个成员。PARP-1通过碱基切除修复(BER)途径对DNA单链损伤(SSB)进行修复。PARP-1由损伤的DNA激活，裂解烟酰胺腺嘌呤二核苷酸，将产生的ADP核糖加至受体蛋白上，进一步聚合成ADP核糖聚合物(PAR)，受体蛋白包括PARP-1自身、组蛋白及一些其他DNA修复蛋白等。PAR聚合物修饰的蛋白带有大量负电荷，能招募一些在BER-SSB途径中发挥重要作用的蛋白，如XRCC1，其他一些参与染色体空间结构形成、DNA修复及复制的蛋白亦能与PAR非共价结合，共同发挥对DNA损伤的修复作用。PARP-2的功能与PARP-1类似，但其表达量要低于PARP-1。现有的PARP抑制剂大多同时抑制PARP-1和PARP-2。

PARP抑制剂应用于肿瘤治疗主要基于两个方面的机制：

1.近年来的研究发现，PARP抑制剂单药对于BRCA1和BRCA2突变的乳腺癌及卵巢癌细胞有明显抑制作用。PARP抑制剂能够抑制DNA单链损伤的修复过程，但这种单链DNA损伤可在DNA复制形成复制叉过程中转变为双链DNA损伤(DSB)，而这种DSB仍可以通过同源重组(HR)途径修复完成。如果肿瘤细胞存在同源重组修复缺陷(包括BRCA1/2突变)，使得DSB损伤无法修复，则会导致所谓PARP抑制剂和同源重组修复缺陷对肿瘤细胞的合成致死作用，随着研究的深入，逐渐发现BRCA1/2只是HR修复途径重要的一部分，HR修复是个复杂的过程，其中包括许多基因及蛋白成分参与，如ATM、ATR、CHK1、RAD51及其同系物如FANC蛋白、MRE11、RAD50、NBS1等。其他一些蛋白如EMSY和PTEN对于HR路径同样重要，它能上调HR通路中其它组成成分的活性。如果HR修复途径存在缺陷，如HR修复途径中某些基因突变或表达沉默，PARP抑制剂即可能通过合成致死作用而产生单药抗肿瘤活性。

2.许多化疗药物和放疗都是通过直接或间接攻击DNA，造成DNA损伤，从而对肿瘤细胞产生细胞杀伤作用的，而PARP1和PARP2对DNA损伤修复有关键的作用，很多研究发现PARP抑制剂可以作为化疗及放疗增敏剂，增强化疗和放疗的效果。最新的研究还发现，PARP抑制剂可将PARP蛋白捕获于受损的DNA上，PARP抑制剂捕获PARP于DNA的能力与化合物抑制肿瘤细胞生长的活性直接相关。

临床前和临床数据表明，PARP抑制剂用于治疗卵巢癌、三阴性乳腺癌、胃癌、小细胞肺癌、神经胶质瘤有巨大的潜力。直接或间接的BRCA1和BRCA2基因缺失在高度恶性浆液性卵巢癌和三阴性乳腺癌占很高的比例。多个PARP抑制剂在临床试验都在高度恶性浆液性卵巢癌和三阴性乳腺癌中有抑制肿瘤、延长无进展生存期(PFS)的效果。胃癌也是对PARP抑制剂敏感的肿瘤。

奥拉帕尼(Olaparib)是由阿斯利康公司开发的口服PARP-1和PARP-2抑制剂。首先在实体瘤患者进行了I期临床研究，起始剂量为10mg(qd)，疗程21天，后续给药剂量调整为60mg(qd)，并逐渐递增至600mg(bid)，每天给药，疗程28天。受试者对奥拉帕尼耐受性良好，主要不良反应为1-2级胃肠毒性和疲乏。最大耐受剂量(MTD)定为400mg(bid)。

奥拉帕尼与紫杉醇联用相比紫杉醇单独用药，对胃癌患者总生存期(OS)有显著提高(13.1vs 8.3个月)，在ATM表达水平低的胃癌患者中药效更加显著。作为化疗及放疗增敏及，多个PARP抑制剂与替莫唑胺或其他化疗药物联用，在小细胞肺癌和神经胶质瘤中进行临床试验。

奥拉帕尼在卵巢癌中进行了多项临床试验，包括单药进行2个II期随机临床试验。结果显示奥拉帕尼将PFS延长了4个月，但在OS上没有显著提高。亚组分析鉴定出，携带BRCA突变的卵巢癌患者，从奥拉帕尼单药维持疗法中获得了最大的治疗收益。基于此结果，阿斯利康公司开展了奥拉帕尼的III期临床试验SOLO项目。SOLO项目包含2个研究，旨在研究奥拉帕尼作为单药疗法，用于携带BRCA突变卵巢癌患者一线铂类药物为基础的化疗后维持治疗的疗效，以及用于携带BRCA突变的铂敏感复发性卵巢癌患者维持治疗的疗效，主要终点均为PFS。今年5月，阿斯利康基于临床研究的结果，向美国FDA和欧洲药局(EMA)提交了奥拉帕尼的新药申请(NDA)，且在EMA获得优先审评资格。但奥拉帕尼的溶解度较差，在pH＝7.4缓冲液中的溶解度小于1mg/mL。因此，出于制剂方便考虑，亟须解决原料药的溶解度问题。传统上，增加难溶性药物溶解度的一个重要方法是前药策略，亦即在母体分子上缀合可显著改善水溶性的基团，最典型的设计为引入磷酸前药。磷酸前药策略的优势在于：1)有很多现成的衍生化试剂可供挑选；2)磷酸前药在体内降解快速且完全，能够完全释放出母体药物。发明人使用氯甲基衍生化的磷酸酯将奥拉帕尼衍生化为奥拉帕尼磷酸衍生物。

发明内容

本发明提供一种具有抗肿瘤活性的磷酸酯衍生物(化合物1)，具有如下结构：

本发明提供所述化合物(1)或其药学上可接受的盐，其中盐选自有机盐和无机盐，优选单钠盐、双钠盐、单铵盐、双铵盐。

本发明还提供一种药物组合物，包含0.01g-10g化合物1及其药学上可接受的盐与一种或多种药用载体和/或稀释剂，制成用于临床的药物制剂。

本发明还提供化合物1在制备抗肿瘤药物方面的应用

本发明还提供化合物1的合成方法，步骤如下：

本发明所示化合物1或其药学上可接受的盐用于哺乳动物，例如人类，所用制剂包括但不仅限于口服制剂、注射剂(静脉、肌肉或皮下)、直肠以及局部给药制剂(如栓剂、乳膏剂、软膏、搽剂、透皮制剂和滴剂等)。

本发明所述口服制剂包括片剂、胶囊剂、丸剂和颗粒剂等。在这些固体制剂中，本发明化合物1为活性成分，与一种或多种惰性辅料混合，如稀释剂，包括但不仅限于微晶纤维素102、淀粉、玉米淀粉、甘露醇、乳糖等；粘合剂，包括但不仅限于羟甲基纤维素、明胶、聚乙烯吡咯烷酮等；崩解剂，包括但不仅限于羧甲基纤维素钠、琼脂、淀粉等；润滑剂，包括但不仅限于滑石、硬脂酸镁、硬脂酸钙等。

本发明所述注射剂包括生理上可接受的无菌含水或无水溶液，如水针和大输液，以及可重溶的冻干粉针，所用辅料包括水、甘露醇、多元醇，磷酸氢钙等。

附图说明

附图1为化合物1的1H NMR图谱

附图2为化合物1的MS棒状图

具体实施方式

[实施例1](4-(3-(4-(环丙羰酰基)哌嗪-1-羰基)-4-氟苯基)-1-氧代酞嗪-2(1H)-基)甲基磷酸酯的合成

步骤1：

将(4-(3-(4-(环丙羰酰基)哌嗪-1-羰基)-4-氟苯基)-1-氧代酞嗪-1(2H)酮(150mg，0.346mmol)溶于3mL二甲基乙酰胺中，加入碳酸铯(284mg，0.865mmol)，(氯甲基)磷酸二叔丁酯(134mg，0.519mmol)。60摄氏度搅拌2小试后，向反应体系加入饱和氯化铵水溶液，用乙酸乙酯萃取(10mL x 3)。合并有机相，浓缩，粗品用硅胶柱层析分离(淋洗剂为二氯甲烷∶甲醇＝80∶1)，得(4-(3-(4-(环丙羰酰基)哌嗪-1-羰基)-4-氟苯基)-1-氧代酞嗪-2(1H)-基)甲基磷酸二叔丁酯(150mg，70％)，无色油状液体。

步骤2：

将步骤1所得产物(150mg，0.229mmol)溶于醋酸/水(3mL/3mL)混合溶液中，60摄氏度搅拌30分钟。反应结束后，蒸干溶剂，用制备HPLC纯化粗品，得(4-(3-(4-(环丙羰酰基)哌嗪-1-羰基)-4-氟苯基)-1-氧代酞嗪-2(1H)-基)甲基磷酸酯(化合物1)(35mg，28％)，白色固体。1H NMR(400MHz，CD3OD)δ8.40(d，1H)，7.95-7.85(m，3H)，7.57(m，1H)，7.45(d，1H)，7.19(t，1H)，6.00(d，2H)，4.42(d，2H)，3.89-3.85(m，2H)，3.74(m，2H)，3.52(m，1H)，3.45(m，1H)，3.30(m，1H)，2.02-1.93(m，1H)，0.90-0.86(m，4H).MS(ESI)m/z，544.8(M+1)⁺

[实施例2]化合物1和奥拉帕尼溶解度比较

pH＝7.4磷酸盐缓冲液配制：

取磷酸二氢钾1.36g，加0.1mol/L氢氧化钠溶液79ml，用水稀释至200ml，即得。

奥拉帕尼溶解度测定：

称量1.011mg奥拉帕尼，置于10mL玻璃试管中，用移液枪吸取1000μL上述磷酸盐缓冲液，加入玻璃试管中。涡旋混合30秒，目视观察，奥拉帕尼未能完全溶解。奥拉帕尼溶解度＜1.0mg/mL。

化合物1溶解度测定：

称量5.034mg化合物1，置于10mL玻璃试管中，用移液枪吸取1000μL上述磷酸盐缓冲液，加入玻璃试管中。涡旋混合30秒，目视观察，化合物1完全溶解。化合物1溶解度≥5mg/mL。

[实施例3]化合物1片剂制备

成分	用量
		化合物1	10g
微晶纤维素102	10.35g
		磷酸氢钙二水合物	16g
交联羧甲基纤维素钠	400mg
		硬脂富马酸	400mg
硬脂酸镁	400mg
		包衣粉	30mg

将所有物料在混合机中混匀，测定总混均一度后，用单冲压片机压片。素片包衣，干燥后即得成品片剂。

[实施例4]化合物1注射剂制备

成分	用量(g)
		化合物1	2.0
甘露醇	1.0
		注射用水	400ml

将所有物料溶于注射用水，分装入玻璃安瓿中，每支2mL，封口，121摄氏度30分钟灭菌，即得注射剂。

[实施例5]化合物1在磷酸缓冲液和血浆中的水解情况

储备液：50μg/mL水溶液

pH 7.4磷酸盐缓冲液的配制：取磷酸二氢钾1.36g，加0.1mol/L氢氧化钠溶液79ml，用水稀释至200ml，即得。

人血浆：

取肝素化健康成年男性全血50mL，8500g离心30min，取上清液，分装，置于-20℃冰柜中备用。

试验方法：

将人血浆和pH7.4磷酸盐缓冲液0.8mL分别加入两个2mL离心管中，置于37℃恒温水浴箱中，保温30min。加入上述储备液0.2mL，涡旋混合30秒，取样0.1mL，于37℃保温30min。向样品中加入0.4mL冷冻(-30℃)甲醇，离心3分钟(4000RPM)，取上清液进行HPLC分析。此后分别在0.5、1、2、4和8h分别取样，后处理同前。

不同时刻的化合物峰面积百分比＝不同时间的积分面积/0时刻积分面积*100％

表1 化合物1在磷酸盐缓冲液和血浆中的水解情况

根据表1的所示数据可以得出结论，化合物1在水溶液中具有良好的溶解度，且在水中稳定。在人血浆中，被迅速水解为母体药物。

[实施例6]化合物1的体外酶水平抑制活性和体外细胞PF₅₀值测定

根据J.Biomol.Screening 2003，8，347-352报道的试验方法，测定化合物1和奥拉帕尼的在体外对PARP-1的抑制活性，其中，选择[实施例5]中化合物1的血浆样品作为体外试验的样品。

根据J.Natl.Cancer Inst.1990，82，1107-1112报道的显色细胞毒试验方法，测定化合物1和奥拉帕尼的PF₅₀值。

表2 化合物1和奥拉帕尼的体外活性

	PARP-1IC50(nM)	PF₅₀
			化合物1	5	23.8
奥拉帕尼	5	24.6

Claims

1.一种具有抗肿瘤活性的磷酸酯衍生物(化合物1)，具有如下结构：

2.权利要求1所述化合物或其药学上可接受的盐，其中盐选自有机盐和无机盐，优选单钠盐、双钠盐、单铵盐、双铵盐。

3.一种药物组合物，包含0.01g-10g权利要求1所述化合物及其药学上可接受的盐与一种或多种药用载体和/或稀释剂，制成用于临床的药物制剂。

4.权利要求1所述化合物在制备抗肿瘤药物方面的应用。

5.权利要求1所述化合物的合成方法，步骤如下：