CN106659740A - 凋亡小体 - Google Patents

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Abstract

本公开涉及凋亡小体。本公开具体地涉及一种包含凋亡小体的组合物。本公开还涉及由干细胞制备凋亡小体。本公开还涉及包括使用包含凋亡小体的组合物的医学治疗。所述凋亡小体可包含凋亡干细胞。细胞的细胞凋亡可通过饥饿法、紫外线照射法、热应力法、星形孢菌素法或其组合进行诱导。

Description

凋亡小体
相关申请的交叉引用
本申请要求2014年8月8日提交的标题为“凋亡小体”的美国临时专利申请号62/035,246(代理人案号064693-0302)的权益，其全部内容以引用的方式并入本文。
技术领域
本公开涉及凋亡小体。本公开具体地涉及一种包含凋亡小体的组合物。本公开还涉及由干细胞制备凋亡小体。本公开还涉及包括使用包含凋亡小体的组合物的医学治疗。
相关技术描述
本公开总体上涉及细胞疗法和细胞治疗产品。细胞治疗产品的一些实例包括干细胞来源的产品和干细胞，诸如来自间充质干细胞、造血干细胞、胚胎干细胞和脐带血干细胞的那些；癌症疗法和免疫疗法，诸如树突细胞疫苗；活化的T淋巴细胞或B淋巴细胞、单核细胞以及修饰的或未修饰的癌细胞、同种异体胰岛细胞、用于骨再生的骨形成细胞、用于软骨修复的软骨细胞、角质形成细胞、成纤维细胞和肝细胞。参见，例如，Wonnacott K.“Cellular Therapy Products”Food and Drug Administration,Web Seminar Series,UCM273197。这个出版物的全部内容以引用的方式并入本文。
细胞治疗产品的实例为包含间充质干细胞(MSC)的组合物。MSC拥有多潜能分化潜力和调控免疫应答的能力。例如，参见Uccelli等“Mesenchymal stem cells in healthand disease”(2008)Nat.Rev.Immunol.8:726-736；Nauta等“Immunomodulatoryproperties of mesenchymal stromal cells”(2007)Blood 110:3499-3506；和Aggarwal等“Human mesenchymal stem cells modulate allogeneic immune cell responses”(2005)Blood 105:1815–1822；这些出版物的全部内容以引用的方式并入本文。MSC已经显示在体外或体内分化成的细胞类型包括成骨细胞、软骨细胞、肌细胞、脂肪细胞、内皮细胞和β-胰岛支持细胞。
MSC具有较大自我更新能力，同时保持其多潜能性。证实多潜能性的标准测试是细胞分化为成骨细胞、脂肪细胞和软骨细胞以及可能的神经元样细胞。然而，培养物将分化的程度因个体和诱导分化的方式(例如，化学对比机械)而不同。已知细胞增殖和分化的能力随供体的年龄以及培养时间降低。
公开了人MSC可以避免同种识别、干扰树突细胞和T细胞功能并通过分泌细胞因子产生局部免疫抑制微环境。还公开了当细胞暴露于特征在于存在升高的局部干扰素-γ水平的炎性环境时，可增强人MSC的免疫调节功能。
因此，MSC可用于组织再生和免疫疗法。例如，参见Le Blanc等“Mesenchymal stemcells for treatment of steroid-resistant,severe,acute graft-versus-hostdisease:a phase II study”(2008)Lancet 371:1579-1586；Sun等“Mesenchymal stemcell transplantation reverses multiorgan dysfunction in systemic lupuserythematosus mice and humans”(2009)Stem Cells 27:1421-1432；和Akiyama等“Mesenchymal-stem-cell-induced immunoregulation involves FAS-ligand-/FAS-mediated T cell apoptosis”(2012)Cell Stem Cell 10:544-555；这些出版物的全部内容以引用的方式并入本文。
然而，仍然需要其他来源的细胞治疗产品和用于其制备的新方法，以及此类产品用于医学治疗的用途。
概述
本公开涉及凋亡小体。本公开具体地涉及一种包含凋亡小体的组合物。本公开还涉及由干细胞制备凋亡小体。优选地，凋亡小体由多潜能干细胞或多能干细胞、而不是全能干细胞制备。更优选地，凋亡小体由多潜能干细胞、而不是多能干细胞或全能干细胞制备。本公开还涉及包括使用包含凋亡小体的组合物的医学治疗。
本公开涉及一种组合物。所述组合物可适合于治疗哺乳动物。所述组合物可包含凋亡小体。凋亡小体可包含凋亡干细胞。
在本公开中，凋亡干细胞可包括任何凋亡干细胞。例如，凋亡干细胞可包括凋亡间充质干细胞、凋亡胚胎干细胞、凋亡胎儿干细胞、凋亡成体干细胞、凋亡羊膜干细胞、凋亡脐带血干细胞、凋亡诱导的多能干细胞或其组合。例如，凋亡干细胞可包括凋亡间充质干细胞。例如，凋亡干细胞可包括凋亡骨髓来源的间充质干细胞、凋亡牙髓干细胞、来自人脱落乳牙的凋亡干细胞、凋亡牙周韧带干细胞、凋亡牙囊干细胞、凋亡牙胚祖细胞、来自根尖牙乳头(apical papilla)的凋亡干细胞、凋亡口腔上皮祖细胞/干细胞、凋亡牙龈来源的间充质干细胞、凋亡骨膜来源的干细胞、凋亡唾液腺来源的干细胞或其组合。例如，凋亡干细胞可包括来源于培养的间充质干细胞的凋亡小体、来源于未培养的牙龈来源的间充质干细胞的凋亡小体、凋亡牙髓干细胞、凋亡骨髓来源的干细胞或其组合。
在本公开中，凋亡干细胞可通过干细胞的细胞凋亡来获得，例如，干细胞的细胞凋亡可通过饥饿法、紫外线照射法、热应力法、星形孢菌素法或其组合进行诱导。
例如，凋亡干细胞可通过将干细胞在无血清培养基中孵育1小时至1,000小时范围内的时间段来获得。或者，凋亡干细胞可通过将干细胞在无血清培养基中孵育10小时至100小时范围内的时间段来获得。
在另一个实例中，凋亡干细胞可通过在30℃至100℃范围内的温度下加热干细胞持续预定时间段来获得。或者，凋亡干细胞可通过在30℃至100℃范围内的温度下加热干细胞1分钟至1,000分钟范围内的时间段来获得。或者，凋亡干细胞可通过在30℃至100℃范围内的温度下加热干细胞10分钟至100分钟范围内的时间段来获得。或者，凋亡干细胞可通过在40℃至70℃范围内的温度下加热干细胞持续预定时间来获得。或者，凋亡干细胞可通过在40℃至70℃范围内的温度下加热干细胞1分钟至1,000分钟范围内的时间段来获得。或者，凋亡干细胞可通过在40℃至70℃范围内的温度下加热干细胞10分钟至100分钟范围内的时间段来获得。
然而，在另一个实例中，凋亡干细胞可通过用1nm星形孢菌素至10,000nM星形孢菌素范围内的量的星形孢菌素处理干细胞持续1小时至1,000小时范围内的时间段来获得。或者，凋亡干细胞可通过用1nm星形孢菌素至10,000nM星形孢菌素范围内的量的星形孢菌素处理干细胞持续5小时至100小时范围内的时间段来获得。或者，凋亡干细胞可通过用100nm星形孢菌素至1,000nM星形孢菌素范围内的量的星形孢菌素处理干细胞持续1小时至1,000小时范围内的时间段来获得。或者，凋亡干细胞可通过用100nm星形孢菌素至1,000nM星形孢菌素范围内的量的星形孢菌素处理干细胞持续5小时至100小时范围内的时间段来获得。或者，凋亡干细胞可通过用1nm星形孢菌素至10,000nM星形孢菌素范围内的量的星形孢菌素处理无血清培养基中的干细胞持续1小时至1,000小时范围内的时间段来获得。或者，凋亡干细胞可通过用1nm星形孢菌素至10,000nM星形孢菌素范围内的量的星形孢菌素处理无血清培养基中的干细胞持续5小时至100小时范围内的时间段来获得。或者，凋亡干细胞可通过用100nm星形孢菌素至1,000nM星形孢菌素范围内的量的星形孢菌素处理无血清培养基中的干细胞持续1小时至1,000小时范围内的时间段来获得。或者，凋亡干细胞可通过用100nm星形孢菌素至1,000nM星形孢菌素范围内的量的星形孢菌素处理无血清培养基中的干细胞持续5小时至100小时范围内的时间段来获得。
然而，在另一个实例中，凋亡干细胞可通过在100nm至400nm范围内的波长下照射干细胞持续0.1分钟至1,000分钟范围内的时间段来获得。或者，凋亡干细胞可通过在对于UV灯100nm至400nm范围内的波长下照射干细胞持续1分钟至100分钟范围内的时间段来获得。
本公开还涉及一种用于制备本公开的组合物的方法。所述制备方法可例如包括诱导干细胞的细胞凋亡且由此制备包含凋亡干细胞的凋亡小体。
在所述制备方法中，干细胞可包括任何干细胞。例如，干细胞可包括胚胎干细胞、胎儿干细胞、成体干细胞、羊膜干细胞、脐带血干细胞、诱导的多能干细胞或其组合。例如，干细胞可包括间充质干细胞。例如，干细胞可包括骨髓来源的间充质细胞、牙髓干细胞、来自人脱落乳牙的干细胞、牙周韧带干细胞、牙囊干细胞、牙胚祖细胞、来自根尖牙乳头的干细胞、口腔上皮祖细胞/干细胞、牙龈来源的间充质干细胞、骨膜来源的干细胞、唾液腺来源的干细胞或其组合。例如，干细胞可包括培养的间充质干细胞、未培养的牙龈来源的间充质干细胞、牙髓干细胞、骨髓来源的干细胞或其组合。
例如，在本公开中，细胞凋亡可通过饥饿法、紫外线照射法、热应力法、星形孢菌素法或其组合进行诱导。
在本公开中，凋亡小体可例如通过离心进行收集。
所述制备方法还可包括通过荧光显微术技术、流式细胞术技术、离心技术或其组合来鉴定、定量和/或分离凋亡小体。
本公开还涉及一种治疗人受试者的方法。所述治疗方法可例如包括向人受试者施用有效量的组合物并且由此治疗所述人受试者，所述组合物包含含有人凋亡干细胞的凋亡小体。
在本公开中，治疗可包括治疗疾病。所述疾病可例如包括炎症、自身免疫性疾病、由卵巢切除术引起的骨丢失、肿瘤形成和/或伤口。
例如，炎症和/或自身免疫性疾病可以是移植物抗宿主病(GvHD)、糖尿病、类风湿性关节炎(RA)、自身免疫性脑脊髓炎、全身性红斑狼疮(SLE)、多发性硬化症(MS)、牙周炎、炎性肠病(IBD)、粘膜炎、结肠炎、败血症等或其组合。例如，炎症和/或自身免疫性疾病可包括结肠炎。例如，炎症和/或自身免疫性疾病可包括全身性红斑狼疮。例如，所述疾病可以是由卵巢切除术引起的骨丢失。例如，所述疾病可以是肿瘤形成。例如，所述肿瘤可以是肝细胞癌、多发性骨髓瘤或其组合。例如，所述疾病可以是伤口。
在所述治疗方法中，人凋亡干细胞可例如包括人凋亡间充质干细胞、人凋亡胚胎干细胞、人凋亡胎儿干细胞、人凋亡成体干细胞、人凋亡羊膜干细胞、人凋亡脐带血干细胞、人凋亡诱导的多能干细胞或其组合。例如，人凋亡干细胞可包括人凋亡间充质干细胞。例如，人凋亡干细胞可包括人凋亡骨髓来源的间充质细胞、人凋亡牙髓干细胞、来自人的人脱落乳牙的凋亡干细胞、人凋亡牙周韧带干细胞、人凋亡牙囊干细胞、人凋亡牙胚祖细胞、来自人的根尖牙乳头的凋亡干细胞、人凋亡口腔上皮祖细胞/干细胞、人凋亡牙龈来源的间充质干细胞、人凋亡骨膜来源的干细胞、人凋亡唾液腺来源的干细胞或其组合。例如，人凋亡干细胞可包括来源于人的培养的间充质干细胞的凋亡小体、来源于人的未培养的牙龈来源的间充质干细胞的凋亡小体、人凋亡牙髓干细胞、人凋亡骨髓来源的干细胞或其组合。
本公开还涉及一种改善干细胞特性的方法(“改善方法”)。所述改善方法可包括使用有效量的本公开的组合物。所述改善方法可包括包含凋亡干细胞的凋亡小体。所述改善方法可改善：(a)骨髓间充质干细胞在体内和/或体外的集落形成；(b)骨髓间充质干细胞在体内和/或体外的免疫调节；(c)骨髓间充质干细胞在体内和/或体外的骨生成；(d)骨髓间充质干细胞在体内和/或体外的脂肪形成；或其组合。例如，所述改善方法可包括改善骨髓间充质干细胞在体内和/或体外的集落形成。例如，所述改善方法可包括改善骨髓间充质干细胞在体内和/或体外的免疫调节。例如，所述改善方法可包括改善骨髓间充质干细胞在体内和/或体外的骨生成。例如，所述改善方法可包括改善骨髓间充质干细胞在体内和/或体外的脂肪形成。
还可进行和遵循本文所述的产品(诸如包含凋亡小体的组合物)、其制备方法及其使用方法的任何组合。
这些以及其他部件、步骤、特征、对象、益处以及优点现在将从阅读以下说明性实施方案的详述、附图以及权利要求的综述变得显而易见。
附图简述
附图公开了说明性实施方案。附图并不列出所有实施方案。此外或作为替代，可使用其他实施方案。可省略可能是显而易见的或不必要的细节，以便节省空间或用于更有效的说明。相反，可在无所公开所有细节的情况下实践一些实施方案。当相同的数字出现在不同附图中时，它是指相同或相似的部件或步骤。
图1.GMSC的示意图。通过星形孢菌素法诱导细胞凋亡。通过使用光学显微镜和流式细胞术分析来检测细胞凋亡。
图2.凋亡小体收集的示意图。
图3.通过荧光显微术进行的凋亡小体鉴定。
图4.相对计数法的示意图以及通过使用此方法获得的凋亡小体计数的实验结果。
图5A-B.使用流式细胞分选法的凋亡小体纯化和分选。DRAQ5用作荧光标记。
图6.凋亡小体纯化的示意图和通过此方法纯化的细胞的显微镜检查。
图7A-B.通过凋亡小体进行的小鼠的全身输注以及BMMSC的收获的示意图。实验CFU数目示于此图中。
图8A-B.通过凋亡小体处理进行的BMMSC体外增殖。(A)细胞显微镜检查和(B)细胞百分比。
图9A-B.在体外用凋亡小体处理的BMMSC的成骨分化潜力。(A)茜素染色和(B)免疫印迹分析。
图10A-B.用凋亡小体处理的BMMSC的矿化组织形成潜力。(A)组织显微镜检查和(B)骨体积面积。
图11A-B.用凋亡小体处理的BMMSC的脂肪形成潜力。(A)油红O染色和(B)免疫印迹分析。
图12A-B.通过凋亡小体处理改善BMMSC体外免疫调节潜力。
图13A-D.用凋亡小体处理结肠炎小鼠。
图14A-I.用凋亡小体处理切除卵巢的小鼠。
图15A-G.用凋亡小体处理全身性红斑狼疮(SLE)小鼠。
图16A-B.凋亡小体输注抑制小鼠肝细胞癌模型中的实体瘤生长。(A)用凋亡小体处理的异种移植肿瘤显示肿瘤体积减小。(B)HE染色示出与对照肿瘤相比，凋亡小体处理的肿瘤诱导的造血细胞的浸润。
图17A-B.凋亡小体处理降低体外肿瘤细胞存活。(A)细胞存活分析表明与凋亡小体共培养以剂量依赖性方式降低肿瘤细胞存活。(B)全基因表达模式的微阵列分析表明凋亡小体处理增加细胞凋亡和溶酶体功能。
图18.凋亡小体输注提高多发性骨髓瘤小鼠模型的存活率。小鼠模型的卡普兰-迈耶(Kaplan-Meier)存活分析表明凋亡小体处理显著提高小鼠寿命。
图19A-E.凋亡小体(AB)肠内输注改善DSS诱导的结肠炎。(A)由于DSS施用可在小鼠中诱导结肠炎，所以在DSS诱导后约3天输注约1×107个AB或骨髓间充质干细胞(MSC)，并且在DDS诱导后约10天收获样品以评价AB的治疗作用，并使用MSC肠内输注作为阳性对照。凋亡小体处理显示：(B)在挽救体重方面与MSC组相比的显著治疗作用和(C)结肠中的组织学活性指数降低和降低。(D和E)与结肠炎组相比，AB处理在结肠炎诱导后约10天在小鼠中显示在降低Th1和Th17细胞水平方面的显著作用。这些实验结果证明AB肠内输注可用作治疗免疫病症(诸如结肠炎)的新方法。
图20A-C.AB输注改善小鼠耳打孔模型中的伤口愈合。(A)将约5×106个AB在耳打孔之前或之后输注到小鼠中。(B和C)在耳打孔后约7天，当与未处理的对照组相比时，AB处理组的耳孔面积显著减小。
说明性实施方案的详述
现在讨论说明性实施方案。此外或作为替代，可使用其他实施方案。对于本领域普通技术人员可能显而易见的或不必要的某些细节可从本公开中省略以提供清楚且简洁的公开内容。相反，可在无所公开的所有细节的情况下实践一些实施方案。
在本公开中使用以下首字母缩略词和缩写。
AB：凋亡小体
BMMSC：骨髓来源的间充质干细胞
BMD：骨矿密度
CFU-F：集落形成单位-成纤维细胞
DFSC：牙囊干细胞
DPSC：牙髓干细胞
DSS：葡聚糖硫酸钠
FACS：荧光辅助的细胞分选
GMSC：牙龈来源的间充质干细胞
GvHD：移植物抗宿主疾病
HE：苏木精和曙红
HA/TCP：羟基磷灰石磷酸三钙
MSC：间充质干细胞
nM：纳摩尔
OESC：口腔上皮祖细胞/干细胞
PDLSC：牙周韧带干细胞
PSC：骨膜来源的干细胞
SCAP：来自根尖牙乳头的干细胞
SGSC：唾液腺来源的干细胞
SHED：来自人脱落乳牙的干细胞
SLE：全身性红斑狼疮
TGPC：牙胚祖细胞
UV：紫外线
μm：微米
本公开涉及凋亡小体。本公开具体地涉及一种包含凋亡小体的组合物。本公开还涉及由干细胞制备凋亡小体。本公开还涉及包括使用包含凋亡小体的组合物的医学治疗。
凋亡小体可以是直径大约0.5-10μm的囊泡，并且由经历程序性细胞死亡(称为细胞凋亡)的细胞产生，细胞凋亡可用细胞收缩和核染色质的凝聚引发，接着是膜起泡。细胞器、凝聚的染色质及其片段可被封装在质膜中以形成凋亡小体。可通过连续离心从凋亡细胞中收集凋亡小体，如实施例3中所公开。凋亡小体可被表征为在表面膜上的磷脂酰丝氨酸暴露，其可用膜联蛋白V染色和其他表面标记物(诸如TSP-1)进行检测。约10％的凋亡小体可含有可用Hoechst 33342标记的遗传物质。
本公开还涉及凋亡小体疗法(或凋亡小体治疗)。凋亡小体治疗可包括但不限于，诊断、治疗、治愈、愈合、减轻或预防哺乳动物的疾病或损伤和/或美容治疗。所述哺乳动物可以是人。所述哺乳动物可以是非人动物，诸如非人灵长类动物、马、绵羊、牛、猪、狗、猫和山羊。
本公开还涉及在肿瘤和炎性和/或自身免疫性疾病的治疗中使用包含凋亡小体的组合物的方法(“治疗方法”)。所述肿瘤的实例可以是肝细胞癌和多发性骨髓瘤。此类疾病的实例是移植物抗宿主疾病(GvHD)、糖尿病、类风湿性关节炎(RA)、自身免疫性脑脊髓炎、全身性红斑狼疮(SLE)、多发性硬化症(MS)、牙周炎、炎性肠病(IBD)、由化学疗法或放射疗法诱导的消化道粘膜炎、结肠炎和败血症。所述治疗方法的另一个实例可以是治疗由卵巢切除术引起的骨丢失。
本公开还涉及在BMMSC的改善中使用包含凋亡小体的组合物的方法(“改善方法”)。改善BMMSC的此类用途的实例包括，用于改善骨髓间充质干细胞在体内或体外的集落形成、改善骨髓间充质干细胞在体内或体外的骨生成、改善骨髓间充质干细胞在体内或体外的脂肪形成、改善骨髓间充质干细胞在体内或体外的免疫调节以及其组合的用途。
适用于治疗的组合物可包含凋亡小体。所述组合物可包含可通过干细胞的细胞凋亡制备的凋亡小体。在一个实例中，凋亡小体可包含凋亡干细胞。所述凋亡干细胞可以是通过干细胞的细胞凋亡制备的干细胞。在本公开的所有实施方案中，优选凋亡小体由多潜能干细胞或多能干细胞、而不是全能干细胞制备。更优选地，凋亡小体由多潜能干细胞、而不是多能干细胞或全能干细胞制备。
在本公开中，所述干细胞可以是哺乳动物的干细胞。所述哺乳动物可以是人。所述哺乳动物可以是非人动物，诸如非人灵长类动物、马、绵羊、牛、猪、狗、猫和山羊。
在本公开中，人的干细胞可用于制备凋亡干细胞。此类人来源的凋亡干细胞可用于治疗人受试者。
本公开涉及组合物。所述组合物可包含凋亡小体。所述组合物可包含含有凋亡小体的细胞培养物。所述组合物可以是药物或生物制剂。所述组合物可用于凋亡小体治疗。
在本公开中，所述组合物可包含含有凋亡干细胞的凋亡小体。
适用于制备示例性组合物的干细胞可以是任何哺乳动物的任何干细胞。例如，所述干细胞可以是经历治疗(即，包括使用包含凋亡自体干细胞的凋亡小体的凋亡小体治疗，“自体凋亡小体治疗”)的哺乳动物的干细胞。或者，所述干细胞可以是除经历治疗(即，包括使用包含凋亡同种异体干细胞的凋亡小体的同种异体小体治疗，“同种异体凋亡小体治疗”)的哺乳动物以外的哺乳动物的干细胞。
以下是适用于制备包含凋亡干细胞的凋亡小体的干细胞的实例。
所述干细胞可以是任何干细胞。干细胞的实例可以是胚胎干细胞、胎儿干细胞、成体干细胞、羊膜干细胞、脐带血干细胞、诱导的多能干细胞或其组合。
干细胞的实例可包括间充质干细胞(MSC)。间充质干细胞的实例可包括骨髓来源的间充质细胞(BMMSC)、牙髓干细胞(DPSC)、人脱落乳牙干细胞(SHED)、牙周韧带干细胞(PDLSC)、牙囊干细胞(DFSC)、牙胚祖细胞(TGPC)、根尖牙乳头干细胞(SCAP)、口腔上皮祖细胞/干细胞(OESC)、牙龈来源的间充质干细胞(GMSC)、骨膜来源的干细胞(PSC)、唾液腺来源的干细胞(SGSC)以及其组合。
关于此类干细胞、适合于此类干细胞的收获的组织、从此类组织中分离此类干细胞的方法、此类干细胞的扩增以及此类干细胞用于治疗的施用方法的详细公开内容，参见，例如，Egusa等“Stem Cells in Dentistry–Part I:Stem Cell Sources”J.ProsthodonticRes.(212)v56,p151-165；Shi等“A composition of stem cells having highlyexpressed Fas ligand,”WO2015038665A1；Atsuta等“Mesenchymal stem cells inhibitmultiple myeloma cells via the Fas/Fas ligand pathway”Stem Cell Research&Therapy,2013,4:111；Le等“Gingiva Derived Stem Cell and Its Application inImmunomodulation and Reconstruction”，U.S.2012/0128636A1；Shi等“A Compositionof Mesenchymal Stem Cells”，WO2014210037；Shi等“Compositions and TreatmentMethods for Mesenchymal Stem Cell-Induced Immunoregulation,”US20150104428A1；Shi等“High Telomerase Activity Bone Marrow Mesenchymal Stem Cells,Methods ofProducing the Same and Pharmaceuticals and Treatment Methods Based Thereon,”US20130330300A1；以及Shi等“Methods and Compositions for Improved TissueRegeneration by Suppression of Interferon-Gamma and Tumor Necrosis Factor-Alpha,”US20140154220A1。这些出版物各自的全部内容以引用的方式并入本文。
在另一个实例中，培养的和/或未培养的MSC可用于制备凋亡小体。在另一个实例中，可使用未培养的和/或培养的GMSC、DPSC或其组合。然而，在另一个实例中，可使用培养的和/或未培养的BMMSC。而且，在另一个实例中，可使用这些未培养的和/或培养的干细胞的组合。
凋亡干细胞由此可由所述干细胞制备。因此，此类凋亡干细胞的实例可以是凋亡间充质干细胞、凋亡胚胎干细胞、凋亡胎儿干细胞、凋亡成体干细胞、凋亡羊膜干细胞、凋亡脐带血干细胞、凋亡诱导多能干细胞以及其组合。例如，所述凋亡干细胞可以是凋亡骨髓来源的间充质细胞、凋亡牙髓干细胞、来自人脱落乳牙的凋亡干细胞、凋亡牙周韧带干细胞、凋亡牙囊干细胞、凋亡牙胚祖细胞、来自根尖牙乳头的凋亡干细胞、凋亡口腔上皮祖细胞/干细胞、凋亡牙龈来源的间充质干细胞、凋亡骨膜来源的干细胞、凋亡唾液腺来源的干细胞或其组合。在其他实例中，所述凋亡干细胞可包括来源于培养的间充质干细胞的凋亡小体、来源于未培养的牙龈来源的间充质干细胞的凋亡小体、凋亡牙髓干细胞、凋亡骨髓来源的干细胞或其组合。
干细胞的细胞凋亡可通过使用多种方法来实现。例如，凋亡干细胞可通过诱导干细胞的细胞凋亡来制备。干细胞细胞凋亡方法的实例可包括干细胞饥饿法、紫外线照射法、热应力法、星形孢菌素法以及其组合。
细胞凋亡可通过使用多种方法进行检测。所述检测方法的实例可以是通过使用光学显微镜的检测、通过使用流式细胞术的检测以及其组合。
凋亡小体可通过离心进行收集。
凋亡小体可通过荧光显微术技术、流式细胞术技术和/或离心技术来鉴定、定量和/或纯化。
本公开还涉及制备的方法(“制备方法”)。所述制备方法可例如包括获得(或收获)包含干细胞的组织，使用所述包含干细胞的组织制备凋亡小体，以及制备包含凋亡小体的组合物。在另一个实例中，所述制备方法可包括获得(或收获)包含干细胞的组织，将所述组织分离成细胞，从所述细胞中分选干细胞，使用所述分选的干细胞制备凋亡小体，以及制备包含所述凋亡小体的组合物。然而，在另一个实例中，所述制备方法可包括获得(或收获)包含干细胞的组织，将所述组织分离成细胞，从所述细胞中分选干细胞，扩增所述干细胞，使用所述扩增的干细胞制备凋亡小体，以及制备包含所述凋亡小体的组合物。所述制备方法还可包括在分选干细胞之前培养分离的细胞。所述制备方法还可包括分离干细胞。
本公开还涉及施用包含凋亡小体的组合物的方法(“施用方法”)。所述施用方法可包括适合于细胞或组织的施用的任何方法。可以各种方式施用(或递送)包含适合于治疗目的的凋亡小体的组合物。例如，它们可输注、在各个部位注射或手术植入。
合适的组合物包括，例如，在液体(优选水性)培养基中的凋亡小体(或细胞)悬浮液，以及有或无固体支撑物或封装材料的聚集形式的凋亡小体。所述液体培养基可以是药学上可接受的液体培养基。所述液体培养基可适合于注射。合适的液体培养基通常是熟知的，并且包括，例如，生理盐水(有或无葡萄糖和/或钾)、林格氏溶液、乳酸林格氏溶液和哈特曼氏溶液。
所述组合物可以有效治疗哺乳动物的量施用。所述组合物的凋亡小体量(或剂量)可以是有效治疗哺乳动物的量。可选择组合物中凋亡小体的量和/或浓度以提供一定量(的对所治疗的哺乳动物来说可接受的组合物)的方便施用。例如，含有高浓度的凋亡小体的液体组合物适合于将相对小体积注射到固体组织中，而含有较低浓度的凋亡小体的液体组合物可有利于通过静脉内输注施用。合适的液体组合物可含有，例如，约1×101个凋亡小体/mL至约1×1010个凋亡小体/mL、或约1×105个凋亡小体/mL至约1×107个凋亡小体/mL或约1×106个凋亡小体/mL至5×106个凋亡小体/mL。聚集组合物或固体组合物可含有，例如，约1×101个凋亡小体/mg至约1×1010个凋亡小体/g。
所述组合物还可包含载体。所述载体可适合于凋亡小体的宿主。所述载体的实例可呈基质、组织、纤维、珠粒或其他材料的形式。
出于治疗目的，可将有效量的组合物施用至有需要的哺乳动物。在施用条件下产生所需作用的量的“有效量”是例如，足以抑制炎症、抑制免疫应答或自身免疫应答、抑制骨丢失、抑制肿瘤生长或转移、促进伤口愈合、或促进BMMSC的集落形成、骨生成或脂肪形成的量。
通常，所述有效量可包括每次施用约1×101个凋亡小体至约1×1010个凋亡小体、或约1×105个凋亡小体至约1×107个凋亡小体、或约1×106个凋亡小体至5×106个凋亡小体。待施用的凋亡细胞的精确剂量可取决于多种因素，包括哺乳动物的年龄、体重和性别，所治疗的疾病及其程度和严重性。普通技术的临床医生可基于这些和其他考虑来确定适当的剂量和施用方法。
在本公开中，凋亡干细胞可通过由饥饿法、紫外线照射法、热应力法、星形孢菌素法或其组合诱导的干细胞的细胞凋亡来获得。这些方法可在无血清培养基中进行。
例如，为了通过饥饿法诱导细胞凋亡，可通过将干细胞在无血清培养基中孵育1小时至1,000小时范围内、或10小时至100小时范围内的时间段来获得凋亡干细胞。
例如，为了通过热应力法诱导细胞凋亡，可通过在预定温度下加热干细胞持续预定时间段来获得凋亡干细胞。例如，为了通过热应力法诱导细胞凋亡，可通过在30℃至100℃范围内、或40℃至70℃范围内的温度下加热干细胞持续1分钟至1,000分钟范围内、或10分钟至100分钟范围内的时间段来获得凋亡干细胞。热应力法可在无血清培养基中进行。
例如，为了通过星形孢菌素法诱导细胞凋亡，可通过用预定量的星形孢菌素处理干细胞持续预定时间段来获得凋亡干细胞。例如，可通过用1nm星形孢菌素至10,000nM星形孢菌素范围内的量、或1nm星形孢菌素至10,000nM星形孢菌素范围内的量的星形孢菌素处理干细胞持续1小时至1,000小时范围内、或5小时至100小时范围内的时间段来获得凋亡干细胞。星形孢菌素法可在无血清培养基中进行。
例如，为了通过紫外线(UV)法诱导细胞凋亡，可在预定波长下照射干细胞持续预定时间段。例如，可在100nm至400nm范围内的波长下照射干细胞0.1分钟至1,000分钟范围内、或1分钟至100分钟范围内的时间段。UV照射法可在无血清培养基中进行。
还可进行和遵循本文所述的产品(诸如包含凋亡小体的组合物)、包含含有凋亡干细胞的凋亡小体的组合物、其制备方法及其使用方法的任何组合。
本公开的其他实施例如下。
实施例1.诱导细胞凋亡的程序。
细胞凋亡可通过使用多种方法来实现。
例如，在饥饿法中，将基本上包含汇合MSC的细胞在无血清培养基中孵育约72小时以诱导细胞凋亡。在此方法中，所述细胞可包含接近100％汇合的MSC。
在UV照射法中，即另一种示例性方法中，可用UV灯处理培养的MSC持续5分钟至10分钟范围内的时间段以诱导细胞凋亡。UV灯可在约110V、约50Hz和约180W下操作。
在热应力法中，即另一种示例性方法中，可将培养的MSC在45℃至50℃范围内变化的温度下孵育40分钟至60分钟范围内的时间段以诱导细胞凋亡。
在星形孢菌素法中，即另一种示例性方法中，将基本上包含汇合MSC的细胞在无血清培养基中用约250nM星形孢菌素处理约15小时以诱导细胞凋亡。在此方法中，所述细胞可包含接近100％汇合的MSC。
上述方法可进行组合以诱导细胞凋亡。例如，饥饿法可与UV照射法和/或热应力组合以诱导细胞凋亡。
实施例2.细胞凋亡检测。
细胞凋亡可通过使用多种方法进行检测。例如，可通过使用光学显微镜来检测细胞收缩和固缩。此外，可使用流式细胞术分析检测膜联蛋白V和7-AAD双阳性凋亡细胞。
在一个实施例中，通过星形孢菌素诱导细胞凋亡。通过使用光学显微镜和流式细胞术分析来检测细胞凋亡。结果示于图1中。可在光学显微镜下观察到来自培养皿的未附着细胞和收缩。与对照组相比，星形孢菌素处理后，7AAD+或膜联蛋白V+或双阳性凋亡细胞群体从3.3％增加至96.8％。
实施例3.凋亡小体收集。
将来自诱导的凋亡细胞的培养基收集在无菌离心管中(在约50ml管中约15ml)。首先，通过在约800g下离心约10分钟除去死细胞和细胞碎片。然后，将上清液转移到约1.5mlEP管中。将上清液在约16,000g下进一步离心约30分钟以获得作为沉淀的凋亡小体。为了消除培养基中的试剂或血清作用，将沉淀重新悬浮并通过PBS洗涤，且在约16,000g下再离心约30分钟。此实施例示意性地示于图2中。
实施例4.凋亡小体鉴定。
在此实施例中，通过使用荧光显微术技术来鉴定凋亡小体。结果示于图3中。如制造商的说明书中所述，将凋亡小体的膜用PKH26标记并且将遗传物质用Hoechst 33342标记。凋亡小体的直径在0.5μm至10μm的范围内变化，平均大小为约3.014±1.1093μm。少于10％的凋亡小体含有遗传物质。凋亡小体的表面标记物膜联蛋白V、7-AAD和TSP可通过流式细胞术分析来鉴定。
实施例5.凋亡小体定量和纯化。
相对计数法用于凋亡小体定量。首先，将已知量的荧光染料标记的珠粒(“计数珠粒”)添加到凋亡小体悬浮液中。然后，通过使用流式细胞术分析来检测凋亡小体和计数珠粒的相对比率。此方法示意性地示于图4中。根据下式基于已知量的计数珠粒来计算凋亡小体的数目：
凋亡小体对细胞的收获率在5至10的范围内变化。
实施例6.通过流式细胞纯化进行的凋亡小体纯化。
在此实施例中，通过使用流式细胞分选技术进一步纯化凋亡小体。这些纯化的凋亡小体可用于制备本公开的组合物，其中所述凋亡小体可以是纯化的凋亡小体。
通过作为流式细胞分选的标记物的DRAQ5标记凋亡小体中的遗传物质。将凋亡小体分成两个群体。结果示于图5A-B中。DRAQ5阳性群体含有具有遗传物质的凋亡小体，而DRAQ5阴性群体含有无遗传物质的凋亡小体。可分选出3.8％具有遗传物质的凋亡小体，同时可在流式细胞分选期间收集43.13％无遗传物质的凋亡小体。
实施例7.通过差速离心进行的凋亡小体纯化。
在此实施例中，通过使用差速离心技术进一步纯化凋亡小体。所述凋亡小体的纯化方法示意性地示于图6中。这些纯化的凋亡小体可用于制备本公开的组合物，其中所述凋亡小体可以是纯化的凋亡小体。
基于不同的沉降速率，使用低离心力分离较大大小的凋亡小体。首先，用PBS重新悬浮沉淀的凋亡小体，并且然后在约4,000g下离心约5分钟。沉淀的凋亡小体的直径在4μm至10μm的范围内变化，并且超过80％的凋亡小体含有遗传物质。结果示于图6中。
实施例8.凋亡小体提高体内BMMSC集落形成数目。
C3H小鼠在第0天和第2天进行凋亡小体的全身输注。每次全身输注的剂量是5×106个凋亡小体细胞。在第7天从小鼠中收获BMMSC。如通过甲苯胺蓝染色所示，输注凋亡小体的小鼠比野生型(wt)小鼠产生更高数目的BMMSC CFU-F。凋亡小体处理组的CFU-F数目从42个集落/100万个细胞增加至57个集落/100万个细胞。参见图7A-B。这些实验结果证明凋亡小体可提高体内BMMSC集落形成数目。
实施例9.凋亡小体提高体外BMMSC集落形成数目。
在此实施例中，用凋亡小体处理BMMSC，并通过并入BrdU测定进行分析。据发现当与未处理的BMMSC相比时，BrdU阳性(BrdU+)细胞的数目在用凋亡小体处理的BMMSC中显著增加。参见图8A-B。这些实验结果证明凋亡小体可提高体外BMMSC集落形成数目。
实施例10.凋亡小体改善体外BMMSC的骨生成。
在此实施例中，在体外用凋亡小体处理BMMSC。在成骨诱导后6周，通过茜素红染色评估BMMSC的成骨分化潜力。就矿化结节而言，茜素红阳性(茜素红+)面积被计算为总面积的百分比。免疫印迹分析揭示OCN的表达水平具有相同的趋势。实验结果示于图9A-B中。
与未处理的BMMSC和用低剂量的凋亡小体处理的BMMSC相比，用高剂量的凋亡小体处理的BMMSC形成显著增加量的矿化结节。这些实验结果证明，BMMSC的成骨分化潜力可通过体外凋亡小体处理改善。这些实验结果还证明，这种改善潜力可通过增加凋亡小体的剂量而增加。
实施例11.凋亡小体改善体内BMMSC的骨生成。
在此实施例中，通过使用羟基磷灰石磷酸三钙(HA/TCP)作为载体将在体外用凋亡小体处理的BMMSC皮下移植到免疫受损的小鼠中。图10A-B中所示的实验结果表明，当与未处理的BMMSC相比时，用凋亡小体处理的BMMSC形成更多的矿化组织。这些实验结果证明，BMMSC的矿化组织形成潜力可通过用凋亡小体体内处理BMMSC而改善。
实施例12.凋亡小体改善体外BMMSC的脂肪形成。
在此实施例中，在体外用凋亡小体处理BMMSC。在脂肪形成诱导后4周，通过油红O染色评估BMMSC的脂肪形成潜力。油红O阳性(油红-O+)细胞的数目被计算为总细胞的百分比。图11A-B中所示的实验结果表明，用凋亡小体处理的BMMSC具有升高的分化成脂肪细胞的潜力。免疫印迹测定表明脂肪细胞特异性分子LPL和PPARγ2的表达水平具有相同的趋势。这些实验结果表明，BMMSC的脂肪形成潜力可通过用凋亡小体体外处理BMMSC而改善。
实施例13.凋亡小体改善体外BMMSC的免疫调节。
BMMSC可直接诱导活性T细胞凋亡作为免疫调节特性。BMMSC/T细胞共培养系统显示，当与未处理的BMMSC相比时，凋亡小体处理的BMMSC具有显著提高的诱导膜联蛋白V+7AAD+双阳性凋亡T细胞的能力。实验结果示于图12A-B中。
实施例14.凋亡小体对诱导性结肠炎小鼠具有治疗作用。
在此实施例中，用5×106个凋亡小体的剂量输注具有DSS诱导的实验性结肠炎的第一组小鼠(“AB输注”)。对于阳性对照，用5×105个BMMSC的剂量输注具有DSS诱导的实验性结肠炎的第二组小鼠(“MSC输注”)。具有DSS诱导的实验性结肠炎的第三组小鼠未经处理(“结肠炎”)。第一和第二小鼠组在诱导结肠炎后输注3天。从诱导结肠炎开始，在10天的时间段内记录三个小鼠组的重量损失。结果示于图13A-D中。
与结肠炎组相比，凋亡小体处理在结肠中发挥更显著的疾病表型、体重损失的恢复和组织学活性指数的降低。与结肠炎组相比，凋亡小体处理在结肠炎诱导后10天在小鼠中显示在降低Th17细胞水平方面的显著作用。这些实验结果证明，凋亡小体可用于治疗免疫障碍疾病如结肠炎。
实施例15.凋亡小体对切除卵巢的小鼠具有治疗作用。
在此实施例中，用5×106个凋亡小体的剂量输注第一组切除卵巢的小鼠(“OVX+AB”)。对于阳性对照，用5×105个BMMSC的剂量输注第二组切除卵巢的小鼠(“OVX+MSC”)。第三组切除卵巢的小鼠未经处理(“OVX”)。第四组未切除卵巢的小鼠也未经处理(“假”)。第一和第二小鼠组在诱导卵巢切除术后两周进行输注。结果示于图14A-I中。
苏木精和曙红(HE)染色显示BMMSC和凋亡小体处理均显著挽救了切除卵巢的小鼠的骨丢失。与未处理的切除卵巢的小鼠相比，凋亡小体处理显著提高股骨BV/TV中的骨矿物质密度(BMD)。此外，凋亡小体输注挽救了OVX来源的骨髓MSC的CFU-F数目、群体倍增、骨生成能力和脂肪形成能力。同时，凋亡小体输注降低了Th1和Th17t细胞的水平。
实施例16.凋亡小体对全身性红斑狼疮(SLE)小鼠具有治疗作用。
在此实施例中，MRL/lpr小鼠用作全身性红斑狼疮模型。用凋亡小体输注第一组MRL/lpr小鼠(“Lpr+AB”)。对于阳性对照，用BMMSC输注第二组MRL/lpr小鼠(“Lpr+MSC”)。第三组MRL/lpr小鼠未经处理(“lpr”)。第四组C3H小鼠也未经处理(“C3H”)。结果示于图15A-G中。
凋亡小体输注挽救了间充质干细胞(MSC)功能缺陷并且重建了MRL/lpr小鼠的小梁骨结构。与未处理的MRL/lpr小鼠相比，凋亡小体输注显著提高股骨BV/TV中的骨矿物质密度(BMD)。凋亡小体输注降低了自身抗体水平并且改善了MRL/lpr小鼠的肾功能。与未处理的组相比，外周血中C3、抗dsDNA的水平在凋亡小体输注组中降低，而白蛋白水平得到挽救。凋亡小体输注降低了Th17T细胞水平并且恢复了Treg/Th17比率。
实施例17.凋亡小体对肿瘤具有治疗作用。
在实体瘤和造血系统肿瘤中评价凋亡小体的治疗作用。对于此评价，建立了肝细胞癌和多发性骨髓瘤的小鼠肿瘤模型。
对于肝细胞癌的小鼠模型，通过肌内注射HepG2细胞来产生肝细胞癌的异种移植物。简言之，在重量匹配的约8周龄雌性NOD/SCID小鼠(Jackson Lab,Bar Harbor,ME,USA)中实施所述小鼠模型。将HepG2肝细胞癌细胞(ATCC,Manassas,VA,USA)在补充有约10％胎牛血清(Summit Biotechnology,Fort Collins,CO,USA)和抗生素(Invitrogen Co.,Carlsbad,CA,USA)的杜氏改良的伊格尔氏培养基(Invitrogen Co.,Carlsbad,CA,USA)中在约37℃、约5％CO2下培养。°将悬浮在PBS中的HepG2细胞(约1×106个细胞/10克体重)肌内注射到NOD/SCID小鼠的后腿中，并且PBS注射充当阴性对照。
为了测试凋亡小体对原位癌的作用，将二乙基亚硝胺作为致癌物注射到B6C3F1小鼠中以用于诱导原位肝细胞癌。简言之，使用约4周龄B6C3F1雄性小鼠来产生癌模型。向小鼠腹膜内施用单一剂量的二乙基亚硝胺(约100mg/克体重)。
对于多发性骨髓瘤模型，将从亲本鼠5T33(IgG2bκ)多发性骨髓瘤的非基质依赖性细胞系亚克隆的5TGM1MM细胞系在具有约10％胎牛血清和抗生素的伊斯科夫氏改良的杜氏培养基(Invitrogen Co.,Carlsbad,CA,USA)中的长期悬浮培养物中生长。在重量匹配的约10周龄雌性NOD/SCID小鼠中实施5TGM1多发性骨髓瘤模型。将小鼠圈养于隔离笼中，并且任意提供高压灭菌的食物和酸化水。通过尾静脉静脉内接种约200μl PBS中的5TGM1细胞(约6×106个/10克体重)来诱导弥散性多发性骨髓瘤。
如下在体内递送凋亡小体。将具有肝细胞癌和多发性骨髓瘤的异种移植肿瘤的小鼠随机分为处理组和对照组。在肿瘤细胞接种约1周后，经由尾静脉注射递送单一剂量的凋亡小体(约3×106个/10克体重)(治疗组)，并且PBS注射充当对照。
对于原位肝细胞癌的小鼠模型，经由尾静脉向小鼠每月施用凋亡小体(约3×106个/10克体重)。
如下评估凋亡小体的治疗作用。在肿瘤接种后约4周，手术收获肝细胞癌的异种移植肿瘤。通过下式测量肿瘤的体积来评估凋亡小体的治疗作用：体积＝长度×宽度2×0.52。为了揭示有或无凋亡小体处理的肿瘤的组织学，将组织在约4％多聚甲醛中固定约48小时，并且随后包埋于石蜡中用于苏木精(Hematoxyin)-曙红染色。
对于评估凋亡小体在多发性骨髓瘤模型中的治疗作用，对不同组中的小鼠的8周存活率进行了比较。通过卡普兰-迈耶存活法分析结果。
如下测定凋亡小体对肿瘤细胞的体内细胞毒性。将HepG2肝细胞癌细胞以约1×105个细胞/孔的浓度接种在24孔板中。在细胞接种后约12小时，通过凋亡小体(约1×106个凋亡小体/孔)或PBS处理细胞，并且在细胞培养物中施用不同浓度的凋亡小体以用于评价细胞毒性。在凋亡小体处理后约2天，通过自动细胞计数器(Bio-rad,Hercules,CA,USA)测定细胞存活，并且通过台盼蓝(Invitrogen Co.,Carlsbad,CA,USA)染色排除死细胞。
肿瘤的凋亡处理的结果如下。肌内接种HepG2细胞成功地在NOD/SCID小鼠中产生了肿瘤生长。为了测试在肿瘤模型中的治疗作用，将凋亡小体全身输注到具有异种移植肿瘤的小鼠中。肿瘤体积测量的结果显示，接受凋亡小体处理的小鼠中的肿瘤显著小于无所述处理的小鼠中的肿瘤(图16A)。通过进行性肿瘤细胞生长填充了由HepG2细胞产生的异种移植肿瘤，并且在凋亡小体处理后，肿瘤被具有大面积坏死的造血细胞浸润(图16B)。为了证实治疗作用，体外共培养测定表明了凋亡小体对HepG2细胞的明显细胞毒性，其呈剂量依赖性方式(图17A)。全基因表达模式的比较表明，在凋亡小体处理后，肿瘤细胞经历增强的细胞凋亡和溶酶体功能(图17B)。
在多发性骨髓瘤的小鼠模型中，接受全身凋亡小体输注的小鼠比对照小鼠存活显著更长，从而表明所述治疗有效地抑制疾病进展(图18)。
实施例18.凋亡小体肠内输注改善结肠炎。
如图19中所示，凋亡小体(AB)输注改善了DSS诱导的结肠炎。由于DSS输注可在小鼠中诱导结肠炎，所以在DSS诱导后约3天肠内输注约1×107个AB或骨髓间充质干细胞(MSC)，并且在DDS诱导后约10天收获样品以评价AB的治疗作用，并使用MSC肠内输注作为阳性对照(图19A)。在挽救体重方面凋亡小体处理显示出与MSC组相比的显著治疗作用(图19B)。凋亡小体处理还显示了结肠中组织学活性指数的降低(图19C)。与结肠炎组相比，AB处理在结肠炎诱导后约10天在小鼠中显示在降低Th1和Th17细胞水平方面的显著作用(图19D-E)。这些实验结果证明AB输注可用作治疗免疫病症(诸如结肠炎)的新方法。
实施例19.凋亡小体输注改善伤口愈合。
如图20A-C中所示，AB输注改善小鼠耳打孔模型中的伤口愈合。将约5×106个AB在耳打孔之前或之后输注到小鼠中(图20A)。在耳打孔后约7天，当与未处理的对照组相比时，AB处理组的耳孔面积显著减小(图20B-C)。
还可进行和遵循本文所述的产品(诸如包含凋亡小体的组合物)、其制备方法及其使用方法的任何组合。
已讨论的部件、步骤、特征、目的、益处和优点仅是说明性的。其中的任何一个或与其相关的讨论均不意图以任何方式限制保护范围。还预期许多其他实施方案。这些其他实施方案包括具有更少的、另外的和/或不同的部件、步骤、特征、目的、益处和优点的实施方案。这些其他实施方案还包括将部件和/或步骤不同地布置和/或排序的实施方案。
除非另外说明，否则在本说明书中(包括在以下权利要求书中)所阐述的所有测量值、值、等级、位置、量值、大小及其他规范均为近似的，而不是准确的。它们意图具有合理的范围，这个范围与它们相关的功能一致并且与它们所属领域中的习惯一致。
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Claims (51)

1.一种适合于治疗哺乳动物的组合物，所述组合物包含凋亡小体。
2.如权利要求1所述的组合物，其中所述凋亡小体包含凋亡干细胞。
3.如权利要求2所述的组合物，其中所述凋亡干细胞包括凋亡间充质干细胞、凋亡胚胎干细胞、凋亡胎儿干细胞、凋亡成体干细胞、凋亡羊膜干细胞、凋亡脐带血干细胞、凋亡诱导的多能干细胞或其组合。
4.如权利要求2所述的组合物，其中所述凋亡干细胞包括凋亡间充质干细胞。
5.如权利要求2所述的组合物，其中所述凋亡干细胞包括凋亡骨髓来源的间充质干细胞、凋亡牙髓干细胞、来自人脱落乳牙的凋亡干细胞、凋亡牙周韧带干细胞、凋亡牙囊干细胞、凋亡牙胚祖细胞、来自根尖牙乳头的凋亡干细胞、凋亡口腔上皮祖细胞/干细胞、凋亡牙龈来源的间充质干细胞、凋亡骨膜来源的干细胞、凋亡唾液腺来源的干细胞或其组合。
6.如权利要求2所述的组合物，其中所述凋亡干细胞包括来源于培养的间充质干细胞的凋亡小体、来源于未培养的牙龈来源的间充质干细胞的凋亡小体、凋亡牙髓干细胞、凋亡骨髓来源的干细胞或其组合。
7.如权利要求2所述的组合物，其中所述凋亡干细胞通过由饥饿法、紫外线照射法、热应力法、星形孢菌素法或其组合诱导的干细胞的细胞凋亡来获得。
8.如权利要求2所述的组合物，其中所述凋亡干细胞通过将干细胞在无血清培养基中孵育1小时至1,000小时范围内的时间段来获得。
9.如权利要求2所述的组合物，其中所述凋亡干细胞通过将干细胞在无血清培养基中孵育10小时至100小时范围内的时间段来获得。
10.如权利要求2所述的组合物，其中所述凋亡干细胞通过在30℃至100℃范围内的温度下加热干细胞持续预定时间段来获得。
11.如权利要求2所述的组合物，其中所述凋亡干细胞通过在30℃至100℃范围内的温度下加热干细胞1分钟至1,000分钟范围内的时间段来获得。
12.如权利要求2所述的组合物，其中所述凋亡干细胞通过在30℃至100℃范围内的温度下加热干细胞10分钟至100分钟范围内的时间段来获得。
13.如权利要求2所述的组合物，其中所述凋亡干细胞通过在40℃至70℃范围内的温度下加热干细胞持续预定时间来获得。
14.如权利要求2所述的组合物，其中所述凋亡干细胞通过在40℃至70℃范围内的温度下加热干细胞1分钟至1,000分钟范围内的时间段来获得。
15.如权利要求2所述的组合物，其中所述凋亡干细胞通过在40℃至70℃范围内的温度下加热干细胞10分钟至100分钟范围内的时间段来获得。
16.如权利要求2所述的组合物，其中所述凋亡干细胞通过用1nm星形孢菌素至10,000nM星形孢菌素范围内的量的星形孢菌素处理干细胞持续1小时至1,000小时范围内的时间段来获得。
17.如权利要求2所述的组合物，其中所述凋亡干细胞通过用1nm星形孢菌素至10,000nM星形孢菌素范围内的量的星形孢菌素处理干细胞持续5小时至100小时范围内的时间段来获得。
18.如权利要求2所述的组合物，其中所述凋亡干细胞通过用100nm星形孢菌素至1,000nM星形孢菌素范围内的量的星形孢菌素处理干细胞持续1小时至1,000小时范围内的时间段来获得。
19.如权利要求2所述的组合物，其中所述凋亡干细胞通过用100nm星形孢菌素至1,000nM星形孢菌素范围内的量的星形孢菌素处理干细胞持续5小时至100小时范围内的时间段来获得。
20.如权利要求2所述的组合物，其中所述凋亡干细胞通过用1nm星形孢菌素至10,000nM星形孢菌素范围内的量的星形孢菌素处理无血清培养基中的干细胞持续1小时至1,000小时范围内的时间段来获得。
21.如权利要求2所述的组合物，其中所述凋亡干细胞通过用1nm星形孢菌素至10,000nM星形孢菌素范围内的量的星形孢菌素处理无血清培养基中的干细胞持续5小时至100小时范围内的时间段来获得。
22.如权利要求2所述的组合物，其中所述凋亡干细胞通过用100nm星形孢菌素至1,000nM星形孢菌素范围内的量的星形孢菌素处理无血清培养基中的干细胞持续1小时至1,000小时范围内的时间段来获得。
23.如权利要求2所述的组合物，其中所述凋亡干细胞通过用100nm星形孢菌素至1,000nM星形孢菌素范围内的量的星形孢菌素处理无血清培养基中的干细胞持续5小时至100小时范围内的时间段来获得。
24.如权利要求2所述的组合物，其中所述凋亡干细胞通过在100nm至400nm范围内的波长下照射干细胞持续0.1分钟至1,000分钟范围内的时间段来获得。
25.如权利要求2所述的组合物，其中所述凋亡干细胞通过在对于UV灯100nm至400nm范围内的波长下照射干细胞持续1分钟至100分钟范围内的时间段来获得。
26.一种用于制备如权利要求2所述的组合物的方法，所述方法包括诱导干细胞的细胞凋亡且由此制备包含所述凋亡干细胞的凋亡小体。
27.如权利要求26所述的方法，其中所述干细胞包括胚胎干细胞、胎儿干细胞、成体干细胞、羊膜干细胞、脐带血干细胞、诱导的多能干细胞或其组合。
28.如权利要求26所述的方法，其中所述干细胞包括间充质干细胞。
29.如权利要求26所述的方法，其中所述干细胞包括骨髓来源的间充质细胞、牙髓干细胞、来自人脱落乳牙的干细胞、牙周韧带干细胞、牙囊干细胞、牙胚祖细胞、来自根尖牙乳头的干细胞、口腔上皮祖细胞/干细胞、牙龈来源的间充质干细胞、骨膜来源的干细胞、唾液腺来源的干细胞或其组合。
30.如权利要求26所述的方法，其中所述干细胞包括培养的间充质干细胞、未培养的牙龈来源的间充质干细胞、牙髓干细胞、骨髓来源的干细胞或其组合。
31.如权利要求26所述的方法，其中所述细胞凋亡通过饥饿法、紫外线照射法、热应力法、星形孢菌素法或其组合进行诱导。
32.如权利要求26-31中任一项所述的方法，其还包括通过离心收集所述凋亡小体。
33.如权利要求26-32中任一项所述的方法，其还包括通过荧光显微术技术、流式细胞术技术、离心技术或其组合来鉴定、定量和/或分离所述凋亡小体。
34.一种治疗人受试者的方法，其包括向所述人受试者施用有效量的组合物并且由此治疗所述人受试者，所述组合物包含含有人凋亡干细胞的凋亡小体。
35.如权利要求34所述的治疗方法，其中所述治疗包括治疗疾病，并且其中所述疾病是炎症、自身免疫性疾病、由卵巢切除术引起的骨丢失、肿瘤形成和/或伤口。
36.如权利要求35所述的治疗方法，其中所述炎症和/或自身免疫性疾病是移植物抗宿主病(GvHD)、糖尿病、类风湿性关节炎(RA)、自身免疫性脑脊髓炎、全身性红斑狼疮(SLE)、多发性硬化症(MS)、牙周炎、炎性肠病(IBD)、粘膜炎、结肠炎或败血症。
37.如权利要求35所述的治疗方法，其中所述炎症和/或自身免疫性疾病是结肠炎。
38.如权利要求35所述的治疗方法，其中所述炎症和/或自身免疫性疾病是全身性红斑狼疮。
39.如权利要求35所述的治疗方法，其中所述疾病是由卵巢切除术引起的骨丢失。
40.如权利要求34所述的治疗方法，其中所述疾病是肿瘤形成。
41.如权利要求40所述的治疗方法，其中所述肿瘤是肝细胞癌、多发性骨髓瘤或其组合。
42.如权利要求35所述的治疗方法，其中所述疾病是伤口。
43.如权利要求34-42中任一项所述的治疗方法，其中所述人凋亡干细胞包括人凋亡间充质干细胞、人凋亡胚胎干细胞、人凋亡胎儿干细胞、人凋亡成体干细胞、人凋亡羊膜干细胞、人凋亡脐带血干细胞、人凋亡诱导的多能干细胞或其组合。
44.如权利要求34-42中任一项所述的治疗方法，其中所述人凋亡干细胞包括人凋亡间充质干细胞。
45.如权利要求34-42中任一项所述的治疗方法，其中所述人凋亡干细胞包括人凋亡骨髓来源的间充质细胞、人凋亡牙髓干细胞、来自人的人脱落乳牙的凋亡干细胞、人凋亡牙周韧带干细胞、人凋亡牙囊干细胞、人凋亡牙胚祖细胞、来自人的根尖牙乳头的凋亡干细胞、人凋亡口腔上皮祖细胞/干细胞、人凋亡牙龈来源的间充质干细胞、人凋亡骨膜来源的干细胞、人凋亡唾液腺来源的干细胞或其组合。
46.如权利要求34-42中任一项所述的治疗方法，其中所述人凋亡干细胞包括来源于人的培养的间充质干细胞的凋亡小体、来源于人的未培养的牙龈来源的间充质干细胞的凋亡小体、人凋亡牙髓干细胞、人凋亡骨髓来源的干细胞或其组合。
47.一种包括使用有效量的组合物来改善以下各项的方法，所述组合物包含含有凋亡干细胞的凋亡小体：
骨髓间充质干细胞在体内或体外的集落形成；
骨髓间充质干细胞在体内或体外的免疫调节；
骨髓间充质干细胞在体内或体外的骨生成；
骨髓间充质干细胞在体内或体外的脂肪形成；或
其组合。
48.如权利要求47所述的方法，其中所述方法改善所述骨髓间充质干细胞在体内和/或体外的集落形成。
49.如权利要求47所述的方法，其中所述方法改善所述骨髓间充质干细胞在体内和/或体外的免疫调节。
50.如权利要求47所述的方法，其中所述方法改善所述骨髓间充质干细胞在体内和/或体外的骨生成。
51.如权利要求47所述的方法，其中所述方法改善所述骨髓间充质干细胞在体内和/或体外的脂肪形成。
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