CN110551685A - 细胞培养液及其应用 - Google Patents

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蒲锋星
程蕊苹
高迎凤
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Shaanxi Baiao Stem Cell Regenerative Medicine Co Ltd
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Abstract

本发明提供一种细胞培养液，所述细胞培养液包含凋亡小体，本发明提供的细胞培养液可以促进干细胞特别是间充质干细胞的增殖效率和间充质干细胞的大规模培养，保持大规模培养后的间充质干细胞形态正常且细胞具有均一性；并能保持大规模培养后的间充质干细胞的多潜能性，使间充质干细胞的大规模临床应用成为可能。

Description

细胞培养液及其应用
技术领域
本发明属于生物工程技术领域。尤其涉及一种适宜进行大规模细胞培养的细胞培养液及其应用。
背景技术
间充质干细胞（Mesenchymal Stem Cells， MSCs）是一类具有自我更新和多项分化潜能的多能干细胞，经诱导后可以分化为多种组织和细胞，由于其取材方便和不具有免疫排斥反应，是再生医学中一种较为理想的种子细胞。值得注意的是，大量传代培养或者高代次培养以后，有些细胞仍能保持其多潜能性，而有些细胞则开始衰老或其分化功能开始减弱，即生长速度逐渐变慢、细胞形态也由长梭形变的扁平粗大，进而失去临床上的使用价值，使用于细胞治疗的间充质干细胞不仅功能变差且数量明显减少。
专利CN201811341164.5公开了一种人脐带间充质干细胞大规模培养无血清培养基，所述培养基由以下浓度的组分组成的，各浓度单位若无特别说明，均为mg/L：L-精氨酸100～300；CuSO4·5H2O 0.0005～0.005；L-天门冬酰胺25～75；L-天门冬氨酸10～30；L-谷氨酸 10～30；Ni（NO3）2·6H2O 0.00002～0.0002；L-谷氨酰胺0～500；ZnSO4·7H2O 0.06～0.6；甘氨酸 5～15；CoCl2·6H2O 0.001～0.008；L-组氨酸10～30；NaSiO3·9H2O 0.001～0.01；L-异亮氨酸 25～75；Na3VO4·12H2O 0.0005～0.005；L-赖氨酸盐酸20～60；SnCl2·2H2O 0.00001～0.0001；L-蛋氨酸10～30；Na2SeO3 0.002～0.01；L-苯丙氨酸10～30；FeSO4·7H2O 0.2～1.6；L-脯氨酸10～30；葡萄糖 1000～4000；L-丝氨酸15～45；维生素C 0.176～0.704；L-苏氨酸10～30；对羟基苯甲酸0.5～1.5；L-色氨酸5～15；丙酮酸钠55～550；L-缬氨酸10～30；亚油酸 0.01～0.05；L-亮氨酸 25～75；β-巯基乙醇 0.8～4.0；二水L-酪氨酸二钠144～432；乙醇胺 1～5；L-胱氨酸二盐酸25～75；地塞米松 0.001～0.005；人转铁蛋白 5～50；人血清白蛋白 1000～5000；纤粘连蛋白 0.5～5；重组人成纤维细胞生长因子 0.1～10；重组人转化因子β 0.1～10；重组人表皮生长因子0.1～10；胰岛素：8～20；胆固醇：20～60；过氧化氢酶：20～50；亚硒酸钠：17.3～35.0；1％二巯基乙醇溶液：0.35～1.0ml/L；余量为水。上述无血清培养基存在的问题是在人脐带间充质干细胞大量传代培养以后，有些人脐带间充质干细胞仍能保持其多潜能性，而有些细胞则开始衰老，如生长速度逐渐变慢，细胞形态也由长梭形变的扁平粗大，进而失去临床上的使用价值。并且上述无血清培养基的成分复杂，不可控因素较多，如果大规模应用风险较大，成本较高。
发明内容
本发明的目的在于，针对现有技术存在的问题，提供一种细胞培养液及其在维持干细胞大规模培养中的应用。
本发明的目的是通过以下技术方案来实现的：
细胞培养液，所述细胞培养液包含凋亡小体。
优选地，所述凋亡小体为体外诱导干细胞凋亡产生的凋亡小体。
优选地，所述干细胞为第1-20代的间充质干细胞。
优选地，所述干细胞为脐带间充质干细胞、骨髓间充质干细胞、脂肪间充质干细胞、牙髓干细胞、牙周韧带干细胞、牙囊干细胞、牙胚祖细胞、来自根尖牙乳头的干细胞、口腔上皮祖细胞/干细胞、牙龈来源的间充质干细胞、骨膜来源的干细胞、凋亡唾液腺来源的干细胞或其任意组合。
优选地，所述细胞培养液中凋亡小体的添加量为2-400μg/L。例如，2μg/L、5μg/L、10μg/L、20μg/L、30μg/L、40μg/L、50μg/L、60μg/L、70μg/L、80μg/L、90μg/L、100μg/L、110μg/L、120μg/L、130μg/L、140μg/L、150μg/L、160μg/L、170μg/L、180μg/L、190μg/L、200μg/L、210μg/L、220μg/L、230μg/L、240μg/L、250μg/L、260μg/L、270μg/L、280μg/L、290μg/L、300μg/L、310μg/L、320μg/L、330μg/L、340μg/L、350μg/L、360μg/L、370μg/L、380μg/L、390μg/L或400μg/L。
优选地，所述细胞培养液还包括基础培养基，所述基础培养基为α-MEM培养基。
优选地，所述细胞培养液还包括添加物，所述添加物包括人血白蛋白、转铁蛋白、氢化可的松、亚硒酸钠、维生素C、亚油酸、胰岛素、孕酮、丙酮酸钠、乙醇胺、非必需氨基酸、必需氨基酸、碱性成纤维生长因子和转化生长因子。
优选地，所述人血白蛋白的添加量为100-1000ng/L，例如，100ng/L、200ng/L、300ng/L、350ng/L、400ng/L、450ng/L、500ng/L、600ng/L、650ng/L、700ng/L、750ng/L、800ng/L、850ng/L、900ng/L、950ng/L或1000ng/L。
优选地，所述转铁蛋白的添加量为0.1-10μmol/L，例如，0.1μmol/L、0.2μmol/L、0.3μmol/L、0.4μmol/L、0.5μmol/L、0.6μmol/L、0.7μmol/L、0.8μmol/L、0.9μmol/L、1.0μmol/L、1.2μmol/L、1.5μmol/L、1.8μmol/L、2.0μmol/L、2.5μmol/L、2.8mol/L、3.0mol/L、3.2mol/L、3.5mol/L、3.7mol/L、4.0mol/L、4.2mol/L、4.5mol/L、4.8mol/L、5.0mol/L、5.5mol/L、5.8mol/L、6.0mol/L、6.3mol/L、6.5mol/L、6.8mol/L、7.0mol/L、7.5mol/L、7.8mol/L、8.0mol/L、8.4mol/L、8.8mol/L、9.0mol/L、9.2mol/L、9.5mol/L、9.8mol/L或10mol/L。
优选地，所述氢化可的松的添加量为10-50μg/L，例如，10μg/L、12μg/L、15μg/L、18μg/L、20μg/L、22μg/L、25μg/L、28μg/L、30μg/L、32μg/L、35μg/L、38μg/L、40μg/L、45μg/L、48μg/L或50μg/L。
优选地，所述亚硒酸钠的添加量为10-35nmol/L，例如，10nmol/L、12nmol/L、15nmol/L、18nmol/L、20nmol/L、22nmol/L、25nmol/L、28nmol/L、30nmol/L、32nmol/L、35nmol/L。
优选地，所述维生素C的添加量为10-50mg/L，例如，10mg/L、12mg/L、15mg/L、18mg/L、20mg/L、22mg/L、25mg/L、28mg/L、30mg/L、32mg/L、35mg/L、38mg/L、40mg/L、45mg/L、48mg/L或50mg/L。
优选地，所述亚油酸的添加量为1-10mg/L，例如，1.0μmg/L、1.2μmg/L、1.5μmg/L、1.8μmg/L、2.0μmg/L、2.5μmg/L、2.8mg/L、3.0mg/L、3.2mg/L、3.5mg/L、3.7mg/L、4.0mg/L、4.2mg/L、4.5mg/L、4.8mg/L、5.0mg/L、5.5mg/L、5.8mg/L、6.0mg/L、6.3mg/L、6.5mg/L、6.8mg/L、7.0mg/L、7.5mg/L、7.8mg/L、8.0mg/L、8.4mg/L、8.8mg/L、9.0mg/L、9.2mg/L、9.5mg/L、9.8mg/L或10mg/L。
优选地，所述胰岛素的添加量为1-10μmol/L，例如，1.0μmol/L、1.2μmol/L、1.5μmol/L、1.8μmol/L、2.0μmol/L、2.5μmol/L、2.8μmol/L、3.0μmol/L、3.2μmol/L、3.5μmol/L、3.7μmol/L、4.0μmol/L、4.2μmol/L、4.5μmol/L、4.8μmol/L、5.0μmol/L、5.5μmol/L、5.8μmol/L、6.0μmol/L、6.3μmol/L、6.5μmol/L、6.8μmol/L、7.0μmol/L、7.5μmol/L、7.8μmol/L、8.0μmol/L、8.4μmol/L、8.8μmol/L、9.0μmol/L、9.2μmol/L、9.5μmol/L、9.8μmol/L或10μmol/L。
优选地，所述孕酮的添加量为1-25μg/L，例如，1μg/L、2μg/L、5μg/L、7μg/L、9μg/L、10μg/L、12μg/L、15μg/L、18μg/L、20μg/L、22μg/L或25μg/L。
优选地，所述丙酮酸钠的添加量为50-150mg/L，例如，50mg/L、60mg/L、65mg/L、70mg/L、80mg/L、85mg/L、90mg/L、95mg/L、100mg/L、105mg/L、110mg/L、115mg/L、120mg/L、125mg/L、130mg/L、135mg/L、140mg/L、145mg/L或150mg/L。
优选地，所述乙醇胺的添加量为10-35μmol/L，例如，10μmol/L、11μmol/L、12μmol/L、13μmol/L、14μmol/L、15μmol/L、16μmol/L、17μmol/L、18μmol/L、19μmol/L、20μmol/L、21μmol/L、22μmol/L、23μmol/L、24μmol/L、25μmol/L、26μmol/L、27μmol/L、28μmol/L、29μmol/L、30μmol/L、31μmol/L、32μmol/L、33μmol/L、34μmol/L或35μmol/L。
优选地，所述非必需氨基酸的添加量为10-30ml/L，例如，10ml/L、11ml/L、12ml/L、13ml/L、14ml/L、15ml/L、16ml/L、17ml/L、18ml/L、19ml/L、20ml/L、21ml/L、22ml/L、23ml/L、24ml/L、25ml/L、26ml/L、27ml/L、28ml/L、29ml/L、30ml/L、
优选地，所述必需氨基酸的添加量为10-30ml/L，例如，10ml/L、11ml/L、12ml/L、13ml/L、14ml/L、15ml/L、16ml/L、17ml/L、18ml/L、19ml/L、20ml/L、21ml/L、22ml/L、23ml/L、24ml/L、25ml/L、26ml/L、27ml/L、28ml/L、29ml/L、30ml/L、
优选地，所述碱性成纤维生长因子的添加量为1-10μg/L，例如，1μg/L、2μg/L、5μg/L、7μg/L、9μg/L或10μg/L。
优选地，所述转化生长因子的添加量为1-10μg/L，例如，1μg/L、2μg/L、5μg/L、7μg/L、9μg/L或10μg/L。
优选地，所述非必需氨基酸选自甘氨酸、丙氨酸、天冬氨酸、胱氨酸、谷氨酸、组氨酸、脯氨酸、丝氨酸、酪氨酸、半胱氨酸盐酸盐和天冬酰胺中的一种或多种；所述必需氨基酸选自赖氨酸、缬氨酸、异亮氨酸、亮氨酸、苯丙氨酸和苏氨酸。
另一方面，本发明提供上述的细胞培养液在维持干细胞大规模培养中的应用。
相对于现有技术，本发明的有益效果在于：
本发明提供的细胞培养液，添加了凋亡小体，可以促进干细胞特别是间充质干细胞的增殖效率。
进一步地，本发明提供的细胞培养液可用于维持干细胞特别是间充质干细胞的大规模培养，保持大规模培养后的间充质干细胞形态正常且细胞具有均一性。
进一步地，本发明提供的细胞培养液在大规模培养干细胞特别是间充质干细胞后，仍能保持其多潜能性，使间充质干细胞的大规模临床应用成为可能。
更进一步地，本发明提供的细胞培养液包含添加物，所述添加物包含人血白蛋白、转铁蛋白、氢化可的松、亚硒酸钠、维生素C、亚油酸、胰岛素、孕酮、丙酮酸钠、乙醇胺、非必需氨基酸、必需氨基酸、碱性成纤维生长因子和转化生长因子。通过以上组配的添加物，一方面维持干细胞大规模培养过程中的营养供给，另一方面，维持干细胞渗透压平衡，生长过程稳定，避免干细胞衰老退化。
附图说明
图1为扫描电镜下观察的间充质干细胞来源的凋亡小体的基本形态；
图2为本发明实施例中间充质干细胞的生长曲线对比图；
图3为本发明实施例中间充质干细胞倍增时间统计结果对比图；
图4A为本发明实施例中对照组1培养的间充质干细胞的细胞形态显微图；
图4B为本发明实施例中实验组1培养的间充质干细胞的细胞形态显微图；
图5A显示了本发明实施例中对照组2的间充质干细胞的成骨分化能力；
图5B显示了本发明实施例中实验组2的间充质干细胞的成骨分化能力；
图6A显示了本发明实施例中对照组3的间充质干细胞的克隆形成能力；
图6B显示了本发明实施例中实验组3的间充质干细胞的克隆形成能力；
图6C显示了本发明实施例中对照组3和实验组3的间充质干细胞克隆形成的统计结果；
图7A是间充质干细胞表面标志物CD90的检测结果示意图；
图7B是间充质干细胞表面标志物CD105的检测结果示意图；
图7C是间充质干细胞表面标志物CD73的检测结果示意图；
图7D是间充质干细胞表面标志物CD34的检测结果示意图；
图7E是间充质干细胞表面标志物CD19的检测结果示意图；
图7F是间充质干细胞表面标志物CD14的检测结果示意图；
图7G是间充质干细胞表面标志物CD45的检测结果示意图；
图7H是间充质干细胞表面标志物HLA-DR的检测结果示意图。
具体实施例
以下将结合附图对本发明的技术方案进行具体说明，以下说明仅为示例性的，不能认为是对本发明保护范围的限制。
实施例1
本实施例提供一种细胞培养液，所述细胞培养液包括凋亡小体，所述凋亡小体是通过体外诱导干细胞凋亡产生的，所述干细胞为脐带间充质干细胞。在一些实施例中，所述干细胞为骨髓间充质干细胞、脂肪间充质干细胞、牙髓干细胞、牙周韧带干细胞、牙囊干细胞、牙胚祖细胞、来自根尖牙乳头的干细胞、口腔上皮祖细胞/干细胞、牙龈来源的间充质干细胞、骨膜来源的干细胞、凋亡唾液腺来源的干细胞或其任意组合。
本实施例所述细胞培养液中凋亡小体的添加量为2μg/L。在一些实施例中，所述细胞培养液中凋亡小体的添加量为5μg/L、10μg/L、20μg/L、30μg/L、40μg/L、50μg/L、60μg/L、70μg/L、80μg/L、90μg/L、100μg/L、110μg/L、120μg/L、130μg/L、140μg/L、150μg/L、160μg/L、170μg/L、180μg/L、190μg/L、200μg/L、210μg/L、220μg/L、230μg/L、240μg/L、250μg/L、260μg/L、270μg/L、280μg/L、290μg/L、300μg/L、310μg/L、320μg/L、330μg/L、340μg/L、350μg/L、360μg/L、370μg/L、380μg/L、390μg/L或400μg/L。
本发明实施例所述细胞培养液还包括基础培养基，所述基础培养基为α-MEM培养基。
本发明实施例所述细胞培养液还包括添加物，所述添加物包括人血白蛋白、转铁蛋白、氢化可的松、亚硒酸钠、维生素C、亚油酸、胰岛素、孕酮、丙酮酸钠、乙醇胺、非必需氨基酸、必需氨基酸、碱性成纤维生长因子和转化生长因子。
在一些实施例中，所述人血白蛋白的添加量为100-1000ng/L，例如，100ng/L、200ng/L、300ng/L、350ng/L、400ng/L、450ng/L、500ng/L、600ng/L、650ng/L、700ng/L、750ng/L、800ng/L、850ng/L、900ng/L、950ng/L或1000ng/L。
在一些实施例中，所述转铁蛋白的添加量为0.1-10μmol/L，例如，0.1μmol/L、0.2μmol/L、0.3μmol/L、0.4μmol/L、0.5μmol/L、0.6μmol/L、0.7μmol/L、0.8μmol/L、0.9μmol/L、1.0μmol/L、1.2μmol/L、1.5μmol/L、1.8μmol/L、2.0μmol/L、2.5μmol/L、2.8mol/L、3.0mol/L、3.2mol/L、3.5mol/L、3.7mol/L、4.0mol/L、4.2mol/L、4.5mol/L、4.8mol/L、5.0mol/L、5.5mol/L、5.8mol/L、6.0mol/L、6.3mol/L、6.5mol/L、6.8mol/L、7.0mol/L、7.5mol/L、7.8mol/L、8.0mol/L、8.4mol/L、8.8mol/L、9.0mol/L、9.2mol/L、9.5mol/L、9.8mol/L或10mol/L。
在一些实施例中，所述氢化可的松的添加量为10-50μg/L，例如，10μg/L、12μg/L、15μg/L、18μg/L、20μg/L、22μg/L、25μg/L、28μg/L、30μg/L、32μg/L、35μg/L、38μg/L、40μg/L、45μg/L、48μg/L或50μg/L。
在一些实施例中，所述亚硒酸钠的添加量为10-35nmol/L，例如，10nmol/L、12nmol/L、15nmol/L、18nmol/L、20nmol/L、22nmol/L、25nmol/L、28nmol/L、30nmol/L、32nmol/L、35nmol/L。
在一些实施例中，所述维生素C的添加量为10-50mg/L，例如，10mg/L、12mg/L、15mg/L、18mg/L、20mg/L、22mg/L、25mg/L、28mg/L、30mg/L、32mg/L、35mg/L、38mg/L、40mg/L、45mg/L、48mg/L或50mg/L。
在一些实施例中，所述亚油酸的添加量为1-10mg/L，例如，1.0μmg/L、1.2μmg/L、1.5μmg/L、1.8μmg/L、2.0μmg/L、2.5μmg/L、2.8mg/L、3.0mg/L、3.2mg/L、3.5mg/L、3.7mg/L、4.0mg/L、4.2mg/L、4.5mg/L、4.8mg/L、5.0mg/L、5.5mg/L、5.8mg/L、6.0mg/L、6.3mg/L、6.5mg/L、6.8mg/L、7.0mg/L、7.5mg/L、7.8mg/L、8.0mg/L、8.4mg/L、8.8mg/L、9.0mg/L、9.2mg/L、9.5mg/L、9.8mg/L或10mg/L。
在一些实施例中，所述胰岛素的添加量为1-10μmol/L，例如，1.0μmol/L、1.2μmol/L、1.5μmol/L、1.8μmol/L、2.0μmol/L、2.5μmol/L、2.8μmol/L、3.0μmol/L、3.2μmol/L、3.5μmol/L、3.7μmol/L、4.0μmol/L、4.2μmol/L、4.5μmol/L、4.8μmol/L、5.0μmol/L、5.5μmol/L、5.8μmol/L、6.0μmol/L、6.3μmol/L、6.5μmol/L、6.8μmol/L、7.0μmol/L、7.5μmol/L、7.8μmol/L、8.0μmol/L、8.4μmol/L、8.8μmol/L、9.0μmol/L、9.2μmol/L、9.5μmol/L、9.8μmol/L或10μmol/L。
在一些实施例中，所述孕酮的添加量为1-25μg/L，例如，1μg/L、2μg/L、5μg/L、7μg/L、9μg/L、10μg/L、12μg/L、15μg/L、18μg/L、20μg/L、22μg/L或25μg/L。
在一些实施例中，所述丙酮酸钠的添加量为50-150mg/L，例如，50mg/L、60mg/L、65mg/L、70mg/L、80mg/L、85mg/L、90mg/L、95mg/L、100mg/L、105mg/L、110mg/L、115mg/L、120mg/L、125mg/L、130mg/L、135mg/L、140mg/L、145mg/L或150mg/L。
在一些实施例中，所述乙醇胺的添加量为10-35μmol/L，例如，10μmol/L、11μmol/L、12μmol/L、13μmol/L、14μmol/L、15μmol/L、16μmol/L、17μmol/L、18μmol/L、19μmol/L、20μmol/L、21μmol/L、22μmol/L、23μmol/L、24μmol/L、25μmol/L、26μmol/L、27μmol/L、28μmol/L、29μmol/L、30μmol/L、31μmol/L、32μmol/L、33μmol/L、34μmol/L或35μmol/L。
在一些实施例中，所述非必需氨基酸的添加量为10-30ml/L，例如，10ml/L、11ml/L、12ml/L、13ml/L、14ml/L、15ml/L、16ml/L、17ml/L、18ml/L、19ml/L、20ml/L、21ml/L、22ml/L、23ml/L、24ml/L、25ml/L、26ml/L、27ml/L、28ml/L、29ml/L、30ml/L、
在一些实施例中，所述必需氨基酸的添加量为10-30ml/L，例如，10ml/L、11ml/L、12ml/L、13ml/L、14ml/L、15ml/L、16ml/L、17ml/L、18ml/L、19ml/L、20ml/L、21ml/L、22ml/L、23ml/L、24ml/L、25ml/L、26ml/L、27ml/L、28ml/L、29ml/L、30ml/L、
在一些实施例中，所述碱性成纤维生长因子的添加量为1-10μg/L，例如，1μg/L、2μg/L、5μg/L、7μg/L、9μg/L或10μg/L。
本实施例所述非必需氨基酸选自甘氨酸、丙氨酸、天冬氨酸、胱氨酸、谷氨酸、组氨酸、脯氨酸、丝氨酸、酪氨酸、半胱氨酸盐酸盐、天冬酰胺中的一种或多种；所述必需氨基酸选自赖氨酸、缬氨酸、异亮氨酸、亮氨酸、苯丙氨酸和苏氨酸。
在一些实施例中，所述转化生长因子的添加量为1-10μg/L，例如，1μg/L、2μg/L、5μg/L、7μg/L、9μg/L或10μg/L。
本实施例中所述脐带间充质干细胞由以下方法制备而成：首先将获取的新鲜脐带中的多余的脐带保存液弃掉，倒入75%酒精消毒三分钟后取出脐带，放入含有双抗的生理盐水中反复清洗，去掉表面残留酒精。剪掉结扎部分并废弃，将剩余脐带均匀分成小段进行清洗，反复洗净残留血液，去除脐静脉和脐动脉，剥离Wharton胶，将其剪碎至1mm3大小的组织块。根据组织块的量加入适量无血清培养基混合均匀后平铺在15cm培养皿中，置于37℃ ，5% CO2且湿度饱和培养箱内培养24h，每培养皿补加8ml培养液。第5天时补液，第8天时半换液，待细胞融合度达到40%-60%以上后，弃掉上清，加生理盐水洗涤两遍后，用0.25%胰酶消化1.5min左右，加终止液吹打收集细胞，离心弃上清后加入新鲜培养基在10cm培养皿中进行传代培养，待细胞融合达80% 进行传代扩增。
本实施例中所述凋亡小体由以下方法制备而成：取培养至第3-5代的脐带间充质干细胞按2.5×105个每孔的密度接种至6孔细胞培养板，置于37℃、5% CO2条件下持续培养，待细胞融合度达到80%-85%时，加入星形孢菌素溶液诱导，其浓度范围为0.1μm-10μm。诱导后，收集上清。将来自诱导的凋亡细胞的培养基收集在无菌离心管中(在约50ml管中约15ml)。然后将上清液于4℃ 、400×g、离心10min，转移上清、除去细胞碎片；4℃ 、2000×g，离心10min，转移上清、除去死细胞；将上清液在约4℃ 、16 ,000g下进一步离心约30min以获得作为沉淀的凋亡小体。为了消除培养基中的试剂或血清作用，将凋亡小体沉淀重新悬浮并通过PBS洗涤2次，同样在约4℃ 、16000g下再离心约30min。最后，用PBS重新悬浮沉淀的凋亡小体，并且然后在约4 ,000g下离心约5分钟。沉淀的凋亡小体的直径在4μm至10μm的范围内变化，并且超过80％的凋亡小体含有遗传物质，凋亡小体沉淀再用200μL-400μL PBS重悬。分装于无菌离心管中，-80℃ 保存备用，同时进行凋亡小体基本形态的鉴定，结果见图1，图 1为扫描电镜下观察的脐带间充质干细胞来源的凋亡小体的基本形态。
实施例2
本实施例提供实施例1所述的细胞培养液在维持干细胞大规模培养中的应用，具体应用过程如下：
细胞接种：取第3-20代生长良好间充质干细胞、离心，收集细胞沉淀，加入本发明实施例1所述细胞培养液制成细胞悬液后计数，作为实验组1；取第3-20代生长良好间充质干细胞、离心，收集细胞沉淀，加入专利CN201811341164.5公开的培养基制成细胞悬液后计数，作为对照组1。根据细胞计数结果分别按5×103个/mL作传代培养接种于24孔板中，1 ml/孔。接种后放入5%CO2、37℃培养箱进行培养。细胞计数：细胞接种24h后，每天取三孔进行细胞计数，取平均值，连续计数7d。
结果统计：收集第1、2、3、4、5、6、7天的计数结果，使用Graphpad prism软件绘制细胞生长曲线；使用SPSS软件曲线拟合计算细胞的群体倍增时间。结果见图2-图3，图2为实验组1和对照组1间充质干细胞的生长曲线对比图 ；图3为实验组1和对照组1间充质干细胞倍增时间统计结果对比图，由图2-图3可知与对照组1相比，实验组1的生长速度更快，增殖效率更高；图4A为对照组1培养的间充质干细胞的显微镜下的细胞形态；图4B为实验组1培养的间充质干细胞的显微镜下的细胞形态，与对照组1相比，实验组1培养的间充质干细胞的细胞更圆润、形态、细胞均一性更好。
实施例3 使用本发明实施例提供的细胞培养液进行大规模培养后获得的干细胞成骨分化功能验证
取实施例2实验组1培养获得的脐带间充质干细胞，消化，离心收集沉淀，生理盐水清洗后制备细胞悬液，作为实验组2。取实施例2对照组1培养获得的脐带间充质干细胞，消化，离心收集沉淀，生理盐水清洗后制备细胞悬液，作为对照组2。分别计数后将细胞接种于六孔板中，每孔约2.5×105个细胞，待细胞长到75%~85% 时，将液体更换为成骨诱导液继续培养，其中，所述成骨诱导液的组分包括500份体积份数的无血清培养基、含有终浓度为0.1μM的地塞米松、10mM β-甘油磷酸钠、50mg/L的维生素C。每三天换液，诱导3~4周后，用于组织学检测。最后是组织学鉴定，采用吸管吸去诱导液，再PBS清洗两次；加入4％多聚甲醛，固定30min；弃去固定液，加入过滤后的茜素红染色液，染色60min；用PBS洗2-5次，去处残留的染色液和残渣，显微镜下观察结果并进行拍照。成骨判断标准：显微镜下有钙结节形成，茜素红染色钙结节被染成红色；而且随着细胞代数的增加，成骨分化能力逐渐减弱。结果见图5A和图5B，图5A显示了对照组2的间充质干细胞成骨分化能力；图5B显示了实验组2间充质干细胞的成骨分化能力，与对照组2结果相比，实验组2的间充质干细胞经普通成骨诱导液诱导分化后矿化结节显著增加，表明使用本发明实施例中的细胞培养液大规模培养后的间充质干细胞的成骨形成潜力保持良好。而使用对照组1中的培养基培养后的间充质干细胞的成骨形成潜力较弱。
实施例4：使用本发明实施例提供的细胞培养液进行大规模培养后获得的干细胞克隆形成率的验证
取实施例2实验组1培养获得的脐带间充质干细胞，消化，离心收集沉淀，生理盐水清洗后制备细胞悬液，作为实验组3。取实施例2对照组1培养获得的脐带间充质干细胞，消化，离心收集沉淀，生理盐水清洗后制备细胞悬液，作为对照组3。
取出待检细胞，显微镜下观察融合度达到70%~80%时用于细胞克隆检测；超净台内弃去培养上清，用生理盐水清洗后加入消化液，37℃培养箱中孵育1-2min；显微镜下观察细胞消化情况，待大多数细胞脱离培养瓶壁后，终止消化。采用移液管反复吹打后，收集细胞至离心管，在800rpm/min离心 5min后，收集细胞。加入培养基后重悬细胞，计数。
取另一个新的50mL离心管，然后从实验组3和对照组3的细胞悬液中取900个细胞加入50mL离心管中，吹打混匀；取三个6cm细胞培养皿，做好标记后，将15mL的间充质干细胞悬液按照5mL（300个）/皿进行接种，接种后放入5% CO2，37℃培养箱继续培养。细胞培养观察：继续培养接种细胞，培养至第10天时，使用结晶紫进行染色1h以上，染色结束后，弃掉染色液，用生理盐水润洗两次，显微镜下观察并拍照。
随后对实验结果进行计算。结果如图6A-6C所示：图6A显示了对照组3的间充质干细胞的显微镜下克隆形成能力；图6B显示了实验组3间充质干细胞的克隆形成能力；图6C显示了对照组3和实验组3的细胞克隆形成率的统计结果。结果显示：与对照3结果相比，实验组3的间充质干细胞克隆形成能力明显较强，反映其细胞群体依赖性和增殖能力较高。图6C中显示的细胞克隆形成率即细胞接种存活率，表示接种细胞后贴壁的细胞成活并形成克隆的数量。
实施例5 使用本发明实施例提供的细胞培养液进行大规模培养后获得的干细胞细胞表面标志的验证
首先是细胞接种：取生长良好、细胞密度达80%左右的细胞，对其进行消化制成细胞混悬液、800rpm离心5分钟；弃上清加适量生理盐水重悬，用70μm的滤膜过滤后混匀计数，取含4×106个细胞的细胞悬液800rpm离心5分钟，弃上清加入800μL含2% FBS的生理盐水重悬，分装每管100μL（即每个样品细胞数为5×105个），一组空白组，剩余每管加入5μL对应的抗体，4℃孵育1-2h。然后每管加入1mL含2% FBS的生理盐水重悬、800rpm离心5分钟、弃上清，再重复一次上述步骤后每管加入300μL含2% FBS的生理盐水重悬后上流式细胞仪进行流式检测，检测间充质干细胞阳性表面分子CD73、CD90和CD105，以及阴性表面分子CD14、CD19、CD34、CD45和HLA-DR。根据实验和临床研究的需求，对间充质干细胞进行表型鉴定，流式检测CD分子是鉴别人类间充质干细胞细胞的重要标记，从而分选出纯度更高的间充质干细胞群，如果细胞老化或者分化的话CD分子会降低，不符合标准。
正常间充质干细胞表面特异性表达抗原应符合以下标准：CD73、CD90和CD105阳性率不低于95%；CD14、CD19、CD34、CD45和HLA-DR阳性率不高于2%。检测结果如图7A至图7H所示，所测结果为第15代间充质干细胞的细胞表面标志。
图7A是间充质干细胞表面标志物CD90的检测结果，实验测得第15代间充质干细胞表面标志物CD90是97.11%，符合标准。
图7B是间充质干细胞表面标志物CD105的检测结果，实验测得第15代间充质干细胞表面标志物CD105是97.68%，符合标准。
图7C是间充质干细胞表面标志物CD73的检测结果，实验测得第15代间充质干细胞表面标志物CD73是96.29%，符合标准。
图7D是间充质干细胞表面标志物CD34的检测结果，实验测得第15代间充质干细胞表面标志物CD34是0.96%，符合标准。
图7E是间充质干细胞表面标志物CD19的检测结果，实验测得第15代间充质干细胞表面标志物CD19是0.40%，符合标准。
图7F是间充质干细胞表面标志物CD14的检测结果，实验测得第15代间充质干细胞表面标志物CD14是0.40%，符合标准。
图7G是间充质干细胞表面标志物CD45的检测结果，实验测得第15代间充质干细胞表面标志物CD45是0.96%，符合标准。
图7H是间充质干细胞表面标志物HLA-DR的检测结果，实验测得第15代间充质干细胞表面标志物HLA-DR是0.40%，符合标准。
综上所述，本发明实施例提供的细胞培养液可以促进干细胞特别是间充质干细胞的增殖效率和间充质干细胞的大规模培养，保持大规模培养后的间充质干细胞形态正常且细胞具有均一性；并能保持大规模培养后的间充质干细胞的多潜能性和细胞表面标志物，使间充质干细胞的大规模临床应用成为可能。
尽管以上结合附图对本发明的实施方案进行了描述，但是本发明并不局限于上述的具体实施方案和应用领域，上述的具体实施方案仅仅是示意性的、指导性的，而不是限制性的。本领域的普通技术人员在说明书的启示下，在不脱离本发明权利要求所保护的范围的情况下，还可以做出多种形式的变化，这些均属于本发明保护之列。

Claims (10)

1.细胞培养液，其特征在于，所述细胞培养液包含凋亡小体。
2.根据权利要求1所述的细胞培养液，其特征在于，所述凋亡小体为体外诱导干细胞凋亡产生的凋亡小体。
3.根据权利要求1所述的细胞培养液，其特征在于，所述干细胞为第1-20代的间充质干细胞。
4.根据权利要求2所述的细胞培养液，其特征在于，所述干细胞为脐带间充质干细胞、骨髓间充质干细胞、脂肪间充质干细胞、牙髓干细胞、牙周韧带干细胞、牙囊干细胞、牙胚祖细胞、来自根尖牙乳头的干细胞、口腔上皮祖细胞/干细胞、牙龈来源的间充质干细胞、骨膜来源的干细胞、凋亡唾液腺来源的干细胞或其任意组合。
5.根据权利要求1所述的细胞培养液，其特征在于，所述细胞培养液中凋亡小体的添加量为2-400μg/L。
6.根据权利要求1所述的细胞培养液，其特征在于，所述细胞培养液还包括基础培养基，所述基础培养基为α-MEM培养基。
7.根据权利要求1所述的细胞培养液，其特征在于，所述细胞培养液还包括添加物，所述添加物包括人血白蛋白、转铁蛋白、氢化可的松、亚硒酸钠、维生素C、亚油酸、胰岛素、孕酮、丙酮酸钠、乙醇胺、非必需氨基酸、必需氨基酸、碱性成纤维生长因子和转化生长因子。
8.根据权利要求7所述的细胞培养液，其特征在于，所述人血白蛋白的添加量为100-1000ng/L，所述转铁蛋白的添加量为0.1-10μmol/L，所述氢化可的松的添加量为10-50μg/L，所述亚硒酸钠的添加量为10-35nmol/L，所述维生素C的添加量为10-50mg/L，所述亚油酸的添加量为1-10mg/L，所述胰岛素的添加量为1-10μmol/L，所述孕酮的添加量为1-25μg/L，所述丙酮酸钠的添加量为50-150mg/L，所述乙醇胺的添加量为10-35μmol/L，所述非必需氨基酸的添加量为10-30ml/L，所述必需氨基酸的添加量为10-30ml/L，所述碱性成纤维生长因子的添加量为1-10μg/L，所述转化生长因子的添加量为1-10μg/L。
9.根据权利要求8所述的细胞培养液，其特征在于，所述非必需氨基酸选自甘氨酸、丙氨酸、天冬氨酸、胱氨酸、谷氨酸、组氨酸、脯氨酸、丝氨酸、酪氨酸、半胱氨酸盐酸盐和天冬酰胺中的一种或多种；所述必需氨基酸选自赖氨酸、缬氨酸、异亮氨酸、亮氨酸、苯丙氨酸和苏氨酸。
10.权利要求1-8任一项所述的细胞培养液在维持干细胞大规模培养中的应用。
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