ES2360434B1

ES2360434B1 - Celulas madre pluripotenciales obtenidas a partir de la pulpa dental.

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Publication number: ES2360434B1
Application number: ES200930488A
Authority: ES
Inventors: Maher Al-Atari Abou-Asi; Nuria Casals Farre; Lluis Jiner Tarrida; Eduardo Ferres Padro
Original assignee: UNI INTERNAC DE CATALUNYA; Universitat Internacional de Catalunya UIC Fundacio Privada
Current assignee: UNI INTERNAC DE CATALUNYA; Universitat Internacional de Catalunya UIC Fundacio Privada
Priority date: 2009-07-21
Filing date: 2009-07-21
Publication date: 2012-04-12
Anticipated expiration: 2029-07-21
Also published as: WO2011009878A1; ES2611922T3; PL2456863T3; EP2456863A1; US20150299661A1; DK2456863T3; US20120251504A1; ES2360434A1; US9017663B2; EP2456863B1

Abstract

Células madre pluripotenciales obtenidas a partir de la pulpa dental con capacidad de diferenciarse en tejidos de las tres capas embrionarias, endodermo, mesodermo y ectodermo.

Description

Células madre pluripotenciales obtenidas a partir de la pulpa dental.

La presente invención está relacionada con células madre pluripotenciales obtenidas de la pulpa dental de pacientes de diferentes edades y su aplicación en la regeneración de tejidos.

Estado de la técnica

En los seres vivos, los tejidos sufren, a lo largo de la vida un desgaste, pero tienen capacidad de autorenovarse. De no existir esta renovación, se reduciría considerablemente la esperanza de vida de los seres vivos. En concreto son las células madre las que tienen esta capacidad de autorenovación de los tejidos. La capacidad de autorenovación se plasma, en la capacidad de producir más células madre y, por otro lado, de generar células de uno o más tipos celulares diferenciados.

El descenso replicativo de células madre implica la degeneración y muerte de los distintos tejidos, ya sea de manera aguda (infartos) o crónica (degeneración-envejecimiento).

Por la capacidad de autorenovación citada, actualmente se aplica la terapia celular con células madre, entre otras en: patologías cardíacas, patologías de la córnea, patologías del suelo pélvico. También se tratan fístulas especialmente en enfermos de Crohn.

Las células madre se pueden clasificar según su potencial de diferenciación en: totipotenciales, pluripotenciales y multipotenciales.

Las células madre totipotentes pueden crecer y formar un organismo completo, tanto los componentes embrionarios (como por ejemplo, las tres capas embrionarias, el linaje germinal y los tejidos que darán lugar al saco vitelino), como los extraembrionarios (como la placenta). Es decir, pueden formar todos los tipos celulares.

Las células madre multipotentes son aquellas que sólo pueden generar células de su propia capa o linaje embrionario de origen (por ejemplo: una célula madre mesenquimal de médula ósea, al tener naturaleza mesodérmica, dará origen a células de esa capa como miocitos, adipocitos u osteocitos, entre otras).

Las células madre pluripotenciales no pueden formar un organismo completo, pero pueden diferenciarse en células provenientes de los tres linajes embrionarios: (a) ectodermo, que es el origen del sistema nervioso, el sistema respiratorio, tubo digestivo superior (estomodeo), la epidermis y sus anexos (pelo y uñas) y las glándulas mamarias; (b) endodermo, que es el origen del intestino, el hígado, el páncreas, los pulmones y la mayor parte de los órganos internos; (c) y mesodermo, que es el origen del sistema esquelético, los músculos, y los sistemas circulatorio y reproductor. Igualmente, pueden formar cualquier otro tipo de célula proveniente del germinal y el saco vitelino.

El hecho de que las células pluripotenciales tengan la capacidad de diferenciarse en un número tan elevado de tejidos, las hace de especial interés para el diseño de nuevas terapias, en general, y de terapias regenerativas, en particular.

Actualmente, las células madre pluripotenciales en individuos adultos se obtienen principalmente de médula ósea.

Es bien conocido en el estado de la técnica, que cuando se lleva a cabo el aislamiento y caracterización de las células madre pluripotenciales a partir de la muestra de médula ósea extraída, existen diferentes criterios bien establecidos en el estado de la técnica que permiten clasificar de manera clara a una célula madre como célula pluripotencial.

Un primer criterio sería determinar la capacidad de diferenciación de la célula aislada a tejidos que proceden de las tres capas embrionarias (endodermo, ectodermo y mesodermo) usando medios de diferenciación disponibles comercialmente, (cfr. Prelle et al., "Establishment of pluripotent cell lines from vertebrate species, present status and future prospects", Cell Tissues Organs, 1999, vol 165, pág. 220-236).

Un segundo criterio consistiría en identificar los marcadores que expresa la célula madre aislada.

Por ejemplo la expresión del gen OCT3/4 ha sido descrita como necesaria para que una célula madre sea pluripotencial (cfr. Niwa et al. "Quantitative expression of Oct-3/4 defines differentiation, dedifferentiation or self-renewal of ES cells", Nature, 2000 vol. 24, pág. 372-376). La expresión de SSEA4 en células pluripotenciales ha sido descrita en (cfr. Venable et al. "Lectin binding profiles of SSEA-4 enriched, pluripotent human embryonic stem cell surfaces" BMC Dev Biol. 2005, vol 21, pág. 5-15), y la expresión de CD13 igualmente en células pluriputentes se cita en (cfr. Young et al., "Human pluripotent and progenitor cells display cell surface cluster differentiation markers cd10, cd13, cd56, and mhc class-I", Proceedings of the Society for Experimental Biology and Medicine, 1999 vol. 221, nº 1, pp. 63-7).

Jiang y colaboradores (cfr. Jiang et al., "Pluripotency of mesenchymal stem cells derived from adult marrow", Nature, 2002, vol 418, pág. 41-47), han descrito la caracterización de células madre pluripotenciales en una población celular de la médula ósea. Esta población son las denominadas MAPC (Células progenitoras multipotenciales adultas). En este artículo se indica que las MAPCs expresan niveles altos de CD13, SSEA-4 y OCT3/4, marcadores propios de células pluripotenciales. Al igual que las células madre embrionarias, en las MAPCs se detecta la activación de los factores de transcripción OCT-4, NANOG y REX-1, factores que son necesarios para mantener la célula en un estado proliferativo e indiferenciado.

Adicionalmente, se incluyen ensayos de clonación que demuestran que es una única célula la que es capaz de diferenciarse a tejidos procedentes de cualquiera de las tres capas embrionarias (endodermo, mesodermo o ectodermo). A diferencia de las células de la invención, estas células no expresan el gen CD105 y sí expresan el gen CD44 y CD73. El origen de estas células es mesodérmico, mientras que el origen de las células de la invención es ectodérmico.

La fuente de células madre pluripotenciales que describe este artículo es la médula ósea. En las extracciones de células madre de médula ósea es necesario una anestesia general o local. El método que se emplea para obtenerlas es el aspirado del contenido medular mediante la punción de un hueso. El material que se obtiene pasa por una serie de procesos de cribado para separar las células. Todo esto hace que la obtención de estas células sea un proceso complejo y poco eficiente.

Por todo lo anterior existe la necesidad de encontrar fuentes alternativas a partir de las cuales se puedan extraer células madre pluripotenciales.

Explicación de la invención

Los investigadores de la presente invención han descubierto que la pulpa dental es una fuente de células madre pluripotenciales. Ventajosamente, las células de la invención están siempre presentes en los humanos, independientemente de la edad de los mismos, aunque la proporción disminuya. Tal y como se ilustra más abajo, las células madre obtenidas a partir de este tejido expresan preferiblemente los marcadores CD13, SSEA4 OCT3/4 y CD105, lo cual indica que dichas células son de tipo pluripotencial.

Además se ha comprobado que las células madre pluripotenciales aisladas a partir de pulpa dental tienen la capacidad de diferenciarse a tejidos procedentes de cada una de las tres capas embrionarias. Esto las hace de interés en el campo de la cirugía, y en particular en el campo de la reconstrucción de tejidos, tales como óseo, neuronal y hepático.

Así, la presente invención se refiere en un primer aspecto a una célula madre pluripotente caracterizada porque se obtiene a partir de la pulpa dental y expresa al menos los genes NANOG, SOX2, y expresa los marcadores SSEA4, OCT3/4 y CD105.

Entre las características ventajosas de las células de la invención es que la fuente de donde provienen, la pulpa dental, es de fácil extracción sin acarrear los problemas de extracción que presentan las células de la médula ósea.

La células de la invención tienen un tamaño pequeño entre 5 y 8 micras. Además no presentan anomalías de cromosomas o cambios estructurales durante el cultivo, elemento muy importante para su aplicación como terapia celular para la regeneración de tejidos.

Por otro lado, las células de la invención son células madre pluripotenciales adultas. Que sean adultas es de especial importancia ya que se evita el rechazo (cuando son transplantadas) al ser células que se extraen del mismo individuo que ha de recibir el tratamiento.

En una realización preferida del primer aspecto de la invención, las células madre pluripotenciales expresan, adicionalmente, CD13, CMyc y CD90, y no expresa los marcadores CD34, CD45, CD73 y CD44.

Los investigadores han realizado un depósito de las células de la invención en la institución DSMZ-Deutsche Sammlung von Mikroorganismen un Zellkulturen GmbH, con la identificación de referencia "Human dental pulp pluripotent stem cells (hDPPSC)" y con nº de acceso DSM ACC3002.

La posibilidad de extraer células madre pluripotenciales a partir de pulpa dental supone una alternativa a las fuentes de obtención conocidas hasta ahora de este tipo de células, con las siguientes ventajas: facilidad de extracción, no implica grandes riesgos frente a la intervención en médula ósea, ni costes elevados.

El diente está formado por dos componentes básicos: la corona y la raíz. Un diente maduro se compone de tejidos duros: esmalte, dentina y cemento, así como de un núcleo de tejido blando conocido como pulpa dental.

Los investigadores han utilizado preferentemente los terceros molares, a partir de los cuales han aislado las células que forman parte de la invención. Dado que el tercer molar es el último diente que se desarrolla en los humanos, está normalmente en una fase más temprana de desarrollo y es capaz de proporcionar una cantidad óptima de tejido de pulpa dental para el aislamiento de las células madre pluripotentes.

Noriaki y colaboradores (cfr. Noriaki et al. "Evaluation of Pluripotency in Human Dental Pulp Cells", J. Oral Maxillofac Surg, 2009, vol. 67, pág. 501-506), indican en este artículo que aislan células pluripotenciales de pulpa dental. Sin embargo, en dicha publicación los únicos ensayos incluidos demuestran la capacidad diferenciadora a tejidos cuyo origen es para todos, la misma capa embrionaria, el mesodermo. Como ya se ha indicado anteriormente, existen criterios bien establecidos que permiten clasificar a una célula como pluripotencial o multipotencial. El experto en la materia, a partir de los ensayos de diferenciación realizados por Noriaki et al., únicamente podría concluir que se trata de células multipotenciales, ya que comprueba la diferenciación a adipocito, condreocito y osteocito (tejidos que proceden de la misma capa embrionaria) y no aporta datos que indiquen que las células aisladas tengan la capacidad de diferenciarse a tejidos procedentes de las otras dos capas embrionarias (endodermo y ectodermo).

Por otro lado, no hay en el artículo de Noriaki y colaboradores ningún análisis de la presencia de marcadores que determinen la pluripotencialidad de la célula. Tampoco muestran otras características propias de las células pluripotenciales como su morfología, tamaño pequeño, alto potencial proliferativo, y alta clonogenicidad.

Por otro lado, el medio usado por Noriaki es un medio conocido en el estado de la técnica como específico de crecimiento de células multipotenciales (cfr. Gronthos et al "Postnatal human dental pulp stem cells in vitro and in vivo" PNAS, 2000, vol. 97, pág 13625-13630).

Los inventores de la presente invención han tenido que optimizar un medio de crecimiento adecuado para conseguir cultivar las células madre pluripotenciales presentes en la muestra de pulpa dental. Dicho medio se caracteriza por incluir los siguientes factores: LIF, EGF y PDGF. En el documento de Noriaki, se utiliza un medio de cultivo propio de las células multiponteciales. En el ejemplo 8 de la presente invención se muestra como no es posible el crecimiento de células pluripotenciales en un medio inadecuado, como es el medio de Noriaki para células pluripotenciales.

Por todo lo anterior, el documento de Noriaki describe el aislamiento de células madre multipotenciales.

En el documento (CFR. Kerkis et al, "Isolation and characterization of a population of immature dental pulp stem cells expressing OCT-4 and other embryonic stem cell markers", Cell Tissues Organs, 2006, vol 184, 105-116) se dice que se extrae células pluripotenciales de la pulpa dental. Sin embargo el origen de las células no es la pulpa dental, porque se indican que la obtención se realiza en pacientes de cinco a siete años. En estas edades se presenta gérmenes dentales, la pulpa dental y la bolsa germinal están unidas y la separación de la pulpa del germen es inviable. El origen de las células de Kerkis son el germen y no la pulpa. El origen de las células de la invención es la pulpa dental, y se pueden obtener de adultos de cualquier edad. La fuente de células de Kerkis sólo se puede obtener de cinco a siete años. Por otro lado, el medio que utilizan para cultivar las células es propio de células mesenquimales, y la técnica de sembraje no es la adecuada para el cultivo de células pluripotenciales.

Con un sembraje de 10.000 células por cm^{2} es imposible el cultivo de células pluripotenciales por la diferenciación a fibroblastos. En la figura 1a del documento de Kerkis muestran las células cultivadas y su morfología no es propia de células pluripotenciales, sino que es una morfología propia de células multipotenciales (cfr. Todorov et al. "Multipotent progenitor cells isolated from adult human pancreatic tissue" TRansplant Proc., 2005 37(8), pág. 3420-1)). El cariotipo que se muestra en la figura 1e del documento de Kerkis, se observa alterado a pesar de que se diga que es normal, porque el cromosoma 1 y 3, 4 no presentan el tamaño correcto. Esto implica que la aplicación a humanos podría generar tumores. Se observan cromosomas fragmentados.

En un segundo aspecto, la presente invención se refiere a un cultivo de células madre definidas en el primer aspecto de la invención, en un medio capaz de soportar la proliferación de dichas células, dicho medio incluyendo al menos un factor de transcripción.

En el estado de la técnica son bien conocidos medios que soporten la proliferación de células madre pluripotenciales, tales como el descrito en Smith y colaboradores (cfr. Smith et al "Inhibition of pluripotential embryonic stem cell diffentiation by purified polypeptides", Nature 1988, vol 336, pág. 688-690).

En una realización preferida del segundo aspecto de la invención, el medio de crecimiento comprende al menos los factores de crecimiento EGF y PDGF, y el factor de transcripción LIF.

En un tercer aspecto la presente invención se refiere a un método para obtener células definidas según el primer aspecto de la invención, que comprende los pasos de:

a) disgregación del tejido de la pulpa dental aislada;

b) separación de las células del tejido de la pulpa de la etapa b);

c) obtención de las células DPPSC mediante cultivo en un medio adecuado y concentración de sembraje entre 40-60 células/cm^{2}.

Una ventaja que presenta el medio de cultivo, rico en factores de crecimiento, y con la presencia de al menos un factor de transcripción, y el protocolo de aislamiento es que no produce alteraciones genéticas en las células, lo cual permite la aplicación de estas células en terapia celular para la regeneración de tejidos.

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La disgregación tisular consiste en romper la malla de proteínas que forman la matriz extracelular que mantiene a las células, que forman parte del tejido, unidas. De esta manera, como consecuencia de la disgregación tisular, se acaba obteniendo una suspensión de células. Para llevar a cabo la disgregación se utilizan procesos que separan las proteínas de la matriz extracelular (por ejemplo, secuestrando los iones calcio que permiten la unión), o bien rompiendo proteolíticamente dichas proteínas (mediante la acción de proteasas), consiguiendo así una suspensión de las células presentes en el tejido. Generalmente, los métodos empleados se pueden clasificar en tres categorías:

a): mecánicos (por ejemplo cortar, picar, cribar, rascar, etc.). En cultivos celulares se emplean con frecuencia los métodos de rascado ("scarpping") de la placa para arrancar las células adheridas.

b): químicos. Generalmente se trata de la adición de soluciones en las que no hay iones divalentes o bien de agentes quelantes de estos iones. En cualquier caso se reduce las concentraciones de los iones que estabilizan las uniones de las proteínas de la matriz extracelular y de éstas con los receptores celulares.

c): enzimáticos. Tratamiento del tejido o del cultivo celular con soluciones de proteasas activas (colagenasa, dispasa, tripsina, elastasa, papaína, pronasa, hialuronidasa, etc.).

En una realización preferida del tercer aspecto de la invención, la disgregación de tejido tiene lugar mediante digestión enzimática. Más preferiblemente, la disgregación del tejido tiene lugar mediante digestión con colagenasa tipo I.

Para llevar a cabo la separación de las células del tejido disgregado (etapa (b) del procedimiento de acuerdo con el tercer aspecto de la invención), se puede usar cualquiera de las técnicas estándar bien conocidas para el experto en la materia, tales como la floculación, la flotación, la filtración y la centrifugación, entre otros. En una realización preferida del segundo aspecto de la invención, la separación tiene lugar mediante centrifugación del tejido disgregado resultante de la etapa (a).

Forma parte del trabajo rutinario del experto en la materia la elección de un método u otro para llevar a cabo tanto la disgregación del tejido como la separación de las células.

Para llevar a cabo la obtención de células DPPSC en el medio de cultivo adecuado, el sembraje debe ser de una concentración baja, entre 40-60 células/cm^{2}. Se observó que con concentraciones mayores de sembraje las células se diferencian a fibroblastos, lo que se considera una contaminación. Tal y como se ha indicado anteriormente, el hecho de que las células aisladas de la pulpa dental sean pluripotenciales las hace de interés en la regeneración y/o transplante de tejidos.

Así, en un cuarto aspecto la presente invención se refiere a una composición terapéutica que comprende las células de la invención y un portador farmacéuticamente aceptable, dichas células estando presentes en una cantidad efectiva para producir células de tejidos.

En realizaciones preferidas del cuarto aspecto de la invención, las células producidas son de tejido óseo, neuronal y hepático.

Para producir células de tejido óseo, hepático y neuronal se pueden usar técnicas bien conocidas por el experto en la materia. Por ejemplo, si se desea la diferenciación a tejido óseo se se podría usar cualquiera de los medios de crecimiento celular que se describen en en Haynesworth y colaboradores (cfr. Haynesworth et al "Characterization of cells with osteogenic potential from human marrow", Bone, 1992, vol. 13, pág. 81-88). Para producir células de tejido hepático se podría usar el medio de crecimiento celular que se describe en Jiang y colaboradores (cfr. Jiang et al "Multipotent adult progenitor cells from human bone marrow differentiate into hepatocyte-like cells induced by co-culture with human hepatocyte line", Zhonghua Yi Xue Za Zhi, 2007, vol. 87, pág. 414-418). Para producir células de tejido neuronal se podría usar el medio de crecimiento celular descrito en Jiang y colaboradores (cfr. Jiang et al "Multipotent progenitor cells can be isolated from postnatal murine bone marrow, muscle and brain", Exp. Hematol., 2002, vol. 30, 896-904).

En un quinto aspecto la presente invención se refiere al uso de una célula pluripotencial definida en el primer aspecto de la invención, para la fabricación de un medicamento destinado a la regeneración, reparación de tejidos o transplante de tejidos en mamíferos.

En una realización preferida del quinto aspecto de la invención, la regeneración del tejido es neuronal, hepático u óseo.

Son numerosos los protocolos existentes en el estado de la técnica para llevar a cabo la regeneración de tejido en general, y de tejido óseo, hepático y neuronal, en particular, a partir de células madre pluripotenciales.

La expresión "uso de una célula pluripotencial" incluye el uso de una población de células madre, la cual se obtiene mediante el cultivo en medios celulares adecuados. El número de células aplicado dependerá del tamaño de la lesión del tejido. La aplicación se puede llevar a cabo habitualmente mediante cirugía, de manera que las células de la invención se pueden aplicar directamente.

A lo largo de la descripción y las reivindicaciones la palabra "comprende" y sus variantes no pretenden excluir otras características técnicas, aditivos, componentes o pasos. Para los expertos en la materia, otros objetos, ventajas y características de la invención se desprenderán en parte de la descripción y en parte de la práctica de la invención. Los siguientes ejemplos y dibujos se proporcionan a modo de ilustración, y no se pretende que sean limitativos de la presente invención.

Breve descripción de los dibujos

La Fig. 1 muestra en las Fig. 1A y Fig. 1B la morfología de las células pluripotentes de la pulpa dental (DPPSC) vistas a a través de un microscopio óptico con objetivos de 20 (Fig. 1A) y 40 (Fig. 1B) aumentos y células obtenidas cuando el cultivo era a alta densidad vistas con objetivos de 40 (Fig. 1C) y 100 (Fig. 1D).

La Fig. 2 muestra una imagen por microscopio convencional (20X) donde se observa la morfología de células seleccionadas o separadas en el ejemplo 3 de la invención después de cuatro días de cultivo.

La Fig. 3 muestra la expresión de los marcadores NANOG y SOX2 de las células DPSSC en los pases 5, 10 y 15 y la expresión de los marcadores en las células MSC de la pulpa.

La Fig. 4 muestra una imagen por microscopio convencional (40x) donde se observa la morfología de las células de la invención diferenciadas a osteoblastos en el día 4.

La Fig. 5 muestra la expresión de osteocalcina mediante Q-RT-PCR día 4 y día 10 respecto a los controles positivo y negativo. Los resultados se muestran en relación al control positivo (SAOS, células de osteoblastos), al que se le da un valor de 1000.

La Fig. 6 muestra una imagen por microscopio convencional (40x) donde se observa la morfología de las células de la invención diferenciadas a neuronas en el día 4.

La Fig. 7 muestra la expresión de nestina mediante Q-RT-PCR día 4 y día 10 respecto a los controles positivo y negativo. Los resultados se muestran en relación al control positivo (Schwann), al que se le da un valor de 1000.

La Fig. 8 muestra una imagen por microscopio convencional (40x) donde se observa la morfología de las células de la invención diferenciadas a hepatocitos en el día 4.

La Fig. 9 muestra la expresión de HNF3 (Factor nuclear de hepatocitos) mediante Q-RT-PCR día 4 y día 10 respecto a los controles positivo y negativo. Los resultados se muestran en relación al control positivo (Ntera), al que se le da un valor de 1000.

La Fig. 10 muestra el estudio citogenético de las células DPPSC de la pulpa dental en el pase 15.

La Fig. 11 muestra una imagen por microscopio convencional donde se observan los resultados del ejemplo 8. Fig 11A Medio 2. Fig 11B Medio3.

Exposición detallada de modos de realización Medios de cultivo utilizados en los diferentes ejemplos

Medio 1. DMEM (Dulbecco's Modified Eagle Médium) se utiliza para el mantenimiento y transporte de las muestras del quirófano al laboratorio.

Medio 2. Este medio se utiliza para el cultivo de las células de la invención DPPSC (células pluripotenciales de la pulpa dental). La composición del medio es 300 ml de DMEM, 200 ml de MCDB (105 Medio SIGMA), 5 ml de SITE (insulina, transferrina, selenito de sodio, etanolamina), 1 ml de LA-BSA (albúmina de suero bovino), 5 ml de Pen/Strep, 5 ml de ácido ascórbico, 10 ml de FBS (suero bovino fetal), 500 \mul de PDGF (factor de crecimiento derivado de las plaquetas), 500 \mul de EGF (factor de crecimiento epidérmico), 50 \mul de LIF (factor inhibidor de leucemia), 0,4 g de BSA (albúmina de suero bovino), 5 ml de Chemically defined Lipid concéntrate.

Medio 3 MSC (células madre mesenquimales). Medio de cultivo de las células de control. Se utiliza para el cultivo de MSC de la médula ósea y de MSC de la pulpa dental. La composición del medio es DMEM bajo en glucosa (DMEM-LG, Gibco Brl 11885-084), 1X Pen/Strep (Cellgro 30-002-CI), 1X (0.1 mM) L-Ácido ascórbico (Sigma A-8960), 2% FBS Hyclone.

Medio 4 Ntera. Se utiliza para el cultivo de la línea celular Ntera. La composición del medio es: DMEM alto en glucosa (DMEM-HG Gibco41966), 2% Suero de caballo (Gibco26050-070), 10% FBS (Biochrom S 0115), 10% Pen/Strep.

Medio 5 SAOS. Se utiliza para el cultivo de las células SAOS. La composición del medio es: DMEM-HG, (Gibco41966), 2% Suero de caballo (Gibco26050-070), 10% FCS (Biochrom S 0115), 10% Pen/Strep.

Medio 6 Schwann. Se utiliza para el cultivo de células Schwann. La composición del medio es: DMEM-LG, (Gibco 41966), 2% Suero de caballo (Gibco 26050-070), 10% FCS (Biochrom S 0115), 10% Pen/Strep.

Medio 7. Medio de diferenciación basal. La composición del medio es: 60% DMEM-LG (GIBCO/BRL), 40% MCDB-201 (Sigma) con 1X insulina-transferrina-selenio, 1X ácido linoleico BSA (albúmina modificada con linoleico), 10^{-9} M dexametasona (Sigma), y 10^{-4} M ácido ascórbico 2-fosfato (Sigma), 100 unidades de penicilina y 1.000 unidades de estreptomicina (GIBCO).

Medios 8 de diferenciación.

A: Medio de hepatocitos: Medio de diferenciación basal con 10 ng/ml FGF-4 (R&D Systems), 10 ng/ml HGF (factor de crecimiento de hepatocitos) (R&D Systems).

B: Medio de neuronas: los primeros 4 días se utilizó medio basal, 100 ng/ml factor de crecimiento de fibroblastos básico (bFGF). En el día 5 se cambio el medio por el medio basal, FGF8 (10 ng/ml), SHH (100 ng/ml). El octavo día: basal media, BDNF (Factor neurotropico derivado del cerebro) (10 ng/ml), GDNF (Factor neurotropico derivado de célula glial) (10 ng/ml) + N2 (R & D Systems).

C: Medio osteogénico: DMEM-LG (GIBCO/BRL), Glutamina (100X), Antibiótico (100X), FBS 10%, 0,01 \muM 1,25 dihidroxivitamina D3(1000X), 50 \muM ascorbato-2-fosfato (1000X), 10 \mu M B-Glicerolfosfato (32,67X).

Preparación de la muestra para los diferentes ensayos

Inmediatamente después de la extracción de los terceros molares se procedió a realizar el lavado de los mismos utilizando una gasa mojada con etanol al 70% y posteriormente con agua destilada estéril.

Se realizó un corte entre el esmalte y el cemento utilizando una fresa cilíndrica de turbina sujetando el diente con fórceps de incisivos superiores.

Se realizó una fractura en la misma línea del corte mediante dos fórceps de incisivos superiores y se colocaron los dos fragmentos del diente en un frasco de Falcon con el Medio 1.

Se trasladaron las muestras al laboratorio. Una vez en la campana de flujo, se virtió el contenido en una placa de Petri.

Se procedió a aislar los tejidos de la pulpa dental mediante una lima de tiranervios del 15 y una pinza de estériles.

Posteriormente, utilizando una jeringa de insulina, se realizó un lavado de los conductos con DMEM y se descartaron los fragmentos dentarios.

El siguiente paso fue realizar la disgregación celular mediante la digestión de colagenasa tipo I (3 mg/ml) del tejido de pulpa durante 40 minutos a 37ºC, posteriormente se centrifugó la muestra durante diez minutos a 1.800 rpm para separar las células del tejido disgregado.

Se realizó un lavado de las células con PBS (tampón fosfato salino) estéril y se centrifugó de nuevo durante 15 minutos a 1.800 rpm, y se determinó la viabilidad celular mediante la tinción con trypan blue. El porcentaje de la viabilidad celular era alrededor del 95%.

Se resuspendieron las células en el medio 2. Se incubaron las células obtenidas a 37ºC durante 2-3 días en frascos previamente tratados con fibronectina y se evaluó la aparición de clones o células pegadas al frasco del cultivo. Cuando se observaron suficientes células pegadas, se tripsinizaron y se expandieron manteniendo siempre una densidad baja.

Mantenimiento del cultivo celular

Las células fueron cultivadas en placas de seis pocillos tratadas con fibronectina humana al 10% en PBS (BD Bioscience) una hora antes de sembrar las células en la incubadora de CO_{2}. En el segundo día se añadieron 2 ml de medio de cultivo y en el cuarto día se aspiraron 2 ml y se añadieron 2 ml de medio nuevo. A partir de la semana se cambió el medio cada tres días.

Análisis por citometría de flujo (Fluorescent Activated Cell Sorting - FACS). Anticuerpos utilizados para los diferentes ensayos

Para los diferentes análisis mediante citometría de flujo (FACS) fue necesario añadir a las células anticuerpos portadores de fluorocromo (Ver tabla 1).

TABLA 1 Anticuerpos monoclonales utilizados en el análisis por FACS

1

: MS:MS, HUM (producido en ratón, reconoce ratón y humano)

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Como control de fluorescencia se utilizaron anticuerpos IgGI unidos a isotiocianato de fluoresceína (FITC), ficoeritrina (PE), PE-Cy5 (BD Pharmingen). La suspensión celular (células resuspendidas en PBS y 2% FBS) se dividió en fracciones de 1,5 millones de células y se incubaron con los respectivos anticuerpos durante 45 minutos a 4ºC y en la oscuridad. Posteriormente, las células se lavaron 2 veces con PBS y 2% FBS, y se centrifugaron 6 minutos a 1.800 rpm. Esto evitó que quedaran restos del fluorocromo, ya que darían un falso porcentaje de fluorescencia.

Dependiendo del número de células, estás se resuspendieron entre 300-600 \mul de PBS y 2% FBS.

Todas las medidas de citometría de flujo se realizaron en el citómetro FACScan y su análisis se llevó a cabo mediante el programa winMDI 2.8.

Ejemplo 1 Caracterización de los cultivos celulares de la pulpa dental. Morfología celular

Durante todo el proceso de cultivo, las células se controlaron y se observaron al microscopio para descartar la posible contaminación por levaduras, hongos o bacterias. Se intentó mantener una densidad baja teniendo en cuenta la proporción de células pequeñas (5-8 micras) respecto las grandes (10-25 micras), con el objeto de intentar aumentar el número de células pequeñas. Son estas células pequeñas las propias de la invención. En el análisis de la morfología de las células madre de la pulpa dental se realizó un seguimiento exhaustivo de los cultivos para que tuvieran capacidad adherente, hasta alcanzar la subconfluencia de estas células. En la Fig. 1 (A y B) se observa el aspecto de la morfología de las células pluripotentes de la pulpa dental (DPPSC) vistas a través de un microscopio óptico con objetivos de 20 y 40 aumentos, respectivamente. Es importante que la densidad de siembra sea baja preferentemente entre 40-60 células por cm^{2}. En la Figura 1 (B, C) se observa el aspecto de la morfología de las células cuando la densidad de siembra es alta 80-100 células por cm^{2}. A estas densidades de siembra las células pluripotenciales se diferencian y se observan un tipo diferente de célula, grande y con morfología fusiforme.

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Ejemplo 2 Análisis de fenotipo de células cultivadas en diferentes pases a partir de la pulpa dental. Análisis por citometría de flujo (FACS)

Este análisis se realizó al cabo de una, dos y tres semanas de cultivo. En este estudio se analizó el fenotipo de células de distintos clones obtenidos a partir de una muestra de pulpa dental de un donantes de 14, 17, 18, 28, 38 años de edad cultivadas a baja densidad, 80 a 100 células por cm^{2}, y expandirlas cuando el cultivo llegó a una confluencia de cultivo al 70%.

El análisis por FACS se realizó en cada semana de cultivo de las células de todos los clones (14, 17, 18, 28, 38 años) durante tres semanas de cultivo para ver el cambio de porcentaje de marcadores específicos de pluripotencialidad. Se utilizaron los anticuerpos CD13 FITC, SSEA4 PE, OCT3/4 FITC. Se analizaron más de 200.000 células por cada muestra para detectar uniones inespecíficas o autofluorescencia. No se detectaron uniones inespecíficas. También se observó una disminución de la presencia de marcadores específicos de DPPSC con el aumento de la edad, pero se veían aumentados durante el cultivo (Ver Tabla 2).

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TABLA 2 Análisis por FACS para determinar el fenotipo de las células cultivadas en diferentes pases a partir de pulpa dental

3

: PAC Y: paciente con edad Y.

Se observa un aumento del porcentaje de marcadores específicos de células DPPSC, cultivadas a baja densidad celular, respecto al tiempo de cultivo. También se observa una disminución de la presencia de marcadores específicos de DPPSC con el aumento de la edad aunque, como se ha indicado anteriormente, se vea aumentado el porcentaje de marcadores durante el tiempo de cultivo.

Se realizó también un análisis adicional por FACS utilizando la muestra del donante de 14 años en la tercera semana de cultivo. Además de los anticuerpos CD13, SSEA4, OCT3/4, se utilizaron los marcadores CD45, CD73, CD105, CD34. La tabla 3 muestra los resultados.

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TABLA 3 Fenotipo de las DPPSC de muestra paciente 14 años

4

Según se desprende de la tabla 3 las células DPPSC de la invención expresan los marcadores CD105, CD14, CD90, CD13, SSEA4, OCT3/4 y no expresan los marcadores CD45, CD73, CD44 y CD34, por ser la mayoría marcadores de células pluripotenciales, queda demostrado la pluripotencialidad de las mismas.

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Ejemplo 3 Análisis de fenotipo de células positivas al SSEA4 separadas por el citómetro de flujo (cell sorter)

Se extrajo una muestra de pulpa dental de un paciente de 18 años.

Seguidamente, se aislaron por FACS las poblaciones positivas al CD13 FITC (eBioscience) y SSEA4 PE (eBioscience), y se aisló también la población doble positivas al CD13 y SSEA4. Se recogieron las células en placas de cultivos de 24 pocillos. La separación por FACS se realizó en un Coulter, EPICS ELITE-ESP®.

Se realizó la separación, mediante citometría de flujo, de la población de células SSEA4 positivas (SSEA4+) contenidas en la muestra original de la pulpa dental obtenida el mismo día de la extracción. De estas células se estudió su fenotipo y se comparó con el de las células DPPSC cultivadas pero no seleccionadas por citometría de flujo.

La citada separación o el aislamiento se realizó en un citómetro de flujo con un dispositivo separador de células, EPICS ELITE-ESP®.

Se consiguieron separar 250 células positivas a SSEA4 (SSEA4+), se cultivaron estas células en una placa de 90 pocillos tratadas con fibronectina humana (BD Bioscience) una hora antes de sembrar las células en la incubadora a 37ºC y 5% de CO_{2}. En cada pocillo se sembraron 10 células con 150 ml de Medio 2.

Las células así separadas sobrevivieron al proceso y fueron proliferando hasta obtener los pocillos subconfluentes. También presentaban una morfología muy similar a las DPPSC de la pulpa dental no separadas por citometría (ver Fig. 2).

También se determinó el fenotipo de estas células mediante marcadores siendo similar a las células de la pulpa dental no separadas por citometría (ejemplo 2). Ver tabla 4.

TABLA 4 Análisis fenotipo por FACS de las células positivas a SSEA4 aisladas por el citómetro (cell sorter)

6

De esta tabla se desprende que el proceso de aislamiento celular mediante citómetro (cell-sorter) no mejora la pureza o homogeneidad de las DPPSC obtenidas mediante el cultivo in vitro durante distintos pases.

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Ejemplo 4 Análisis de la expresión de marcadores NANOG, SOX2, de pluripotencialidad en células DPPSC de la pulpa dental mediante Q-RT-PCR (Reacción en cadena de la polimerasa por transcripción reversa y cuantitativa)

Para determinar la expresión de genes mediante Q-RT-PCR se utilizó el sistema Syber-Green.

En este sistema la reacción se llevó a cabo en un volumen de 22 \mul totales: 20 \mul de mezcla (Syber-Green subermix) y 2 \mul de muestra de ADN complementario (cDNA Las muestras se sometieron a 40 ciclos tras un ciclo de desnaturalización de 2 min. A 50ºC. Se utilizaron en todos los casos un control positivo y negativo para cada muestra, así como un control de carga GAPDH (Gliceraldehído-fosfato-deshidrogenasa).

Mediante Q-RT-PCR se demostró la expresión NANOG, SOX-2, en las células DPPSC de la pulpa dental del clon del paciente con 14 años, y se realizó la comparación de expresión de estos genes en pase 5, 10, 15, utilizando la células NTERA como control positivo y MSC de la pulpa como control negativo.

Se observó que la expresión del NANOG y SOX-2 aumentaba entre los pases 5, 10 y el pase 15. Ver Fig. 3.

Anteriormente se realizó la eficiencia de amplificación de cada gen en las células NTERA en diferentes concentraciones (1, 0.1, 0.0 1, 0.001, 0.0001) del cDNA. Se observo que la amplificación del cDNA resulta lineal entre 19.98 a 28.46 ciclos para GAPDH, entre 24.15 a 30.73 ciclos para NANOG, y entre 25.30 a 31.27 ciclos para SOX-2. Las pendientes de amplificación de los genes fueron: GAPDH y = 3,0196x +14,412, R^{2} = 0,97. NANOG y=3,2878x+20,841, R^{2} = 0,9999. Sox2 y = 2,9832x + 22,563, R^{2} = 0,9802. Las secuencias de los cebadores y sondas utilizadas se describen a continuación:

Detección de GADPH por Syber-Green:

	Cebador directo (SEC ID NO 1):	TGGTATCGTGGAAGGACTCATGAC
	Cebador reverso (SEC ID NO 2):	ATGCCAGTGAGCTTCCCGTTCAGC

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Detección SOX-2 sistema Syber-Green:

	Cebador directo (SEC ID NO 3):	GGGAAATGGGAGGGGTGCAAAAGAGG
	Cebador reverso (SEC ID NO 4):	TTGCGTGAGTGTGGATGGGATTGGTG

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Detección NANOG sistema Syber-Green:

	Cebador directo (SEC ID NO 5):	AAAGAATCTTCACCTATGCC
	Cebador reverso (SEC ID NO 6):	GAAGGAAGAGGAGAGACAGT

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Ejemplo 5 Diferenciación de células de la pulpa dental

Con el objetivo de determinar la pluripotencialidad de las DPPSC de la pulpa dental analizamos el potencial de diferenciación in vitro hacia tejidos de cada una de las tres capas embrionarias, mesodermo, endodermo y ectodermo.

Diferenciación mesodérmica. Diferenciación a osteoblastos

Se sembraron las células a diferenciar en placas de 24 pocillos en el medio de cultivo a una densidad de 3 x 10^{3} células por cm^{2} en medio basal. Al día siguiente se cambió el medio de cultivo por medio de diferenciación DMEM-LG, 10% FBS, 10 mM \beta-glicerolfosfato (Sigma), 50 \muM de ácido L-ascórbico (Sigma), 0,01 \muM 1,25 dexametasona y 1% penicilina y streptomicina. Se cambió el medio cada 3 días durante 10 días. Mediante técnicas de Q-RT-PCR se demostró que estas células se habían diferenciado a tejido óseo, expresando genes específicos de este tejido, como osteocalcina. Para determinar la presencia de osteocalcina en Q-RT-PCR se utilizó como cebador directo la secuencia (SEC ID NO 7) GGTGCAGAGTCCAGCAAAGG y como cebador reverso la secuencia (SEC ID NO 8) AGCGCCTGGGTCTCTTCCTA.

Se utilizaron células de SAOS como control positivo y células DPPSC de pulpa dental indiferenciadas como control negativo y GAPDH como gen constitutivo (HK). Como se observa en la Fig. 5 la concentración de osteocalcina se ve aumentada en el día 4 respecto al día 0.

En la Fig. 4 se observa también la diferenciación a osteoblastos por microscopio convencional, mostrando las células la morfología propia de dicho tipo celular.

Diferenciación ectodérmica. Diferenciación a neuronas

Se sembraron las células a diferenciar en placas de 24 pocillos en el medio de cultivo a una densidad de 25-30 células por cm^{2} en medio basal. Al día siguiente se cambió el medio de cultivo por medio de diferenciación; en los primeros 4 días medio basal 100 ng/ml (bFGF); el octavo día, medio basal m, FGF8 (10 ng/ml), SHH (100 ng/ml), BDNF (10 ng/ml), GDNF (10 ng/ml) + N2 (R&D Systems). Se cambió el medio cada 3 días durante 10 días. En la Q-RT-PCR se utilizaron células de Schwann como control positivo y GAPDH como control de carga (HK). Como se observa en la Fig. 7 la concentración de NESTINA aumentó en el día 4 respecto al día 0.

Para determinar la NESTINA en Q-RT-PCR se utilizó como cebador directo la secuencia (SEC ID NO 9) CAGGA
GAAACAGGGCCTACA y como cebador reverso la secuencia (SEC ID NO 10) TGGGAGCAAAGATCCAAGAC.

En la Fig. 6, se observa también la diferenciación a neuronas por microscopio convencional, mostrando las células la morfología propia de las neuronas.

Diferenciación endodérmica. Diferenciación a hepatocitos

Se sembraron las células a diferenciar en placas de 24 pocillos en el medio de cultivo a una densidad de 25 \times 10^{3} células por cm^{2} en medio basal. Al día siguiente se cambió el medio de cultivo por medio de diferenciación: medio basal sin FBS, 10 ng/ml HGF, 10 ng/ml FGF-4 (R&D Systems). Se cambió el medio cada 3 días durante 10 días. Mediante técnicas de Q-RT-PCR se determinó que estas células se habían diferenciado a tejido hepático, expresando genes específicos de este tejido como HNF3 (Factor nuclear de hepatocitos). Se utilizaron células Ntera como control positivo y GAPDH como control de carga (HK). Como se observa en la Fig. 9 la concentración de HNF3 se ve aumentada en el día 4 respecto al día 0.

Para determinar la presencia de HNF3 en Q-RT-PCR se utilizó como cebador directo la secuencia (SEC ID NO 11) CAGGAGAAACAGGGCCTACA y como cebador reverso la secuencia (SEC ID NO 12) TGGGAGCAAAGATC
CAAGAC.

En la Fig. 8 se observa también la diferenciación a hepatocitos por microscopio convencional, mostrando las células la morfología propia de este tipo de células.

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Ejemplo 6 Estudio citogenético y de microscopía electrónica de las DPPSC

Se realizó un estudio cada semana de citogenética y microscopía electrónica de barrido (SEM) para ver si había anomalías de cromosomas o cambios de estructuras celulares de cultivo. Esto se realizó con el objetivo de aplicar estas células a nivel clínico en el futuro como terapia celular para la regeneración de tejidos.

En la Fig. 10 se muestra el citado estudio citogenético y SEM y puede apreciarse que no se observan ni anomalías ni fragmentación de cromosomas o de estructuras celulares. Para este estudio se analizaron 200 metafases y se observó más del 85% de las células sin anomalías o fragmentaciones. En 15% de las metafases restantes, se observaron roturas cromosómicas, las cuales son habituales como consecuencia de la técnica utilizada.

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Ejemplo 7 Comparación del fenotipo por la expresión de diferentes marcadores de diferentes tipos de células

Se comparó la expresión o no de los genes mostrados el la tabla 5, mediante FACS de las células de las invención DPPSC, MAPSC (células madre adultas multipotentes progenitoras), MSC (Células madre mesenquimales), IPS (induced pluripotent stem) y Ntera.

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TABLA 5 Muestra la expresión (+) o no (-) de los distintos marcadores en los diferentes tipos de células estudiadas. La "?" muestra marcadores no ensayados

7

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Ejemplo 8 Ensayo comparativo de medios de cultivo

Se realizó una comparativa entre el Medio 2, el Medio para DPPSC, el Medio 3, y el Medio MSC con la finalidad de determinar cuál de ellos permitía obtener las células madre pluripotenciales de la presente invención. Para ello, se utilizó una muestra de la pulpa dental del mismo paciente. En el mismo día la muestra fue repartida en dos partes; una parte en medio de MSC y la otra parte en medio de DPPSC. Se mantuvo con la misma concentración de sembraje durante 3 semanas y se observó la gran diferencia de morfología y de fenotipo. Esto demuestra que las células DPPSC solo pueden vivir en su medio escrito. La Fig. 11 muestra las células que se cultivaron en el medio 2 a la izquierda (Fig. 11A) y las células que se cultivaron en el medio 3 a la derecha (Fig. 11B).

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<110> UIC Universidad Internacional de Cataluña

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<120> Células madre pluripotenciales obtenidas a partir de la pulpa dental

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<130> P1454ES00

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<160> 12

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<170> PatentIn version 3.5

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<210> 1

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<211> 24

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<212> DNA

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<213> artificial

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<220>

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<223> Cebador directo detección gliceraldehido 3-fosfato dehidrogenasa (GADPH)

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<400> 1

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\hskip1cm

9

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<210> 2

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<211> 24

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<212> DNA

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<213> artificial

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<220>

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<223> Cebador reverso detección gliceraldehido 3-fosfato dehidrogenasa (GADPH)

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<400> 2

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\hskip1cm

10

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\vskip0.400000\baselineskip

<210> 3

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<211> 26

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<212> DNA

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<213> artificial

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<220>

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<223> Cebador directo detección gen SOX2 humano

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<400> 3

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\hskip1cm

11

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<210> 4

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<211> 26

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<212> DNA

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<213> artificial

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<220>

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<223> Cebador reverso detección gen SOX2 humano

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\vskip0.400000\baselineskip

<400> 4

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\hskip1cm

12

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\vskip0.400000\baselineskip

<210> 5

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<211> 20

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<212> DNA

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<213> artificial

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\vskip0.400000\baselineskip

<220>

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<223> Cebador directo detección gen NANOG humano

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\vskip0.400000\baselineskip

<400> 5

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\hskip1cm

13

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\vskip0.400000\baselineskip

<210> 6

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<211> 20

\vskip0.400000\baselineskip

<212> DNA

\vskip0.400000\baselineskip

<213> artificial

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\vskip0.400000\baselineskip

<220>

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<223> Cebador inverso detección gen NANOG humano

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<400> 6

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\hskip1cm

14

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<210> 7

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<211> 20

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<212> DNA

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<213> artificial

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<220>

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<223> Cebador directo detección del gen osteocalcina

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\vskip0.400000\baselineskip

<400> 7

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\hskip1cm

15

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<210> 8

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<211> 20

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<212> DNA

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<213> artificial

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<220>

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<223> Cebador inverso detección gen osteocalcina

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<400> 8

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\hskip1cm

16

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\vskip0.400000\baselineskip

<210> 9

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<211> 20

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<212> DNA

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<213> artificial

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<220>

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<223> Cebador directo detección del gen nestina

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<400> 9

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\hskip1cm

17

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<210> 10

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<211> 20

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<212> DNA

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<213> artificial

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<220>

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<223> Cebador inverso detección del gen nestina

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<400> 10

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\hskip1cm

18

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<210> 11

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<211> 20

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<212> DNA

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<213> artificial

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\vskip0.400000\baselineskip

<220>

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<223> Cebador directo gen (HNF3) Factor nuclear de hepatocito

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<400> 11

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\hskip1cm

19

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<210> 12

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<211> 20

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<212> DNA

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<213> artificial

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<220>

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<223> Cebador inverso gen (HNF3) Factor nuclear de hepatocito

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<400> 12

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\hskip1cm

20

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Claims

1. Célula madre pluripotente que tiene la identificación de referencia "Human dental pulp pluripotent stem cells (hDPPSC)" en la institución DSMZ-Deutsche Sammlung von Mikroorganismen un Zellkulturen GmbH con nº de acceso DSM ACC3002.

2. Cultivo de una célula madre según la reivindicación 1 en un medio capaz de soportar la proliferación de dichas células, dicho medio incluyendo al menos un factor de transcripción.

3. Cultivo según reivindicación 2 caracterizado porque el medio comprende al menos los factores de crecimiento EGF y PDGF, y al menos el factor de transcripción LIF.

4. Método para obtener células madre pluripotenciales de acuerdo con cualquiera la reivindicación 1, que comprende los pasos de: (a) disgregación del tejido de la pulpa dental aislada de un ser mamífero; y (b) separación de las células madre del tejido disgregado resultante de la etapa (a) c) cultivo de las células en un medio que presente al menos un factor de transcripción.

5. Composición terapéutica que comprende una célula madre pluripotente según se definen en la reivindicación 1 y un portador farmacéuticamente aceptable, dicha célula estando presente en una cantidad efectiva para producir células de tejidos.

6. Composición terapéutica según reivindicación 5 para producir células del tejido óseo.

7. Composición terapéutica según reivindicación 5 para producir células del tejido neuronal.

8. Composición terapéutica según reivindicación 5 para producir células del tejido hepático.

9. Uso de una célula pluripotencial según se define en la reivindicación 1, para la fabricación de un medicamento destinado a la regeneración, reparación de tejidos o transplante de tejidos en mamíferos.

10. Uso según reivindicación 9, para la regeneración de tejido óseo.

11. Uso según reivindicación 9, para la regeneración de tejido neuronal.

12. Uso según la reivindicación 9, para la regeneración de tejido hepático.