CN114958736A - 乳牙牙髓干细胞凋亡囊泡的制备方法和应用 - Google Patents

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Abstract

本发明提供了一种乳牙牙髓干细胞(hDPSC)凋亡囊泡制备方法和其在牙髓再生中的应用主要成分为：乳牙牙髓、α‑MEM培养基、星胞菌素(Staurosporine)、Pluronic F‑127凝胶。该具有诱导牙髓再生功能的凋亡囊泡制备方法包括：分离培养hDPSCs，诱导凋亡，提取凋亡囊泡并利用制备为具有缓释功能凝胶。本发明提取乳牙牙髓干细胞凋亡囊泡(hDPSC‑ApoVs)并制备为缓释凝胶，目前已利用hDPSC‑ApoVs凝胶成功在临床前动物模型中再生出了具有良好生物学结构的牙髓样组织。本发明原创性地建立了hDPSC‑ApoVs凝胶的制备方法，为临床牙髓坏死提供了无细胞治疗的新策略，拥有有良好的应用前景。

Description

乳牙牙髓干细胞凋亡囊泡的制备方法和应用
技术领域
本发明属于医用治疗技术领域，具体涉及乳牙牙髓干细胞凋亡囊泡的制备方法和应用。
背景技术
牙髓炎症与坏死是口腔临床常见疾病，目前临床上的常规治疗方式为根管治疗(Root canal therapy，RCT)，即去除炎症或坏死牙髓组织并用无机材料进行根管充填；然而经此方法治疗后的牙齿会因失去牙髓活力而变得脆弱易折，同时失去了感知外界环境刺激的生理功能，因此牙髓再生一直是口腔医学领域的攻关热点。
随着对间充质干细胞(Mesenchymal stem cells，MSC)细胞生物学功能研究的不断加深，学者们对于MSC移植作用机制的推断经历了由细胞替代(Cell replacement)到细胞赋能(Cell empowerment)的范式转变(Paradigm shifts)。细胞赋能是干细胞的一种重要生理功能，通过旁分泌信号因子调控周围组织细胞功能，进而影响组织损伤修复及再生过程。细胞外囊泡(Extracellularvesicle，EVs)作为细胞赋能作用的重要信使，按照生物起源以及产生方式，可以将其分为三大类：外泌体(Exosome)，微囊泡(Microvesicle，MVs)和凋亡囊泡(Apoptotic vesicles，ApoVs)。以往研究认为凋亡囊泡是细胞代谢废物的一种方式，国内外最新研究表明ApoVs能够通过转运生物活性分子促进血管分化，参与组织修复与重建。EVs治疗可以被称为“无细胞的细胞疗法”，间充质干细胞来源的ApoVs具有容易制备并且产业化生产的优势；此外由于细胞外囊泡具有转运生物活性分子的功能，是机体病理生理过程中关键介质，其特异性的组织归巢能力可以将有效载荷靶向输送至特定组织细胞，并逃避免疫监视，发挥治疗作用。因此，利用(乳牙牙髓干细胞)hDPSC-ApoVs凝胶代替传统干细胞移植，实现牙髓组织功能性再生，有待深入研究。
发明内容
本发明的目在于提供乳牙髓干细胞凋亡囊泡制备方法及其在牙髓再生中的应用，采用干细胞来源凋亡囊泡更好的促进死髓牙牙髓组织再生。
本发明解决其技术问题是采用以下方案来实现的。
乳牙牙髓干细胞凋亡囊泡的制备方法，包括以下步骤：
步骤1：分离培养hDPSC；
步骤2：诱导hDPSC凋亡，提取hDPSC-ApoVs；
步骤3：采用BSA蛋白定量分析检测hDPSC-ApoVs浓度；
步骤4：制备hDPSC-ApoVs凝胶；
步骤5：将hDPSC-ApoVs凝胶装载于注射器中，于4℃冷藏。
优选的，在步骤1中，获取临床患儿乳牙牙髓，采用胶原酶消化法分离培养hDPSC。
优选的，步骤2具体包括以下步骤：
步骤201：使用含有0.5μM Staurosporine凋忘诱导液培养细胞12h，诱导hDPSC凋亡；
步骤202：收集凋亡细胞上清于离心管中，4℃，800g离心10min去除细胞碎片，进而吸取上清液，4℃，1600g离心30min获得hDPSC-ApoVs沉淀；
步骤203：然后使用PBS缓冲液重悬沉淀，4℃，1600g离心30min清洗hDPSC-ApoVs。
优选的，所述的hDPSC-ApoVs包括粒径在1-5μm之间的凋亡小体与粒径＜1μm的凋亡微囊泡。
优选的，在步骤4中，利用hDPSC-ApoVs的PBS悬液与适量Pluronic F-127混合，获得浓度为0.2mg/mL的hDPSC-ApoVs凝胶。
本发明还提供了一种乳牙牙髓干细胞凋亡囊泡在制备牙髓组织再生材料中的应用。
本发明的有益效果：通过hDPSC-ApoVs招募宿主内源性干细胞，并定植在根管内进行增殖分化，同时活化宿主血管内皮细胞，通过促进牙髓血运重建为根管内组织重建提供营养并排除代谢废物，从而再生出具有良好组织结构的牙髓组织。目前已利用hDPSC-ApoVs凝胶成功在临床前动物模型中再生出了具有良好生物学结构的牙髓样组织。本发明原创性地建立了hDPSC-ApoVs凝胶的制备方法，为临床牙髓坏死提供了无细胞治疗的新策略，拥有有良好的应用前景。
附图说明
为了更清楚地说明本发明实施例或现有技术中的技术方案，下面将对实施例或现有技术描述中所需要使用的附图作简单地介绍，显而易见地，下面描述中的附图仅仅是本发明的一些实施例，对于本领域普通技术人员来讲，在不付出创造性劳动的前提下，还可以根据这些附图获得其他的附图。
图1为本发明实施例中hDPSC-ApoVs的制备示意图、粒径分布、表面形貌以及生物学标志物检测。
图2为本发明实施例中对照组及hDPSC-ApoVs组在牙髓异位再生模型中再生牙髓效果。
图3为本发明实施例中正常对照组、hDPSC-ApoVs组和血运重建组在牙髓原位再生模型中再生牙髓效果。
图4为动物模型图。
具体实施方式
牙髓炎是临床常见口腔疾病，根管治疗(Rootcanal therapy，RCT)作为目前临床常规治疗方式难以恢复牙齿功能。干细胞移植被证明能够再生具有良好形态结构的牙髓组织，并恢复牙齿功能，然而这种方法对细胞获取来源与储存运输等要求较高，难以广泛普及。此外，还存在免疫排斥与肿瘤转化风险等风险。
为实现牙髓功能性再生，同时突破干细胞治疗的局限性，以EVs治疗为代表的“无细胞的细胞疗法”应运而生。我们研究首次发现，异种移植乳牙牙髓干细胞来源凋亡囊泡(hDPSC-ApoVs)能够促进宿主牙髓组织内源性再生；临床前大动物原位牙髓再生模型结果显示，根管内新生组织富含血管且具有类牙髓结构，年轻恒牙牙根得到进一步发育，根管壁厚度增加，根尖孔闭合。
hDPSC-ApoVs具有容易制备并且产业化生产的优势；同时，由于细胞外囊泡具有转运生物活性分子的功能，是机体病理生理过程中关键介质，其特异性的组织归巢能力可以将有效载荷靶向输送至特定组织细胞，并逃避免疫监视，发挥治疗作用。因此，利用hDPSC-ApoVs凝胶代替传统干细胞移植，实现牙髓组织功能性再生，有待深入研究。
下面对本发明实施例中具有引导牙髓组织再生功能的干细胞凋亡囊泡制备及其在牙髓再生中的应用方法进行具体的说明。
本实施例提供的一种具有引导牙髓组织再生功能的干细胞凋亡囊泡制备方法，如图1所示，包括以下步骤：
步骤1：分离培养hDPSC
获取临床患儿乳牙牙髓，采用胶原酶消化法分离培养hDPSC；
所述胶原酶消化法的具体步骤如下：
收集来自临床患儿脱落乳牙的牙髓组织，采用酶解法消化分离SHED细胞。
1)在超净台内用PBS缓冲液反复冲洗牙髓组织，而后使用无菌器械将组织剪碎成1mm3大小组织块；
2)在15mL离心管中用I型胶原酶消化，而后置于37℃孵箱中60-90min充分消化组织；
3)待组织转变为絮状物后，向离心管中加入适量胎牛血清浓度10％的α-MEM培养基停止消化，800g、5min离心弃上清；
4)用胎牛血清浓度10％的α-MEM培养基重悬细胞沉淀，于25cm2培养瓶中接种细胞，并补充适量培养基，摇匀后置于37℃、5％CO2条件下进行培养，待细胞融合度达90％后进行传代；
步骤2：诱导hDPSC凋亡，提取hDPSC-ApoVs
步骤201：使用含有0.5μM Staurosporine凋忘诱导液培养细胞12h，诱导hDPSC凋亡；
步骤202：收集凋亡细胞上清于15mL离心管中，4℃，800g离心10min去除细胞碎片，进而吸取上清液，4℃，1600g离心30min获得hDPSC-ApoVs沉淀；
步骤203：然后使用PBS缓冲液重悬沉淀，4℃，1600g离心30min清洗hDPSC-ApoVs；
步骤3：采用BSA蛋白定量分析检测hDPSC-ApoVs浓度；
步骤4：制备hDPSC-ApoVs凝胶
利用hDPSC-ApoVs的PBS悬液与适量Pluronic F-127混合，获得浓度为0.2mg/mL的hDPSC-ApoVs凝胶；
步骤5：将hDPSC-ApoVs凝胶装载于注射器中，于4℃冷藏。
上述所述的hDPSC-ApoVs包括粒径在1-5μm之间的凋亡小体与粒径＜1μm的凋亡微囊泡。
本实施还提供了一种乳牙牙髓干细胞凋亡囊泡在引导牙髓组织再生功能中的应用。
hDPSC-ApoVs凝胶的具体使用方法如下：
1)通过机械方法去除坏死牙髓组织，并对根管进行常规消毒、预备。
2)吸干根管中水分，将hDPSC-ApoVs凝胶缓慢注入根管中。
3)使用玻璃离子封闭髓腔，进而使用纳米树脂修复缺损牙体组织。
以下结合实施例对本发明的特征和性能作进一步的详细描述。
实施例
具有引导牙髓组织再生功能的干细胞凋亡囊泡应用过程
首先通过机械方法去除坏死牙髓组织，并对根管进行常规消毒、预备，进而吸干根管中水分，将hDPSC-ApoVs凝胶缓慢注入根管中；而后使用玻璃离子封闭髓腔，进而使用纳米树脂修复缺损牙体组织。
注射3m后通过影像学技术检测根管内组织重建效果。
图2为本发明实施例中对照组及hDPSC-ApoVs组在牙髓异位再生模型中再生牙髓效果。
图3为本发明实施例中正常对照组、hDPSC-ApoVs组和血运重建组在牙髓原位再生模型中再生牙髓效果。
图4为动物模型图。
实验过程分析
离体牙根支架的制备
1)去除离体牙牙冠，获得牙根，利用高压涡轮手机去除牙根表面软组织，并截取5mm长度的根管。
2)利用柱状金刚砂车针清理管腔内残留牙髓组织，并将根管制备为内径为1mm的管状结构，而后打磨牙根外壁，使其形成约为1mm均匀厚度的管壁结构。
3)利用PBS缓冲液冲洗牙齿表面3遍以上，浸于去离子水中超声震荡约半小时，而后通过高温高压消毒灭菌备用。
2裸鼠皮下牙髓异位再生实验
1)实验分组：按照植入的材料不同分为：①PBS凝胶组；②SHED-ApoVs凝胶组。
2)模型构建：用1％戊巴比妥钠进行裸鼠腹腔注射麻醉后，用碘伏消毒小鼠背部皮肤，制作5-6mm的横向切口，将聚合体充填入离体牙根支架中，而后将复合物放置于裸鼠背部皮下，最后缝合伤口。
3)组织取材：于术后2m注射过量戊巴比妥钠处死小鼠，将离体牙根支架取出并浸于4％多聚甲醛中固定，24h后取出并用PBS缓冲液洗净，于17％EDTA脱钙液中脱钙，隔天换液，脱钙结束后取出根管并用流水冲洗，而后进行脱水、包埋、切片，最后通过组织学方法评估再生效果。
图2结果
HE染色结果表明，植入2m后，相比于PBS组，ApoVs组新生组织中细胞排列更为紧密，且血管含量较多(图2A-B)。为了进一步明确血管再生情况，我们通过免疫荧光染色标记再生组织中的血管内皮细胞(CD31)，结果显示与PBS组相比，ApoVs组中CD31+细胞(绿色荧光)数量更多，并且细胞呈连续环状分布，具有血管结构特点，进一步荧光密度分析结果表明ApoVs组中血管密度更高(图2C-D)。以上结果说明SHED-ApoVs能够在体内促进血管形成。
图3实验过程
比格犬牙髓原位再生模型的构建
1.实验分组
按照去髓后处理方式不同分为：①PBS组：去髓后在根管中注射PBS凝胶；②ApoVs组：去髓后在根管中注射SHED-ApoVs凝胶；③Revas(血运重建)组：去髓后按照临床血运重建术进行处理；④Normal(正常对照)组：不做去髓处理。
2.构建动物模型
1)称重比格犬，按照0.08-0.10mL/kg剂量肌肉注射陆眠宁诱导麻醉，而后加注0.20-0.30mL/kg 3％戊巴比妥钠加强麻醉。
2)将比格犬取俯卧位固定四肢，使用碘伏消毒术区，铺巾，洗手，着手术衣
3)手术开始后，于术区注射1％阿替卡因进行局部麻醉。
4)使用牙科高速涡轮手机打开比格犬前牙髓腔，去净髓室顶，用拔髓针将牙髓完整拔除，而后用生理盐水反复冲洗髓腔至再无血液渗出。
5)取Protaper镍钛根管锉进行预备，去除残留牙髓组织，并配合以生理盐水反复冲洗。
6)用纸尖蘸干根管中水分，PBS与ApoVs组分别注射PBS凝胶、ApoVs凝胶充盈整个根管腔，Revas组用1mL注射器针头刺破根尖血管，使血液充盈整个根管并凝固。
7)最后用BP封闭开髓口，用树脂充填牙体组织。
3.检测血管再生效果
1)组织取材：待比格犬麻醉后，用牙挺挺松前牙，用拔牙钳拔出牙齿。
2)将犬牙固定在4％多聚甲醛中24h。
3)用PBS缓冲液洗3遍，将犬牙置于17％EDTA脱钙液中进行脱钙，每2天更换一次脱钙液。
4)待犬牙脱钙完全后，用流水冲洗12h。
5)脱水、包埋、切片，利用HE/Masson染色或免疫荧光染色(CD31)观测牙髓血运重建情况。
CBCT影像学检测
待比格犬麻醉后，取坐姿固定，进行全头颅CBCT扫描；将数据导出并用NNTViewer进行分析，记录术前及术后3m牙本质厚度，计算不同组改变量；利用Mimics对原始数据进行三维重建，比较牙根再发育情况。
图3结果
我们利用SHED-ApoVs充填根管构建比格犬年轻恒牙牙髓原位再生动物模型，选择年龄在3m-4m，恒切牙尚未完全萌出的年轻比格犬，待其乳切牙脱落，恒切牙萌出不久进行实验，根管注入等量PBS(PBS组)作为对照，观察SHED-ApoVs对牙髓坏死年轻恒牙的治疗效果(ApoVs组)。此外，我们根据临床操作指南构建了血运重建术治疗模型(Revas组)，通过组织学方法对比两种处理方法的治疗效果。HE染色结果显示，在三组模型中，仅ApoVs组根管中可见新生组织形成(图3A-C)，高倍镜下可以观察到组织中存在新生血管结构，管腔中可见密集分布的血细胞(黑色箭头标记)。为了进一步明确血管再生效果，我们使用了CD31标记受体血管内皮细胞，共聚焦显微镜观察可见ApoVs组中存在大量CD31+(绿色荧光)细胞，且细胞连续排列成管腔(图3D)。以上结果说明在天然根管环境中，SHED-ApoVs能够促进富含血管组织的形成。
为了进一步评估两种处理术式的疗效，我们使用CBCT对比格犬年轻恒牙术前及术后3m的发育情况进行记录并对比，结果显示，未进行手术的正常比格犬年轻恒牙(Normal组)发育良好，牙本质厚度普遍增加了1-2mm，PBS组牙根没有改变，说明牙根停止发育；Revas(血运重建组)中牙根发育欠佳，部分牙齿牙本质厚度少量增加，但无统计学意义；ApoVs组中牙根厚度平均增加了0.5-1mm，且结果具有统计学意义(图3F)。三维重建结果显示，Normal组与ApoVs组牙根发育明显，根尖孔闭合情况较好，而Revas组牙根发育不足，根尖孔未能完全闭合；PBS组牙根停止发育，根尖呈喇叭口样敞开(图3E)。HE及Masson染色后观察发现，PBS组中无成型组织存在(图3A)；Revas组中仅存在部分无定形基质，类似于肌肉纤维，骨组织与细胞外基质混合物，无明显细胞存在(图3B)；ApoVs组根管中有明显富含血管组织的长入，且新生组织细胞排列整齐、规则(图3C)。上述结果表明SHED-ApoVs能够通过介导牙髓血运重建促进牙髓组织再生，进而诱导年轻恒牙牙根的继续发育，且治疗效果优于现有的血运重建术，具有一定的临床应用价值。
以上所述，仅用以说明本发明的技术方案而非限制，本领域普通技术人员对本发明的技术方案所做的其它修改或者等同替换，只要不脱离本发明技术方案的精神和范围，均应涵盖在本发明的权利要求范围当中。

Claims (6)

1.乳牙牙髓干细胞凋亡囊泡的制备方法，其特征在于，包括以下步骤：
步骤1：分离培养hDPSC；
步骤2：诱导hDPSC凋亡，提取hDPSC-ApoVs；
步骤3：采用BSA蛋白定量分析检测hDPSC-ApoVs浓度；
步骤4：制备hDPSC-ApoVs凝胶；
步骤5：将hDPSC-ApoVs凝胶装载于注射器中，于4℃冷藏。
2.根据权利要求1所述的乳牙牙髓干细胞凋亡囊泡的制备方法，其特征在于，在步骤1中，获取临床患儿乳牙牙髓，采用胶原酶消化法分离培养hDPSC。
3.根据权利要求1所述的乳牙牙髓干细胞凋亡囊泡的制备方法，其特征在于，步骤2具体包括以下步骤：
步骤201：使用含有0.5μM Staurosporine凋忘诱导液培养细胞12h，诱导hDPSC凋亡；
步骤202：收集凋亡细胞上清于离心管中，4℃，800g离心10min去除细胞碎片，进而吸取上清液，4℃，1600g离心30min获得hDPSC-ApoVs沉淀；
步骤203：然后使用PBS缓冲液重悬沉淀，4℃，1600g离心30min清洗hDPSC-ApoVs。
4.根据权利要求3所述的乳牙牙髓干细胞凋亡囊泡的制备方法，其特征在于，所述的hDPSC-ApoVs包括粒径在1-5μm之间的凋亡小体与粒径＜1μm的凋亡微囊泡。
5.根据权利要求1所述的乳牙牙髓干细胞凋亡囊泡的制备方法，其特征在于，在步骤4中，利用hDPSC-ApoVs的PBS悬液与适量Pluronic F-127混合，获得浓度为0.2mg/mL的hDPSC-ApoVs凝胶。
6.根据权利要求1-5任一项所述的乳牙牙髓干细胞凋亡囊泡在制备牙髓组织再生材料中的应用。
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